Summary
Tykkelsen på vevsseksjoner begrenset den morfologiske studien av hudens innervering. Den nåværende protokollen beskriver en unik vevsryddingsteknikk for å visualisere kutane nervefibre i tykke 300 μm vevsseksjoner under konfokal mikroskopi.
Abstract
Hud innervering er en viktig del av det perifere nervesystemet. Selv om studien av kutane nervefibre har utviklet seg raskt, kommer det meste av forståelsen av deres fordelingsmessige og kjemiske egenskaper fra konvensjonell histokjemisk og immunhiistokjemisk farging på tynne vevsseksjoner. Med utviklingen av vevsryddingsteknikken har det blitt mulig å se de kutane nervefibrene på tykkere vevsseksjoner. Den nåværende protokollen beskriver flere fluorescerende flekker på vevsseksjoner med en tykkelse på 300 μm fra plantar og dorsal hud av rotte bakfot, de to typiske hårete og glabrøse hudstedene. Her merker calcitoningenrelatert peptid de sensoriske nervefibrene, mens falloidin og lymfatisk kar endotelhyaluronreseptor 1 merker henholdsvis blod- og lymfekarene. Under et konfokalt mikroskop ble de merkede sensoriske nervefibrene fulgt helt på lengre avstand, og løp i bunter i det dype kutane laget og freestyle i det overfladiske laget. Disse nervefibrene løp parallelt med eller omringet blodkarene, og lymfekar dannet et tredimensjonalt (3D) nettverk i hårete og glabroushuden. Den nåværende protokollen gir en mer effektiv tilnærming til å studere hud innervering enn de eksisterende konvensjonelle metodene fra metodikkperspektivet.
Introduction
Huden, det største organet i kroppen, som tjener som et nøkkelgrensesnitt for miljøet, er tett innervated av mange nervefibre 1,2,3. Selv om hudinnvandring har blitt studert mye tidligere med ulike histologiske metoder, for eksempel farging på helmonterte hud- og vevsseksjoner 4,5,6, er den detaljerte effektive demonstrasjonen av kutane nervefibre fortsatt en utfordring 7,8. Gitt dette utviklet den nåværende protokollen en unik teknikk for å vise kutane nervefibre tydeligere i den tykke vevsdelen.
På grunn av grensen ved tykkelsen på seksjoner er observasjonen av innerverte hudnervefibre ikke presis nok til å nøyaktig skildre forholdet mellom calcitonin genrelatert peptid (CGRP) nervefibre og lokale vev og organer fra den oppkjøpte bildeinformasjonen. Fremveksten av 3D-vevsryddingsteknologi gir en mulig metode for å løse dette problemet 9,10. Den raske utviklingen av vevsryddingsmetoder har tilbudt mange verktøy for å studere vevsstrukturer, hele organer, nevronprojeksjoner og hele dyr i nyere tid11. Det gjennomsiktige hudvevet kan avbildes i en mye tykkere del ved konfokal mikroskopi for å få dataene til å visualisere kutane nervefibre.
I den nåværende studien ble plantar og dorsal hud av en rotte bakfot valgt som de to målstedene for hårete og glabrøse hud 3,4,7. For å spore de kutane nervefibrene på lengre avstand, ble hudvevet skiver i tykkelsen på 300 μm for immunhiistokjemisk og histokjemisk farging, etterfulgt av vevsryddingsbehandling. CGRP ble brukt til å merke de sensoriske nervefibrene12,13. I tillegg, for å markere de kutane nervefibrene på vevsbakgrunnen, ble falloidin og lymfatisk kar endotelhyaluronreseptor 1 (LYVE1) videre brukt til å merke blodkarene og lymfekarene, henholdsvis14,15.
Disse tilnærmingene ga en enkel metode som kan brukes for å demonstrere en høyoppløselig visning av kutane nervefibre og også å visualisere den romlige korrelasjonen mellom nervefibre, blodkar og lymfatiske kar i huden, noe som kan gi mye mer informasjon for å forstå homeostase av normal hud og den kutane endringen under de patologiske forholdene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den nåværende studien ble godkjent av Etikkkomiteen ved Institutt for akupunktur og moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (referansenummer D2018-04-13-1). Alle prosedyrer ble utført etter National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Tre voksne hannrotter (Sprague-Dawley, vekt 230 ± 15 g) ble brukt i denne studien. Alle dyrene ble plassert i en 12 timers lys/ mørk syklus med kontrollert temperatur og fuktighet og tillot fri tilgang til mat og vann.
1. Perfusjon og prøvepreparering
- Injiser 250 mg/kg tribromoetanoloppløsning (se materialfortegnelse) intraperitonealt i rotten for å indusere eutanasi.
- Når pusten stopper, bruk kirurgisk saks i rustfritt stål for å åpne thoraxhulen på rotten. Bruk 20 G nåler til å parfyme via venstre hjerte ventrikel13 med en hastighet på 3 ml/min med 100 ml 0,9 % normal saltvann etterfulgt av 250–300 ml 4 % paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffer (PB, pH 7,4) (figur 1A,B).
- Etter perfusjon, bruk en skalpell for å fjerne huden på dorsum og såle fra bakpoten.
- For prøvene som krever frossen seksjon, post-fix vevet i 4% paraformaldehyd i 0,1 M PB i 2 timer; kryoprekte vevet i 25 % sukrose i 0,1 M PB i mer enn 24 timer ved 4 °C
- For prøvene med den tykke delen som krever vevsrydding, post-fix vevet i 4% paraformaldehyd i 1x fosfatbufret saltvann (1x PBS) i 2 timer; kryoprekk vevet i 1x PBS ved 4 °C (figur 1C–E).
2. Trippel fluorescerende farging med CGRP, falloidin og LYVE1 etterfulgt av vevsryddingsbehandling
MERK: Trippel fluorescerende farging med CGRP, falloidin og LYVE1 ble påført for å avsløre nervefibrene, blodårene og lymfekarene i hårete og glabrous hud på vevsseksjoner med en tykkelse på 300 μm etter vevsryddingsbehandling.
- Forbered 2% agarose i 1x PBS ved oppvarming i en mikroovn i 2 min til agarose oppløses (se Materialtabell).
- Etter vask legger du inn hudvevet i 2% agarose ved 37 °C, og plasserer dem inne i isboksen for kjøling (figur 1F,G).
- Fest det monterte vevet på den vibratoriske mikrotommen med isvannet og skjær dem i en tykkelse på 500 μm i tverrretningen. Bruk følgende parametere for å stille inn vibrasjonsskiven og fullfør kuttingen: hastighet, 0,50 mm/s og amplitude, 1,5 mm (figur 1H-K).
- Etter kutting fjerner du agarose fra seksjonene og oppbevarer dem i en seksbrønnsplate med 1x PBS (pH 7.4) (figur 1L).
- Inkuber vevsseksjonene i en oppløsning på 2% Triton X-100 i 1x PBS (TriX-PB) over natten ved 4 °C. Se figur 2 for følgende fremgangsmåte.
- Plasser vevsdelene i blokkeringsbufferen og roter ved 72 o/min på shakeren over natten ved 4 °C.
MERK: Den blokkerende buffersammensetningen er 10 % normalt eselserum, 1 % Triton-X 100 og 0,2 % natriumazid i 1x PBS (se materialtabellen). - Overfør vevsdelene inn i oppløsningen som inneholder de primære antistoffene til musmonokron anti-CGRP (1:500) og sau polyklonal anti-LYVE1 antistoff (1:500) i fortynningsbuffer i mikrocentrifugerøret (se Materialfortegnelse), og roter på shakeren i 2 dager ved 4 °C.
MERK: Fortynningsbuffersammensetningen er 1% normalt eselserum, 0,2% Triton-X 100 og 0,2% natriumazid i 1x PBS. - Vask vevsseksjonene to ganger med vaskebuffer ved romtemperatur, og hold dem deretter på shakeren over natten ved 4 °C i vaskebuffer.
MERK: Vaskebuffersammensetningen er 0,2% Triton-X 100 i 0,1 M PB (pH 7,4). - Neste dag overfører du vevsdelene til den blandede løsningen som inneholder sekundære antistoffer av esel antimus IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) og esel anti-sauer IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), samt Alexa-Flour594 falloidin (1:1000) (se Materialtabell) i et mikrocentrifugerør og roter ved 72 o/min på shakeren i 5 timer ved 4 °C.
- Vask vevsdelene i en seksbrønnsplate med vaskebuffer i 1 time, to ganger, ved romtemperatur. Hold vevsdelene i vaskebufferen på shakeren over natten ved 4 °C.
- Overfør vevsdelene inn i vevsryddingsreagenset (se Materialtabell, volumet var fem ganger mer enn prøvevolumet) og roter ved 60 rpm på shakeren forsiktig i 1 time ved romtemperatur.
MERK: Etter denne behandlingen blir vevsdelene tydelige (figur 2B). - Monter det ryddede vevet på lysbildet, sirkle vevet med en avstandsstykke, og hold gapet med friskt vevsryddingsreagens og dekslerlip.
3. Trippel fluorescerende farging med CGRP, falloidin og LYVE1 etter den konvensjonelle tilnærmingen
MERK: Til sammenligning ble den samme fargingen utført på vevsseksjoner med en tykkelse på 30 μm etter konvensjonelle teknikker.
- Skjær vevsdelene i 30 μm på en mikrotom i tverrretningen og monter dem på lysbildet.
- Tilsett blokkeringsløsning med 3% normalt eselserum og 0,3% Triton X-100 i 0,1 M PB og inkuber seksjonene i 30 minutter ved romtemperatur.
- Fjern blokkeringsløsningen og inkuber seksjonene med oppløsningen som inneholder de primære antistoffene til musen monoklonal anti-CGRP (1:500) og sau polyklonal anti-LYVE1 antistoff (1:500) i fortynningsbuffer over natten ved 4 °C.
- Neste dag, vask vevsdelene med 0,1 M PB (pH 7,4) tre ganger, tilsett den blandede løsningen som inneholder sekundære antistoffer fra esel antimus IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) og esel anti-sauer IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), samt Alexa-Flour594 falloidin (1:1000) på seksjonene og inkubere i 1 time ved romtemperatur.
- Før mikroskopisk observasjon, vask seksjonene i 0,1 M PB (pH 7,4) tre ganger, og dekk dem deretter med deksler i 50% glyserin.
4. Avbildning og analyser
- Vær oppmerksom på de fargede prøvene under et fluorescerende mikroskop, og ta deretter bildene ved hjelp av et konfokalt mikroskop.
- Ta 30 bilder (Z-stabler), hver i 10 μm rammer, fra hver 300 μm tykk seksjon og integrer et enkelt in-focus bilde ved hjelp av en bildeprosessor av det konfokale mikroskopisystemet (se Tabell over materialer).
- Utfør følgende trinn i bildebehandlingsprogramvaren for det konfokale oppsettet for tredimensjonal analyse (3D): Angi Start brennpunktplan | Angi endefokusplan | Angi trinnstørrelse | Velg Dybdemønster | | for avbildningsopptak Z-serien.
MERK: Eksitasjons- og utslippsbølgelengdene til blå fluorescenssignaler var henholdsvis 401 nm og 421 nm. Eksitasjons- og utslippsbølgelengder av grønne fluorescenssignaler var henholdsvis 499 nm og 519 nm. Eksitasjons- og utslippsbølgelengder av røde fluorescenssignaler var henholdsvis 591 nm og 618 nm. 152 μm er diameteren på det konfokale hullhullet (10x objektiv linse, NA: 0,4). Bildeopptaksoppløsningen var 1024 × 1024 piksler.
- Utfør følgende trinn i bildebehandlingsprogramvaren for det konfokale oppsettet for tredimensjonal analyse (3D): Angi Start brennpunktplan | Angi endefokusplan | Angi trinnstørrelse | Velg Dybdemønster | | for avbildningsopptak Z-serien.
- For de konvensjonelle prøvene (trinn 3) tar du 30 bilder (Z-stabler) i 1 μm-bilder fra hver 30 μm tykke del og behandler disse bildene ytterligere som nevnt ovenfor (trinn 4.1-4.2).
- Demonstrere bildene i mønsteret for 3D-rekonstruksjon med bildebehandlingssystemet.
- Utfør 3D-rekonstruksjoner ved å importere Z-stack confocal-bilder til Imaris 9.0 (celleavbildningsprogramvare, se Materialfortegnelse) og lage overflategjengivelser basert på flekkintensiteter: Legg til nye overflater | Velg kildekanal | Bestem parameterne i det jevne alternativet For | Bestemme parameterne i terskelalternativet absolutt intensitet | Kl klassifisere overflater | Gjør deg ferdig.
- Innhente data i overflatearealet av positive nervefibre med celleavbildningsprogramvaren. Velg det gjengitte bildet | Statistikk | Detaljert | Bestemte verdier | Volum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter trippel fluorescerende farging ble nervefibrene, blodkarene og lymfekarene tydelig merket med henholdsvis CGRP, falloidin og LYVE1 i den hårete og glabrøse huden (figur 3,4). Med ryddingsbehandlingen kan de CGRP-positive nervefibrene, falloidinpositive blodårene og LYVE1-positive lymfekarene avbildes i større dybde for å skaffe seg fullstendig strukturell informasjon om huden (figur 3). Da disse vevsstrukturene ble ytterligere rekonstruert i et 3D-mønster, ble distribusjonen lettere å spore. Det ble vist at de CGRP-positive nervefibrene passerte gjennom det subkutane vevet og dermis til epidermis. Disse nervefibrene kjørte i bunter i det subkutane vevet, forgrenet innenfor dermis, og avsluttet i epidermis (figur 3). I motsetning til dette fordeles falloidinpositive blodårer og LYVE1-positive lymfatiske kar i det subkutane vevet og dermis (figur 3). Generelt løp de CGRP-positive nervefibrene parallelt med eller omringet blodkarene og lymfatiske karene, og dannet et 3D-nettverk i hårete og glabrøse hud.
Med den konvensjonelle tilnærmingen, selv om nervefibrene, blodkarene og lymfekarene var tydelig merket med CGRP, falloidin og LYVE1 i de tynne delene, er observasjonen av disse strukturene begrenset av skivetykkelsen og kan ikke observeres helt (figur 4). Bildeteknikken gjengitt dyptgående bilder for hvert objektelement fra forskjellige positive fluorescerende signaler. Etter å ha generert bildet, ble overflatearealet av CGRP-positive nervefibre anskaffet gjennom Imaris-programvaren. I delen med en tykkelse på 30 μm var det ingen forskjell mellom hårete hud og glabrous hud i overflatearealet av CGRP-positive nervefibre. I de 300 μm tykke vevsdelene, sammenlignet med hårete hud, ble overflatearealet av CGRP-positive nervefibre av glabroushud betydelig økt (* P < 0,05, Kruskal-Wallis ikke-parametrisk test, n = 3, figur 5). Derfor, for å sammenligne overflatearealet av positive nervefibre nøyaktig, er den 300 μm ryddede delen bedre enn den tradisjonelle 30 μm-delen. Til sammenligning er det mulig å skaffe flere muligheter for et ideelt 3D-bilde fra den tykke vevsdelen med clearingbehandling enn i den konvensjonelle tynne delen.
Figur 1: Fotografier av eksperimentelle verktøy og viktige trinn i studien. (A) Kirurgiske verktøy (skalpell, saks, etc.). (B) Pumpen for perfusjon. (C) Plantar og dorsale sider av bakpoten etter perfusjon. (D) Sålen og dorsumskinnene ble fjernet fra bakpoten. (E) Trimmet hudvev. (F,G) Montert hudvev med 2% agarose ved 37 °C og 4 °C. (H) Vibrerende mikrotom. (I) Fast hudvev på skjærestøtten. (J) Angi parametere for kutting. (K) Prosess for kutting. (L) Representative seksjoner har en tykkelse på 300 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fluorescerende fargingsprosedyre og rydding av hudvev. (A) En representasjon av protokolltrinnene som er involvert i denne studien. (B) Utvendig syn på hudvev før og etter ryddingsbehandlingen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Romlig korrelasjon mellom nervefibre, blodårer og lymfatiske kar etter vevsryddingsbehandling på den tykke hudseksjonen. (A,B) Representative bilder av den tykke delen av rotte-bakfotens plantar- og dorsalhud viser fordelingen av nervefibre, blodkar og lymfatiske kar i glabrous (A) og hårete (B) hud. (A1-A3) Panel A ble vist separat med CGRP-merking (A1), Pha-merking (A2) og LYVE1-merking (A3). (A4,A5; B1,B2) Panelene (A) og (B) ble justert i et 3D-mønster og vist med henholdsvis for- (A4,B1) og bakvisning (A5,B2). Samme skalalinje for alle paneler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Romlig korrelasjon av nervefibre, blodårer og lymfatiske kar på den tynne huddelen med konvensjonell tilnærming. (A,B) Representative bilder av den tykke delen av rotte-bakfotens plantar og dorsale hud viser fordelingen av nervefibre, blodkar og lymfatiske kar i glabrous (A) og hårete (B) hud. (A1,A2; B1,B2): Paneler (A) og (B) ble justert i et 3D-mønster og vist med henholdsvis frontvisningene (A1, B1) og bak (A2,B2). Samme skalalinje for alle paneler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Et histogram som viser overflatearealet av CGRP-positive nervefibre i hårete og glabrøs hud. (A) I avsnittet med en tykkelse på 30 μm var det ingen forskjell mellom hårete hud og glabrous hud i overflatearealet av CGRP-positive nervefibre. (B) I avsnittet med en tykkelse på 300 μm, sammenlignet med hårete hud, ble overflatearealet av CGRP-positive nervefibre av glabrous hud betydelig økt (* P < 0,05, n = 3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nåværende studien gir en detaljert demonstrasjon av de kutane nervefibrene i den hårete og glabrøse huden ved å bruke immunfluorescens på tykkere vevsseksjoner med ryddingsbehandling og en 3D-visning for å forstå hudens innervasjon bedre. Antistoffinkubasjonstiden på opptil 1-2 dager og en rengjøringsprosess over natten er viktig. Disse to viktige trinnene påvirker direkte immunfluorescensfargingseffekten av tykke seksjoner. Et annet problem ble reist fra valg av antistoffer, ikke alle er egnet for tykke seksjoner. Vi spekulerer i at antistoffer med mindre molekylvekter kan være ideelle for immunfluorescensfarging av tykke seksjoner. Dermed er vanskeligheten med antistoffvalg en stor begrensning av denne tilnærmingen. Det nåværende arbeidet hadde observert forskjellene i fordelingen av blodkar, lymfatiske kar og nerver på hårete og hårløs hud av rotter. For mennesker er hudstrukturen svært forskjellig fra gnagere; vi ser frem til å bruke vevsryddingsteknologi for å observere og forske på menneskelig hud i neste trinn.
Tidligere studier har gjort mange anstrengelser for å avsløre kutane nervefibre 4,5,6,7,8. I motsetning til den konvensjonelle vevsseksjonsstudien har vevsryddingsteknikker inkludert CUBIC, CLARITY og vDISCO blitt mye brukt til å studere hele organer og hele kropper av dyr de siste årene 16,17,18,19. Vanligvis er det vanskelig å spore kutane nervefibre med en lang og komplett struktur i den tynne delen 4,5,6,7,8; relativt sett kan vevsrydding på den store prøven ta lang tid 16,17,18,19. Tatt i betraktning deres fordeler og ulemper, er den nåværende protokollen et riktig valg for å undersøke den detaljerte strukturen til de kutane nervefibrene i den gjennomsiktig behandlede tykke delen, som er praktisk å bli observert og registrert under vanlig konfokal mikroskopi. Ved å bruke denne tilnærmingen kan man observere lengre kutane nervefibre i den tykke delen sammenlignet med den tynne delen, og spare eksperimentell tid for vevsbehandling sammenlignet med de store prøvene med vevsrydding.
I denne studien ble de kutane nervefibrene merket med CGRP. Denne typen nervefibre tilhører C og Aδ sensoriske fibre, spiller rollen som å transportere nociceptive signaler og modulere vasodilatasjon12,13. Siden CGRP-positive nervefibre ligger nær blodkar og lymfatiske kar i det subkutane laget, ble det også foreslått å delta i sårheling ved å forbedre angiogenese og lymfangiogenese20,21. I likhet med tidligere studier 14,20,21,22, ble falloidin sterkt uttrykt i blodårene med dette trippelmerkingseksperimentet. I tillegg er LYVE1 et integrert membranglykoprotein og brukes effektivt som biomarkør for sortering av rottedermale lymfatiske endotelceller 15,23,24. Ved å dra nytte av trippel fluorescerende farging med CGRP, falloidin og LYVE1, sammen med vevsryddingsteknikken, presenteres et høyoppløselig bilde for bedre innsikt i nettverket av nervefibre, blodkar og lymfatiske kar i den hårete og glabrøse huden.
Det skal bemerkes at bare de CGRP-positive nervefibrene ble demonstrert i denne studien. Foruten denne typen sensorisk nervefiber, kan denne protokollen også passe for å undersøke andre typer kutane nervefibre med de tilsvarende antistoffene. I tillegg, siden falloidin er sterkt uttrykt i cytoskeletalkomponenten i glatte muskulære og endotelceller 21,22,25, foruten blodkarene, ble muskel- og epidermalt vev også merket med falloidin. Men ifølge den morfologiske egenskapen er det ikke vanskelig å identifisere blodkar fra den andre typen vev.
Oppsummert utforsker den nåværende protokollen effektivt innervasjonen av den hårete og glabrøse huden på tykkere seksjoner ved å bruke en kombinasjon av immunfluorescens med ryddingsbehandling. Fra metodikkperspektivet vil det være en fordel å undersøke de andre typene kutane nervefibre og deres romlige korrelasjon med blodkar og lymfekar i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (Prosjektkode nr. CI2021A03404) og National Traditional Chinese Medicine Interdisciplinary innovation Fund (Prosjektkodenr. ZYYCXTD-D-202202).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
References
- Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design. Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, 00181 (2012).
- Pomaville, M. B., Wright, K. M. Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation. Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).
- Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study. Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).
- Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution. Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).
- Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity. Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).
- Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin. Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).
- Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).
- Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Liang, H., et al. CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing. Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Chazotte, B. Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).
- Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).
- Schwager, S., Detmar, M.
- Hagan, I. M. Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates. Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).
