Summary
本协议描述了使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白在小鼠模型中诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎，并使用临床评分系统监测疾病过程。采用小鼠股骨显微计算机断层扫描分析和开放现场试验分析实验性自身免疫性脑脊髓炎相关症状，全面评估疾病过程。
Abstract
多发性硬化症 （MS） 是一种典型的中枢神经系统 （CNS） 自身免疫性疾病，其特征是炎症浸润、脱髓鞘和轴索损伤。目前，没有完全治愈MS的措施，但有多种疾病改善疗法（DMT）可用于控制和减轻疾病进展。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）和MS患者的CNS病理特征有显着相似之处。EAE已被广泛用作确定MS药物疗效和探索MS疾病新疗法开发的代表性模型。在小鼠中主动诱导EAE具有稳定且可重复的作用，特别适用于研究药物或基因对自身免疫性神经炎症的影响。主要分享用髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白（MOG35-55）免疫C57BL / 6J小鼠的方法和使用临床评分系统的疾病症状的日常评估。鉴于MS病因复杂，临床表现多样，现有的临床评分体系无法满足疾病治疗的评估。为了避免单一干预的缺点，创建了基于MS患者焦虑样情绪和骨质疏松症的临床表现来评估EAE的新指标，以提供更全面的MS治疗评估。
Introduction
自身免疫性疾病是由免疫系统对其自身抗原的免疫反应引起的一系列疾病，导致组织损伤或功能障碍1。多发性硬化症（MS）是中枢神经系统（CNS）多发性神经病的慢性自身免疫性疾病，其特征是炎症浸润，脱髓鞘和神经元轴突变性2，3。目前，MS已影响全球多达250万人，其中大多数是20-40岁的年轻人和中年人，他们往往是家庭和社会的支柱。这对家庭和社会造成了相当大的影响和伤害2，4。
MS是一种多因素疾病，临床表现多样且复杂。除了以炎症浸润和脱髓鞘为特征的经典神经系统疾病外，MS还经常表现出视力障碍，肢体运动障碍以及认知和情绪障碍5，6，7。如果MS患者没有得到适当和正确的治疗，其中一半将在20年后生活在轮椅上，其中近一半会出现抑郁和焦虑症状，导致自杀意念水平比一般人群高得多8，9。
尽管研究时间较长，但MS的病因仍然难以捉摸，MS的发病机制尚未阐明。尽管啮齿动物和人类免疫系统之间存在显着差异，但MS的动物模型允许作为探索疾病发展和新治疗方法的测试工具，同时共享一些基本原理。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是目前研究MS的理想动物模型，利用髓鞘蛋白自身抗原免疫诱导易感小鼠对CNS成分的自身免疫，并加入完全弗氏佐剂（CFA）和百日咳毒素（PTX）增强体液免疫应答。根据遗传背景和免疫抗原，获得不同的疾病过程，包括急性、复发缓解或慢性，以模拟各种临床形式的 MS 10，11，12。构建EAE模型常用的相关免疫原来自自身CNS蛋白，如髓鞘碱性蛋白（MBP）、蛋白脂蛋白（PLP）或髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）。MBP或PLP免疫的SJL / L小鼠发展复发 - 缓解过程，MOG触发C57BL / 6小鼠的慢性进行性EAE11，12，13。
疾病修正疗法（DMT）的主要目的是尽量减少疾病症状并改善功能6。临床上有几种药物用于缓解MS，但尚未使用任何药物来完全治愈它，这表明协同治疗的必要性。C57BL/6小鼠是目前最常用于构建转基因小鼠的方法，本工作采用MOG35-55 诱导的5点量表C57BL/6J小鼠EAE模型监测疾病进展。EAE模型还患有焦虑样情绪和骨质流失，以及广为人知的脱髓鞘病变。在这里，还描述了使用开放现场测试和显微计算机断层扫描（Micro-CT）分析从多个角度评估EAE症状的方法。
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Protocol
同济大学动物护理委员会批准了目前的工作，并遵循了所有动物护理指南。使用8-12周龄的雄性或雌性C57BL / 6J小鼠进行实验。确保实验组的年龄和性别相同;否则，对该疾病的易感性受到影响。将小鼠饲养在特定的无病原体环境中，在恒定条件下（室温23±1°C，湿度50%±10%）交替进行12小时的光照和黑暗循环，并自由获取小鼠食物和水。
1.MOG35-55 乳液的制备
- 加入热灭活冻干结核分枝杆菌（MTB，H37Ra）以完成弗氏佐剂（本身含有1mg / mL热灭活MTB，H37Ra），最终MTB浓度为5mg / mL（见 材料表）。
注意：整个操作必须在生物安全柜中完成;不要打开吹风。 - 用无菌预冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）（不含钙和镁离子，pH 7.4）溶解冻干的MOG35-55 肽（参见 材料表），以制备浓度为2mg / mL的抗原溶液。
- 取一个干净的 2 mL 微量离心管，向每个管中添加一个灭菌的 5 mm 钢球（参见 材料表）。
- 将 500 μL 含有 5 mg/mL MTB 和 500 μL MOG35-55 抗原溶液的完整弗氏佐剂加入上述含有一个钢球的微量离心管中。
- 将上述管在TissueLyser（见 材料表）上振荡10分钟，在冰上冷却10分钟，重复四次以充分混合，最后形成白色粘稠溶液。
注意：良好的乳化是制备MOG35-55 乳液的关键步骤，因此需要彻底混合。组织裂解器的速度设置为 28 Hz。
2. 百日咳毒素（PTX）的制备
- 将含有ddH2O的PTX制备成100μg/ mL浓度，并储存在4°C。
- 用无菌 1x PBS（不含钙和镁离子，pH 7.4）稀释 PTX 储备溶液 50 倍，制成 200 ng/100 μL 溶液以供使用。
3. EAE动物模型的建立
- 使用8-12周龄的雄性或雌性C57BL / 6J小鼠构建EAE模型。确保小鼠在免疫接种前充分适应喂养环境。
- 通过按下设备的脉冲按钮（参见材料表）在4°C下离心制备的MOG35-55乳液（步骤1）2-3秒，以沉淀管底部的所有乳液。
注意：MOG35-55 乳液可在-20°C下储存数天。为避免药物失败，建议尽快使用。 - 将 22 G 针头连接到 1 mL 注射器筒上，吸出 MOG 35-55 乳液，然后将 MOG35-55 乳液转移到新的 1 mL 注射器筒中。固定 1 mL 注射器筒和带密封膜的 26 G 针头之间的连接（参见材料表）。
注意：将 MOG35-55 乳液装入 1 mL 注射器筒中时，避免气泡。 - 用70%乙醇擦拭和消毒注射部位。
- 在小鼠背脊的每一侧皮下注射MOG35-55 乳剂，每侧100μL。观察注射操作完成后小鼠背部皮肤下球状肿块的自动形成。
注意：确保有经验的实验者执行免疫过程，并且注射轻柔缓慢地完成，以尽量减少对小鼠的压力。 - 腹膜内注射上述小鼠100μLPTX（步骤2）。
注意：免疫接种当天是第 0 天。此外，确保可以准确识别小鼠以进行后续的日常评估，例如在小鼠尾巴上使用颜色标记。 - 在免疫接种后第 2 天注射相同剂量的 PTX。
- 准备一组未免疫的小鼠作为野生型（WT）小鼠。
4.小鼠的临床监测
- 每天记录EAE和WT小鼠的体重。
注意：EAE的严重程度与小鼠的体重减轻呈正相关，因此体重也是一个非常重要的监测指标。 - 使用 表1中列出的0-5评分系统监测免疫后0-21天的小鼠状态。
注意：介于两者之间的症状计为正负 0.5 分。
5. 露天试验
注意：为此步骤选择的实验动物是处于早期发作，峰值和缓解期的EAE小鼠。此外，WT小鼠用作对照。需要注意的是，在建模之前对所有小鼠进行了焦虑样行为测试，以排除患有焦虑症的小鼠进行EAE建模。此外，完全运动丧失能力的高峰期和缓解期的EAE小鼠被排除在测试之外。
- 准备一个40×40×40cm3 开放场反应室和一个运动活动（开放场）视频分析系统（见 材料表）。
注意：相机安装在完全覆盖盒子的位置，反应室光线均匀，测试室要求为安静区域。 - 在开始实验前1小时将测试小鼠置于测试室中习惯化。
- 在开始测试之前，用70%乙醇喷洒整个区域，并用干净的纸巾擦拭以确保反应室清洁。
- 在开始探索之前，将每只老鼠从笼子中单独取出，并将其放在竞技场的同一角落。
注：盒子底部分为16个网格，其中中间四个网格区域为中心区域，周围区域为外围区域。 - 点击视频分析系统菜单栏中的开始拍摄按钮，记录时间，开始 拍摄 。
- 考场内保持安静。
- 在录制过程中让鼠标自由移动5分钟。
- 停止采集系统并保存视频。
- 将鼠标带出竞技场，将其放回笼子中，然后继续下一只鼠标。
注意：在运行之间用70%乙醇清洁测试区域，以去除异味和其他物质。 - 使用视频分析系统分析结果。
6. 骨表型分析
- 在第21天通过颈椎脱位对EAE和WT小鼠实施安乐死。
注意：进行颈椎脱位手术的人员必须经过良好的培训，以尽量减少动物死亡期间所承受的疼痛。 - 使鼠标平躺在解剖托盘中并固定四肢。
- 用镊子握住小鼠后肢皮肤，用剪刀打开小鼠皮肤和肌肉组织。
- 用剪刀小心地将股骨与胫骨和髋骨分开。
- 用剪刀去除粘附在股骨上的肌肉，并在室温下将股骨放入70%乙醇中。
- 使用各向同性体素大小为10μm，峰值X射线管电压为70 kV，X射线强度为0.114 mA的显微CT系统（见 材料表）扫描股骨远端。
注意： 3D 高斯滤波器允许对 2D 阈值图像进行去噪。 - 分析从股骨干中部扫描的 100 个切片以测量股骨参数，包括骨体积、组织体积、骨矿物质密度、小梁分离、小梁数、小梁连接密度以及小梁和皮质厚度。
注意：从小鼠股骨远端生长板的近端开始，发现完全没有骨骺帽结构的切片，并继续向股骨近端延伸100个切片，在远离内皮质表面的几个体素处手动勾勒轮廓以识别骨骺小梁。 - 通过在显微 CT 系统中堆叠来自轮廓区域的阈值 2D 图像来创建 3D 重建。
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Representative Results
小鼠免疫后，每天记录小鼠的体重，并根据上述方案评估其临床症状（步骤4）。在免疫MOG肽的C57BL/6J小鼠中，由于病变的位置主要局限于脊髓，EAE小鼠的发病机制从尾端扩散到头部。在疾病开始时，EAE小鼠表现出尾巴无力和下垂，随后是后肢无力，运动不协调和瘫痪。随着病情的恶化，逐渐发展为前肢无力，瘫痪，严重时导致小鼠移动困难，甚至濒临死亡。如图 1A所示，具有不同程度EAE病理的小鼠的状态图描绘了一组小鼠从无症状变为高分EAE症状的示例性图片（得分4）。前面也提到EAE小鼠的体重与临床症状相关。与WT小鼠相比，EAE小鼠的体重减轻可能在免疫后的最初几天开始出现，而EAE小鼠的临床症状通常在免疫后第6-9天开始，并在第14-16天达到高峰。在此之后，EAE小鼠的症状一般会部分恢复，同时，小鼠的体重减轻也会得到缓解（图1B，C）。因此，EAE发病过程通常分为早发期、高峰期和缓解期，这些时间点的预测对于评估结局参数非常重要。一般来说，为了分析EAE病变部位免疫细胞和细胞因子的产生，可以分离并进一步处理EAE小鼠在疾病高峰期的大脑和脊髓中的免疫细胞，这可以通过流式细胞术14，15进行分析。高峰发作的脊髓组织也最适合制备苏木精和伊红（H&E）染色和Luxol快速蓝色染色，以进一步研究脊髓的炎症细胞浸润和脱髓鞘14，16。为了监测EAE不同发病时间免疫系统的变化，早发时的脾脏和淋巴结也是必不可少的选择17，18。此外，来自MOG免疫EAE小鼠脾脏或淋巴结的细胞通常用于构建转移模型，在 体外 再刺激MOG后将其转移到受体小鼠以诱导EAE小鼠的被动免疫18。
MS 是一种自身免疫性炎症诱导的中枢神经系统脱髓鞘病变，其特征是炎症性脱髓鞘和神经元丢失2，3。这种疾病通常伴有精神合并症，如情感障碍，其中焦虑症在MS患者中非常常见，高达30%的MS患者患有焦虑症9，19。焦虑症是一种精神异常，其特征是过度的情绪压力和担忧。露天测试通常用于分析啮齿动物的焦虑行为20，21。借助分析EAE小鼠在早发期，高峰期和缓解期在开放野外测试中的探索行为，发现EAE小鼠也具有与MS患者相似的焦虑样行为（图2A）。在露天测试中，焦虑的啮齿动物往往活动减少，刻板行为增加，包括偏爱靠近角落，偏向外围区域，以及缺乏探索中心区域的欲望。与WT小鼠相比，EAE小鼠在疾病的所有三个时期的行走距离和运动时间显着降低，即使在疾病的早期发作时，EAE小鼠还没有运动障碍（图2B，C）。此外，EAE小鼠通过的距离明显比正常小鼠少，停留在中心区域更少，甚至只在外围区域移动，表现出明显的焦虑样情绪（图2D，E）。EAE小鼠在轻度发作时仍表现出强烈的焦虑样情绪，即运动协调。一些研究表明，这可能归因于轻度神经炎症，这进一步影响神经递质的分泌22，23。监测EAE小鼠焦虑样情绪触发的开放现场测试可以帮助研究人员了解和治疗MS精神合并症。
随着疾病的进展，MS基本上最终表现为运动障碍。研究发现，MS患者对骨质疏松症和骨折的易感性较高，主要是由于骨量丢失，运动障碍的严重程度与患者的骨密度密切相关24，25。在EAE动物模型的帮助下，通过显微CT分析可以观察到类似的现象（图3A，H）。从小鼠股骨小梁分析数据来看，EAE小鼠骨密度（BMD）与WT小鼠相比显著降低，这是对骨强度反应的重要指标，也是诊断骨质疏松症的重要依据（图3B）。进一步分析表明，与健康WT小鼠相比，EAE小鼠发生小梁骨质流失显着，并伴有小梁连接密度，小梁数和小梁厚度的降低。这些都是骨量减少的特征，表明EAE也会导致小鼠股骨中的小梁骨质流失（图3C-F）。同时，骨小梁结构形态发生变化，小梁间距明显增大;间距越大，骨骼的骨质疏松性越严重（图3G）。这与MS患者容易患骨质疏松症的观点一致。在股骨骨干的皮质骨中，EAE模型中皮质骨的厚度明显小于正常小鼠（图3I）。在多发性硬化症中，运动能力下降和肌肉萎缩症增加与骨质疏松症、骨折以及由于机械力降低导致的骨吸收增加密切相关，骨完整性逐渐降低，从而增加骨质疏松症和骨折的风险26。EAE小鼠股骨显微CT分析可以很好地监测骨骼健康，干预有利于控制EAE的状况。
图1：EAE临床症状的监测。 （A）具有不同程度EAE病理的小鼠的示例图片。（B）WT和EAE小鼠的体重变化。（C）WT和EAE小鼠的临床评分。数据以平均±SEM（n = 5），****p <0.001与WT小鼠，双向方差分析检验给出。 请点击此处查看此图的大图。
图2：EAE小鼠在开放现场测试中的焦虑样行为。 （A）开放现场测试的代表性轨迹图。WT小鼠和EAE小鼠在早发期，高峰期和缓解期的行进距离（B），活动持续时间（C），中心行进距离（D）和在中心花费的时间（E）。数据是平均值±SEM （n = 3），*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001与WT小鼠，学生t检验。请点击此处查看此图的大图。
图3：EAE小鼠骨骼健康的显微CT分析。 （A）股骨小梁结构的代表性3D图像（比例尺，100μm）。采用显微CT分析法测定股骨小梁的骨密度（B）、骨体积/组织体积比（C）、连接密度（D）、数量（E）、厚度（F）和间距（G）。（H） 皮质骨的代表性3D图像（比例尺，100微米）。（I）从微计算机断层扫描数据中获得的皮质厚度。数据是平均值±SEM （n = 3），*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001与WT小鼠，学生t检验。请点击此处查看此图的大图。
| 得分 | 临床体征 | ||
| 0 | 无临床体征 | ||
| 0.5 | 尾巴无力，尾巴前部下垂 | ||
| 1 | 尾巴完全瘫痪 | ||
| 2 | 后肢轻度麻痹（双后肢无力或单侧麻痹、行走不协调、对挤压有反应） | ||
| 3 | 后肢完全瘫痪，后肢拖曳行走，后肢对挤压无反应 | ||
| 4 | 后肢麻痹和前肢无力 | ||
| 5 | 濒临死亡或垂死 | ||
表1：临床评分系统。
| 抗原 | 应变 | 特征 | 应用 | 限度 | ||
| 软工党 | SJL/J34 | 复发缓解型脑电镜 | 临床复发中涉及的细胞和分子事件的研究 | 仅限于 T 细胞特异性反应;研究SJL/J菌株中的特定基因和途径具有挑战性 | ||
| MBP | SJL/J35 | 急性麻痹恢复后部分或全部受者出现复发性麻痹 | 神经炎症和免疫系统激活的研究 | 仅限于 T 细胞特异性反应;研究SJL/J菌株中的特定基因和途径具有挑战性 | ||
| MOG35-55 | C57BL/631 | 原发性进行性脑膜炎;慢性进行性脑电镜 | 轴突损伤机制研究;转基因和基因敲除模型中分子疾病机制的研究 | 原发性脱髓鞘和髓鞘再生研究价值有限 | ||
| 脊髓匀浆 | 比奥兹 ABH36 | 复发缓解型脑电镜 | 髓鞘再生和MS神经保护治疗的研究 | 无临床进展性，随时间推移出现神经功能缺损;仅限于 CD4 T 细胞特异性反应 | ||
| 泰勒氏鼠脑脊髓炎病毒 | 多种小鼠品系高度易感，包括SJL/J、SWR、PL/J12，31 | 炎症性脱髓鞘的病毒模型 | 轴索损伤和炎症诱导的脱髓鞘的研究 | 未发现 MS 特异性病毒感染;髓鞘再生难以评估，脱髓鞘和髓鞘再生同时发生 | ||
| 铜皮酮 | 广泛用于C57BL / 6小鼠，而其他菌株（例如CD1菌株）不易受到铜铜铜引起的损伤37，38 | 脱髓鞘和髓鞘再生的毒性模型 | 研究T细胞非依赖性脱髓鞘，特别是髓鞘再生和基本髓鞘修复过程 | 中毒损伤停止后发生显著的自发性髓鞘再生;脱髓鞘是脑区域特异性的，对研究脊髓脱髓鞘没有用 | ||
| 溶血卵磷脂 | SJL/J12、C57BL/639 等 | 脱髓鞘和髓鞘再生的毒性模型 | 研究T细胞非依赖性脱髓鞘，特别是髓鞘再生和基本髓鞘修复过程 | 在MS期间观察到缺乏免疫反应 | ||
| 溴化乙锭 | C57BL/640等 | 脱髓鞘和髓鞘再生的毒性模型 | 局灶性脱髓鞘病变的研究及脱髓鞘和髓鞘再生动力学的预测 | 溴化乙锭会损害所有含有核仁的细胞;与 MS 的相关性有限 | ||
表2：MS的不同小鼠型号。
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Discussion
MS是中枢神经系统的脱髓鞘炎症性疾病，是导致年轻人慢性残疾的最常见神经系统疾病之一，给家庭和社会带来巨大负担3，4。MS一直被归类为器官特异性T细胞介导的自身免疫性疾病，诱导自身免疫系统缓慢侵蚀CNS，这将涉及全身的多个系统27。典型的临床症状包括视力障碍、运动障碍、认知和情绪障碍等6，7。MS是一种毁灭性的疾病，如果治疗不当，会逐渐恶化，导致严重的失明和瘫痪28。MS的发病机制尚不完全清楚，因为其临床表现和病理进展是异质性的，因此动物模型对于MS治疗的研究和开发至关重要。
最常研究的MS动物模型是EAE，它主要有两种建模方法：主动免疫和被动免疫29。前者因其简单、无小鼠照射和周期时间短而被广泛采用。EAE主动免疫模型通过用自身髓鞘抗原或其后续肽免疫啮齿动物来诱导中枢神经系统的自身免疫反应，通常表现为尾部无力和肢体麻痹13。具体来说，MOG 35-55诱导的EAE模型在C57BL / 6J小鼠中的特征在于交替的缓解 - 复发周期，伴有CNS炎症，脱髓鞘和轴突损伤，这使得MOG35-55诱导的EAE成为首选模型11，12。在皮下注射MOG35-55肽致敏的小鼠中，用富含MTB的免疫增强剂CFA乳化，并在第0-230天给予腹腔注射具有血脑屏障破坏作用的PTX。EAE模型面临的最大挑战是症状较弱的发生率低，几个影响因素对实验过程至关重要。（1）小鼠的年龄和环境会影响对EAE的易感性。因此，在实验前需要选择同龄的小鼠。小鼠在笼子分配前应加权并随机分组，每组的体重需要保持接近。此外，确保独立实验之间的环境条件具有可比性。（2）PTX的浓度：PTX的主要作用是增加血脑屏障的通透性，使致病性T细胞进入CNS分泌相关细胞因子，促进炎症反应，最终导致包裹在神经轴突外层的髓磷脂蛋白水解。EAE小鼠的发病随着PTX给药浓度的降低而延迟，如果PTX降低60%以上，疾病的严重程度会减弱。（3）MOG 35-55抗原的溶解：为避免冻融，建议将冻干后的MOG35-55抗原分包采购，4mg/管，避免冻融。此外，PTX用于溶解而不是无菌水，因为最好使用PTX与CFA乳化。（4）MOG35-55抗原和CFA必须通过振荡充分乳化，形成油包水结构，乳液液滴长时间不分散在水面上，说明乳化性好。（5）双点注射用于小鼠EAE建模。注射部位最好位于腰部以上和颈部下方，靠近脊柱，避免小鼠舔咬皮肤，造成MOG35-55乳液溢出。
然而，由MOG35-55抗原诱导的EAE模型仍然存在一定的局限性。作为CD4 T细胞介导的原发性轴索损伤的炎症性脑病模型，主要病变为大块轴突变性伴继发性脱髓鞘和较少原发性脱髓鞘，这与MS病理学31，32，33不同。MOG35-55诱导的EAE模型主要反映了CD4 T细胞驱动的免疫应答，而CD8 T细胞和B细胞等其他免疫细胞在该模型中没有很强的参与感31。另一个限制因素是MOG35-55诱导的EAE对MS病理生理学的免疫学成分有一定的偏倚，在考虑针对CNS病理学的研究时可以考虑其他动物模型，例如脱髓鞘和髓鞘再生过程的研究34，35，36，37，38，39，40，如表2所述.
EAE是模仿MS自身免疫特性的有效预测因子，以及其炎症和脱髓鞘机制12，这使得许多学者热衷于研究其免疫调节机制，而忽略了MS的其他临床症状。 研究表明，MS相关的焦虑归因于病理生理过程，例如免疫失调和脑部炎症22，23，41.心理健康问题，如焦虑，在MS患者中尤其常见，焦虑症会阻碍基本日常任务的执行并显着影响生活质量42，43。EAE小鼠运动能力的改变可以预测神经过程的改变。在露天实验中，EAE小鼠中发生了类似焦虑的行为，包括疾病早期开始的探索行为减少（基本上，临床评分为<0.5且运动能力几乎与正常小鼠一样好的测试对象），表明焦虑样行为的发作先于运动障碍。此外，缓解期的EAE小鼠没有改善运动能力增加的焦虑样行为。炎症反应的出现可能是EAE小鼠通过神经元活动的精神障碍的原因，导致情绪变化，并且炎症细胞因子水平的上调干扰了运动障碍发作前的纹状体突触功能23，41。但是，露天测试需要注意的是，测试室必须是一个安静的区域，并且测试小鼠需要提前1h适应房间，以避免新环境造成的压力过大。在测试之间需要用乙醇进行额外的清洁，以去除最后一个测试对象留下的气味和其他物质。露天试验的主要局限性是EAE小鼠运动功能障碍引起的干扰，评估啮齿动物焦虑样行为的试验基于反应室内啮齿动物活动的距离、时间和范围，不能排除运动功能障碍对焦虑样行为的影响。因此，未来的研究需要考虑运动障碍。
传统的骨组织相关研究分析方法往往使用二维骨切片显微镜，由于二维平面的影响和生物标本的不均匀性，在分析结构形态、密度分布、取向分布等特征方面可能具有较大的困难。许多研究已经证实了Micro-CT系统描述骨形态的准确性和有效性，许多研究44，45，46已经证实了微观结构检测结果。通过显微CT对骨组织进行三维成像，可以获得更直观和准确的骨组织形态测量结果。已经实现了在不执行动物或损坏组织标本的情况下扫描小动物和标本，从而允许在组织内部获得详细的三维空间结构信息44。研究表明，MS患者容易出现骨量丢失和骨质疏松症24，25;通过用Micro-CT系统扫描和成像EAE小鼠的股骨，与发生骨质疏松症的WT小鼠相比，EAE小鼠的股骨骨微结构明显恶化，骨强度下降。显微CT分析相对简单，相对便宜，显微CT实时成像可用于监测未来EAE小鼠治疗时的骨骼健康。然而，缺点是缺乏通过血液样本或骨组织形态测定法评估的骨转换标志物来观察EAE小鼠骨代谢稳态的根本变化47。成骨细胞和破骨细胞的调节可以在未来的研究中考虑。
MS 是一种多症状性疾病，疾病管理的唯一目的是尽量减少疾病症状。在上述方案中，可以通过构建MOG35-55 诱导的EAE模型来模拟MS的临床症状。EAE小鼠表现出运动功能障碍和焦虑样行为以及骨质疏松症的临床症状。该方案中描述的5点评分系统，开放现场测试和Micro-CT分析可以从多个角度监测EAE小鼠的病理症状，并为EAE的治疗提供参考方案。在缺乏有效的疾病改善药物的情况下，协同治疗的潜在组合可以提供缓解症状和改善功能的最佳机会。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢中国国家自然科学基金（32070768，31871404，31900658，32270754）和药物研究国家重点实验室的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe(with 26 G needle) | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | 60017031 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | HAIKELASI | KY-LXG2A | |
| 22 G needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | 60017208 | |
| Complete Freund’s Adjuvant | Sigma | F5881 | Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL |
| Conditioned place preference system | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | Animal behavior | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | Stored at RT |
| Locomotion activity (open field) video analysis system | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | DigBehv-002 | Animal behavior |
| MOG35-55 peptide | Gill Biochemical Co., Ltd | GLS-Y-M-03590 | Stored at -20 °C |
| Mycobacterium tuberculosis H37Ra | BD | 231141 | Stored at 4 °C |
| Open field reaction chamber | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | Animal behavior | |
| Pertussis toxin | Calbiochem | 516560 | Stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | Made in our laboratory | ||
| Scissor | Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd | J21010 | |
| Sealing film | Heathrow Scientific | HS 234526B | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002447 | |
| Steel ball | QIAGEN | 69975 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Tweezer | Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd | JD1060 | |
| μCT 35 desktop microCT scanner | Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland |
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