Dissektionstekniker och histologisk provtagning av hjärtat i stora djurmodeller för hjärt-kärlsjukdomar

Summary

På grund av den komplexa anatomin kan ett konsekvent reproducerbart dissektions- och skördeprotokoll för hjärtprover vara utmanande att implementera. Detta manuskript presenterar nyckelelementen i vissa vanliga hjärtdissektionsprotokoll och belyser både de grova undersökningsmetoderna och de provtagningsställen som vanligtvis används för histopatologisk undersökning.

Abstract

Den vanliga bruttoundersökningen och provtagningen är nyckelelement i reproducerbarheten och framgången för experimentella studier av hjärt-kärlsjukdomar som utförs på stora djur. Med tanke på hjärtans komplexa anatomi, skillnader mellan arter och typerna av kompensatoriska och patologiska reaktioner är konsekventa protokoll utmanande att genomföra. Användningen av flera dissektionsprotokoll är vanligtvis anpassad för att passa prosektorns erfarenhet, och personliga preferenser fortsätter att vara en källa till experimentell och interobservervariation. Här är målet att presentera de viktigaste anatomiska egenskaperna och landmärkena, dissektionsprotokoll och histologiska provtagningsstandarder för hjärtat hos vissa vanliga arter (inklusive hundar, grisar, idisslare och katter) som modeller av hjärt-kärlsjukdomar.

Två vanliga bruttoundersökningsprotokoll presenteras här. För det första inflöde-utflödesmetoden, som följer den fysiologiska blodflödesriktningen genom hjärtat och stora kärl (används ofta hos hundar, idisslare och grisar), och för det andra fyrkammardissektionstekniken (exemplifierad hos katter). Båda teknikerna kan anpassas till alla arter under vissa experimentella omständigheter. Provtagningsprotokollen inkluderar alla intresseområden (sinoatriell nod, ventriklar, interventrikulär septum, förmak, ventiler och aorta), och om de utförs korrekt, förbättra både reproducerbarheten och tillförlitligheten hos experimentella studier.

Introduction

På grund av den komplexa anatomin och den tidiga noggrannheten, som kan störa bedömningen av hjärtväggtjockleken, är den grova undersökningen av hjärtat utmanande och benägen för flera teknikrelaterade eller tolkningsfel. Detta förstärks av de interspecifika morfologiska variationerna och av det faktum att många kliniska, stora hjärtpatologier (inklusive tidiga fall av kranskärlssjukdomar, fibros, arterit och amyloidos) inte är förknippade med några grova förändringar, som i huvudsak är histologiska patologier. Ett standardiserat dissektions- och histologiskt provskördsprotokoll kan ge konsekvens mellan observatörer och samtidigt jämförbarhet och reproducerbarhet av experimentella studier av hjärt-kärlsjukdomar.

Proverna samlades in från två hundar (Canis lupus familiaris) (en 3-årig, manlig fransk bulldogg och en 8-årig, kvinnlig blandras), en katt (Felis catus) (en 6-årig, manlig europeisk korthår), en tamgris (Sus scrofa domesticus) (en 1-årig, manlig stor vit) och en ko (Bos taurus) (en 2 månader gammal, kvinnlig Holstein). Var och en av de valda arterna har särskild användning som en kardiovaskulär modell för en annan sjukdom; Till exempel är hundar en föredragen modell för arytmimodellering; katter föredras för hypertrofisk kardiomyopati (HCM), eftersom det är den art som har den högsta förekomsten av HCM; grisar används som modell för akut hjärtinfarkt; och idisslare används som modell för berusning på grund av deras exponering för toxiner som lätt kan hittas på ängar¹¹.

I detta manuskript presenteras ett obduktionsprotokoll och två dissektionsprotokoll i hjärtat, utformade för att förbättra den grova och histologiska undersökningen av hjärtat i experimentella hjärt-kärlsjukdomar. De beskrivna protokollen utvecklades baserat på information från veterinärhandböcker 1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12, tidskriftslitteratur 3,13,14^, officiella dokument 15 och webbseminarier ^{16 ,17}. Proverna som användes i denna studie skördades från kadaver som skickades till patologiavdelningen vid USAMV Cluj-Napoca för rutinmässig obduktionsdiagnostik.

Protocol

Det experimentella protokollet fick bioetiskt avtal (nr 311 från 2022) och godkändes av bioetikkommittén vid University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca, i enlighet med både nationell (lag nr 43 från 2014) och europeisk (EU-direktiv nr 63 från 2010) lagstiftning. Se materialförteckningen för mer information om alla material och instrument som används i detta protokoll.

1. Obduktionsprotokoll

OBS: Det rekommenderas att samma obduktionsprotokoll används för alla arter som presenteras på grund av lättare åtkomst det är när det utförs ^2,12. Följande steg representerar obduktionen som utförs i en medelstor hund. Anpassa stegen när du utför obduktioner på olika ämnen.

1. Väg motivet och placera det på obduktionsbordet på vänster sida (figur 1A). Fortsätt till den externa undersökningen av ämnet (genom att inspektera och palpation av cutis och slemhinnor, notera alla förändringar i färg, konsistens och volym).
2. Använd en kniv (eller en skalpell) och gör ett snitt på 7 cm i höger axilla (figur 1A).
3. Leta reda på coxofemoralkorsningen (figur 1A,B). Öppna kapseln med en kniv. Klipp ligamentet på lårbenets huvud (figur 1B).
4. Använd kniven för att förlänga hudsnittet i axillakranialen till mandibulär symfys och kaudalt till perineum (figur 1B).
5. Ta bort huden med skalpellen och exponera bröstkorgs- och bukväggen från den ventrala mittlinjen till nivån på de vertebrala tvärgående processerna (figur 1B).
6. Med skalpellen och pincetten skapar du en flik genom bukväggen, ventrocaudal till höger costal arch. Öppna bukhålan med sax - följ den kaudala aspekten av rätt hypokondrium (figur 1B).
7. Förläng snittet kaudalt längs det högra paralumbarområdet tills den yttre iliac crest. Förläng sedan snittet tills blygdläpparna av linea alba.
8. Undersök kortfattat bukorganen in situ (genom att notera eventuella förändringar i färg, konsistens, volym och position hos organen).
9. Med skalpellen och pincetten punkterar du membranet vid den högsta punkten (figur 1B).
10. Gå in i brösthålan genom att ta bort den högra bröstkorgen med två längsgående sektioner med benskärande pincett. Avsnitt det parasternala brosksegmentet av revbenen. Därefter sektion av dorsala segmentet av revbenen, proximalt till costovertebral lederna (Figur 1C).
11. Undersök hjärtat på plats (figur 1C). Lägg märke till storlek, position, färg, anslutningar med de intilliggande vävnaderna och genom palpation, eventuella förändringar i konsistensen⁹.
    OBS: Om en trombos eller medfödd hjärtsjukdom är närvarande måste hjärtat dissekeras på plats (detta tillvägagångssätt möjliggör fullständig undersökning av de stora kärlen).
12. Använd sax för att undersöka och öppna perikardhålan med en längsgående sektion från basen till hjärtets topp. Undersök perikardhålan och epikardiet (notera eventuella förändringar i färg, konsistens och volym)¹².
13. Släpp hjärtat med sax, vilket ger tvärgående delar av aortan, lungstammen och både vena cavae. Sektion den överlägsna vena cava minst 1 cm ovanför ingången till höger atrium för att bevara crista terminalis^11,13.
14. Undersök organets yttre kontur, epikardiets utseende, myokardiets utseende genom epikardiets genomskinlighet och de stora kärlens yttre utseende (Figur 2A).
    OBS: I allmänhet uppvisar öppningen och undersökningen av perikardiet vissa skillnader mellan arterna. Undersökningen av perikardhålan börjar med en extern inspektion och bedömning genom genomskinlighet i perikardiet av det totala perikardiella innehållet ^1,2. Hos en katt eller hund innehåller hjärtsäcken vanligtvis cirka 0,25 ml/kg tunn, klar, genomskinlig till ljusgul vätska⁹. Om det finns några patologiska effusioner, bör de samlas in med en steril spruta eller vacutainerrör.

2. Dissektionsprotokoll

OBS: Flera obduktionstekniker används för hjärtat, var och en med flera fördelar. För detta protokoll valdes två av de mest använda teknikerna: 1) "inflödesmetoden", som möjliggör en bättre undersökning av ventilerna och endokardiet och är ett protokoll som används för de flesta av arterna 2,11,12,16, och²) "fyra kamrar dissektion"/"ekokardiografiskt plan" -teknik, som vanligtvis används för katter eller små hundar^{1, 17}.

1. "Inflödes-utflödesmetoden" för hjärtdissektion 2,11,12,16
   1. Placera hjärtat med förmaksansiktet uppåt (figur 2A).
   2. Använd sax och tandlös tång för att i stort sett skära från den kaudala vena cava längs in i det högra förmaket (figur 2B). Fortsätt klippningen till höger aurikulärt bihang för att exponera crista terminalis/sinoatrial nod (SA-nod). Inspektera tricuspidventilen från dorsalvyn.
   3. Skär en sektion från det högra atriumet till korsningen mellan höger kammare och interventrikulär septum (figur 2C). Visa den högra atrioventrikulära ventilen.
   4. Sektion den högra ventrikelfria väggen längs interventrikulär septum. Fortsätt sektionen tills lungstammens ursprung (figur 2C,D).
   5. Undersök noggrant de högra atrioventrikulära ventilerna, inklusive chordae tendineea och papillärmusklerna (figur 2D). Skär chordae tendineae.
   6. Placera pincett genom lungstammen och skär stammen i längdriktningen (figur 2E). Undersök lungutflödeskanalen, lungstammens ursprung och semilunarventiler.
   7. Skär det vänstra atriumet från lungvenerna till spetsen av vänster aurikel (figur 2F). Inspektera bicuspid (mitral) ventilen från dorsalvyn.
   8. Placera hjärtat med interventrikulär septum nedåt (figur 2F). Gör ett stort snitt i den ventrikulära fria väggen från ventrikelns botten till hjärttoppen. Visa den vänstra atrioventrikulära ventilen helt.
   9. Skär chordae tendineae i cusp på den vänstra atrioventrikulära ventilen.
   10. Placera pincett genom det vänstra ventrikulära utflödeskanalen och använd det som vägledning för att öppna aortan (figur 2G).
   11. Använd saltlösning för att ta bort alla blodproppar. När alla blodproppar har tagits bort, bedöma och jämför hjärtvikten mot kroppsmassan eller standardtabellerna för hjärtvikt (tabell 1)^11,13.
   12. Väg hjärtat.
   13. Om bara SA-noden är intressepunkten, efter den vänstra ventrikelundersökningen, placera hela hjärtat helt i 10% neutralbuffrat formalin (NBF) i 24 timmar och trimma det högra atriumet för att prova crista terminalis.
       OBS: Med denna teknik kan vänster och höger kammare lätt uppskattas. Förhållandet mellan vänster och höger ventrikulär väggtjocklek är 3: 1, med små skillnader efter art och ras; För djurfostrets hjärta är förhållandet 1:1¹².

3. Provtagningsprotokoll för histologi¹⁶

1. Med en skalpell, gör två längsgående, parallella snitt (cirka 5 mm från varandra) som involverar höger atrium, tricuspidventilen och den högra ventrikulära fria väggen (figur 2I)
2. Gör två längsgående parallella snitt (med cirka 5 mm mellanrum) som involverar vänster förmak, mitralventil, dorsal papillärmuskel och vänster kammare (figur 2H).
3. Inom den dorsala övre tredjedelen av hjärtat, tvärgående sektion av hjärtats bas efter en linje, inklusive interventrikulär septum, höger atrium, aorta, aortaklaffen och tricuspidventilen (figur 2J).
4. Gör två längsgående parallella skärningar som involverar basen av aortan och interventrikulär septum (figur 2J).
5. Trimma det högra atriumet runt crista terminalis och ge flera parallella sektioner orienterade tvärgående på cristas längdaxel (ungefär 3-4 mm från varandra) för att få sex delar av SA-noden (figur 3, figur 4I och figur 5H).
6. Trimma de erhållna vävnaderna i histologiska kassetter.
   OBS: Rekommenderat blockeringsprotokoll: steg 3.1.-histologiskt block 1 (figur 6 visar den resulterande bilden från detta block.), steg 3.2.-histologiskt block 2 (figur 7 visar den resulterande bilden från detta block), steg 3.4.-histologiskt block 3 (figur 8 visar den resulterande bilden från detta block), steg 3.5.-histologiskt block 4 (figur 9 visar den resulterande bilden från detta block).
7. Sänk ner vävnaderna i 10% NBF i minst 48 timmar.

4. Provtagning av kranskärl 3,10,14

1. Använd pincett och en skalpell för att dissekera kranskärlen från hjärtparakonalspåret (figur 4K). Fixa kranskärlen över natten i 10% NBF.
2. Om det behövs, avkalka tillräckligt i en 1:1-blandning av 8% myrsyra och saltsyra.
3. Gör flera tvärgående snitt med 3 mm mellanrum. Placera sektionerna i en kassett och lägg sedan kassetten i 10% NBF tills den är inbäddad.
   OBS: Grisar kan användas som en hjärtmodell för människor, särskilt när det gäller kranskärlssjukdom. Därför rekommenderas kompletterande prover och histologiska sektioner av kranskärl 3,10,14.

5. Dissektionstekniken "fyra kamrar"/"ekokardiografiskt plan" i hjärtat ^1,17

OBS: Fyrkammardissektionstekniken består av ett snitt från basen till hjärtats topp för att få standardvy¹. Tekniken "fyra kammare" tillämpas bäst på fasta vävnader.

1. Placera hela hjärtat i 10% NBF i minst 48 timmar.
2. När hjärtat har fixerats i 10% NBF i minst 48 timmar (figur 10A), placera två tandlösa raka dissektionstångar, en genom kranial cava-höger atrium-tricuspidventil-höger kammare och den andra genom lungvenen-vänster atrium-mitralventil-vänster kammare (figur 10B).
3. Använd utrymmet mellan tångarmarna som vägledning för skärbladet från basen till hjärtats topp (figur 10C). Ange en ytterligare längsgående sektion med ungefär 5 mm mellanrum från den sektion som beskrivs i steg 5.2. på hjärtsegmentet, som inkluderar aorta.
4. Med ett tvärgående snitt, separera helt hjärtbasen från toppen. Placera varje vävnadssegment i en histologisk kassett.
   OBS: Rekommenderat blockeringsprotokoll: hjärt-apex-histologiska block 5 (figur 11A visar den resulterande bilden från detta block), hjärtbas-histologiska block 6 (figur 11B visar den resulterande bilden från detta block).
5. Placera kassetterna i 10% NBF tills de bäddas in. Fixa alla hjärtprover i 10% NBF (mer än 10 gånger volymen vävnad), bearbeta dem rutinmässigt i paraffinvax, sektion vid 4 μm tjocklek och fläck med hematoxylin och eosinfläck (H&E-fläck) enligt ett tidigare beskrivet protokoll¹⁰.
   OBS: Om myokardit misstänks bör "en bit färsk hjärtvävnad behållas under sterila förhållanden med sterilt kirurgiskt material och steril provbehållare för mikrobiologiska och virala studier"¹³.

6. Fotografisk dokumentation

OBS: Fotografisk dokumentation är ett valfritt steg i obduktionsundersökningen. Fotografering och videoinspelningar är dock viktiga för att ha en "korrekt dokumentation av normal och onormal anatomi"³.

1. För korrekt fotografisk dokumentation, ta digitala bilder medan du utför "progressiv dissektion av hjärtvävnader"¹³. Se riktlinjerna för fotografisk dokumentation och fotografi¹⁵ den allmänna utsikten - främre och bakre; en bit av hjärtat; och eventuella misstänkta skador.

Representative Results

Detta protokoll användes för att visualisera anatomiska egenskaper och samla prover för histologisk undersökning av hjärtat i fyra olika arter (hund, katt, gris och ko). Obduktionsprotokollet upprepades hos var och en av de ovan nämnda arterna men illustrerades endast hos hundar. Obduktionsprotokollet börjar med en omfattande extern undersökning av kroppen (figur 1A) (inklusive huden, utforskningsbara lymfkörtlar och yttre slemhinna), mätning av den totala vikten och poängsättning av djurets allmänna tillstånd. Efter den externa undersökningen fortsätter obduktionen med en partiell skinnning av kroppen (riktad för att noggrant undersöka subcutis och ytliga muskler) och med öppningen av huvudkroppens håligheter (Figur 1B-D).

Bukhålan är vanligtvis den första som undersöks (figur 1C), följt av en omfattande in situ-undersökning av bukhålan och bukorganen, följt av sektionering av membranet och slutligen avlägsnande av höger hemithorax (figur 1D). Med denna teknik kan en bra in situ-undersökning av thoracoab-organen (inklusive perikardhålan och hjärtat) uppnås, samtidigt som man möjliggör en korrekt bedömning av länkarna mellan dessa organ och de lokala blodkärlen, lymfatiken, ligamenten och nerverna. Undersökningen av perikardhålan uppnås genom bred sektionering av parietal perikardium efter hjärtans längdaxel, följt av avlägsnande av hjärtat genom att sektionera hjärtats stora kärl nära lungparenkymen. Den externa undersökningen av hjärtat följs av sektionering av hjärtkaviteterna, vilket möjliggör en omfattande inspektion och slutligen korrekt skörd av vävnadsproverna för histopatologi. Kortfattat presenteras proceduren och resultaten av de två hjärtdissektionsteknikerna, "blodflödet" (figur 2, figur 3, figur 4 och figur 5) och "fyra kamrar" (figur 10).

Tekniken "blodflöde" användes i hjärtat av hundar, svin och idisslare (figur 2, figur 4 och figur 5). Efter att hjärtat avlägsnats från kroppen observerades den externa konfigurationen (figur 2A, figur 4A och figur 5A). När man utför dissektion bör man märka förmakskonfigurationen, crista terminalis, som är det makroskopiska identifieringselementet för den sinoatriella noden (figur 2B, figur 4B och figur 5B). Efter att ha fortsatt med stegen i protokollet (figur 2B-G, figur 4B-G och figur 5B-G) är dissektion fullständig och skördeprotokollet för histologin kan påbörjas (figur 2H-J, figur 4G-J och figur 5H-K). Alternativt kan crista terminalis också skördas efter att hjärtat är fixerat (figur 3) i 10% NBF. Jämfört med hundar finns det ett extra steg som ska utföras i hjärtat av svinen - skörden av kranskärlen (Figur 4K).

Efter skörden fixerades proverna i 10% NBF, bearbetades rutinmässigt och bäddades in i paraffinvax och slutligen sektionerades vid 4 μm och färgades av H&E. De histologiska objektbilderna erhållna med denna teknik innefattar vanligtvis följande: 1) epikardiet, myokardiet och endokardiet i höger förmak och ventrikel, tricuspidventilen och kranskärlen för histologiskt block 1 (Figur 6); 2) epikardium, myokardium och endokardium i vänster förmak och ventrikel, mitralventilen, kranskärlen och hjärtnerverna för histologiskt block 2 (Figur 7); 3) myokardiet, endokardiet i interventrikulär septum och epikardium i det högra atriumet och tricuspidventilen för histologiskt block 3 (figur 8); 4) flera sektioner från SA-noden för histologisk block 4 (figur 9); 5) epikardium, myokardium och endokardium i hjärtets topp (vänster och höger kammare och interventrikulär septum) för histologiskt block 5 (Figur 11A); och 6) epikardiet, myokardiet och endokardiet i hjärtats bas (vänster och höger förmak, ventriklar, interventrikulär septum, atrioventrikulära ventiler och kranskärl) för histologisk block 6 (Figur 11B).

Figur 1: Obduktionsteknik hos en hund. (A) Ämnets placering på vänster sida. B) Öppning av bukhålan. C) Öppning av brösthålan. D) Undersökning av brösthålan. 1-7 anger platser och ordning för de rekommenderade snitten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Dissektions- och provtagningsprotokoll i hundens hjärta. (A) Extern konfiguration av hjärtat; (B) Börja från den kaudala cava och trimma det högra atriumet, öppna det högra atriumet och observera crista terminalis; (C) trimma höger kammare längs korsningen med interventrikulär septum; visa tricuspidventilen; D) Efter att ha skurit chordae tendinae, undersök höger kammare och fortsätt snittet längs parakonalspåret. E) föra tången genom lungstammen och använda dem för att styra snittet, undersöka lungutflödet; F) 1-öppna det vänstra förmaket, 2-från basen, skuren till toppen; undersöka mitralventilen och vänster ventrikel; (G) föra tången genom aortan och använda dem för att styra snittet, undersöka aortan; (H) gör två snitt längs vänster hjärta och placera mittstycket i 10% NBF; (I) gör två snitt längs höger hjärta, placera mittstycket i 10% NBF och trimma bort crista terminalis; (J) klipp bort hjärtats bas, gör två snitt längs biten och placera mittstycket i 10% NBF. Förkortningar: SAN = sinoatrial nod; NBF = neutralt buffrat formalin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Provtagning av crista terminalis från ett formalinfixerat hjärta. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: Dissektions- och provtagningsprotokoll i grisens hjärta. (A) Extern konfiguration av hjärtat; (B) Börja från den kaudala cava och sektion av det högra atriumet, undersök det högra atriumet, lokalisera crista terminalis och börja öppna höger kammare; (C) trimma höger kammare längs korsningen med interventrikulär septum och undersöka tricuspidventilen; (D) Efter att ha klippt chordae tendinae, undersök höger kammare, placera tången genom lungstammen och använd dem för att styra snittet. E) undersöka lungutflödet, efter sektionering av vänster atrium, skär vänster ventrikel från bas till topp; F) undersöka mitralventilen och vänster kammare och skära chordae tendineae; placera pincett genom aortan och använd dem för att styra snittet; (G) undersöka aortan, göra två snitt längs vänster hjärta, placera mittstycket i 10% NBF; (H) gör två snitt längs höger hjärta; placera mittstycket i 10% NBF; (I) trimma bort crista terminalis, placera biten i 10% NBF; (J) trimma bort hjärtats bas, gör två snitt längs biten och placera mittstycket i 10% NBF; (K) trimma kranskärlen, fixa den över natten och gör sedan flera tvärgående snitt med 3 mm mellanrum. Förkortning: NBF = neutralt buffrat formalin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: Dissektions- och provtagningsprotokoll i kohjärta. (A) Extern konfiguration av hjärtat; (B) Börja från den kaudala cava och sektion av det högra atriumet, undersök det högra atriumet, lokalisera crista terminalis och börja öppna höger kammare; (C) trimma höger kammare längs korsningen med interventrikulär septum och undersöka tricuspidventilen; (D) fortsätt snittet parallellt med det parakonala spåret, passera pincetten genom lungstammen och använd dem för att styra snittet; (E) undersöka lungutflödet, börja skära lungvenerna och det vänstra förmaket och fortsätt sedan att skära vänster kammare från bas till topp; F) undersöka mitralventilen och vänster kammare och skära chordae tendineae; (G) passera tången genom aortan, använd dem för att styra snittet och undersöka aortan; (H) trimma bort crista terminalis och placera biten i 10% NBF; (I) gör två snitt längs vänster hjärta och placera mittstycket i 10% NBF; (J) gör två snitt längs höger hjärta och placera mittstycket i 10% NBF; (K) klipp bort hjärtats bas, gör två snitt längs biten och placera mittstycket i 10% NBF. Förkortning: NBF = neutralt buffrat formalin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6: Histologisk undersökning av höger kammare, höger atrium och tricuspidventil i hjärtat av en hund. H&E-färgning. (A) Histologiskt prov av höger kammare, höger förmak och tricuspidventil; (B) höger kammare, höger förmak och tricuspidventil. Skalstänger = 500 μm; (C) höger kammare, höger förmak och kranskärl. Skalstänger = 100 μm; (D) höger atrium. Skalstänger = 500 μm. Förkortningar: H&E = hematoxylin och eosin; RV = höger kammare; RA = höger atrium; Ts-V = tricuspidventil; CA = kranskärl; EnC = endokardium; MC = myokardium; EpC = epikardium. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7: Histologisk undersökning av vänster kammare, vänster atrium och mitralventil i hjärtat av en hund. H&E-färgning. (A) Histologiskt prov av vänster kammare, vänster förmak och mitralventil; (B) vänster atrium. Skalstänger = 500 μm; (C) vänster förmak, vänster kammare, kranskärl och nerv. Skalstänger = 100 μm; (D) kranskärl, nerv. Skalstänger = 50 μm. Förkortningar: H&E = hematoxylin och eosin; LA = vänster atrium; LV = vänster kammare; Mt-V = mitralventil; CA = kranskärl; EnC = endokardium; MC = myokardium; EpC = epikardium; NV = nerv. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8: Histologisk undersökning av interventrikulär septum, höger atrium och tricuspidventil i hjärtat av en hund. H&E-färgning (A) Interventrikulär septum, höger förmak och tricuspidventil-histologiskt prov; (B) interventrikulär septum, höger förmak och tricuspidventil. Skalstänger = 500 μm. Förkortningar: H&E = hematoxylin och eosin; IVS = interventrikulär septum; RA = höger atrium; Ts-V tricuspidventil. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 9: Histologisk undersökning av den sinoatriella noden i hjärtat av en hund. H&E-färgning. A) Histologiskt prov av crista terminalis. (B) sinoatrial nod 4x förstoring. Skalstänger = 500 μm; (C) sinoatrial nod 20x förstoring. Skalstänger = 100 μm; (D) sinoatrial nod 40x förstoring. Skalstänger = 50 μm. Förkortningar: H&E = hematoxylin och eosin; SA-nod = sinoatrial nod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 10: Dissektionsprotokoll på ett formalinfixerat hjärta hos en katt. (A) Extern konfiguration av hjärtat; B) föra tången genom kranial cava och lungvener, pincettarna styr den längsgående sektionen från bas till topp; C) Fyrkammarvyn efter snittet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 11: Histologiska prover av hjärtat av en katt. H&E-färgning. A) Toppen av det hjärthistologiska provet. B) basen för det hjärthistologiska provet. Förkortningar: H&E = hematoxylin och eosin; LV = vänster kammare; IVS = interventrikulär septum; RV = höger kammare; LA = vänster atrium; MV = mitralventil; TS-V = tricuspidventil; RA = höger atrium. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Art	Ålder	Medelvärde %BW	(LV + S)/Husbil	Källhänvisningar
Katt	Nyfödd	0.77%	-	7
Katt	Vuxen	0.33%-0.46%	2.94-4.17	8, 5, 11
Hund	Nyfödd	0.47%-0.76%	-	8, 7
Hund	Vuxen	0.70%-0.85%	2.39-5.12	8, 6, 11
Gris	Vuxen	0.32%-0.48%	2.38-3.84	11
Får	Vuxen	0.17%-0.65%	2.63-4.54	11
Ko	Vuxen	0.30%-0.66%	2.43-4.00	11

Tabell 1: Referensvärden för förhållandet mellan normal hjärtvikt/kroppsvikt och ventrikelförhållandet hos djur. Hjärtmätningar för katt, hund, gris, får och ko. Förkortningar: BW = kroppsvikt; LV = vänster kammare; S = interventrikulär septum; RV = höger kammare.

Discussion

När du utför det aktuella protokollet bör flera kritiska steg noggrant övervägas för konsekventa resultat. Hos unga djur skiljer sig hjärtmätningarna från de hos vuxna (inklusive ventrikulär väggtjocklek), och i allmänhet representerar hjärtat en större andel kroppsvikt^11,12. Graden av ventrikulär hypertrofi kan kvantifieras genom att tillämpa en allmän viktformel, förhållandet mellan vänster ventrikel plus septum dividerat med den fria högra ventrikelvikten, som under normala förhållanden bör vara 2,8-4,0 hos mogna djur (tabell 1). Om detta förhållande överstiger 4,0 indikerar det vänster ventrikulär hypertrofi, och om det är mindre än 2,8 indikerar det höger ventrikulär hypertrofi 4,11,12. För att erhålla kammarens värde måste den högra ventrikulära fria väggen dissekeras längs interventrikulärväggen och koronarspåret som ska separeras från det högra atriumet. Dissektion av vänster ventrikel från vänster atrium görs vid den atrioventrikulära^{ringen 4}.

Hjärtat separeras från kroppen genom att sektionera de stora kärlen. Om sektionerna av de stora kärlen är för nära hjärtbasen kan flera strukturer äventyras, främst förmaken och auriklarna. För att underlätta processen är det nödvändigt att försiktigt dra hjärtat ventralt för att ordentligt dela de stora kärlen ovanför hjärtans botten. Ett andra kritiskt steg är att erkänna morfologin hos crista terminalis, som är en diskret anatomisk struktur som kräver detaljerad strukturell kunskap om hjärtat. SA-noden måste skördas noggrant och bäddas in med särskild hänsyn till arrangemanget av vävnadsproverna i blocken under den histologiska processen.

Modifieringen av "fyrkammare" -tekniken var att ändra det histologiska blockeringsschemat från ett block till två. Standarddimensionerna för allmänt använda histologiska kassetter och det anpassade histologiska förfarandet (inklusive den roterande mikrotomfärgningsstationen) är inte lämpliga för att passa hela delen av hjärtat i ett block utan vävnadsförvrängning. Även om "fyrkammartekniken" underlättar undersökningen av hjärtkamrarnas struktur, begränsar den undersökningen av det ledande systemet. Detta är särskilt viktigt i fall då hjärtarytmi är dokumenterad. Vidare, med tanke på att "fyrkammare" -tekniken kräver vävnad fixerad i NBF, kan flera ytterligare undersökningar som bakteriologi och molekylärbiologi äventyras till en viss grad.

När det gäller hjärtat av en katt eller en liten hund erhålls en exakt standard ekokardiografisk plan på fast vävnad. Fyrkammarvyn är till hjälp, särskilt för kammardimensioner, om det finns variationer i ventrikulära eller förmaksstorlekar¹. Förutom fördelarna relaterade till den perfekta superpositionen av bruttotrimningen hyvlad med de som erhållits under klinisk undersökning genom ekokardiografi, presenterar denna teknik fördelen att inkludera de flesta av hjärtans nyckelkomponenter i endast två histologiska block.

Metoden "inflöde-utflöde" som beskrivs hos grisar anpassades från protokoll som används i människors hjärtan genom att lägga till kranskärlsprovtagningssteget. De för närvarande beskrivna hjärtdissektionsprotokollen illustrerar standardpunkter för provtagning. När dissektorn observerar eller misstänker andra skador än de som omfattas av protokollet bör dessutom kompletterande prover samlas in från intresseområdena.

Under utvecklingen av de nuvarande protokollen studerades andra metoder, såsom metoden som innebär en initial längsgående skärning av de stora hjärtkurvorna¹² och "brödlimpa"/kortaxeltekniken ^9,11. Tekniken som innebär en längsgående skärning av de stora hjärtkurvorna är ett enklare protokoll som ofta används i biomedicinsk utbildning¹². Den kortaxliga sektionstekniken ("brödbrödsteknik") kan utföras med en kortaxelsektion¹¹ eller en serie sektioner med 1-2 cm tjocklek från toppen mot basen och lämnar den atrioventrikulära apparaten intakt⁹. Denna teknik är den mest lämpliga om dissektorn misstänker myokardiella patologier (inklusive inflammatoriska patologier och kardiomyopatier) men har nackdelen med en ytlig undersökning av de valvulära komponenterna⁹.

Båda dessa tekniker behärskas lätt av individer med en relativt grundläggande kunskap om hjärtats anatomi men saknar robusta punkter för histologisk provtagning och viktning av varje hjärtkomponent. Efter att ha fortsatt med dessa metoder innebär det efterföljande skördeförfarandet mödosamt arbete för att identifiera intresseområdena och erhålla konstanta prover. På hjärtan dissekerade med hjälp av dessa metoder kräver den separata vägningen av de två halvorna ansträngning för att kunna beräkna förhållandet mellan dem. Den kortaxliga metoden behöver ytterligare steg för undersökning av endokardiet och alla komponenter som ligger vid hjärtans botten. Dessutom består skördeförfarandet enligt dessa metoder av mödosamt arbete för att identifiera intresseområdena och erhålla konstanta prover.

Detta manuskript presenterar nyckelelementen i vissa vanliga hjärtdissektionsprotokoll och belyser både de grova undersökningsmetoderna och de provtagningsställen som vanligtvis används för histopatologisk undersökning. När det gäller de framtida tillämpningarna av tekniken är huvudsyftet med det presenterade protokollet att erbjuda en robust riktlinje för hjärtdissektion som lätt kan användas i alla experimentella studier som kräver en detaljerad hjärtbedömning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline solution	B. BRAUN MELSUNGEN AG	W04479004	For washing all the blood, and blood clots from the heart.
10% neutral buffered formalin (NBF)	Q Path	11699404	Materials for collecting histopathology samples.
Bone cutting forceps	HELEN SRL	LS109HV	Sturdy instrument for cutting bone.
Cutting board	Ambition	86304	For an easier manipulation, and cutting the organs.
Decalcifying solution	Thermo Scientific TBD-2	6764004	1:1 mixture of 8% formic acid and hydrochloric acid.
Digital camera	Canon Inc.	PowerShot SX540 HS	For photographic, and videographic documentation.
Forceps	MKD-Medicale	15-430	Dissection instruments.
Histological cassettes	Q Path	720-2215	Materials for collecting histopathology samples. Dimensions: 3 × 2.5 × 0.4 cm
Knife	TEHNO FOOD COM SERV SRL	D2006/15	Sharp blade for cutting soft tissue.
Latex gloves	MKD-Medicale	SANTEX-S	Protection equipment.
Mask	MKD-Medicale	21221	Protection equipment.
Petri dishes	MKD-Medicale	0598-1V	Materials for collecting ancillary testing samples.
Plastic recipients	Corning Gosselin	TP200-02	Materials for collecting histopathology samples.
Scale	ESPERANZA	MEEKS008	For weighing the organs.
Scale	White Deals	72	For weighing the subjects.
Scalpel	MKD-Medicale	10322E	Sharp blade for cutting soft tissue.
Scissors	MKD-Medicale	13-260	Dissection instruments.
Scrub	MKD-Medicale	410100-52	Protection equipment.
Syringes	MKD-Medicale	10573EU	Materials for collecting ancillary testing samples.