Summary
Detta protokoll beskriver arbetsflödet för metabolisk märkning av senescenta och icke-delande celler med pulserad SILAC, oriktad masspektrometrianalys och en strömlinjeformad beräkning av proteinhalveringstider.
Abstract
Monteringsbevis har visat att ackumuleringen av senescenta celler i centrala nervsystemet bidrar till neurodegenerativa störningar som Alzheimers och Parkinsons sjukdomar. Cellulär senescens är ett tillstånd av permanent cellcykelstopp som vanligtvis uppstår som svar på exponering för subletala påfrestningar. Liksom andra icke-delande celler förblir emellertid senescenta celler metaboliskt aktiva och utför många funktioner som kräver unika transkriptions- och translationella krav och utbredda förändringar i de intracellulära och utsöndrade proteomerna. Att förstå hur proteinsyntes och sönderfallshastigheter förändras under senescens kan belysa de underliggande mekanismerna för cellulär senescens och hitta potentiella terapeutiska vägar för sjukdomar som förvärras av senescenta celler. Denna uppsats beskriver en metod för proteomskala utvärdering av proteinhalveringstider i icke-delande celler med hjälp av pulserad stabil isotopmärkning av aminosyror i cellodling (pSILAC) i kombination med masspektrometri. pSILAC involverar metabolisk märkning av celler med stabila tunga isotophaltiga versioner av aminosyror. Tillsammans med moderna masspektrometrimetoder möjliggör pSILAC mätning av proteinomsättning av hundratals eller tusentals proteiner i komplexa blandningar. Efter metabolisk märkning kan omsättningsdynamiken hos proteiner bestämmas baserat på den relativa anrikningen av tunga isotoper i peptider detekterade genom masspektrometri. I detta protokoll beskrivs ett arbetsflöde för generering av senescenta fibroblastkulturer och liknande arresterade vilande fibroblaster, liksom en förenklad, engångspunkt pSILAC-märkningstidskurs som maximerar täckningen av förväntade proteinomsättningshastigheter. Vidare presenteras en pipeline för analys av pSILAC-masspektrometridata och användarvänlig beräkning av proteinnedbrytningshastigheter med hjälp av kalkylblad. Tillämpningen av detta protokoll kan utvidgas bortom senescenta celler till alla icke-delande odlade celler såsom neuroner.
Introduction
Senescens identifierades först som ett tillstånd av obestämd tillväxtstopp som uppvisades av odlade primära celler efter att ha nått replikativ utmattning1. Det har sedan dess visat sig att senescens kan uppstå som svar på många cellulära förolämpningar, inklusive genotoxiska, mitokondriella och onkogena påfrestningar, bland andra2. Medan senescens har flera fysiologiskt viktiga roller, såsom tumörundertryckning och sårläkning, är ackumuleringen av senescenta celler under åldrandet associerad med en mängd skadliga effekter på hälsan3, inklusive flera neurodegenerativa tillstånd 4,5,6. Cellulär senescens förekommer i flera hjärncelltyper, inklusive neuroner 7,8,9,10, astrocyter11, mikroglia12 och oligodendrocytprekursorer13, och bidrar till neurodegeneration och kognitiv dysfunktion. Amyloid beta-oligomerer, ett av kännetecknen för Alzheimers sjukdom14, har visat sig påskynda neuronal senescens 13,15,16. En ökad förekomst av senescenta celler har också associerats med Parkinsons sjukdom17, särskilt till följd av miljöstressorer11,18. Viktigt är att den selektiva elimineringen av senescenta celler i prekliniska modeller förlänger livslängden och mildrar en mängd åldersrelaterade sjukdomar 3,5,12 och förbättrar kognitiva underskott 8,11,12,13. Senescenta celler har således framträtt som lovande terapeutiska mål för behandling av många åldersrelaterade tillstånd.
Mycket av den skadliga effekten av senescenta celler orsakas av den senescensassocierade sekretoriska fenotypen (SASP), en komplex blandning av bioaktiva molekyler utsöndrade av senescenta celler som kan orsaka lokal inflammation, angiogenes, förstörelse av den extracellulära matrisen och förökning av åldrande i omgivande vävnad 19,20,21 . SASP representerar också ett intressant biologiskt fenomen av senescens eftersom det kräver en betydande transkriptionell och translationell ansträngning under ett tillstånd av cellcykelstopp. Faktum är att senescenta celler har visat sig uppvisa minskningar i ribosobiogenes 22,23,24 som bör minska proteinsyntesen. Istället översätter senescenta celler robust vissa proteiner, särskilt SASP-faktorer, och påverkar metabolismen av omgivande vävnad25. Således finns det ett stort intresse för att förstå hur senescenta celler som genomgår ett permanent cellcykelstopp fortsätter att upprätthålla proteinhomeostas samtidigt som de robust uttrycker SASP-faktorer och andra utvalda proteiner.
Denna metod beskriver hur man använder masspektrometri och pulserad stabil isotopmärkning av aminosyror i cellodling (pSILAC) för att globalt mäta halveringstiderna för proteiner i senescenta celler i proteomomfattande skala. I traditionell SILAC är odlade celler helt metaboliskt märkta med tunga och lätta icke-radioaktiva isotoper av aminosyror för nedströms analys av proteinöverflöd. Denna metod har tidigare tillämpats för att bedöma förändringar i överflöd på ett omfattande och kvantitativt sätt i SASP för odlade fibroblaster26. I pSILAC är celler på samma sätt metaboliskt märkta med en puls av tung isotop som följer förmärkning med lätt isotop och skördas sedan med ett eller flera tidsintervaller. Inkorporeringshastigheterna för tung isotop med hänvisning till befintlig ljusisotop används sedan för att beräkna relativa proteinomsättningshastigheter. I allmänhet används isotoper av arginin och lysin eftersom trypsin klyver vid dessa rester; således kommer alla peptider från standard matsmältning potentiellt att innehålla den tunga etiketten. Par av peptider som endast skiljer sig åt genom närvaron eller frånvaron av tungt lysin eller arginin är kemiskt identiska och kan differentieras och kvantifieras med en masspektrometer. Efter masspektrometrianalys kan peptider identifieras som nysyntetiserade eller redan existerande baserat på närvaron eller frånvaron av isotopetiketten i de resulterande peptididentifieringarna. Proteinomsättningshastigheter kan sedan bestämmas genom att anpassa förhållandet mellan tunga (13 C-15N) över lätta (12 C-14N) peptider för ett givet protein till kinetiska modeller för exponentiell tillväxt eller sönderfall27,28. pSILAC har använts i flera jämförelser av proteinomsättningshastigheter 29,30,31,32 och är för närvarande den mest omfattande metoden med hög genomströmning för mätning av proteinhalveringstider.
Detta protokoll beskriver beredningen av senescenta celler parallellt med liknande tillväxtstoppade vilande celler i odling, följt av metabolisk märkning med pSILAC. Celler skördas sedan, homogeniseras till lysater och bearbetas för förvärv och analys av masspektrometri. Data som erhålls från masspektrometri används sedan för att bestämma proteinhalveringstider med hjälp av en förenklad kvantitativ metod som använder en enda tidpunkt och halveringstidsberäkningar utförda i ett kalkylblad. Med hjälp av detta tillvägagångssätt kan uppskattningar av proteinhalveringstider mätas på ett omfattande och kvantitativt sätt som är mer autentiskt för ostörda cellulära förhållanden än protokoll som använder blockerare av proteinsyntes eller omsättning.
Protocol
1. Beredning av vilande celler och celler som görs senescenta genom exponering för joniserande strålning (IR)
OBS: Cellulär senescens och lugn kan induceras med hjälp av flera metoder, som beskrivs i detalj någon annanstans 33,34,35. De stimuli som används för att inducera åldrande och lugn kan bero på celltypen av intresse och den biologiska frågan som undersöks. Cellerna som används i denna studie är kommersiellt tillgängliga.
- Tina humana diploida IMR-90 fibroblaster (~ 1 x 106 celler) från en kryovial och platta dem i 20 ml DMEM kompletterat med 10% Fetal Bovine Serum (FBS) (tabell 1) på en 150 mm platta.
- Odla cellerna vid fysiologiska syreförhållanden (3%O2, 5% CO2, 37 ° C) och expandera kulturerna i 10% FBS-innehållande media tills tillräckliga replikat för vilande och senescenta celler har upprättats (minst 3-5 replikat rekommenderas per tillstånd).
OBS: Odlingsceller vid fysiologiskt (3%) syre är idealiskt för primära humana fibroblastceller, men lämpliga odlingsförhållanden för andra celltyper kan variera och bör bestämmas från fall till fall. - Generera senescenta celler genom att exponera prolifererande celler till 15 grå (Gy) joniserande strålning (IR).
OBS: Strålningsexponeringens intensitet kan variera beroende på celltyp. Medan 15 Gy används här är 10 Gy också en vanlig stråldos för fibroblaster; andra celler, såsom monocyter, kan kräva en dos så låg som 5 Gy. Dosen bestäms i allmänhet empiriskt genom att väga livskraft mot senescensinduktion.- Exponera cellerna vid 40% -60% sammanflöde till IR i media som innehåller 10% FBS.
- Efter IR-exponering, byt till färska medier som innehåller 10% FBS.
- Byt media (20 ml, innehållande 10% FBS) varannan dag i 8 dagar.
OBS: Celler utsätts för IR vid lägre sammanflöde eftersom IR-behandlade celler kommer att expandera i odling innan de slutar växa. I detta experiment var celler inte delade celler under upprättandet av senescens, och även om de blev mer sammanflytande visade de fortfarande senescenta cellmarkörer vid skörden. I fibroblaster utvecklas den senescenta fenotypen inom 7-10 dagar.
- Generera vilande kontrollceller genom att ändra mediet på pläterade prolifererande celler till media som innehåller 0,2% FBS (serumsvält) (tabell 1).
- Fortsätt växa celler som kommer att användas för lugnkontroll i media som innehåller 10% FBS fram till dag 4 efter att senescenta celler utsätts för IR, dela vid behov.
- På dag 4 efter IR, ändra mediet för vilande celler till 20 ml media som innehåller 0,2% FBS (tabell 1) och fortsätt växa i ytterligare 6 dagar, byt media varannan dag.
OBS: Även i media som innehåller 0,2% FBS kommer fibroblaster att fortsätta att växa något och kan verka sammanflytande i slutet av skörden. Som en tumregel, sträva efter att samla vilande celler när de har nått sammanflöde som liknar den hos de senescenta cellkulturerna.
2. Märkning av celler för pulserad SILAC och skörd av lysater
- Byt media på både senescenta och vilande celler (12 plattor) till SILAC Light (tabell 1) och växa i 2 dagar.
OBS: Denna märkning hjälper till att minska bakgrundsbrus eftersom det finns ett lågt naturligt överflöd på 13C och 15N. Detta steg kan hoppas över i reagensbegränsande förhållanden men kommer att resultera i en liten överskattning av ny proteinsyntes. - Ersätt media med SILAC DMEM (tabell 1) för metabolisk märkning.
OBS: SILAC DMEM-medier är speciellt formulerade för att innehålla rent lätta eller tunga isotoper av arginin och lysin för metabolisk märkning. De får inte ersättas med dmem-standardformuleringar i delsteg 2.2.1 eller 2.2.2.- För tre senescenta och tre vilande plattor, ersätt media med 30 ml SILAC Light (tabell 1) och växa i 3 dagar utan att byta media.
- För minst tre senescenta och tre vilande plattor, byt ut mediet mot 30 ml SILAC Heavy (tabell 1) och växa i 3 dagar utan att byta media.
OBS: Det finns ett alternativ vid denna tidpunkt att skörda vad som kommer att vara de ljusmärkta cellerna omedelbart, snarare än att märka dem i ytterligare 3 dagar. För en enda tidpunkt är det att föredra att märka tunga och lättmärkta celler under samma period som görs i detta protokoll för att minimera batcheffekter.
- Lossa cellerna från odlingsplattorna genom att tillsätta 5 ml förvärmt trypsinreagens till varje skål och inkubera i 5 minuter vid 37 °C.
- Resuspendera de fristående cellerna i 5 ml av samma medium som används för odling (antingen SILAC Light eller SILAC Heavy) till en total volym på 10 ml.
- Skörda cellerna för extraktion av lysater och validering av senescensmarkörer.
- För varje suspension, alikvot 0,6 x 106 celler i 2 ml media innehållande 0,2 % FBS i en 6-brunnsskål (två skålar, en för SILAC Light-odlade celler och en för SILAC Heavy odlade celler) och placera vid 37 °C för inkubation över natten.
OBS: Dessa plattor (delsteg 2.5.1) kommer att användas för detektion av senescensassocierad β-galaktosidas (SA-βGal) aktivitet (steg 3.1). - För varje suspension, alikvot 1 x 106 celler i ett mikrocentrifugrör och snurra ner i en bordscentrifug med full hastighet i 1 min. Ta bort supernatanten och resuspendera pelletsen i 1 ml fenol; vid detta steg kan RNA renas fullständigt enligt beskrivningen i fenolleverantörens manual eller lagras långsiktigt vid -80 ° C.
VARNING: Fenol är frätande och bör hanteras uteslutande i en huva med handskar och en laboratorierock.
OBS: Det extraherade RNA kommer att användas för detektion av mRNA som kodar för SASP-faktorer med hjälp av omvänd transkription (RT) följt av realtid, kvantitativ (q) PCR-analys (RT-qPCR) (steg 3.2). En annan tillförlitlig analys för senescensinduktion är ett test för 5-etynyldihydroxiuridin (EdU) införlivande, vilket indikerar närvaron av prolifererande celler. Frånvaron av proliferation kan användas för att bekräfta lugn och senescens. - Överför de återstående cellerna till is och snurra ner vid 300 x g och 4 °C.
- För varje suspension, alikvot 0,6 x 106 celler i 2 ml media innehållande 0,2 % FBS i en 6-brunnsskål (två skålar, en för SILAC Light-odlade celler och en för SILAC Heavy odlade celler) och placera vid 37 °C för inkubation över natten.
- Ta bort supernatanten och tvätta cellerna två gånger i 1 ml kall PBS för att avlägsna media/trypsin och exogen proteinkontaminering från fetalt bovint serum från odlingsmediet.
- Snurra ner cellerna igen, ta bort supernatanten och fortsätt till lys.
- Återsuspendera cellpelletsna i 150 μL nyberedd 8 M urea 50 mM ammoniumbikarbonatlysbuffert (tabell 1) och blanda genom pipettering upp och ner.
- Sonicate lysaterna i en vatten sonicator i 2,5 min med 30 s på / av vid medeleffekt vid 4 ° C.
- Överför lysaterna till ett förvärmt 95 °C värmeblock och denaturera i 4 min.
- Snurra ner lysaterna; Lysater kan nu lagras vid -80 °C eller användas omedelbart för kvantifiering.
- Gör ett 30 μL lager av 1:10 utspädningar för varje lysat i Lysis Buffer.
- Mät proteinkoncentrationen med BCA Assay Kit med hjälp av en standardkurva framställd i 1/10x Lysis Buffer utspädd iddH2O. Lysater kan nu lagras vid -80 °C på obestämd tid.
3. Validering av åldrande genom senescensassocierad β-galaktosidas (SA-βGal) aktivitet och RT-qPCR-analys av senescensassocierade mRNA
OBS: Utgångsmaterialet för dessa steg samlas in under steg 2.5
- Med utgångspunkt från 6-brunnsplattorna som sattes upp i understeg 2.5.1, analysera celler för SA-βGal-aktivitet med hjälp av Senescence β-Galactosidase Staining kit enligt tillverkarens protokoll. Visualisera färgning under ljusfält med färg aktiverad, som tidigare beskrivits36.
OBS: SA-βGal kvantifieras genom att jämföra procentandelen positiva celler (synlig blå färg) i senescenta kontra vilande kontrollförhållanden. Minst 70% av cellerna bör vara SA-βGal-positiva för framgångsrik bekräftelse av åldrande. Vilande kontrollceller bör vara mindre än 10% positiva för SA-βGal. - Extrahera RNA från fenolsuspension (delsteg 2.5.2) och analysera med RT-qPCR för ökade nivåer av mRNA som kodar för SASP-faktorer (IL6, CXCL8, IL1B), cellcykelmarkörer (CDKN2A / p16, CDKN1A / p21) och andra indikatorer på senescens (förlust av LMNB1 och PCNA).
OBS: RNA är instabilt och bör därför hanteras med RNase-fri utrustning, färska handskar och på is om inte annat anges i protokollet.- Från fenolsuspension tillsätt 200 μL kloroform per 1 ml fenol och spinna ner vid 12 000 x g i 15 min vid 4 °C.
- Avlägsna försiktigt vattenfasen och tillsätt 1:1 volym isopropanol, 15 μg glykogen co-precipitant, och inkubera sedan vid 4 °C i 10 min för att fälla ut RNA.
- Efter inkubation, pelletera RNA genom centrifugering vid 12 000 x g i 20 min vid 4 °C följt av en tvätt i 75 % EtOH lika med 1 volym fenol som används. Resuspendera RNA i 50 μL nukleasfritt destillerat vatten; RNA kan lagras vid -80 °C på obestämd tid.
- Till RNA-prover, tillsätt 38 μL nukleasfritt destillerat vatten, 10 μL 10x DNAse-reaktionsbuffert och 2 μL DNas I följt av blandning.
OBS: Att generera en gemensam blandning av alla reagenser i delsteg 3.2.3 multiplicerat med antalet prover för behandling för lika fördelning till prover är bästa praxis. - Inkubera DNas I-behandlade RNA-prover vid 37 °C i 30 min.
- Avlägsna DNas från proverna med 1 volym fenol/kloroform/isoamylalkohol (25:24:1) genom att virvla och snurra med maximal hastighet i en bordscentrifug i 5 minuter. RNA kommer att finnas i vattenfasen.
- Upprepa delstegen 3.2.2 och 3.2.3 för att fälla ut RNA. Resuspend i 20 μL nukleasfritt destillerat vatten; RNA kan lagras vid -80 °C på obestämd tid.
- Generera cDNA från renat RNA genom att inkubera 0,5-1,0 μg renat RNA med 200 U omvänt transkriptas, 100 pMol slumpmässiga primrar och 10 mM av en dNTP-blandning i 1x reaktionsbuffert försedd med det omvända transkriptaset; inkubera i 10 min vid 25 °C, därefter i 30 min vid 50 °C, med ett sista inaktiveringssteg vid 85 °C i 5 min.
- Analysera cDNA från RT-steget (delsteg 3.2.3) från vilande kontroll och senescenta celler med hjälp av realtid, kvantitativ (q) PCR-analys för att bedöma nivån av mRNA-markörer som är kända för att ökas (CDKN2A / p16, CDKN1A / p21, IL1B, IL6 och CXCL8 mRNA) eller minska (LMNB1 och PCNA mRNA) med senescens som beskrivs någon annanstans. ACTB-mRNA , som kodar för hushållsproteinet β-Actin, är ofta ett bra mRNA för att normalisera skillnader i ingångsmaterialet. De primers som används finns i tabell 2.
OBS: Relativ RT-qPCR-analys är beroende av antaganden om lika bindningseffektivitet mellan målprimerparen och ett referensprimerpar. Dessa antaganden bör testas för nya primeruppsättningar som beskrivs på andra ställen37. Dessutom bör referensmarkörer vara konstanta mellan de celltyper som jämförs, och flera ytterligare alternativ för senescenta celler har tidigare identifierats38.
4. Trypsin digestion i lösning
OBS: Från och med nu är det viktigt att använda buffertar, lösningsmedel och kemikalier av masspektrometrikvalitet för att förhindra störningar från föroreningar under masspektrometrianalys. Alla buffertar bör bestå av ingredienser som är lämpade för vätskekromatografi tandemmasspektrometrianalys, inklusive vatten och acetonitril. Se materialförteckningen för en lista över lämpliga kemikalier och lösningsmedel.
- Alikvot 50 μg av varje proteinprov i nya rör och bringa till lika stora volymer med Lysis Buffer.
- Till varje prov, tillsätt DTT till en slutlig koncentration av 20 mM för att minska disulfidbindningarna.
- Inkubera proverna vid 37 ° C i 30 minuter med skakning och låt sedan proverna svalna vid rumstemperatur (RT, ~ 10 min).
- Tillsätt jodoacetamid till en slutlig koncentration av 40 mM för att irreversibelt alkylera de sulfhydrylgrupper som reducerades i föregående steg. Inkubera proverna vid RT i mörkret i 30 minuter.
- Späd varje prov till under 1 M urea med en buffert bestående av 50 mM ammoniumbikarbonat. Kontrollera om pH är ungefär 8 genom att pipettera en liten mängd prov på pH-remsor.
- Tillsätt 1 μg trypsin till varje prov för 50 μg startprotein, eller vid förhållandet 1:50 trypsin:protein, i massa, om man smälter en annan proteinmängd. Till exempel skulle 3 μg trypsin tillsättas för matsmältning av 150 μg protein.
- Inkubera proverna över natten vid 37 ° C med skakning för att smälta proteiner till peptider.
- Tillsätt myrsyra till 1 volymprocent av varje prov för att släcka proteinsmältningen.
OBS: Experimentet kan pausas här. Frys proverna vid -80 °C och fortsätt till nästa steg vid ett senare tillfälle om det behövs.
5. Provrensning med fastfasextraktion (SPE)
OBS: Detta fastfasextraktionsprotokoll kräver patroner för fastfasextraktion och en vakuumgrenrörsinställning. Andra likvärdiga SPE-protokoll (Solid Phase Extraction) kan utföras efter forskarens eget gottfinnande före masspektrometrianalys.
- Förbered dig för SPE genom att placera fastfasextraktionspatroner på ett vakuumgrenrör med en extraktionskassett för varje prov.
OBS: Se tillverkarens riktlinjer för mängden sorbent som ska användas i SPE-protokollet. För 50 μg peptidprover rekommenderas att använda 10 mg sorbentpatroner. - Konditionera varje SPE-patron genom att tillsätta 800 μL SPE Elution Buffer (tabell 1) och använd vakuumsugning för att dra lösningsmedlet genom patronen.
- Upprepa steg 5.2.
- Balansera varje patron genom att lägga till 800 μL SPE Wash Buffer (tabell 1) och använd vakuumsugning för att dra bufferten genom patronerna.
- Upprepa steg 5.4 ytterligare två gånger totalt tre gånger.
- Ladda peptidproverna i SPE-patroner och använd vakuumsugning för att dra prover genom patronerna.
OBS: Vid denna tidpunkt är peptider bundna till sorbenten inuti patronerna. - Tvätta varje patron med SPE Wash Buffer och använd vakuumsugning för att dra bufferten genom patronerna.
- Upprepa steg 5.7 ytterligare två gånger för totalt tre tvättar.
- Före elueringssteget, ordna uppsamlingsrör i vakuumgrenröret under varje patron, varsamt säkerställd inriktning mellan uppsamlingsrören och patronerna.
- För att eluera peptider, tillsätt 800 μL SPE Elution Buffer till varje patron och eluera peptider i uppsamlingsrör med vakuumsugning.
- Upprepa steg 5.10 med 400 μL SPE Elution Buffer.
- Ta bort peptidproverna från vakuumgrenröret och torka helt i en vakuumkoncentrator (torkningen tar cirka 3 timmar).
OBS: Experimentet kan pausas här. Frys prover vid -80 °C och fortsätt vid ett senare tillfälle vid behov.
6. Databeroende förvärv (DDA) masspektrometrianalys
- Resuspendera peptidproverna i en koncentration av 400 ng/μL i en buffert bestående av 0,2 % myrsyra i vatten.
- För att underlätta återlöslighet av peptider, virvla proverna i 5 minuter. Sedan, sonicate proverna i 5 min i ett vattenbad sonicator.
- Pelletera alla olösliga material genom centrifugering av prover vid 15 000 x g i 15 min vid 4 °C. Överför peptidsupernatanterna till MS-injektionsflaskor.
- Lägg till indexerade retentionstidsstandarder (iRT) som valts till varje prov i en koncentration av 1:30 iRT:sample, i volymprocent.
- Skicka in proverna för proteomisk analys med hjälp av vätskekromatografi tandemmasspektrometri (LC-MS / MS) analys.
- Använd LC-MS/MS-inställningar som rekommenderas för oriktad analys av masspektrometrianläggningen. Exempel på inställningar för analys visas i figur 3, konfigurerad för analys på en Orbitrap-masspektrometer kopplad till ett nanovätskekromatografisystem i nanoflödesläge. Ett exempelprotokoll följer.
- Lägg 1 μg (5 μL) av varje prov på en fällpelare (1 cm lång x 100 μm diameter) och tvätta dem med laddningslösningsmedel (tabell 1) med en flödeshastighet på 10 μL/min i 5 min.
- Lägg proverna på en analytisk kolonn (50 cm lång x 100 μm diameter) med en flödeshastighet på 400 nL/min.
- Eluera peptiderna över en 90 minuters linjär gradient med ett organiskt lösningsmedel (0,2 % myrsyra och 99,8 % acetonitril) och oorganiskt lösningsmedel (0,2 % myrsyra i 99,8 % vatten), från 5 % till 35 % organiskt lösningsmedel.
- Hämta masspektrometridata i databeroende läge med en kontinuerlig cykel av MS1-undersökningsskanningar (60 000 upplösning, 3e6 AGC-mål, 100 ms maximal ackumuleringstid och 400-1 600 m/z massintervall) följt av 20 databeroende MS2-skanningar (15 000 upplösning, 1e5 AGC-mål, 25 ms maximal injektionstid och 1,6 m/z breddisoleringsfönster) med HCD-fragmentering (normaliserad kollisionsenergi på 27 %).
- Efter MS-förvärv av alla prover, importera råa masspektrometrifiler till ett masspektrometriproteomikanalysverktyg för identifiering och kvantifiering av peptidtoppområden.
OBS: För identifiering av peptider och proteiner i detta experiment användes Mascot-databassökningsverktyget med den granskade UniProt humana proteomsekvensdatabasen (Proteome ID: UP000005640). Följande sökparametrar har angetts i Mascot:- Kvantitation: SILAC K+8 R+10 [MD] Enzym: Trypsin/p Fast modifiering: karbamidmetyl (C)
- Variabla modifieringar: acetyl (Protein N-term), Gln->pyro-Glu (N-term Q), Oxidation (M), Etikett:13C(6)15N(2) (K), Etikett:13C(6)15N(4) (R)
- Tolerans för peptidmassa: 10 ppm
- Fragment masstolerans: 0,08 Da
- Max missade urringningar: 2
- Alla ospecificerade parametrar var standard
- Kvantifiera peptidtoppområdena för tunga och lätta peptider i proteomkvantitationsprogramverktyget. För kvantifiering av toppområden i detta experiment användes den fria och öppna källkoden Skyline mjukvaruplattform39,40. Exportera tunga och lätta peptidtoppområden för uppskattning av proteinhalveringstider.
7. Beräkning av proteinhalveringstider
- Öppna SILAC Analysis Workbook (tabell 3) till det första arket med namnet 1) Rådata och klistra in UniProt-ID:er, gennamn, tunga toppområden och lätta toppområden i de angivna kolumnerna (SH = Senescent-Heavy, SL = Senescent-Light, CH = Control (quiescent)-Heavy, CL = Control (quiescent)-Light).
- Öppna ark 2-4 och se till att UniProt ID- och Genkolumnerna matchar antalet proteiner som identifierats från analysen (dessa experiment identifierade 841 proteiner). Resten av kolumnerna fylls automatiskt med data efter att de har dragits för att täcka de identifierade proteinerna.
- Öppna det fjärde arket med namnet 4) Analys och ta bort rader där kolumnerna G och H indikerar att provet är utanför intervallet; håll rader som läser inom räckhåll. Vulkandiagrammet i det femte arket fylls automatiskt.
Representative Results
Detta protokoll beskriver en metod för att globalt jämföra proteinhalveringstider mellan senescenta och icke-delande, vilande kontrollceller med hjälp av pSILAC och minimala tidpunkter. Detta protokoll beskriver generering av senescenta och vilande celler i odling, metabolisk märkning av celler med stabila isotoper av arginin och lysin under 3 dagar, kvantifiering av de relativa överflöden av tunga och lätta peptidisotoper genom masspektrometri och en enkel och tillgänglig beräkning av proteinhalveringstider med hjälp av kalkylarkformler (Figur 1). Denna metod är mycket flexibel och kan anpassas till många celltyper och förhållanden.
Som en del av genereringen av senescenta celler för detta protokoll används två metoder för senescensvalidering: SA-βGal-positiva celler visualiserade med mikroskopi och ökade nivåer av senescenta markörer kvantifierade med hjälp av RT-qPCR-analys. Mätningen av senescenta markörer bör ge tydliga skillnader mellan vilande och senescenta celler för att jämförelser av de två cellpopulationerna ska anses vara giltiga. För SA-βGal-aktivitet bör senescenta celler visas blå medan vilande kontrollceller har ingen eller mycket liten färg (figur 2A). Denna analys kan kvantifieras genom att räkna de positiva, blåfärgade cellerna som en procentandel av det totala antalet celler och sedan jämföra den procentuella positivitetsgraden mellan vilande kontroll och senescenta celler. Det är viktigt att detta protokoll utförs samtidigt för jämförelse av båda celltillstånden; SA-βGal-aktiviteten är beroende av färglösningens pH, så resultaten kan variera väsentligt mellan analyserna och bör betraktas som ett kvalitativt mått.
RT-qPCR-analysen av senescenta markörer kommer att visa höga nivåer av de mRNA som kodar för SASP-faktorer (IL6, CXCL8, IL1B) och cellcykelhämmarna (CDKN2A/p16, CDKN1A/p21) i de flesta senescenta modeller. Även om viss variation förväntas baserat på celltyp, odlingstillstånd och senescent inducerare 41,42, visar de flesta senescenta celler större än fem gånger högre nivåer av IL6, CXCL8 och CDKN1A / p21 mRNA jämfört med vilande kontrollceller; Omvänt bör nivåerna av LMNB1- och PCNA-mRNA, som kodar för proliferationsmarkörer, vara låga eller frånvarande i senescenta celler jämfört med vilande celler (figur 2B). Sammantaget är en signifikant procentandel av SA-βGal-positivitet och det förväntade uttrycket av en panel av senescensassocierade mRNA-markörer tillräckliga för att bekräfta induktionen av senescens i ett experiment.
Bearbetning av proteinprover för masspektrometrianalys består av matsmältning i lösningen (2 dagar) och extraktion i fast fas (4-6 timmar). För att utföra oriktad proteomisk analys skickas de resulterande peptiderna in för LC-MS/MS-analys med hjälp av databeroende förvärv (DDA). På Orbitrap-instrument kan en DDA-metod specificeras i redigeraren för masspektrometriinstrumentets programvarumetod. De masspektrometerinställningar som används i denna studie visas i figur 3A. Vätskekromatografiinställningar kan också anges i metodredigeraren. För denna studie användes en 90 min linjär gradient med ökande organisk fas (acetonitril) (figur 3B). Efter ett lyckat förvärv bör den totala jonströmmen (TIC) innehålla en intensiv signal under den linjära gradientdelen av metoden (figur 3C). Detta protokoll beskriver ett exempelprotokoll på ett Orbitrap-instrument, men beräkningen av proteinhalveringstider kan utföras på data som erhållits från vilken masspektrometer som helst som samlades in i DDA-läge, vilket är tillgängligt på flera typer av instrument (t.ex. Orbitraps och time-of-flight-instrument) och leverantörer. Förvärvsinställningarna kommer att vara unika för typen och konfigurationen av det instrument som används, och det rekommenderas att använda de inställningar som föreslås av masspektrometrianläggningen. Denna metod är också kompatibel med icke-DDA-metoder (SRM, PRM, DIA), så länge kvantitativa kromatografiska toppområden för tunga och lätta toppar kan extraheras från rådatafilerna och skrivas in i kalkylbladsformlerna.
Råa masspektrometrifiler söks med ett av de många tillgängliga proteomiska databassökningsverktygen för att identifiera peptider och proteiner. Till exempel använde denna studie sökmotorn Mascot43. För att erhålla kromatografiska toppområden för kvantifiering av tunga och lätta peptider importeras databassökresultat till en proteomisk programvara som kan kromatografiska toppområden som Skyline39,40. Undersökning av de extraherade jonkromatogrammen av peptider (figur 4) kommer att avslöja den relativa andelen tunga och lätta peptidsignaler. En lägre andel tung peptidsignal i förhållande till ljuspeptidsignal i senescenta celler indikerar en långsammare proteinomsättningshastighet (figur 4A), och en högre tung peptidsignal i förhållande till ljus indikerar en snabbare proteinomsättningshastighet (Figur 4B). De omärkta proverna ska visa liten eller ingen tung peptidsignal. Varje uppenbar tung peptidsignal i de omärkta proverna betraktas som bakgrundsbrus och kommer att subtraheras under de slutliga beräkningarna. Kvantifiering av kromatografiska toppområden för lätta och tunga peptider för alla behandlings- och märkningsförhållanden måste exporteras för efterföljande beräkning av proteinomsättningshastigheter och statistisk analys.
Genom att använda enstaka tidspunktsanalys är kvantifieringen av proteinhalvätningstider enkel att utföra och kan göras bekvämt i kalkylblad. I tabell 3 beräknades halveringstider för 695 proteiner som identifierats från masspektrometrianalysen. Med utgångspunkt från proteinnivå tunga och lätta isotopöverflöd för varje protein i proverna (ingång för 1) Rådatablad ) beräknas sedan en procent tung isotop (benämnt Ratio, R) automatiskt på arket med titeln 2) Förhållande H | H + L. I detta steg normaliseras R från tunga märkta prover genom att subtrahera R från omärkta prover för att producera en slutlig R för de vilande och senescerande trelikaten. Eftersom omärkta prover inte bör ha någon exogent tillsatt tung isotop, används de för att eliminera bakgrundssignalen. Från R beräknas kdeg (omsättningshastighet) med följande formel:
Halveringstiden (H, i dagar) bestäms för varje protein i den vilande kontrollen och senescenta trelikat (blad med titeln 3) Halveringstid (dagar)) med användning av följande formel:
Dessa halveringstider är sedan i genomsnitt bland de vilande och senescenta tre exemplaren för att generera en vilande och senescent genomsnittlig halveringstid för varje protein samt ett p-värde. Beräknade halveringstider filtreras sedan för värden som är negativa, vilket inträffar när den tunga signalen från ljusmärkta celler (bakgrunden) är större än den tunga signalen från tungmärkta celler. Denna filtrering resulterade i 707 proteiner från 841 identifierade med giltiga halveringstider för de resultat som presenteras här.
Halveringstiden rapporteras sedan som ett log2-förhållande av senescent över vilande kontrollceller (log2FC) och plottas i ett vulkandiagram (figur 5). Genom att titta på analysbladet 5) kan till exempel koagulation II-trombinreceptorproteinet (F2R) ses ha en halveringstid i vilande celler på 0,51 dagar (kolumn B) och en halveringstid i senescenta celler på 1,07 dagar (kolumn C) som gav en logg2FC på ~ 1,06 (kolumn D) med ett p-värde på 0,001.
Figur 1: Diagram över pSILAC-arbetsflöde för senescenta och vilande kontrollceller. Humana IMR-90-fibroblaster användes för att bereda vilande (lågserum) eller senescenta (IR) cellkulturer för jämförelse av proteinhalveringstider. Cellerna märktes sedan med SILAC Light eller SILAC Heavy media med isotoparginin och lysin i 3 dagar. Lysater extraherades från celler, smältes, avsaltades och analyserades med hjälp av masspektrometri. Tunga och lätta peptidisotoptoppar motsvarar nyligen syntetiserade respektive befintliga peptider. Halveringstider beräknades med hjälp av en ekvation för exponentiellt sönderfall. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Validering av senescenta fenotyper med hjälp av SA-βGal- och RT-qPCR-analyser. (A) Senescenta och vilande celler ompläteras vid skördetillgången till en 6-brunnsplatta och färgas för SA-βGal med hjälp av SA-βGal-färgningssatsen. Blå färg i cellkroppen är positiv för senescens. Bilderna är tagna i ljusfält med färg vid 10x förstoring, storleksmarkör i rött. (B) RT-qPCR-analys som jämför senescenta celler (röda) och cykelceller (grå) från ett orelaterat experiment. Ökningar av nivåerna av CDKN1A / p21, CXCL8 och IL6 mRNA är en indikation på åldrande, liksom minskningen av LMNB1 mRNA-nivåer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa metoder för databeroende förvärvsskanningar (DDA) och vätskekromatografigradient av pSILAC-kulturer på Q-Exactive HF orbitrap masspektrometer. (A) Rekommenderade instrumentinställningar i instrumentprogramvaran för databeroende analys av helcellslysat från ett pSILAC-experiment. (B) Exempel på inställningar för flödesgradientmetod för vätskekromatografi. Peptider elueras över en 90-minuters linjär gradient som sträcker sig från 5% till 35% buffert B (0,2% myrsyra och 99,8% acetonitril), följt av en 10 min tvätt med 80% buffert B och 25 min jämvikt med 5% buffert B. (C) Ett representativt totalt jonkromatogram (TIC) av ett masspektrometriförvärv av IMR-90 fibroblastpeptider förvärvade med de angivna inställningarna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa extraherade jonkromatogram av peptider med förändrad omsättning under senescens. (A) Kromatografiska toppområden av peptiden FQMTQEVVCDECPNVK++ från proteinet DnaJ homolog underfamilj B-medlem 11 (DNAJB11) i senescenta och icke-senescenta celler. Efter 3 dagars SILAC införlivar senescenta celler mindre tung isotop i denna peptid jämfört med vilande (icke-senescenta) celler, vilket indikeras av en minskning av topparean av tung isotopinnehållande peptid (blå) i förhållande till ljuspeptiden (röd), vilket indikerar att denna peptid har minskad omsättning i senescenta celler. (B) Kromatografiska toppområden av peptiden VQAQVIQETIVPK++ från proteinet Splicing Factor 3a Subunit 1 (SF3A1) i senescenta och icke-senescenta celler. Efter 3 dagars SILAC införlivar senescenta celler en högre andel tung isotop i denna peptid jämfört med vilande (icke-senescenta) celler, vilket indikeras av en minskning av topparean av tung isotopinnehållande peptid (blå) i förhållande till ljuspeptiden (röd), vilket indikerar att denna peptid har ökad omsättning i senescenta celler. De omärkta (dag 0) förhållandena visar ingen inkorporering av tung isotop för båda peptiderna, som förväntat. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Jämförelse av proteinhalveringstider i senescenta och vilande celler bestämda från pSILAC-märkning. (A) Vulkandiagram som visar log2-förhållandet mellan senescent / kontroll (vilande) för vart och ett av de 695 identifierade proteinerna; i detta experiment innehöll lätta och tunga märkningsmedier ingen glukos och ingen fenolröd. (B) Tabeller som visar de 10 mest proteiner som har flest ökade eller minskade halveringstider i vilande celler jämfört med senescenta celler (vänster respektive höger). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Media och buffertar som används i detta protokoll. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: RT-qPCR-primers som används i detta protokoll. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 3: Silac-analysarbetsbok för beräkning av proteinhalveringstider, vikförändringar och t-tester. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Discussion
pSILAC är en kraftfull teknik som möjliggör global kvantifiering av proteinomsättningshastigheter över flera cellulära förhållanden. Detta dokument beskriver användningen av pSILAC för att jämföra globala proteinhalveringstider mellan senescenta och vilande celler, inklusive instruktioner för beredning av senescenta och vilande celler, SILAC-märkning och skörd och slutligen analys med DDA-masspektrometri. Dessutom beskrivs ett tvåstegstest för validering av senescensfenotypen med användning av SA-βGal- och RT-qPCR-analys av en panel av mRNA som kodar för senescensassocierade proteiner. Förutom validering av åldrande med de två beskrivna metoderna kan en tredje validering av senescens utföras efter masspektrometrianalys genom att leta efter förändringar i kända senescensmarkörer mellan senescenta och vilande celler på proteomisk nivå. Senescensassocierade proteiner som förväntas vara förhöjda inkluderar bland annat p16, p21 och BCL2, som beskrivs någon annanstans44,45. I protokollet som beskrivits ovan användes joniserande strålning för induktion av åldrande och serumsvält för vilande celler. För induktion av åldrande finns det flera alternativ tillgängliga och det finns betydande heterogenitet bland dem 41,42,46. För närvarande finns det ingen senescent metod som anses vara den "mest fysiologiska", så valet av senescent inducerare är till stor del baserat på experimentets sammanhang. Experiment med målet att ange ett allmänt fenomen om senescens rekommenderas dock att använda minst två olika senescenta inducerare. Att diskutera utbudet av senescensparadigmer ligger utanför ramen för detta papper, men några vanliga metoder för att inducera åldrande inkluderar att utlösa DNA-skador (IR, doxorubicin, replikativ utmattning), uttrycka onkogena proteiner (HRAS, BRAF) och störa mitokondriernas funktion2.
Förutom valet av senescent inducerare är valet av kontrollceller ett lika viktigt övervägande. Senescenta celler är per definition under obestämd tillväxtstopp, så en jämförelse med andra tillväxtstoppade celler väljs ofta. För pSILAC är cellcykelarresterade celler i allmänhet att föredra eftersom de inte replikerar och därmed är lättare att använda för beräkningar av proteinhalveringstiden47. Men eftersom odlade celler ofta behåller vissa delande celler är det viktigt att de metoder som används för att inducera cellcykelstopp ger ett så homogent svar som möjligt för att minimera fel från celler som fortfarande förökar sig. För att beräkna proteinnedbrytningshastigheter för cykelceller med pSILAC krävs ytterligare beräkningar för att kompensera för den hastighet med vilken protein späds ut i dotterceller27. Vilande tillväxtstopp i sig är emellertid inte utan komplikationer. Det finns två allmänna metoder för cellcykelstopp: serumbrist och kontakthämning48. Inte alla celler kan göras vilande genom kontakthämning, även om vissa fibroblaster har visat sig visa lugn efter flera dagars odling49. Denna metod använde serumbrist eftersom den oftare används för jämförelser av senescenta celler, även om det kräver att den senescenta cellen på samma sätt serumberövas för exakta jämförelser. Serum aktiverar mTOR-komplexet, och därmed har serumbrist flera nedströms effekter på cellen utöver cellcykelstopp50. I synnerhet har senescenta celler visat sig uppvisa en minskad SASP vid serumbrist eller mTOR-hämning51,52.
En annan viktig punkt att tänka på i pSILAC är hur många tidpunkter som ska testas. Detta protokoll samlade celler vid en enda tidpunkt (3 dagars lätt eller tung märkning), vilket väsentligt förenklar den resulterande analysen. Valet av tidpunkt bör baseras på experimentets mål. För global analys förväntas 3 dagar fånga en majoritet av proteinerna, men halveringstider för kortlivade proteiner som helt omsätter inom 3 dagar (all ljussignal går förlorad) kan inte mätas vid denna tidpunkt. Omvänt är långlivade proteiner med mycket liten omsättning på 3 dagar också svåra att kvantifiera och verkar ofta ha extremt stora halveringstider (i veckors ordning) som vanligtvis bara är en följd av mycket liten tung signalackumulering. På grund av det icke-linjära förhållandet i förhållandet mellan tunga och lätta peptidsignaler jämfört med andelen nysyntetiserat protein vid kortare och längre tidpunkter kan kvantitationen av halveringstider förbättras genom att lägga till ytterligare märkningstidpunkter. För relativa jämförelser mellan två celltillstånd, som i detta protokoll, kan en ungefärlig halveringstid vara tillräcklig, men ytterligare tidpunkter kan användas för att förbättra kvantitativ noggrannhet.
Detta protokoll beskriver hur man utför en oriktad DDA-baserad analys av proteinomsättning. Beräkningarna av proteinomsättningen kan emellertid tillämpas generellt på alla förvärvsscheman som kan härleda det relativa överflödet av tunga och lätta peptidpar. Exempelvis kan MS2-baserade metoder såsom dataoberoende förvärv (DIA/SWATH) också tillämpas för beräkning av omsättningshastigheter framgångsrikt53. Dessutom kan andra instrumenterings- och programvarupipelines än de som beskrivs i detta protokoll användas för att utföra DDA-analys, proteinidentifiering och proteinkvantifiering. När du använder programvaruplattformar för proteinkvantifiering som Skyline för att extrahera peptidtoppområden är det lämpligt att manuellt inspektera extraherade jonkromatogram i dokumentarbetsytan, identifiera toppar som felaktigt integrerades och icke-kvantitativa toppar och kurera dokumentet i enlighet därmed. En omfattande samling självstudier finns tillgängliga online för Skyline (skyline.ms).
pSILAC representerar en av de mest idealiska metoderna för global kvantifiering av proteinhalveringstider i odlade celler på grund av överlägsen multiplexering (proteomtäckning) och genomströmning. Medan pSILAC inte ger direkta syntes- eller nedbrytningshastigheter, eftersom förändringen i lätt och tung signal beror på ett sammanflöde av faktorer, är pSILAC mycket användbart för jämförelser mellan förhållanden och olika celltyper. Metoder med låg genomströmning faller ofta i två typer: 1) behandling av celler med cykloheximid för att blockera proteinsyntes och skörda med tidsintervall efter tillsats för att övervaka sönderfall, eller 2) behandling av celler med en hämmare av proteinförfall och skörd vid tidsintervall efter tillsats för att övervaka ackumuleringen av protein, vilket härleder proteinförfallshastigheter. Begränsningen av båda metoderna är att sådana behandlingar oundvikligen kommer att orsaka betydande förändringar i cellulär fysiologi. Däremot kräver pSILAC ingen väsentlig intervention och har teoretiskt inga detekterbara effekter på cellulär fysiologi eftersom isotopaminosyror skiljer sig med endast en enda neutron från sina icke-isotopiska motsvarigheter. Således representerar metoden som beskrivs här för pSILAC ett enkelt protokoll för global mätning av de mest fysiologiska proteinhalveringstiderna i icke-delande celler.
Förändringar i proteinomsättningen har ett nära samband med åldrande, åldersrelaterade sjukdomar, neurodegeneration och livslängd 54,55. Detta protokoll beskriver en metod för att förhöra dessa relationer genom att använda stabil isotopmärkning av aminosyror i cellodling för att mäta proteinomsättningshastigheter i senescensceller. Det finns emellertid många analoga metoder för att utföra studier i samband med åldrande och neurodegeneration in vivo i hela organismer som möss. Faktum är att dessa studier har betonat vikten av att mäta proteinomsättningshastigheter i samband med åldersrelaterade sjukdomar 56,57,58,59.
I denna studie stod ribosomala proteiner och proteiner som finns i endoplasmatisk retikulum ut som två kategorier av proteiner med minskade respektive ökade halveringstider i senescenta celler. Medan ytterligare analys av steady-state-nivåer krävs för definitiva slutsatser, tyder dessa resultat vidare på att senescenta celler unikt kan reglera översättning genom minskade halveringstider för ribosomala proteiner. Framöver kommer tillämpning av stabila isotopmärkningsmetoder för att studera förhållandet mellan cellulär senescens och neurodegeneration in vivo i musmodeller att vara en lovande förlängning av isotopmärkningsmetoden som beskrivs av detta protokoll.
Disclosures
Författarna har inga avslöjanden.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) och Intramural Research Program (IRP), National Institute on Aging (NIA). OBS stöddes av Longevity Impetus Grants och Office of Dietary Supplements (ODS) Scholars Program. Figur 1 skapades med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (LC-MS grade) | Grainger | AH015 | |
| Ammonium Bicarbonate | Millipore-Sigma | 9830 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BCA Assay Kit | ThermoFisher | 23227 | |
| Dithiothreotol (DTT) | Sigma | D9779 | |
| DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher | 12430112 | |
| dNTP Mix | ThermoFisher | R0191 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated | ThermoFisher | 10082147 | |
| Formic Acid | Sigma | 27001 | |
| Gammacel 40 Exactor | Best Theratronics | Cesium Irradiator for cells | |
| GlycoBlue | ThermoFisher | AM2238 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I1149 | Light sensitive |
| IMR-90 primary lung fibroblasts | ATCC | CCL-186 | |
| iRT Kit (indexed retention time) | Biognosys | Ki-3002-2 | Indexed Retention Time Peptide Standards |
| Isopropanol | ThermoFisher | 423835000 | |
| Mascot | Matrix Science | Mascot Daemon 2.8 | Proteomic database searching software |
| Maxima Reverse Transcritase (200 U/µL) | ThermoFisher | EP0742 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | ThermoFisher | 11140050 | |
| Nano LC System | ThermoFisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Oasis HLB Solid Phase Extraction Cartirdges | Waters | 186000383 | |
| Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | Q Exactive HF Orbitrap | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 327110025 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
| Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (Trypsin) -DMEM | ThermoFisher | A33972 | |
| QuantStudio 6 Real-Time PCR System | ThermoFisher | ||
| Random Hexamer Primer | ThermoFisher | SO142 | |
| Senescence β-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling | 9860 | |
| Skyline | University of Washington | Skyline-Daily v21.2.1.424 | Free and open source qantiative proteomic software. Available on www.skyline.ms |
| Sonicator waterbath | Branson | CPX-952-516R | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | Referred to as phenol in text; hazardous |
| TRYPle Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Trypsin (sequencing grade) | Promega | V5113 | |
| TURBO Dnase (2U/ uL) | ThermoFisher | AM2238 | |
| Urea | ThermoFisher | 29700 | |
| Water (LC-MS grade) | Grainger | AH365 |
References
- Hayflick, L.
- Gorgoulis, V., et al. Cellular senescence: Defining a path forward. Cell. 179 (4), 813-827 (2019).
- Borghesan, M., Hoogaars, W. M. H., Varela-Eirin, M., Talma, N., Demaria, M. A senescence-centric view of aging: Implications for longevity and disease. Trends in Cell Biology. 30 (10), 777-791 (2020).
- Martinez-Cue, C., Rueda, N.
- Wissler Gerdes, E. O., et al. Cellular senescence in aging and age-related diseases: Implications for neurodegenerative diseases. International Review of Neurobiology. 155, 203-234 (2020).
- Baker, D. J., Petersen, R. C. Cellular senescence in brain aging and neurodegenerative diseases: evidence and perspectives. Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1208-1216 (2018).
- Musi, N., et al. Tau protein aggregation is associated with cellular senescence in the brain. Aging Cell. 17 (6), 12840 (2018).
- Ogrodnik, M., et al. Obesity-induced cellular senescence drives anxiety and impairs neurogenesis. Cell Metabolism. 29 (5), 1061-1077 (2019).
- Chow, H. M., et al. Age-related hyperinsulinemia leads to insulin resistance in neurons and cell-cycle-induced senescence. Nature Neuroscience. 22 (11), 1806-1819 (2019).
- Dehkordi, S. K., et al. Profiling senescent cells in human brains reveals neurons with CDKN2D/p19 and tau neuropathology. Nature Aging. 1, 1107-1116 (2021).
- Chinta, S. J., et al. Cellular senescence is induced by the environmental neurotoxin paraquat and contributes to neuropathology linked to Parkinson's disease. Cell Reports. 22 (4), 930-940 (2018).
- Bussian, T. J., et al. Clearance of senescent glial cells prevents tau-dependent pathology and cognitive decline. Nature. 562 (7728), 578-582 (2018).
- Zhang, P., et al. Senolytic therapy alleviates Abeta-associated oligodendrocyte progenitor cell senescence and cognitive deficits in an Alzheimer's disease model. Nature Neuroscience. 22 (5), 719-728 (2019).
- Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8 (6), 595-608 (2016).
- Wei, Z., et al. Amyloid beta protein aggravates neuronal senescence and cognitive deficits in 5xfad mouse model of Alzheimer's disease. Chinese Medical Journal (England). 129 (15), 1835-1844 (2016).
- He, N., et al. Amyloid-beta(1-42) oligomer accelerates senescence in adult hippocampal neural stem/progenitor cells via formylpeptide receptor 2. Cell Death & Disease. 4 (11), 924 (2013).
- van Dijk, K. D., et al. Changes in endolysosomal enzyme activities in cerebrospinal fluid of patients with Parkinson's disease. Movement Disorders: Offical Journal of Movement Disorder Society. 28 (6), 747-754 (2013).
- Chinta, S. J., et al. Environmental stress, ageing and glial cell senescence: a novel mechanistic link to Parkinson's disease. Journal of Internal Medicine. 273 (5), 429-436 (2013).
- Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Patholology. 5, 99-118 (2010).
- Acosta, J. C., et al. A complex secretory program orchestrated by the inflammasome controls paracrine senescence. Nature Cell Biology. 15 (8), 978-990 (2013).
- Payea, M. J., Anerillas, C., Tharakan, R., Gorospe, M. Translational control during cellular senescence. Molecular and Cellular Biology. 41 (2), 00512 (2021).
- Nishimura, K., et al. Perturbation of ribosome biogenesis drives cells into senescence through 5S RNP-mediated p53 activation. Cell Reports. 10 (8), 1310-1323 (2015).
- Lessard, F., et al. Senescence-associated ribosome biogenesis defects contributes to cell cycle arrest through the Rb pathway. Nature Cell Biology. 20 (7), 789-799 (2018).
- Xu, M., et al. Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age. Nature Medicine. 24 (8), 1246-1256 (2018).
- Wiley, C. D., et al. SILAC Analysis reveals increased secretion of hemostasis-related factors by senescent cells. Cell Reports. 28 (13), 3329-3337 (2019).
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Doherty, M. K., Hammond, D. E., Clague, M. J., Gaskell, S. J., Beynon, R. J. Turnover of the human proteome: determination of protein intracellular stability by dynamic SILAC. Journal of Proteome Research. 8 (1), 104-112 (2009).
- Riba, A., et al. Protein synthesis rates and ribosome occupancies reveal determinants of translation elongation rates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (30), 15023-15032 (2019).
- Mathieson, T., et al. Systematic analysis of protein turnover in primary cells. Nature Communications. 9 (1), 689 (2018).
- Liu, T. Y., et al. Time-resolved proteomics extends ribosome profiling-based measurements of protein synthesis dynamics. Cell Systems. 4 (6), 636-644 (2017).
- Welle, K. A., et al. Time-resolved analysis of proteome dynamics by tandem mass tags and stable isotope labeling in cell culture (TMT-SILAC) hyperplexing. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (12), 3551-3563 (2016).
- Neri, F., Basisty, N., Desprez, P. Y., Campisi, J., Schilling, B. Quantitative proteomic analysis of the senescence-associated secretory phenotype by data-independent acquisition. Current Protocols. 1 (2), 32 (2021).
- Hernandez-Segura, A., Brandenburg, S., Demaria, M. Induction and validation of cellular senescence in primary human cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57782 (2018).
- Noren Hooten, N., Evans, M. K. Techniques to Induce and quantify cellular senescence. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55533 (2017).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-βgal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Hernandez-Segura, A., Rubingh, R., Demaria, M. Identification of stable senescence-associated reference genes. Aging Cell. 18 (2), 12911 (2019).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Pino, L. K., et al. The Skyline ecosystem: Informatics for quantitative mass spectrometry proteomics. Mass Spectrometry Reviews. 39 (3), 229-244 (2020).
- Casella, G., et al.
- Basisty, N., et al. A proteomic atlas of senescence-associated secretomes for aging biomarker development. PLoS Biology. 18 (1), 3000599 (2020).
- Perkins, D. N., Pappin, D. J., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
- Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M.
- Kohli, J., et al. Algorithmic assessment of cellular senescence in experimental and clinical specimens. Nature Protocols. 16 (5), 2471-2498 (2021).
- Hernandez-Segura, A., et al. Unmasking transcriptional heterogeneity in senescent cells. Current Biology: CB. 27 (17), 2652-2660 (2017).
- Swovick, K., et al. Interspecies differences in proteome turnover kinetics are correlated with life spans and energetic demands. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100041 (2021).
- Marescal, O., Cheeseman, I. M. Cellular mechanisms and regulation of quiescence. Developmental Cell. 55 (3), 259-271 (2020).
- Lacorazza, H. D. Cellular Quiescence. , Springer, Humana Press. New York. (2018).
- Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).
- Herranz, N., et al. mTOR regulates MAPKAPK2 translation to control the senescence-associated secretory phenotype. Nature Cell Biology. 17 (9), 1205-1217 (2015).
- Laberge, R. M., et al. MTOR regulates the pro-tumorigenic senescence-associated secretory phenotype by promoting IL1A translation. Nature Cell Biology. 17 (8), 1049-1061 (2015).
- Pino, L. K., Baeza, J., Lauman, R., Schilling, B., Garcia, B. A. Improved SILAC quantification with data-independent acquisition to investigate Bortezomib-induced protein degradation. Journal of Proteome Research. 20 (4), 1918-1927 (2021).
- Basisty, N., Meyer, J. G., Schilling, B.
- Basisty, N., Holtz, A., Schilling, B. Accumulation of "Old Proteins" and the critical need for MS-based protein turnover measurements in aging and longevity. Proteomics. 20 (5-6), 1800403 (2020).
- Basisty, N., et al. Mitochondrial-targeted catalase is good for the old mouse proteome, but not for the young: 'reverse' antagonistic pleiotropy. Aging Cell. 15 (4), 634-645 (2016).
- Dai, D. F., et al. Altered proteome turnover and remodeling by short-term caloric restriction or rapamycin rejuvenate the aging heart. Aging Cell. 13 (3), 529-539 (2014).
- Karunadharma, P. P., et al. Subacute calorie restriction and rapamycin discordantly alter mouse liver proteome homeostasis and reverse aging effects. Aging Cell. 14 (4), 547-557 (2015).
- Basisty, N. B., et al. Stable isotope labeling reveals novel insights into ubiquitin-mediated protein aggregation with age, calorie restriction, and rapamycin treatment. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 73 (5), 561-570 (2018).
