Técnicas de Dissecção e Amostragem Histológica do Coração em Modelos de Grandes Animais para Doenças Cardiovasculares

Summary

Devido à anatomia complexa, um protocolo de dissecção e colheita consistentemente reprodutível para amostras cardíacas pode ser difícil de implementar. Este manuscrito apresenta os elementos-chave de alguns protocolos padrão de dissecção cardíaca, destacando tanto as abordagens de exame macroscópica quanto os locais de amostragem comumente utilizados para o exame histopatológico.

Abstract

O exame grosseiro padrão e a amostragem são elementos-chave na reprodutibilidade e sucesso de estudos experimentais de doenças cardiovasculares realizados em animais de grande porte. Considerando a complexa anatomia do coração, as diferenças entre espécies e os tipos de reações compensatórias e patológicas, protocolos consistentes são difíceis de implementar. A utilização de protocolos de dissecção múltipla é geralmente adaptada para se adequar à experiência do pró-setor, e a preferência pessoal continua a ser uma fonte de variabilidade experimental e interobservador. Aqui, o objetivo é apresentar as principais características anatômicas e marcos, protocolos de dissecção e padrões de amostragem histológica do coração em algumas espécies comumente utilizadas (incluindo cães, suínos, ruminantes e gatos) como modelos de doenças cardiovasculares.

Dois protocolos de exame grosseiro padrão são apresentados aqui. Primeiro, o método de entrada-saída, que segue a direção fisiológica do fluxo sanguíneo através do coração e grandes vasos (frequentemente usado em cães, ruminantes e porcos), e segundo, a técnica de dissecção de quatro câmaras (exemplificada em gatos). Ambas as técnicas podem ser adaptadas a qualquer espécie em determinadas circunstâncias experimentais. Os protocolos de amostragem incluem todas as áreas de interesse (linfonodo sinoatrial, ventrículos, septo interventricular, átrios, válvulas e aorta) e, se bem realizados, melhoram tanto a reprodutibilidade quanto a confiabilidade dos estudos experimentais.

Introduction

Devido à anatomia complexa e ao rigor precoce, que podem interferir na avaliação da espessura da parede cardíaca, o exame macroscópica do coração é desafiador e propenso a vários erros relacionados à técnica ou de interpretação. Isso é amplificado pelas variações morfológicas interespecíficas e pelo fato de que muitas patologias cardíacas clínicas importantes (incluindo casos precoces de doenças coronarianas, fibrose, arterite e amiloidose) não estão associadas a alterações macroscópicas, sendo, em essência, patologias histológicas. Um protocolo padronizado de dissecção e colheita histológica de amostras pode trazer consistência entre os observadores e, ao mesmo tempo, comparabilidade e reprodutibilidade de estudos experimentais de doenças cardiovasculares.

As amostras foram coletadas de dois cães (Canis lupus familiaris) (um buldogue francês macho de 3 anos de idade e uma mestiça fêmea de 8 anos), um gato (Felis catus) (um macho de 6 anos de idade, de pelo curto europeu macho), um porco doméstico (Sus scrofa domesticus) (um macho de 1 ano, macho Large White) e uma vaca (Bos taurus) (uma Holstein fêmea de 2 meses de idade). Cada uma das espécies escolhidas tem uso particular como modelo cardiovascular para uma doença diferente; por exemplo, os cães são um modelo preferido para a modelagem de arritmia; os gatos são preferidos para cardiomiopatia hipertrófica (CMH), por ser a espécie com maior prevalência de CMH; suínos são utilizados como modelo para infarto agudo do miocárdio; e os ruminantes são utilizados como modelo de intoxicação devido à sua exposição a toxinas que podem ser facilmente encontradas em prados¹¹.

Neste manuscrito, são apresentados um protocolo de necropsia e dois protocolos de dissecção do coração, destinados a melhorar o exame macroscópica e histológico do coração em doenças cardiovasculares experimentais. Os protocolos descritos foram desenvolvidos com base em informações de livros didáticos veterinários ^{1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12}, literatura de periódicos 3,13,14^, documentos oficiais 15 e webinars ^{16 ,17}. As amostras utilizadas neste estudo foram colhidas de cadáveres submetidos ao Departamento de Patologia da USAMV Cluj-Napoca para diagnóstico de autópsia de rotina.

Protocol

O protocolo experimental recebeu acordo bioético (nº 311 de 2022) e foi aprovado pelo Comitê de Bioética da Universidade de Ciências Agrárias e Medicina Veterinária Cluj-Napoca, em conformidade com a legislação nacional (Lei nº 43 de 2014) e europeia (Diretiva da UE nº 63 de 2010). Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais e instrumentos utilizados neste protocolo.

1. Protocolo de necropsia

NOTA: Recomenda-se que o mesmo protocolo de necropsia seja utilizado para todas as espécies apresentadas, devido à facilidade de acesso quando realizada ^2,12. Os passos a seguir representam a necropsia realizada em um cão de tamanho médio. Adapte os passos ao realizar necropsias em diferentes sujeitos.

1. Pese o sujeito e coloque-o sobre a mesa de necropsia do lado esquerdo (Figura 1A). Proceder ao exame externo do sujeito (inspecionando e palpação da cútis e mucosas, observando todas as alterações de cor, consistência e volume).
2. Use uma faca (ou bisturi) e faça uma incisão de 7 cm na axila direita (Figura 1A).
3. Localizar a junção coxofemoral (Figura 1A,B). Abra a cápsula com uma faca. Corte do ligamento da cabeça do fêmur (Figura 1B).
4. Use a faca para estender a incisão cutânea na axila craniana para a sínfise mandibular e caudalmente para o períneo (Figura 1B).
5. Retirar a pele com o bisturi e expor a parede torácica e abdominal da linha média ventral até o nível dos processos transversais vertebrais (Figura 1B).
6. Com o bisturi e a pinça, crie um retalho através da parede abdominal, ventrocaudal ao arco costal direito. Abra a cavidade abdominal com tesoura - siga a face caudal do hipocôndrio direito (Figura 1B).
7. Estender a incisão caudalmente ao longo da área paralombar direita até a crista ilíaca externa. Depois, estenda a incisão até a inserção púbica da linha alba.
8. Resumidamente, examine os órgãos abdominais in situ (observando quaisquer alterações nas mudanças de cor, consistência, volume e posição dos órgãos).
9. Com o bisturi e a pinça, puncione o diafragma no ponto mais alto (Figura 1B).
10. Entre na cavidade torácica removendo a caixa torácica direita com duas seções longitudinais usando pinça de corte ósseo. Seção do segmento cartilaginoso paraesternal das costelas. Em seguida, corte o segmento dorsal das costelas, proximal às articulações costovertebrais (Figura 1C).
11. Examine o coração in situ (Figura 1C). Observe o tamanho, a posição, a cor, as conexões com os tecidos adjacentes e, por palpação, quaisquer alterações na consistência⁹.
    NOTA: Se uma trombose ou doença cardíaca congênita estiver presente, o coração deve ser dissecado in situ (esta abordagem permite o exame completo dos grandes vasos).
12. Use uma tesoura para examinar e abrir a cavidade pericárdica com uma seção longitudinal da base até o ápice do coração. Examine a cavidade pericárdica e o epicárdio (observando quaisquer alterações na cor, consistência e volume)¹².
13. Solte o coração com uma tesoura, produzindo cortes transversais da aorta, tronco pulmonar e ambas as veias cavas. Seção da veia cava superior pelo menos 1 cm acima da entrada no átrio direito para preservar a crista terminalis^11,13.
14. Examine o contorno externo do órgão, a aparência do epicárdio, o aparecimento do miocárdio pela transparência do epicárdio e a aparência externa dos grandes vasos (Figura 2A).
    NOTA: Em geral, a abertura e o exame do pericárdio apresentam algumas diferenças entre as espécies. O exame da cavidade pericárdica inicia-se com uma inspeção externa e avaliação através da transparência do pericárdio do conteúdo pericárdico global ^1,2. Em um gato ou cão, o pericárdio normalmente contém cerca de 0,25 mL/kg de líquido fino, límpido, translúcido a amarelo claro⁹. Se houver derrames patológicos, eles devem ser coletados com uma seringa estéril ou tubo vacutainer.

2. Protocolo de dissecação

NOTA: Várias técnicas de necropsia são usadas para o coração, cada uma com várias vantagens. Para este protocolo, foram escolhidas duas das técnicas mais utilizadas: 1) o "método de entrada-saída", que permite um melhor exame das valvas e do endocárdio e é um protocolo utilizado para a maioria das espécies 2,11,12,16, e²) a técnica de "dissecção de quatro câmaras"/"plano ecocardiográfico", tipicamente utilizada para gatos ou cães de pequeno porte ^{1, 17}.

1. O "método de entrada-saída" para dissecção cardíaca 2,11,12,16
   1. Coloque o coração com a face atrial para cima (Figura 2A).
   2. Use tesouras e pinças desdentadas para cortar amplamente da veia cava caudal ao longo do átrio direito (Figura 2B). Continue o corte até o apêndice auricular direito para expor a crista terminalis/nó sinoatrial (nó SA). Inspecione a valva tricúspide a partir da vista dorsal.
   3. Corte de um corte do átrio direito até a junção entre o ventrículo direito e o septo interventricular (Figura 2C). Exibir a válvula atrioventricular direita.
   4. Seção da parede livre do ventrículo direito ao longo do septo interventricular. Continue a secção até a origem do tronco pulmonar (Figura 2C,D).
   5. Examinar minuciosamente as valvas atrioventriculares direitas, incluindo as cordas tendíneas, e os músculos papilares (Figura 2D). Corte os acordes tendineae.
   6. Colocar pinça através do tronco pulmonar e cortá-lo longitudinalmente (Figura 2E). Examine a via de saída pulmonar, a origem do tronco pulmonar e as válvulas semilunares.
   7. Corte o átrio esquerdo das veias pulmonares até a ponta da aurícula esquerda (Figura 2F). Inspecione a válvula bicúspide (mitral) a partir da vista dorsal.
   8. Colocar o coração com o septo interventricular voltado para baixo (Figura 2F). Faça uma grande incisão na parede livre ventricular da base do ventrículo até o ápice cardíaco. Exibir completamente a válvula atrioventricular esquerda.
   9. Corte as cordas tendíneas da cúspide da valva atrioventricular esquerda.
   10. Colocar a pinça através da via de saída do ventrículo esquerdo e utilizá-la como orientação para abrir a aorta (Figura 2G).
   11. Use solução salina para remover todos os coágulos sanguíneos. Uma vez removidos todos os coágulos sanguíneos, avalie-se e compare o peso cardíaco com a massa corporal ou tabelas de peso cardíaco padrão (Tabela 1)^11,13.
   12. Pese o coração.
   13. Se apenas o nó SA for o ponto de interesse, após o exame do ventrículo esquerdo, coloque todo o coração inteiramente em formalina tamponada neutra (NBF) a 10% por 24 h e corte o átrio direito para coletar amostras da crista terminal.
       NOTA: Por esta técnica, os ventrículos esquerdo e direito podem ser facilmente apreciados. A razão entre a espessura da parede ventricular esquerda e direita é de 3:1, com pequenas diferenças por espécie e raça; para o coração do feto animal, a proporção é de 1:1¹².

3. Protocolo de amostragem para histologia¹⁶

1. Com bisturi, fazer dois cortes longitudinais paralelos (aproximadamente 5 mm de distância) envolvendo o átrio direito, a valva tricúspide e a parede livre do ventrículo direito (Figura 2I)
2. Realizar dois cortes longitudinais paralelos (aproximadamente 5 mm de distância) envolvendo o átrio esquerdo, valva mitral, músculo papilar dorsal e ventrículo esquerdo (Figura 2H).
3. Dentro do terço superior dorsal do coração, seccionar transversalmente a base do coração seguindo uma linha, incluindo o septo interventricular, átrio direito, aorta, valva aórtica e valva tricúspide (Figura 2J).
4. Realizar dois cortes longitudinais paralelos envolvendo a base da aorta e o septo interventricular (Figura 2J).
5. Aparar o átrio direito ao redor da crista terminal e fornecer várias seções paralelas orientadas transversalmente no eixo longitudinal da crista (aproximadamente 3-4 mm de distância) para obter seis peças do nó SA (Figura 3, Figura 4I e Figura 5H).
6. Aparar os tecidos obtidos em histológicas.
   NOTA: Protocolo de bloqueio recomendado: etapa 3.1.-bloqueio histológico 1 (a Figura 6 mostra o slide resultante deste bloco.), passo 3.2.-bloco histológico 2 (a Figura 7 mostra o slide resultante deste bloco), passo 3.4.-bloco histológico 3 (a Figura 8 mostra o slide resultante deste bloco), passo 3.5.-bloco histológico 4 (a Figura 9 mostra o slide resultante deste bloco).
7. Mergulhe os tecidos em 10% de NBF por pelo menos 48 h.

4. Amostragem de artérias coronárias 3,10,14

1. Use fórceps e bisturi para dissecar as artérias coronárias do sulco paraconal cardíaco (Figura 4K). Fixe a artéria coronária durante a noite em 10% NBF.
2. Se necessário, descalcificar adequadamente em uma mistura 1:1 de ácido fórmico a 8% e ácido clorídrico.
3. Faça vários cortes transversais em intervalos de 3 mm. Coloque as seções em um e, em seguida, coloque o em 10% NBF até a incorporação.
   NOTA: Os porcos podem ser usados como um modelo cardíaco para os seres humanos, especialmente quando se trata de doença cardíaca coronária. Assim, amostras suplementares e cortes histológicos de artérias coronárias são recomendados 3,10,14.

5. A técnica de dissecção do coração "quatro câmaras"/"plano ecocardiográfico" ^1,17

NOTA: A técnica de dissecção de quatro câmaras consiste em um corte da base até o ápice do coração para obter a visão padrão¹. A técnica de "quatro câmaras" é melhor aplicada a tecidos fixos.

1. Coloque todo o coração em 10% NBF por pelo menos 48 h.
2. Após a fixação do coração em NBF a 10% por pelo menos 48 h (Figura 10A), coloque duas pinças de dissecção retas desdentadas, uma através do crânio-átrio direito-valva tricúspide-ventrículo direito e a segunda através da veia pulmonar-átrio esquerdo-valva mitral-ventrículo esquerdo (Figura 10B).
3. Use o espaço entre os braços da pinça como orientação para a lâmina de corte da base até o ápice do coração (Figura 10C). Fornecer uma secção longitudinal adicional com aproximadamente 5 mm, para além da secção descrita na etapa 5.2. no segmento cardíaco, que inclui a aorta.
4. Com uma incisão transversal, separe completamente a base cardíaca do ápice. Coloque cada segmento de tecido em um histológico.
   NOTA: Protocolo de bloqueio recomendado: o bloqueio histológico ápice-cardíaco 5 (a Figura 11A mostra a lâmina resultante deste bloqueio), o bloco histológico de base cardíaca 6 (a Figura 11B mostra a lâmina resultante deste bloqueio).
5. Coloque as em 10% NBF até incorporar. Fixar todas as amostras cardíacas em NBF a 10% (mais de 10 vezes o volume de tecido), processá-las rotineiramente em cera de parafina, corte a 4 μm de espessura e coloração com hematoxilina e eosina (coloração H&E) seguindo um protocolo descrito anteriormente¹⁰.
   NOTA: Se houver suspeita de miocardite, "um pedaço de tecido cardíaco fresco deve ser retido em condições estéreis com material cirúrgico estéril e recipiente de amostra estéril para estudos microbiológicos e virais"¹³.

6. Documentação fotográfica

NOTA: A documentação fotográfica é uma etapa opcional no exame de necropsia. No entanto, fotografias e gravações de vídeo são essenciais para se ter uma "documentação precisa da anatomia normal e anormal"³.

1. Para documentação fotográfica adequada, tire imagens digitais durante a realização de "dissecção progressiva de tecidos cardíacos"¹³. Consulte as orientações para documentação fotográfica e fotografia¹⁵ a vista geral-anterior e posterior; uma fatia do coração; e quaisquer lesões suspeitas.

Representative Results

Este protocolo foi utilizado para visualizar características anatômicas e coletar amostras para exame histológico do coração em quatro espécies diferentes (cão, gato, porco e vaca). O protocolo de necropsia foi repetido em cada uma das espécies acima mencionadas, mas ilustrado apenas em cães. O protocolo de necropsia inicia-se com um extenso exame externo do corpo (Figura 1A) (incluindo a pele, linfonodos exploráveis e mucosa externa), medindo o peso total e pontuando o estado geral do animal. Após o exame externo, a necropsia continua com uma esfola parcial do corpo (direcionada para examinar minuciosamente os músculos subcutâneos e superficiais) e com a abertura das cavidades corporais principais (Figura 1B-D).

A cavidade abdominal é tipicamente a primeira a ser examinada (Figura 1C), seguida de um extenso exame in situ da cavidade peritoneal e dos órgãos abdominais, seguido de secção do diafragma e, finalmente, a remoção do hemitórax direito (Figura 1D). Por esta técnica, um bom exame in situ dos órgãos toracoabdominais (incluindo a cavidade pericárdica e o coração) pode ser alcançado, permitindo simultaneamente uma avaliação adequada das ligações desses órgãos com os vasos sanguíneos locais, linfáticos, ligamentos e nervos. O exame da cavidade pericárdica é realizado por ampla secção do pericárdio parietal seguindo o eixo longitudinal do coração, seguido pela remoção do coração por secção dos grandes vasos cardíacos próximos ao parênquima pulmonar. O exame externo do coração é seguido pelo corte das cavidades cardíacas, o que permite uma inspeção extensiva e, finalmente, a colheita adequada das amostras de tecido para histopatologia. Resumidamente, são apresentados o procedimento e os resultados das duas técnicas de dissecção cardíaca, o "fluxo sanguíneo" (Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Figura 5) e as "quatro câmaras" (Figura 10).

A técnica de "fluxo sanguíneo" foi utilizada no coração de cães, suínos e ruminantes (Figura 2, Figura 4 e Figura 5). Após a retirada do coração do corpo, observou-se a configuração externa (Figura 2A, Figura 4A e Figura 5A). Ao realizar a dissecção, deve-se observar a configuração atrial, a crista terminalis, que é o elemento macroscópico de identificação para o nó sinoatrial (Figura 2B, Figura 4B e Figura 5B). Após prosseguir com as etapas do protocolo (Figura 2B-G, Figura 4B-G e Figura 5B-G), a dissecção está completa e o protocolo de colheita para a histologia pode ser iniciado (Figura 2H-J, Figura 4G-J e Figura 5H-K). Alternativamente, a crista terminalis também pode ser colhida após a fixação do coração (Figura 3) em NBF a 10%. Em comparação com os cães, há uma etapa extra a ser realizada no coração dos suínos - a colheita da artéria coronária (Figura 4K).

Após a colheita, as amostras foram fixadas em NBF a 10%, processadas rotineiramente e embutidas em cera de parafina e, finalmente, seccionadas a 4 μm e coradas por H&E. As lâminas histológicas obtidas por essa técnica geralmente incluem: 1) epicárdio, miocárdio e endocárdio do átrio e ventrículo direito, valva tricúspide e artérias coronárias para bloqueio histológico 1 (Figura 6); 2) epicárdio, miocárdio e endocárdio do átrio e ventrículo esquerdos, valva mitral, artérias coronárias e nervos cardíacos para bloqueio histológico 2 (Figura 7); 3) miocárdio, endocárdio do septo interventricular e epicárdio do átrio direito e valva tricúspide para bloqueio histológico 3 (Figura 8); 4) múltiplos cortes do nó SA para o bloqueio histológico 4 (Figura 9); 5) epicárdio, miocárdio e endocárdio do ápice do coração (ventrículos esquerdo e direito e septo interventricular) para bloqueio histológico 5 (Figura 11A); e 6) epicárdio, miocárdio e endocárdio da base do coração (átrios esquerdo e direito, ventrículos, septo interventricular, valvas atrioventriculares e artérias coronárias) para bloqueio histológico 6 (Figura 11B).

Figura 1: Técnica de necropsia em cão. (A) A colocação do sujeito no lado esquerdo; (B) abertura da cavidade abdominal; (C) abertura da cavidade torácica; (D) exame da cavidade torácica. 1-7 indicam os locais e a ordem das incisões recomendadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Dissecção e protocolo de amostragem no coração do cão. (A) Configuração externa do coração; (B) Começar pela cava caudal e aparar o átrio direito, abrir o átrio direito e observar a crista terminal; (C) aparar o ventrículo direito ao longo da junção com o septo interventricular; exibir a valva tricúspide; (D) após o corte das cordas tendíneas, examinar o ventrículo direito e continuar o corte ao longo do sulco paraconal; (E) passar a pinça pelo tronco pulmonar e utilizá-la para guiar o corte; examinar o fluxo de saída pulmonar; (F) 1 - abrir o átrio esquerdo, 2 - a partir da base, cortado até o ápice; examinar a valva mitral e o ventrículo esquerdo; (G) passar a pinça pela aorta e usá-los para guiar o corte; examinar a aorta; (H) fazer dois cortes ao longo do coração esquerdo e colocar a peça do meio em 10% de NBF; (I) fazer dois cortes ao longo do coração direito, colocar a peça do meio em 10% NBF e aparar a crista terminalis; (J) corte a base do coração, faça dois cortes ao longo da peça e coloque a peça do meio em 10% de NBF. Abreviaturas: SAN = nó sinoatrial; NBF = formalina tamponada neutra. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Amostragem da crista terminalis a partir de um coração fixado em formol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Dissecção e protocolo de amostragem no coração de porco. (A) Configuração externa do coração; (B) Começar a partir da cava caudal e seccionar o átrio direito, examinar o átrio direito, localizar a crista terminal e começar a abrir o ventrículo direito; (C) aparar o ventrículo direito ao longo da junção com o septo interventricular e examinar a valva tricúspide; (D) após o corte das cordas tendíneas, examinar o ventrículo direito, colocar o fórceps através do tronco pulmonar e usá-lo para guiar o corte; (E) examinar a saída pulmonar; após a secção do átrio esquerdo, corte o ventrículo esquerdo da base ao ápice; (F) examinar a valva mitral e o ventrículo esquerdo e cortar as cordas tendíneas; coloque pinças através da aorta e use-as para guiar o corte; (G) examinar a aorta, fazer dois cortes ao longo do coração esquerdo, colocar a peça do meio em 10% NBF; (H) fazer dois cortes ao longo do coração direito; colocar a peça do meio em 10% NBF; (I) aparar a crista terminalis, colocar a peça em 10% NBF; (J) aparar a base do coração, fazer dois cortes ao longo da peça e colocar a peça do meio em 10% NBF; (K) aparar a artéria coronária, fixá-la durante a noite e, em seguida, fazer vários cortes transversais em intervalos de 3 mm. Abreviação: NBF = formalina tamponada neutra. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Dissecção e protocolo de amostragem no coração da vaca. (A) Configuração externa do coração; (B) Começar a partir da cava caudal e seccionar o átrio direito, examinar o átrio direito, localizar a crista terminal e começar a abrir o ventrículo direito; (C) aparar o ventrículo direito ao longo da junção com o septo interventricular e examinar a valva tricúspide; (D) continuar o corte paralelo ao sulco paraconal, passar a pinça pelo tronco pulmonar e utilizá-la para guiar o corte; (E) examinar a saída pulmonar, começar a cortar as veias pulmonares e o átrio esquerdo e, em seguida, continuar a cortar o ventrículo esquerdo da base ao ápice; (F) examinar a valva mitral e o ventrículo esquerdo e cortar as cordas tendíneas; (G) passar o fórceps através da aorta, usá-los para guiar o corte e examinar a aorta; (H) aparar a crista terminalis e colocar a peça em 10% NBF; (I) fazer dois cortes ao longo do coração esquerdo e colocar a peça do meio em 10% de NBF; (J) fazer dois cortes ao longo do coração direito e colocar a peça do meio em 10% NBF; (K) corte a base do coração, faça dois cortes ao longo da peça e coloque a peça do meio em 10% NBF. Abreviação: NBF = formalina tamponada neutra. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Exame histológico do ventrículo direito, átrio direito e valva tricúspide no coração de um cão. Coloração H&E. (A) Amostra histológica do ventrículo direito, átrio direito e valva tricúspide; (B) ventrículo direito, átrio direito e valva tricúspide. Barras de escala = 500 μm; (C) ventrículo direito, átrio direito e artérias coronárias. Barras de escala = 100 μm; (D) átrio direito. Barras de escala = 500 μm. Abreviaturas: H&E = hematoxilina e eosina; VD = ventrículo direito; AR = átrio direito; Ts-V = valva tricúspide; AC = artéria coronária; EnC = endocárdio; CM = miocárdio; EpC = epicárdio. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Exame histológico do ventrículo esquerdo, átrio esquerdo e valva mitral no coração de um cão. Coloração H&E. (A) Amostra histológica do ventrículo esquerdo, átrio esquerdo e valva mitral; (B) átrio esquerdo. Barras de escala = 500 μm; (C) átrio esquerdo, ventrículo esquerdo, artéria coronária e nervo. Barras de escala = 100 μm; (D) artéria coronária, nervo. Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: H&E = hematoxilina e eosina; AE = átrio esquerdo; VE = ventrículo esquerdo; Mt-V = valva mitral; AC = artéria coronária; EnC = endocárdio; CM = miocárdio; EpC = epicárdio; NV = nervo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Exame histológico do septo interventricular, átrio direito e valva tricúspide no coração de um cão. Coloração H&E (A) Septo interventricular, átrio direito e amostra histológica valvar tricúspide; (B) septo interventricular, átrio direito e valva tricúspide. Barras de escala = 500 μm. Abreviaturas: H&E = hematoxilina e eosina; SVI = septo interventricular; AR = átrio direito; Válvula tricúspide Ts-V. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Exame histológico do nó sinoatrial no coração de um cão. Coloração H&E. (A) Amostra histológica da crista terminalis; (B) ampliação 4x do nó sinoatrial. Barras de escala = 500 μm; (C) ampliação do nó sinoatrial 20x. Barras de escala = 100 μm; (D) ampliação do nó sinoatrial 40x. Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: H&E = hematoxilina e eosina; Nó SA = nó sinoatrial. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10: Protocolo de dissecação em um coração fixado em formalina de um gato. (A) Configuração externa do coração; (B) passar a pinça através da cava craniana e veias pulmonares; a pinça guia a secção longitudinal da base ao ápice; (C) a vista de quatro câmaras após o corte. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 11: Amostras histológicas do coração de um gato. Coloração H&E. (A) Apex da amostra histológica cardíaca; (B) base da amostra histológica cardíaca. Abreviaturas: H&E = hematoxilina e eosina; VE = ventrículo esquerdo; SVI = septo interventricular; VD = ventrículo direito; AE = átrio esquerdo; VM = valva mitral; TS-V = valva tricúspide; AR = átrio direito. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Espécie	Idade	%Pm médio	(LV + S)/RV	Números de citação
Gato	Recém-nascido	0.77%	-	7
Gato	Adulto	0.33%-0.46%	2.94-4.17	8, 5, 11
Cão	Recém-nascido	0.47%-0.76%	-	8, 7
Cão	Adulto	0.70%-0.85%	2.39-5.12	8, 6, 11
Porco	Adulto	0.32%-0.48%	2.38-3.84	11
Ovelha	Adulto	0.17%-0.65%	2.63-4.54	11
Vaca	Adulto	0.30%-0.66%	2.43-4.00	11

Tabela 1: Valores de referência para a relação peso cardíaco/peso corporal normal e razão ventricular em animais. Medidas cardíacas para gato, cão, porco, ovelha e vaca. Abreviaturas: PN = peso corporal; VE = ventrículo esquerdo; S = septo interventricular; VD = ventrículo direito.

Discussion

Ao executar o protocolo atual, várias etapas críticas devem ser cuidadosamente consideradas para resultados consistentes. Em animais jovens, as medidas cardíacas são diferentes daquelas em adultos (incluindo a espessura da parede ventricular) e, geralmente, o coração representa maior proporção do peso corporal^11,12. O grau de hipertrofia ventricular pode ser quantificado pela aplicação de uma fórmula de peso geral, a razão entre o ventrículo esquerdo mais septo dividida pelo peso do ventrículo direito livre, que, em condições normais, deve ser de 2,8-4,0 em animais maduros (Tabela 1). Se essa razão for superior a 4,0, indica hipertrofia ventricular esquerda e, se for menor que 2,8, indica hipertrofia ventricular direita 4,11,12. Para obter o valor da câmara, a parede livre do ventrículo direito deve ser dissecada ao longo da parede interventricular e o sulco coronariano a ser separado do átrio direito. A dissecção do ventrículo esquerdo do átrio esquerdo é feita no anel atrioventricular⁴.

O coração é separado do corpo seccionando os grandes vasos. Se as seções dos grandes vasos estiverem muito próximas da base do coração, várias estruturas podem ser comprometidas, principalmente os átrios e as aurículas. Para facilitar o processo, é necessário puxar suavemente o coração ventralmente para seccionar adequadamente os grandes vasos acima da base do coração. Um segundo passo crítico é reconhecer a morfologia da crista terminalis, que é uma estrutura anatômica discreta que requer conhecimento estrutural detalhado do coração. O nó SA deve ser cuidadosamente colhido e incorporado com especial consideração para o arranjo das amostras de tecido dentro dos blocos durante o processo histológico.

A modificação da técnica de "quatro câmaras" foi para mudar o esquema de bloqueio histológico de um bloco para dois. As dimensões padrão das histológicas amplamente utilizadas e o procedimento histológico adaptado (incluindo a estação de coloração de micrótomos rotativos) não são adequados para encaixar toda a seção do coração em um bloco sem distorção tecidual. Embora a técnica de "quatro câmaras" facilite o exame da estrutura das câmaras cardíacas, ela limita o exame do sistema condutivo. Isto é especialmente importante nos casos em que a arritmia cardíaca é documentada. Além disso, considerando que a técnica de "quatro câmaras" requer tecido fixado em NBF, vários exames adicionais, como bacteriologia e biologia molecular, podem ser comprometidos até certo ponto.

Quando se trata do coração de um gato ou de um cão de pequeno porte, um plano ecocardiográfico padrão preciso é obtido no tecido fixo. A visão de quatro câmaras é útil, especialmente para as dimensões da câmara, se houver variações nos tamanhos ventriculares ou atriais¹. Além das vantagens relacionadas à perfeita superposição do corte grosseiro aplainado com as obtidas durante o exame clínico por ecocardiografia, essa técnica apresenta a vantagem de incluir a maioria dos principais componentes do coração em apenas dois blocos histológicos.

O método de "entrada-saída" descrito em suínos foi adaptado a partir de protocolos utilizados no coração de seres humanos, adicionando a etapa de amostragem da artéria coronária. Os protocolos de dissecção cardíaca atualmente descritos ilustram pontos padrão para amostragem. Além disso, quando a dissecção observar ou suspeitar de outras lesões além daquelas cobertas pelo protocolo, amostras suplementares devem ser coletadas nas áreas de interesse.

Durante o desenvolvimento dos protocolos atuais, outros métodos foram estudados, como o método que envolve um corte longitudinal inicial das principais curvas cardíacas 12 e a técnica "pão de pão"/eixo curto ^9,11. A técnica que envolve um corte longitudinal das principais curvas cardíacas é um protocolo mais simples e frequentemente utilizado na educação biomédica¹². A técnica de seccionamento de eixo curto ("técnica do pão de pão") pode ser realizada com uma seção de eixo curto¹¹ ou uma série de cortes de 1-2 cm de espessura do ápice em direção à base, deixando o aparelho atrioventricular intacto⁹. Essa técnica é a mais indicada se o dissector suspeitar de patologias miocárdicas (incluindo patologias inflamatórias e cardiomiopatias), mas tem a desvantagem de um exame superficial dos componentes valvares⁹.

Ambas as técnicas são facilmente dominadas por indivíduos com um conhecimento relativamente básico da anatomia cardíaca, mas carecem de pontos robustos para amostragem histológica e ponderação de cada componente cardíaco. Após o prosseguimento desses métodos, o procedimento de colheita subsequente envolve um trabalho árduo para identificar as áreas de interesse e obter amostras constantes. Nos corações dissecados usando esses métodos, a pesagem separada das duas metades requer esforço para poder calcular a proporção entre elas. O método de eixo curto precisa de etapas adicionais para o exame do endocárdio e de todos os componentes localizados na base do coração. Além disso, o procedimento de colheita seguindo esses métodos consiste em um trabalho trabalhoso para identificar as áreas de interesse e obter amostras constantes.

Este manuscrito apresenta os elementos-chave de alguns protocolos padrão de dissecção cardíaca, destacando tanto as abordagens de exame macroscópica quanto os locais de amostragem comumente utilizados para o exame histopatológico. Em relação às futuras aplicações da técnica, o principal objetivo do protocolo apresentado é oferecer uma diretriz robusta para a dissecção cardíaca que possa ser prontamente utilizada em todos os estudos experimentais que requerem uma avaliação cardíaca detalhada.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline solution	B. BRAUN MELSUNGEN AG	W04479004	For washing all the blood, and blood clots from the heart.
10% neutral buffered formalin (NBF)	Q Path	11699404	Materials for collecting histopathology samples.
Bone cutting forceps	HELEN SRL	LS109HV	Sturdy instrument for cutting bone.
Cutting board	Ambition	86304	For an easier manipulation, and cutting the organs.
Decalcifying solution	Thermo Scientific TBD-2	6764004	1:1 mixture of 8% formic acid and hydrochloric acid.
Digital camera	Canon Inc.	PowerShot SX540 HS	For photographic, and videographic documentation.
Forceps	MKD-Medicale	15-430	Dissection instruments.
Histological cassettes	Q Path	720-2215	Materials for collecting histopathology samples. Dimensions: 3 × 2.5 × 0.4 cm
Knife	TEHNO FOOD COM SERV SRL	D2006/15	Sharp blade for cutting soft tissue.
Latex gloves	MKD-Medicale	SANTEX-S	Protection equipment.
Mask	MKD-Medicale	21221	Protection equipment.
Petri dishes	MKD-Medicale	0598-1V	Materials for collecting ancillary testing samples.
Plastic recipients	Corning Gosselin	TP200-02	Materials for collecting histopathology samples.
Scale	ESPERANZA	MEEKS008	For weighing the organs.
Scale	White Deals	72	For weighing the subjects.
Scalpel	MKD-Medicale	10322E	Sharp blade for cutting soft tissue.
Scissors	MKD-Medicale	13-260	Dissection instruments.
Scrub	MKD-Medicale	410100-52	Protection equipment.
Syringes	MKD-Medicale	10573EU	Materials for collecting ancillary testing samples.