Summary
Het huidige protocol beschrijft de inductie van experimentele auto-immune encefalomyelitis in een muismodel met behulp van myeline oligodendrocytenglycoproteïne en het monitoren van het ziekteproces met behulp van een klinisch scoresysteem. Experimentele auto-immuun encefalomyelitis-gerelateerde symptomen worden geanalyseerd met behulp van muis femur micro-computertomografie analyse en open veld test om het ziekteproces uitgebreid te beoordelen.
Abstract
Multiple sclerose (MS) is een typische auto-immuunziekte van het centrale zenuwstelsel (CZS) gekenmerkt door inflammatoire infiltratie, demyelinisatie en axonale schade. Momenteel zijn er geen maatregelen om MS volledig te genezen, maar er zijn meerdere ziektemodificerende therapieën (DMT) beschikbaar om de progressie van de ziekte te beheersen en te verminderen. Er zijn significante overeenkomsten tussen de pathologische kenmerken van het CZS van experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) en MS-patiënten. EAE is op grote schaal gebruikt als een representatief model om de werkzaamheid van MS-geneesmiddelen te bepalen en de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor MS-ziekte te onderzoeken. Actieve inductie van EAE bij muizen heeft een stabiel en reproduceerbaar effect en is bijzonder geschikt voor het bestuderen van de effecten van geneesmiddelen of genen op auto-immuun neuro-inflammatie. De methode voor het immuniseren van C57BL/6J-muizen met myeline-oligodendrocytenglycoproteïne (MOG35-55) en de dagelijkse beoordeling van ziektesymptomen met behulp van een klinisch scoresysteem wordt voornamelijk gedeeld. Gezien de complexe etiologie van MS met diverse klinische manifestaties, kan het bestaande klinische scoresysteem niet voldoen aan de beoordeling van de behandeling van de ziekte. Om de tekortkomingen van een enkele interventie te voorkomen, worden nieuwe indicatoren gecreëerd om EAE te beoordelen op basis van klinische manifestaties van angstachtige stemmingen en osteoporose bij MS-patiënten om een uitgebreidere beoordeling van ms-behandeling te bieden.
Introduction
Auto-immuunziekten zijn een spectrum van aandoeningen veroorzaakt door de immuunrespons van het immuunsysteem op zijn eigen antigenen, wat resulteert in weefselbeschadiging of disfunctie1. Multiple sclerose (MS) is een chronische auto-immuunziekte van polyneuropathie in het centrale zenuwstelsel (CZS), gekenmerkt door inflammatoire infiltratie, demyelinisatie en neuronale axonale degeneratie 2,3. Op dit moment heeft MS maar liefst 2,5 miljoen mensen over de hele wereld getroffen, voornamelijk jonge en middelbare leeftijden van 20-40 jaar, die vaak de ruggengraat vormen van hun familie en samenleving. Dit heeft aanzienlijke impact en schade veroorzaakt voor gezinnen en de samenleving 2,4.
MS is een multifactoriële ziekte met diverse en complexe klinische manifestaties. Naast klassieke neurologische aandoeningen die worden gekenmerkt door inflammatoire infiltratie en demyelinisatie, vertoont MS vaak visuele beperkingen, limb dyskinesie en cognitieve en emotionele stoornissen 5,6,7. Als MS-patiënten niet de juiste en juiste behandeling krijgen, zal de helft van hen na 20 jaar in een rolstoel leven en bijna de helft van hen zal depressieve en angstsymptomen ervaren, wat leidt tot veel hogere niveaus van zelfmoordgedachten dan de algemene bevolking 8,9.
Ondanks een lange onderzoeksperiode blijft de etiologie van MS ongrijpbaar en is de pathogenese van MS nog niet opgehelderd. Diermodellen van MS hebben het mogelijk gemaakt om te dienen als testinstrumenten om ziekteontwikkeling en nieuwe therapeutische benaderingen te verkennen, ondanks de aanzienlijke verschillen tussen het knaagdier en het menselijke immuunsysteem, terwijl tegelijkertijd enkele basisprincipes worden gedeeld. Experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) is momenteel het ideale diermodel voor het bestuderen van MS, dat autoantigeenimmuniteit van myeline-eiwitten gebruikt om auto-immuniteit te induceren voor CZS-componenten bij gevoelige muizen, met de toevoeging van complete Freund's adjuvans (CFA) en kinkhoesttoxine (PTX) om de humorale immuunrespons te verbeteren. Afhankelijk van de genetische achtergrond en immuunantigenen worden verschillende ziekteprocessen, waaronder acute, relapsing-remitting of chronisch, verkregen om verschillende klinische vormen van MS 10,11,12 na te bootsen. De relevante immunogenen die vaak worden gebruikt bij de constructie van EAE-modellen zijn afkomstig van zelf-CZS-eiwitten, zoals myeline-basiseiwit (MBP), proteolipide-eiwit (PLP) of myeline-oligodendrocytenglycoproteïne (MOG). MBP- of PLP-geïmmuniseerde SJL / L-muizen ontwikkelen een relapsing-remitting-cursus en MOG triggert chronische progressieve EAE bij C57BL / 6-muizen 11,12,13.
Het belangrijkste doel van disease-modifying therapy (DMT) is het minimaliseren van ziektesymptomen en het verbeteren van functie6. Verschillende geneesmiddelen worden klinisch gebruikt om MS te verlichten, maar er is nog geen medicijn gebruikt om het volledig te genezen, wat de noodzaak van synergetische behandeling onthult. C57BL / 6-muizen zijn momenteel de meest gebruikte om transgene muizen te construeren, en in dit werk werd een EAE-model geïnduceerd door MOG35-55 in C57BL / 6J-muizen met een 5-puntsschaal gebruikt om de progressie van de ziekte te volgen. EAE-modellen lijden ook aan angstachtige stemmingen en botverlies, en de alom bekende demyeliniserende laesies. Hier wordt ook de methode beschreven om de symptomen van EAE vanuit meerdere perspectieven te beoordelen met behulp van open-veldtest en micro-computertomografie (Micro-CT) -analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het Animal Care Committee van tongji University keurde het huidige werk goed en alle richtlijnen voor dierenverzorging werden gevolgd. Mannelijke of vrouwelijke C57BL/6J muizen tussen 8-12 weken oud werden gebruikt voor de experimenten. Er werd voor gezorgd dat de leeftijd en het geslacht in de experimentele groepen hetzelfde waren; anders werd de gevoeligheid voor de ziekte aangetast. Muizen werden gehuisvest in een specifieke pathogeenvrije omgeving met afwisselend 12 uur lichte en donkere cycli onder constante omstandigheden (kamertemperatuur 23 ± 1 °C, vochtigheid 50% ± 10%), met vrije toegang tot muizenvoer en water.
1. Bereiding van MOG35-55 emulsie
- Voeg warmte-geïnactiveerde gelyofiliseerde Mycobacterium tuberculosis (MTB, H37Ra) toe om het adjuvans adjuvans van Freund te voltooien (zelf bevat het 1 mg / ml warmte-geïnactiveerde MTB, H37Ra), wat resulteert in een uiteindelijke MTB-concentratie van 5 mg / ml (zie materiaaltabel).
OPMERKING: De hele operatie moet worden voltooid in de bioveiligheidskast; open de blaaslucht niet. - Los het gelyofiliseerde MOG35-55-peptide (zie materiaaltabel) op met steriele voorgekoelde fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (zonder calcium- en magnesiumionen, pH 7,4) om de antigeenoplossing te bereiden in de concentratie van 2 mg / ml.
- Neem een schone microcentrifugebuis van 2 ml en voeg een gesteriliseerde stalen kogel van 5 mm (zie materiaaltabel) toe aan elke buis.
- Voeg 500 μL compleet Freund's adjuvans met 5 mg/ml MTB en 500 μL MOG35-55 antigeenoplossing toe aan de bovenstaande microcentrifugebuis die één stalen kogel bevat.
- Oscilleer de bovenstaande buis op een TissueLyser (zie Tabel van Materialen) gedurende 10 minuten, koel af op ijs gedurende 10 minuten en herhaal vier keer om het goed te mengen en uiteindelijk een witte viskeuze oplossing te vormen.
OPMERKING: Goede emulgering is een belangrijke stap bij het bereiden van MOG35-55-emulsie , dus grondig mengen is vereist. De TissueLyser is ingesteld op een snelheid van 28 Hz.
2. Bereiding van kinkhoesttoxine (PTX)
- Bereid PTX met ddH2O in een concentratie van 100 μg/ml en bewaar bij 4 °C.
- Verdun de PTX-stamoplossing 50 keer met steriele 1x PBS (zonder calcium- en magnesiumionen, pH 7,4) om een oplossing van 200 ng/100 μL te maken voor gebruik.
3. Vaststelling van het EAE-diermodel
- Bouw het EAE-model met behulp van de 8-12 weken oude mannelijke of vrouwelijke C57BL / 6J-muizen. Zorg ervoor dat de muizen voldoende zijn geacclimatiseerd aan de voedingsomgeving voorafgaand aan immunisatie.
- Centrifugeer de bereide MOG35-55 emulsie (stap 1) bij 4 °C gedurende 2-3 s door op de pulseknop van de apparatuur te drukken (zie Materiaaltabel) om alle emulsies aan de onderkant van de buis neer te slaan.
OPMERKING: MOG35-55 emulsie kan enkele dagen bij -20 °C worden bewaard. Om falen van geneesmiddelen te voorkomen, wordt het aanbevolen om het zo snel mogelijk te gebruiken. - Bevestig een naald van 22 G aan een spuitvat van 1 ml, zuig de MOG35-55-emulsie aan en breng de MOG35-55-emulsie over in een nieuw spuitvat van 1 ml. Beveilig de verbinding tussen de spuithouder van 1 ml en een naald van 26 G met afdichtingsfolie (zie materiaaltabel).
OPMERKING: Vermijd luchtbellen bij het laden van MOG35-55 emulsie in spuitvaten van 1 ml. - Veeg en desinfecteer de injectieplaats met 70% ethanol.
- Injecteer de MOG35-55 emulsie subcutaan aan elke kant van de dorsale wervelkolom van de muizen, 100 μL aan elke kant. Observeer de automatische vorming van bolvormige massa's onder de huid van de dorsum van de muizen nadat de injectieoperatie is voltooid.
OPMERKING: Zorg ervoor dat ervaren experimentatoren het immunisatieproces uitvoeren en dat de injectie voorzichtig en langzaam wordt uitgevoerd om de druk op muizen te minimaliseren. - Injecteer de bovenstaande muizen intraperitoneaal met 100 μL PTX (stap 2).
OPMERKING: De dag van immunisatie is dag 0. Zorg er ook voor dat de muizen nauwkeurig kunnen worden geïdentificeerd voor latere dagelijkse evaluatie, zoals het gebruik van een kleurmarker op de staart van de muizen. - Injecteer dezelfde dosis PTX op dag 2 na immunisatie.
- Bereid een groep niet-gevaccineerde muizen voor als wild-type (WT) muizen.
4. Klinische monitoring van muizen
- Noteer dagelijks het lichaamsgewicht van EAE- en WT-muizen.
OPMERKING: De ernst van EAE is positief gecorreleerd met het gewichtsverlies van muizen, dus lichaamsgewicht is ook een zeer belangrijke monitoringindex. - Controleer de status van muizen van 0-21 dagen na immunisatie met behulp van het 0-5 scoresysteem vermeld in tabel 1.
OPMERKING: Symptomen tussendoor worden geteld als plus of min 0,5 punt.
5. Open veld test
OPMERKING: De proefdieren die voor deze stap zijn geselecteerd, zijn EAE-muizen in de vroege aanvangs-, piek- en remissieperioden. Daarnaast werden WT-muizen gebruikt als controle. Opgemerkt moet worden dat alle muizen werden getest op angstachtig gedrag voorafgaand aan het modelleren om muizen met angststoornissen uit te sluiten voor EAE-modellering. Bovendien werden EAE-muizen in piek- en remissieperioden met volledige motorische onbekwaamheid uitgesloten van de test.
- Bereid een 40 × 40 × 40 cm3 open veld reactiekamer en een locomotie activiteit (open veld) video analysesysteem (zie Tabel van materialen).
OPMERKING: De camera is geïnstalleerd in een positie die de doos volledig bedekt, de reactieruimte is gelijkmatig verlicht en de testruimte moet een rustige ruimte zijn. - Plaats de testmuizen 1 uur voor aanvang van het experiment in de testruimte voor gewenning.
- Spuit het hele gebied in met 70% ethanol en veeg af met een schone papieren handdoek om ervoor te zorgen dat de reactiekamer schoon is voordat u met de test begint.
- Verwijder elke muis afzonderlijk uit zijn kooi en plaats hem in dezelfde hoek van de arena voordat je begint te verkennen.
OPMERKING: De onderkant van het vak is verdeeld in 16 rasters, waarvan het middelste vier rastergebied het centrale gebied is en het omliggende gebied het perifere gebied. - Klik op de knop Start Capture in de menubalk van het video-analysesysteem, neem de tijd op en begin met fotograferen.
- Blijf rustig in de testruimte.
- Laat de muis gedurende 5 minuten vrij bewegen tijdens het opnameproces.
- Stop het acquisitiesysteem en sla de video op.
- Haal de muis uit de arena, zet hem terug in de kooi en ga verder met de volgende muis.
OPMERKING: Reinig het testgebied met 70% ethanol tussen de runs om geuren en andere stoffen te verwijderen. - Analyseer de resultaten met behulp van het video-analysesysteem.
6. Analyse van botfenotype
- Euthanaseer de EAE- en WT-muizen door cervicale dislocatie op de 21e dag.
OPMERKING: Personeel dat cervicale dislocatieoperaties uitvoert, moet goed worden opgeleid om de pijn tijdens de dood van het dier te minimaliseren. - Laat de muis plat in een ontleedbak liggen en fixeer de ledematen.
- Houd de huid van de achterpoten van de muis vast met een tang en open de muizenhuid en het spierweefsel met een schaar.
- Scheid het dijbeen voorzichtig van het scheenbeen en heupbot met een schaar.
- Verwijder de spier die zich met een schaar aan het dijbeen hecht en plaats het dijbeen in 70% ethanol bij kamertemperatuur.
- Scan het distale dijbeen met behulp van een micro-CT-systeem (zie Materiaaltabel) met een isotrope voxelgrootte van 10 μm, met een piek röntgenbuisspanning van 70 kV en een röntgenintensiteit van 0,114 mA.
OPMERKING: Een 3D Gauss-filter maakt het denoïseren van 2D-drempelafbeeldingen mogelijk. - Analyseer de 100 plakjes gescand vanaf de middelste femurschacht om femurparameters te meten, waaronder botvolume, weefselvolume, botmineraaldichtheid, trabeculaire scheiding, trabeculair getal, trabeculaire verbindingsdichtheid en trabeculaire en corticale dikte.
OPMERKING: Vanaf het proximale uiteinde van de distale femurgroeischijf bij muizen werden secties gevonden die volledig verstoken waren van epifysaire kapstructuren en bleven 100 plakjes uitstrekken naar het proximale dijbeen, die handmatig contouren werden geschetst op verschillende voxels weg van het binnenste corticale oppervlak om epifysaire trabeculae te identificeren. - Maak de 3D-reconstructies door drempel 2D-afbeeldingen van contourgebieden in het micro-CT-systeem te stapelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na immunisatie van de muizen wordt het lichaamsgewicht van de muizen dagelijks geregistreerd en worden hun klinische symptomen geëvalueerd volgens het hierboven beschreven protocol (stap 4). Bij C57BL /6J-muizen geïmmuniseerd met MOG-peptide, omdat de locatie van de laesie voornamelijk beperkt is tot het ruggenmerg, verspreidt de pathogenese van EAE-muizen zich van het staarteinde naar het hoofd. Aan het begin van de ziekte vertonen EAE-muizen zwakte en hangen van de staart, gevolgd door zwakte van de achterpoten, ongecoördineerde beweging en verlamming. Naarmate de ziekte verergert, ontwikkelt het zich geleidelijk tot de zwakte van de voorpoten, verlamming en veroorzaakt het in ernstige gevallen problemen bij het verplaatsen van de muizen en zelfs bijna de dood. Zoals te zien is in figuur 1A, toont het toestandsdiagram van de muizen met verschillende gradaties van EAE-pathologie een voorbeeldig beeld van een groep muizen die verandert van asymptomatische naar hoog scorende EAE-symptomen (score 4). Er is ook eerder vermeld dat het lichaamsgewicht van EAE-muizen gecorreleerd is met klinische symptomen. In vergelijking met WT-muizen kan gewichtsverlies bij EAE-muizen beginnen op te treden in de eerste paar dagen na immunisatie, terwijl de klinische symptomen van EAE-muizen meestal beginnen op dag 6-9 na immunisatie en een piek bereiken op dag 14-16. Hierna herstellen de symptomen van EAE-muizen over het algemeen gedeeltelijk en tegelijkertijd zal het gewichtsverlies van de muizen worden verlicht (figuur 1B, C). Het verloop van het begin van EAE is dus meestal verdeeld in perioden met een vroeg begin, piek en remissie, en de voorspelling van deze tijdspunten is belangrijk bij het beoordelen van uitkomstparameters. In het algemeen, om de productie van immuuncellen en cytokines op de plaats van EAE-laesies te analyseren, kunnen immuuncellen in de hersenen en het ruggenmerg van EAE-muizen op het hoogtepunt van de ziekte worden geïsoleerd en verder worden verwerkt, wat kan worden geanalyseerd door flowcytometrie14,15. Het ruggenmergweefsel bij piekontwrichting is ook het meest geschikt voor het bereiden van hematoxyline- en eosine (H&E)-kleuring en Luxol-snelle blauwe kleuring om de ontstekingscelinfiltratie en demyelinisatie van het ruggenmerg verder te onderzoeken14,16. Voor het monitoren van veranderingen in het immuunsysteem op verschillende aanvangstijden van EAE zijn milt en lymfeklieren bij vroege aanvang ook essentiële opties17,18. Bovendien worden cellen uit de milt of lymfeklieren van MOG-geïmmuniseerde EAE-muizen vaak gebruikt om overdrachtsmodellen te construeren, die na restimulatie van MOG in vitro worden overgedragen aan ontvangende muizen om passieve immunisatie van EAE-muizen te induceren18.
MS is een auto-immuun inflammatoire geïnduceerde demyeliniserende laesie van het centrale zenuwstelsel gekenmerkt door inflammatoire demyelinisatie en neuronaal verlies 2,3. Deze ziekte gaat meestal gepaard met psychiatrische comorbiditeiten, zoals affectieve stoornissen, waarvan angststoornis veel voorkomt bij MS-patiënten, met tot 30% van de MS-patiënten die lijden aan angst 9,19. Angststoornis is een psychiatrische afwijking die wordt gekenmerkt door overmatige emotionele stress en zorgen. Open veldtest wordt vaak gebruikt om gedrag te analyseren op angst bij knaagdieren20,21. Met behulp van het analyseren van het exploratiegedrag van EAE-muizen in open veldtests tijdens vroege aanvangs-, piek- en remissieperioden, bleek dat EAE-muizen ook angstachtig gedrag vertoonden dat vergelijkbaar was met dat van MS-patiënten (figuur 2A). In de open veldtest hebben angstige knaagdieren de neiging om verminderde activiteit en verhoogd stereotiep gedrag te hebben, waaronder een voorkeur om dichter bij hoeken te zijn, een voorkeur voor het perifere domein en een gebrek aan verlangen om het centrale gebied te verkennen. In vergelijking met WT-muizen hadden EAE-muizen significant lagere loopafstand en bewegingstijd in alle drie de perioden van de ziekte, zelfs in het vroege begin van de ziekte toen EAE-muizen nog geen motorische beperking hadden (figuur 2B, C). Bovendien passeren EAE-muizen aanzienlijk minder afstand en blijven ze minder in het centrale gebied dan normale muizen, en bewegen ze zelfs alleen in het perifere gebied, met een duidelijke angstachtige stemming (figuur 2D, E). EAE-muizen vertonen nog steeds een sterke angstachtige stemming wanneer het begin mild is, dat wil zeggen motorische coördinatie. Sommige studies suggereren dat dit kan worden toegeschreven aan milde neuro-inflammatie, die de secretie van neurotransmitters verder beïnvloedt22,23. Open veldtests die angstachtige stemmingstriggers bij EAE-muizen monitoren, kunnen onderzoekers helpen ms-psychiatrische comorbiditeiten te begrijpen en te behandelen.
Met het verloop van de ziekte manifesteert MS zich uiteindelijk als dyskinesie. Studies hebben aangetoond dat MS-patiënten een hogere gevoeligheid hebben voor osteoporose en fracturen, voornamelijk als gevolg van botmassaverlies, en dat de ernst van dyskinesie sterk gecorreleerd is met de botdichtheid van de patiënt24,25. Een soortgelijk fenomeen kan worden waargenomen door Micro-CT-analyse met behulp van het EAE-diermodel (figuur 3A, H). Uit de trabeculaire analysegegevens van dijbeen bij muizen, ondergingen EAE-muizen een significante afname van de botmineraaldichtheid (BMD) in vergelijking met WT-muizen, wat een belangrijke indicator is van de respons op botsterkte en een belangrijke basis voor de diagnose van osteoporose (figuur 3B). Verdere analyse toonde aan dat trabeculair botverlies significant optrad bij EAE-muizen in vergelijking met gezonde WT-muizen en gepaard ging met een vermindering van de trabeculaire verbindingsdichtheid, trabeculaire aantallen en trabeculaire dikte. Deze zijn allemaal kenmerkend voor verminderde botmassa, wat suggereert dat EAE ook trabeculair botverlies veroorzaakt in het dijbeen van muizen (figuur 3C-F). Tegelijkertijd veranderde de structurele morfologie van het bottrabeculae en nam de afstand van de trabeculae aanzienlijk toe; hoe groter de afstand, hoe osteoporotischer het bot (figuur 3G). Dit komt overeen met het idee dat MS-patiënten vatbaar zijn voor osteoporose. In corticale botten van de femurdiafyse was de dikte van corticale bot in het EAE-model significant minder dan die bij normale muizen (figuur 3I). Bij MS zijn verminderde beweeglijkheid en verhoogde spierdystrofie sterk geassocieerd met osteoporose, fracturen en verhoogde botresorptie als gevolg van verminderde mechanische krachten, waardoor de botintegriteit geleidelijk afneemt, waardoor het risico op osteoporose en fractuur toeneemt26. Micro-CT-analyse van het dijbeen bij EAE-muizen kan de gezondheid van de botten goed volgen en de interventie is gunstig bij het beheersen van de toestand van EAE.
Figuur 1: Monitoring van klinische symptomen van EAE. (A) Het voorbeeldige beeld van de muizen met verschillende gradaties van EAE-pathologie. (B) Gewichtsverandering bij WT- en EAE-muizen. (C) Klinische score bij WT- en EAE-muizen. De gegevens worden gegeven als gemiddelde ± SEM (n = 5), ***p < 0,001 versus WT-muizen, tweeweg ANOVA-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Angstachtig gedrag van EAE-muizen in de open veldtest. (A) Representatieve trackplots van de open veldtest. Reisafstand (B), duur van de activiteit (C), reisafstand in het centrum (D) en tijd doorgebracht in het centrum (E) van WT-muizen en EAE-muizen in vroege aanvangs-, piek- en remissieperioden. De gegevens zijn gemiddeld ± SEM (n = 3), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 versus WT-muizen, Student's t-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Micro-CT-analyse van de botgezondheid bij EAE-muizen. (A) Representatieve 3D-beelden van femorale trabeculaire architectuur (schaalbalken, 100 μm). Botmineraaldichtheid (B), botvolume/weefselvolumeverhouding (C), verbindingsdichtheid (D), aantallen (E), dikte (F) en scheiding (G) van femoraal trabeculair werden bepaald door Micro-CT-analyse. (H) Representatieve 3D-beelden van corticale botten (schaalstaven, 100 μm). (I) Corticale dikte verkregen uit microcomputed tomografiegegevens. De gegevens zijn gemiddeld ± SEM (n = 3), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 versus WT-muizen, Student's t-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Partituur | Klinisch teken | ||
| 0 | Geen klinische symptomen | ||
| 0.5 | Staartzwakte, voorzijde van staartdruppeling | ||
| 1 | Staart volledig verlamd | ||
| 2 | Milde verlamming van de achterpoten (zwakte van beide achterpoten of eenzijdige verlamming, ongecoördineerd lopen, reactie op knijpen) | ||
| 3 | Volledige verlamming van achterpoten, achterpoten slepen en lopen, achterpoten reageren niet op knijpen | ||
| 4 | Verlamming van de achterpoten en zwakte van de voorpoten | ||
| 5 | Bijna dood of stervende | ||
Tabel 1: Klinisch scoresysteem.
| Antigeen | Zeven | Karakteristiek | Toepassing | Beperking | ||
| PLP | SJL/J34 | Relapsing-remitting EAE | Studie van de cellulaire en moleculaire gebeurtenissen die betrokken zijn bij klinische terugval | Beperkt tot T-celspecifieke reacties; Het bestuderen van specifieke genen en paden in de SJL/J-stam is een uitdaging | ||
| Mbp | SJL/J35 | Recidiverende verlamming gevolgd bij gedeeltelijke of totale ontvangers na herstel van acute verlamming | Studie van neuro-inflammatie en activering van het immuunsysteem | Beperkt tot T-celspecifieke reacties; Het bestuderen van specifieke genen en paden in de SJL/J-stam is een uitdaging | ||
| MOG35-55 | C57BL/631 | Primaire progressieve EAE; Chronisch progressieve EAE | Studie van axonale schademechanismen; Studie van moleculaire ziektemechanismen in transgene en knock-out modellen | Primaire demyelinisatie en myeline regeneratie studies zijn van beperkte waarde | ||
| Ruggenmerghomogenaat | Biozzi ABH36 Zoekertjes | Relapsing-remitting EAE | Studie van myelineregeneratie en neuroprotectieve therapie voor MS | Niet klinisch progressief, met accumulatie van neurologische tekorten in de loop van de tijd; Beperkt tot CD4 T-cel specifieke reacties | ||
| Theiler's murine encefalomyelitis virus | Meerdere muizenstammen zijn zeer gevoelig, waaronder SJL/J, SWR, PL/J12,31 | Virale modellen van inflammatoire demyelinisatie | Studie van axonale letsels en ontstekingsgeïnduceerde demyelinisatie | Er zijn geen MS-specifieke virale infecties vastgesteld; Myelineregeneratie is moeilijk te beoordelen, demyelinisatie en myelineregeneratie vinden gelijktijdig plaats | ||
| Cuprizone | Op grote schaal gebruikt in C57BL/6-muizen, terwijl andere stammen, zoals de CD1-stam, minder gevoelig zijn voor door koperen cuprizon geïnduceerde schade37,38 | Toxisch model van demyelinisatie en remyelinisatie | Studie van T-cellen-onafhankelijke demyelinisatie, met name myelineregeneratie en basis myelineherstelprocessen | Significante spontane myeline regeneratie treedt op na het stoppen van toxische schade; Demyelinisatie is hersengebiedspecifiek en niet nuttig voor het bestuderen van demyelinisatie van het ruggenmerg | ||
| Lysolecithine | SJL/J12, C57BL/639, enz. | Toxisch model van demyelinisatie en remyelinisatie | Studie van T-cellen-onafhankelijke demyelinisatie, met name myelineregeneratie en basis myelineherstelprocessen | Gebrek aan immuunrespons waargenomen tijdens MS | ||
| Ethidiumbromide | C57BL/640, enz. | Toxisch model van demyelinisatie en remyelinisatie | Studie van focale demyeliniserende laesies en voorspelling van de kinetiek van demyelinisatie en myelineregeneratie | Ethidiumbromide beschadigt alle nucleolus bevattende cellen; Beperkte correlatie met MS | ||
Tabel 2: Verschillende muismodellen van MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MS is een demyeliniserende ontstekingsziekte van het CZS en is een van de meest voorkomende neurologische aandoeningen die chronische invaliditeit bij jongeren veroorzaken, waardoor gezinnen en de samenleving een enorme last krijgen 3,4. MS is altijd geclassificeerd als een orgaanspecifieke T-cel-gemedieerde auto-immuunziekte, waardoor het auto-immuunsysteem langzaam het CZS uitholt, waarbij meerdere systemen in het hele lichaam betrokken zijn27. Typische klinische symptomen zijn visuele beperking, motorische stoornissen, cognitieve en emotionele stoornissen, enz. 6,7. MS is een verwoestende ziekte die geleidelijk zal verergeren als het niet goed wordt behandeld, wat leidt tot ernstige blindheid en verlamming28. De pathogenese van MS is nog niet volledig begrepen, omdat de klinische manifestaties en pathologische progressie ervan heterogeen zijn en daarom diermodellen essentieel zijn voor het onderzoek en de ontwikkeling van de behandeling van MS.
Het meest bestudeerde diermodel voor MS is EAE, dat voornamelijk twee modelleringsmethoden heeft: actieve immunisatie en passieve immunisatie29. De eerste wordt op grote schaal gebruikt vanwege zijn eenvoud, gebrek aan muisbestraling en korte cyclustijd. Het actieve EAE-immuunmodel induceert auto-immuunreacties in het CZS door knaagdieren te immuniseren met zelfmyeline-antigenen of hun daaropvolgende peptiden, die zich meestal manifesteren als staartzwakte en ledemaatverlamming13. In het bijzonder wordt het EAE-model geïnduceerd door MOG35-55 bij C57BL / 6J-muizen gekenmerkt door afwisselende remissie-terugvalcycli, vergezeld van CZS-ontsteking, demyelinisatie en axonaal letsel, waardoor de MOG35-55-geïnduceerde EAE het voorkeursmodel11,12 is. EAE kan goed worden geïnduceerd bij muizen die gesensibiliseerd zijn door subcutane injectie van MOG35-55-peptide, geëmulgeerd met immunopotentiator CFA verrijkt met MTB, en een intraperitoneale injectie van PTX met bloed-hersenbarrière verstorend effect op dagen 0-230. De grootste uitdaging voor het EAE-model is de lage incidentie van zwakke symptomen en verschillende beïnvloedende factoren zijn van cruciaal belang voor het verloop van het experiment. (1) De leeftijd en omgeving van muizen zullen de gevoeligheid voor EAE beïnvloeden. Daarom moeten muizen van dezelfde leeftijd vóór het experiment worden geselecteerd. De muizen moeten worden gewogen en willekeurig worden gegroepeerd voordat de kooi wordt toegewezen, en het gewicht van elke groep moet dichtbij worden gehouden. Zorg er ook voor dat de omgevingsomstandigheden tussen onafhankelijke experimenten vergelijkbaar zijn. (2) De concentratie van PTX: De belangrijkste rol van PTX is het verhogen van de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière, waardoor pathogene T-cellen het CZS kunnen binnendringen om relevante cytokines uit te scheiden en de ontstekingsreactie te bevorderen, wat uiteindelijk leidt tot de hydrolyse van myeline-eiwitten verpakt in de buitenste laag van zenuwaxonen. Het begin van de ziekte bij EAE-muizen werd vertraagd met een afnemende PTX-toedieningsconcentratie en de ernst van de ziekte zou worden verzwakt als PTX met meer dan 60% zou afnemen. (3) Het oplossen van MOG35-55-antigeen: Om bevriezing en ontdooiing te voorkomen, wordt aanbevolen om het gelyofiliseerde MOG35-55-antigeen in afzonderlijke verpakkingen, 4 mg / buis, aan te schaffen om bevriezing en ontdooiing te voorkomen. Ptx wordt ook gebruikt voor het oplossen in plaats van steriel water, omdat het beter is om te emulgeren met CFA met behulp van PTX. (4) MOG35-55-antigeen en CFA moeten voldoende worden geëmulgeerd door oscilleren om een water-in-oliestructuur te vormen, en de emulsedruppels verspreiden zich niet lang op het wateroppervlak, wat wijst op een goede emulgering. (5) Tweepuntsinjectie werd gebruikt voor eae-modellering bij muizen. De injectieplaats bevindt zich bij voorkeur boven de taille en onder de nek, dicht bij de wervelkolom, om te voorkomen dat muizen de huid likken en bijten, wat resulteert in het morsen van MOG35-55-emulsie.
Het EAE-model geïnduceerd door het MOG35-55-antigeen heeft echter nog steeds enkele beperkingen. Als een inflammatoir encefalopathiemodel van primaire axonale schade gemedieerd door CD4 T-cellen, is de belangrijkste laesie massale axonale degeneratie met secundaire demyelinisatie en minder primaire demyelinisatie, die verschilt van de MS-pathologie 31,32,33. Het EAE-model geïnduceerd door MOG35-55 weerspiegelt voornamelijk de immuunrespons die wordt aangedreven door CD4 T-cellen, terwijl andere immuuncellen zoals CD8 T- en B-cellen geen sterk gevoel van deelname aan dit modelhebben 31. Een andere beperkende factor is dat EAE geïnduceerd door MOG35-55 een zekere voorkeur heeft voor de immunologische component van MS-pathofysiologie, en andere diermodellen kunnen worden overwogen bij het overwegen van studies gericht op CZS-pathologieën, zoals de studie van demyelinisatie en myelineregeneratieprocessen 34,35,36,37,38,39,40, zoals beschreven in tabel 2 .
EAE is een effectieve voorspeller bij het imiteren van de auto-immuuneigenschappen van MS, evenals het ontstekings- en demyelinisatiemechanisme12, waardoor veel wetenschappers graag de immunomodulerende mechanismen willen bestuderen en andere klinische symptomen van MS negeren. Studies hebben aangetoond dat MS-geassocieerde angst wordt toegeschreven aan pathofysiologische processen zoals immuunontregeling en hersenontsteking22, 23,41. Geestelijke gezondheidsproblemen, zoals angst, komen vooral vaak voor bij mensen met MS, en angststoornis kan de uitvoering van elementaire dagelijkse taken belemmeren en de kwaliteit van leven aanzienlijk beïnvloeden42,43. Veranderingen in het bewegingsvermogen van EAE-muizen kunnen veranderingen in neurale processen voorspellen. In open-veldexperimenten trad angstachtig gedrag op bij EAE-muizen, waaronder een afname van verkennend gedrag dat vroeg begon met het begin van de ziekte (in wezen proefpersonen met klinische scores <0,5 en locomotorisch vermogen bijna net zo goed als normale muizen), wat suggereert dat het begin van angstachtig gedrag voorafgaat aan motorische stoornissen. Bovendien verbeterden EAE-muizen in de remissieperiode niet angstachtig gedrag met een verhoogd motorisch vermogen. De opkomst van de ontstekingsreactie kan verantwoordelijk zijn voor de mentale stoornis bij EAE-muizen door neuronale activiteit, wat leidt tot stemmingswisselingen, en upregulatie van inflammatoire cytokineniveaus interfereert met de striatale synaptische functie voorafgaand aan het begin van motorische stoornissen23,41. De open veldtest vereist echter aandacht voor het feit dat de testruimte een rustige ruimte moet zijn en dat de testmuizen 1 uur van tevoren aan de kamer moeten acclimatiseren om overmatige druk veroorzaakt door de nieuwe omgeving te voorkomen. Extra reiniging met ethanol is vereist tussen de tests om geuren en andere stoffen te verwijderen die door de laatste proefpersoon zijn achtergelaten. De belangrijkste beperking van de open veldtest is de interferentie veroorzaakt door motorische disfunctie bij EAE-muizen, en de test voor het evalueren van knaagdierangstachtig gedrag is gebaseerd op de afstand, tijd en het bereik van knaagdieractiviteit in de reactiekamer en kan het effect van motorische disfunctie op angstachtig gedrag niet uitsluiten. Daarom moeten toekomstige studies rekening houden met locomotorische stoornissen.
Traditionele methoden om botweefselgerelateerde studies te analyseren, gebruiken vaak tweedimensionale botsectiemicroscopie, die grotere problemen kan hebben bij het analyseren van structurele morfologie, dichtheidsverdeling, oriëntatieverdeling en andere kenmerken vanwege de invloed van tweedimensionale vlakken en inhomogeniteit van biologische exemplaren. Veel studies hebben de nauwkeurigheid en effectiviteit van het Micro-CT-systeem bevestigd om botmorfologie te beschrijven, en veel studies 44,45,46 hebben microstructuurdetectieresultaten bevestigd. De driedimensionale beeldvorming van botweefsel door Micro-CT zorgt voor meer intuïtieve en nauwkeurige bot histomorfometrie resultaten. Het is gelukt om kleine dieren en specimens te scannen zonder het dier uit te voeren of het weefselmonster te beschadigen, waardoor gedetailleerde driedimensionale ruimtelijke structuurinformatie in het weefselmogelijk is 44. Studies hebben aangetoond dat MS-patiënten gevoelig zijn voor botmassaverlies en osteoporose 24,25; Door het dijbeen van EAE-muizen met een Micro-CT-systeem te scannen en in beeld te brengen, kon een duidelijke verslechtering van de botmicroarchitectuur en verminderde botsterkte worden waargenomen in het dijbeen van EAE-muizen in vergelijking met WT-muizen die osteoporose hadden ontwikkeld. Micro-CT-analyse is relatief eenvoudig uit te voeren en relatief goedkoop, en Micro-CT live beeldvorming kan worden gebruikt om de gezondheid van de botten in de toekomst te controleren bij het toedienen van de behandeling aan EAE-muizen. Het nadeel is echter de afwezigheid van botvernieuwingsmarkers die zijn beoordeeld door middel van bloedmonsters of bothomorfometrie om fundamentele veranderingen in botbiotische homeostase bij EAE-muizente observeren 47. Regulatie van osteoblasten en osteoclasten kan in de toekomst binnen de studie worden overwogen.
MS is een multisymptomatische ziekte en het enige doel van ziektebeheer is om ziektesymptomen te minimaliseren. In het hierboven genoemde protocol kunnen de klinische symptomen van MS worden gesimuleerd door het MOG35-55 geïnduceerde EAE-model te construeren. EAE-muizen vertoonden klinische symptomen van motorische disfunctie en angstachtig gedrag en osteoporose. Het 5-punts scoresysteem, de open veldtest en de Micro-CT-analyse die in dit protocol worden beschreven, kunnen de pathologische symptomen van EAE-muizen vanuit meerdere perspectieven volgen en een referentieschema bieden voor de behandeling van EAE. Bij afwezigheid van effectieve ziektemodificerende geneesmiddelen kan een mogelijke combinatie van synergetische therapie de beste gelegenheid bieden om de symptomen te verlichten en de functie te verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de steun van de National Natural Science Foundation of China (32070768, 31871404, 31900658, 32270754) en het State Key Laboratory of Drug Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe(with 26 G needle) | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | 60017031 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | HAIKELASI | KY-LXG2A | |
| 22 G needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | 60017208 | |
| Complete Freund’s Adjuvant | Sigma | F5881 | Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL |
| Conditioned place preference system | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | Animal behavior | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | Stored at RT |
| Locomotion activity (open field) video analysis system | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | DigBehv-002 | Animal behavior |
| MOG35-55 peptide | Gill Biochemical Co., Ltd | GLS-Y-M-03590 | Stored at -20 °C |
| Mycobacterium tuberculosis H37Ra | BD | 231141 | Stored at 4 °C |
| Open field reaction chamber | Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd | Animal behavior | |
| Pertussis toxin | Calbiochem | 516560 | Stored at 4 °C |
| Phosphate Buffered Saline | Made in our laboratory | ||
| Scissor | Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd | J21010 | |
| Sealing film | Heathrow Scientific | HS 234526B | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002447 | |
| Steel ball | QIAGEN | 69975 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Tweezer | Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd | JD1060 | |
| μCT 35 desktop microCT scanner | Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland |
References
- Zhernakova, A., Withoff, S., Wijmenga, C. Clinical implications of shared genetics and pathogenesis in autoimmune diseases. Nature Reviews Endocrinology. 9 (11), 646-659 (2013).
- Filippi, M., et al.
- Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. Europen Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
- Rietberg, M. B., Veerbeek, J. M., Gosselink, R., Kwakkel, G., van Wegen, E. E. Respiratory muscle training for multiple sclerosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. 12 (12), (2017).
- O'Brien, K., Gran, B., Rostami, A. T-cell based immunotherapy in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Immunotherapy. 2 (1), 99-115 (2010).
- Feinstein, A., Freeman, J., Lo, A. C. Treatment of progressive multiple sclerosis: what works, what does not, and what is needed. Lancet Neurology. 14 (2), 194-207 (2015).
- Li, H., Lian, G., Wang, G., Yin, Q., Su, Z. A review of possible therapies for multiple sclerosis. Molecular and Cellular Biochemistry. 476 (9), 3261-3270 (2021).
- Lewis, V. M., et al. depression and suicide ideation in people with multiple sclerosis. Journal of Affective Disorders. 208, 662-669 (2017).
- Boeschoten, R. E., et al. Prevalence of depression and anxiety in Multiple Sclerosis: A systematic review and meta-analysis. Journal of the Neurological Sciences. 372, 331-341 (2017).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164, 1079-1106 (2011).
- Glatigny, S., Bettelli, E. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) as Animal Models of Multiple Sclerosis (MS). Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (11), 028977 (2018).
- Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G.
- Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis-potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
- DiToro, D., et al. Insulin-like growth factors are key regulators of T helper 17 regulatory T cell balance in autoimmunity. Immunity. 52 (4), 650-667 (2020).
- Jain, R., et al. Interleukin-23-induced transcription factor Blimp-1 promotes pathogenicity of T helper 17 cells. Immunity. 44 (1), 131-142 (2016).
- Du, C., et al. Kappa opioid receptor activation alleviates experimental autoimmune encephalomyelitis and promotes oligodendrocyte-mediated remyelination. Nature Communications. 7, 11120 (2016).
- Yang, C., et al. Betaine Ameliorates Experimental Autoimmune Encephalomyelitis by Inhibiting Dendritic Cell-Derived IL-6 Production and Th17 Differentiation. The Journal of Immunology. 200 (4), 1316-1324 (2018).
- McGinley, A. M., et al. Interleukin-17A serves a priming role in autoimmunity by recruiting IL-1β-producing myeloid cells that promote pathogenic T cells. Immunity. 52 (2), 342-356 (2020).
- Kocovski, P., et al. Differential anxiety-like responses in NOD/ShiLtJ and C57BL/6J mice following experimental autoimmune encephalomyelitis induction and oral gavage. Laboratory Animals. 52 (5), 470-478 (2018).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. C. Use of the Open Field Maze to measure locomotor and anxiety-like behavior in mice. Journal of Visualized Experiments. (96), e52434 (2015).
- Walsh, R. N., Cummins, R. A. The Open-Field Test: a critical review. Psychological Bulletin. 83 (3), 482-504 (1976).
- Tauil, C. B., et al. Depression and anxiety disorders in patients with multiple sclerosis: association with neurodegeneration and neurofilaments. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 54 (3), 10428 (2021).
- Gentile, A., et al. Interaction between interleukin-1beta and type-1 cannabinoid receptor is involved in anxiety-like behavior in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 13, 231 (2016).
- Hearn, A. P., Silber, E.
- Gibson, J. C., Summers, G. D.
- Ye, S., Wu, R., Wu, J.
- Zamvil, S. S., et al. Lupus-prone' mice are susceptible to organ-specific autoimmune disease, experimental allergic encephalomyelitis. Pathobiology. 62 (3), 113-119 (1994).
- Oh, J., Vidal-Jordana, A., Montalban, X.
- Smith, P.
- Aharoni, R., Globerman, R., Eilam, R., Brenner, O., Arnon, R. Titration of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)-Induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model. Journal of Neuroscience Methods. 351, 108999 (2021).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: experimental models and reality. Acta Neuropathological. 133 (2), 223-244 (2017).
- Goverman, J., Perchellet, A., Huseby, E. S. The role of CD8(+) T cells in multiple sclerosis and its animal models. Current Drug Targets. Inflammation and Allergy. 4 (2), 239-245 (2005).
- Schultz, V., et al. Acutely damaged axons are remyelinated in multiple sclerosis and experimental models of demyelination. Glia. 65 (8), 1350-1360 (2017).
- McRae, B. L., et al. Induction of active and adoptive relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) using an encephalitogenic epitope of proteolipid protein. Journal of Neuroimmunology. 38 (3), 229-240 (1992).
- Zamvil, S., et al. T-cell clones specific for myelin basic protein induce chronic relapsing paralysis and demyelination. Nature. 317 (6035), 355-358 (1985).
- Jackson, S. J., Lee, J., Nikodemova, M., Fabry, Z., Duncan, I. D. Quantification of myelin and axon pathology during relapsing progressive experimental autoimmune encephalomyelitis in the Biozzi ABH mouse. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 68 (6), 616-625 (2009).
- Gudi, V., Gingele, S., Skripuletz, T., Stangel, M. Glial response during cuprizone-induced de- and remyelination in the CNS: lessons learned. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 73 (2014).
- Yu, Q., et al.
- Dehghan, S., Aref, E., Raoufy, M. R., Javan, M. An optimized animal model of lysolecithin induced demyelination in optic nerve; more feasible, more reproducible, promising for studying the progressive forms of multiple sclerosis. Journal of Neuroscience Methods. 352, 109088 (2021).
- Kuypers, N. J., James, K. T., Enzmann, G. U., Magnuson, D. S., Whittemore, S. R. Functional consequences of ethidium bromide demyelination of the mouse ventral spinal cord. Experimental Neurology. 247, 615-622 (2013).
- Haji, N., et al. TNF-alpha-mediated anxiety in a mouse model of multiple sclerosis. Experimental Neurology. 237, 296-303 (2012).
- Butler, E., Matcham, F., Chalder, T. A systematic review of anxiety amongst people with Multiple Sclerosis. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 10, 145-168 (2016).
- Peres, D. S., et al. TRPA1 involvement in depression- and anxiety-like behaviors in a progressive multiple sclerosis model in mice. Brain Research Bulletin. 175, 1-15 (2021).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Chappard, D., Retailleau-Gaborit, N., Legrand, E., Baslé, M. F., Audran, M. Comparison insight bone measurements by histomorphometry and microCT. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (7), 1177-1184 (2005).
- Akhter, M. P., Lappe, J. M., Davies, K. M., Recker, R. R. Transmenopausal changes in the trabecular bone structure. Bone. 41 (1), 111-116 (2007).
- Wei, H., et al. Identification of Fibroblast Activation Protein as an Osteogenic Suppressor and Anti-osteoporosis Drug Target. Cell Reports. 33 (2), 108252 (2020).
