Summary
Die Mikrofluidik ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Entwicklung diagnostischer Tests. Oft sind jedoch teure Geräte und Materialien sowie aufwändige Fertigungs- und Handhabungstechniken erforderlich. Hier beschreiben wir das Herstellungsprotokoll eines mikrofluidischen Acrylgeräts für magnetische Mikro- und Nanopartikel-basierte Immunoassays in einer kostengünstigen und einfach zu bedienenden Umgebung.
Abstract
Mikrofluidische Systeme haben stark verbesserte Immunoassay-Techniken. Viele Mikrofabrikationstechniken erfordern jedoch spezialisierte, teure oder komplizierte Geräte, was die Herstellung teuer und inkompatibel mit der Massenproduktion macht, was eine der wichtigsten Voraussetzungen für Point-of-Care-Tests (POCT) in ressourcenarmen Umgebungen ist. Diese Arbeit beschreibt den Herstellungsprozess eines Acryls (Polymethylmethacrylat, PMMA) für Nanopartikel-konjugierte enzymatische Immunoassay-Tests unter Verwendung der Computer Numerical Control (CNC) Mikrofrästechnik. Die Funktionsweise des mikrofluidischen Geräts wird durch die Durchführung eines Immunoassays zum Nachweis eines kommerziellen Antikörpers unter Verwendung von Lysozym als Modellantigen gezeigt, das an 100 nm magnetische Nanopartikel konjugiert ist. Dieses Gerät integriert eine physikalisch versetzte Beschränkung von nur 5 μm Höhe, die verwendet wird, um magnetische Mikropartikel zu erfassen, die eine Magnetfalle bilden, indem ein externer Magnet platziert wird. Auf diese Weise reicht die magnetische Kraft auf die Immununterstützung konjugierter Nanopartikel aus, um sie einzufangen und dem Strömungswiderstand zu widerstehen. Dieses mikrofluidische Gerät eignet sich besonders für die kostengünstige Massenproduktion ohne den Verlust an Präzision für die Immunoassay-Leistung.
Introduction
In den letzten Jahren hat die Mikrofluidik eine wichtige Rolle bei Immunoassay-Technikengespielt 1. Die Miniaturisierungstechnologie hat viele herausragende Vorteile im Vergleich zu herkömmlichen Immunoassays, wie z. B. einen reduzierten Proben- und Reagenzienverbrauch, kürzere Inkubationszeiten, effizienten Lösungsaustausch sowie eine höhere Integration und Automatisierung2.
Darüber hinaus reduzieren mikrofluidische Systeme in Immunoassays in Verbindung mit magnetischen Nanopartikeln als Immununterstützung die Inkubationszeiten erheblich und erreichen aufgrund des erhöhten Oberflächen-Volumen-Verhältnisses eine hohe Detektionsempfindlichkeit3. Die Brownsche Bewegung der Partikel verbessert die Reaktionskinetik während der Bildung des Antigen-Antikörper-Komplexes 4,5. Darüber hinaus bieten die magnetischen Eigenschaften von Nanopartikeln die Vielseitigkeit, in verschiedene mikrofluidische Gerätekonfigurationen integriert zu werden, was sie zu einem idealen Kandidaten für die Signalübertragung und Molekülerfassung in miniaturisierten On-Chip-Biosensorsystemen macht5. Allerdings sind die magnetischen Kräfte aufgrund des hohen Oberflächen-Volumen-Verhältnisses deutlich schwächer als die Widerstandskräfte auf der Nanometerskala6. Daher kann die Erfassung von Nanopartikeln für entscheidende Immunoassay-Schritte wie Waschen und Detektion eine Herausforderung darstellen, und ein herkömmlicher Magnet reicht nicht aus4.
Eine effiziente Möglichkeit, die Nanopartikel zu manipulieren, ist die Verwendung einer mikrofluidischen Magnetfalle, die aus Eisenmikropartikeln besteht, die in einer mikrofluidischen Strukturverpackt sind 3. Wenn sich also ein externer Magnet nähert, entsteht innerhalb des magnetisierten porösen Mediums eine komplexe Wechselwirkung zwischen den magnetischen und den Flusskräften. Die magnetische Kraft, die auf die Nanopartikel wirkt, ist stark genug, um sie einzufangen und dem Strömungswiderstand 3,4,7 zu widerstehen. Dieser Ansatz erfordert Mikrofabrikationstechniken, die Auflösungen in der Größenordnung von wenigen Mikrometern erreichen, um mikrometrische Strukturen zu erzeugen, die die Mikropartikel zurückhalten.
Aktuelle Mikrofabrikationstechniken ermöglichen die hochauflösende Herstellung von Strukturen von wenigen Mikrometern bis zu Hunderten vonNanometern 8. Viele dieser Techniken erfordern jedoch eine spezielle, teure oder komplizierte Ausrüstung. Eine der Hauptschwierigkeiten ist die Forderung nach einem Reinraum für den Formenbau, der nach wie vor kostspielig und zeitaufwendigist 8,9. In jüngster Zeit haben Mikrofluidik-Ingenieure diesen Nachteil überwunden, indem sie eine Vielzahl alternativer Fertigungsmethoden mit verschiedenen Vorteilen wie reduzierten Kosten, schnelleren Durchlaufzeiten, billigeren Materialien und Werkzeugen und erhöhter Funktionalität entwickelthaben 8. Auf diese Weise brachte die Entwicklung neuer Mikrofabrikationstechniken kostengünstige Nicht-Reinraum-Methoden, die Auflösungen von nur 10 μm8 erreichen. Die Strukturierung kann direkt auf einem Substrat verwendet werden, ohne ein teures Formmuster zu erzeugen, wodurch ein zeitaufwändiger Prozess vermieden wird. Zu den direkten Fertigungsmethoden gehören CNC-Fräsen, Laserablation und Direktlithographie8. Alle diese Verfahren eignen sich zur Herstellung von Kanälen mit hohem Aspektverhältnis in einer Vielzahl von Materialien, unabhängig von ihrer Härte9, was neue und vorteilhafte Geometrien, physikalisches Verhalten und Qualitäten in mikrofluidischen Bauelementen ermöglicht8.
CNC-Mikrofräsen erzeugt mikroskalige Strukturen mit Schneidwerkzeugen, die Schüttgut von einem Substrat entfernen und ist eine effektive Herstellungsmethode für mikrofluidische Geräte10,11. Die Mikrofrästechnik kann in mikrofluidischen Anwendungen nützlich sein, um Mikrokanäle und Merkmale direkt auf der Arbeitsfläche zu erzeugen, was einen entscheidenden Vorteil bietet: Ein Werkstück kann in kurzer Zeit (weniger als 30 Minuten) hergestellt werden, wodurch die Durchlaufzeit vom Entwurf bis zum Prototyp erheblich verkürztwird 12. Darüber hinaus macht die breite Verfügbarkeit von Schneidzubehör verschiedener Materialien, Größen und Formen CNC-Fräsmaschinen zu einem geeigneten Werkzeug, das die Herstellung verschiedener Merkmale in vielen Arten von kostengünstigen Einwegmaterialien ermöglicht hat13.
Unter allen Materialien, die üblicherweise beim Mikrofräsen verwendet werden, bleiben Thermoplaste aufgrund ihrer vielen günstigen Eigenschaften und ihrer Kompatibilität mit biologischen Anwendungen eine führende Wahl10,14. Thermoplaste sind aufgrund ihrer signifikanten Vorteile für die Entwicklung kostengünstiger Einweg-Analysesysteme ein attraktives Substrat für mikrofluidische Systeme9. Darüber hinaus sind diese Materialien sehr gut für hochvolumige Herstellungsprozesse geeignet, wodurch sie für die Kommerzialisierung und Massenproduktion geeignet sind. Aus diesen Gründen gelten Thermoplaste wie PMMA seit den frühen Jahren der Mikrofluidik als zuverlässige und robuste Materialien10. Es wurden verschiedene Protokolle beschrieben, um geschlossene Kanäle in Thermoplasten herzustellen, wie z. B. Lösungsmittelbindung15, Wärmebindung 16 und ultraviolette (UV) / Ozon-Oberflächenbehandlungsbindung17.
In vielen Fällen reicht die mit herkömmlichen Mikrofräsmaschinen erreichte Positionierauflösung für einige mikrofluidische Anwendungen, die Strukturen kleiner als 10 μm erfordern, nicht aus. High-End-Mikrofräsen hat genug Auflösung. Leider ist seine Verwendung aufgrund der hohen Preise auf eine Handvoll Benutzer beschränkt12. Zuvor berichtete unsere Forschungsgruppe über die Herstellung und Manipulation eines kostengünstigen Werkzeugs, das die Bearbeitung von Strukturen von weniger als 10 μm ermöglicht und die Auflösung herkömmlicher Fräsmaschinen überwindet12. Die Leuchte ist eine Plattform, die im 3D-Druck mit einfacher Elektronik hergestellt wird und drei piezoelektrische Aktuatoren enthält. Die Oberfläche enthält scharnierförmige Gelenke, die es ermöglichen, sie anzuheben, wenn die piezoelektrischen Elemente gleichzeitig wirken. Die Verschiebung der Z-Achse kann mit einer Auflösung von 500 nm und einer Genauigkeit von ±1,5 μm12 gesteuert werden.
Dieses Papier stellt die Schritte des Herstellungsprozesses eines Acrylgeräts (PMMA) durch eine Mikrofrästechnik vor. Das Chipdesign besteht aus einem 200 μm breiten und 200 μm hohen Hauptkanal und einem Seitenkanal mit den gleichen Abmessungen, um den Fluss der Reagenzien zu reinigen. Im zentralen Bereich wird der Kanal durch eine physikalische Beschränkung von nur 5 μm Höhe unterbrochen, die mit der 3D-gedruckten piezoelektrischen Plattform dieser Gruppe12 hergestellt wurde, um magnetische Mikropartikel einzufangen, die eine magnetische Falle für Nanopartikel bilden, indem ein externer Magnet platziert wird. Wir zeigen die Funktionsweise des mikrofluidischen Geräts durch die Durchführung eines Immunoassays zum Nachweis eines kommerziellen Antikörpers unter Verwendung von Lysozym als Modellantigen, das an 100 nm magnetische Nanopartikel konjugiert ist. Dieses Gerät kombiniert verschiedene Eigenschaften, die es einzigartig machen4: Die Verwendung von magnetischen Nanopartikeln als Immununterstützung reduziert die Gesamttestzeit von Stunden auf Minuten; Die Verwendung eines fluorogenen Enzyms für den Nachweis ermöglicht Nachweisgrenzen, die mit denen von Standard-Enzym-gebundenen Immunassays (ELISAs) vergleichbar sind. und die Verwendung eines Thermoplasts als Herstellungsmaterial macht es kompatibel mit der Massenproduktion, was bei den magnetischen Fallen früherer mikrofluidischer Nanopartikel nicht der Fall war3, und macht es zu einem ausgezeichneten Kandidaten für die Entwicklung von POCT.
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Protocol
1. Mikrofräsen
- Oberflächenschliff
- Schalten Sie die Mikrofräse und die piezoelektrische Steuerung ein. Starten Sie die jeweilige Steuerungssoftware12.
- Wählen Sie die gewünschten Schaftfräser (Durchmesser 200 μm und 800 μm). Legen Sie sie in das entsprechende Fach der Fräsmaschine (Abbildung 1).
- Schneiden Sie 9 mm x 25 mm Rechtecke aus 1,3 mm dickem PMMA mit dem 800 μm Schaftfräsermeißel. Befestigen Sie eines dieser Rechtecke vorsichtig mit doppelseitigem Klebeband an der piezoelektrischen Plattform (Abbildung 2).
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie das Acrylrechteck immer an der gleichen Position platzieren, so dass eine der Ecken mit den Ursprungskoordinaten auf der x- und y-Achse für die Bearbeitung übereinstimmt. - Schließen Sie den Z-Sensor an und platzieren Sie ihn auf der Oberfläche des PMMA-Rechtecks. Wählen Sie den Erkennungsstift aus und bewegen Sie ihn über die Sensoroberfläche. Senken Sie den Stift manuell ab, ohne den Sensor zu berühren. Aktivieren Sie den Z0-Erkennungsmodus (Abbildung 3).
- Wählen Sie den 200-μm-Schaftfräser aus und bewegen Sie ihn zum x-y-Ursprung. Entfernen Sie den Z-Sensor. Senken Sie den Meißel vorsichtig ab, ohne die Acryloberfläche zu berühren.
- Drehen Sie den 200 μm Schaftfräser bei 14.500 U/min. Senken Sie sie langsam auf die Ursprungskoordinate auf der z-Achse ab (z = 0). Setzen Sie die z-Achse 30 μm unter den Ursprung zurück. Legen Sie diese Koordinate als neuen Z-Ursprung fest.
HINWEIS: Senken Sie das Bit niemals, wenn es sich nicht dreht. Andernfalls besteht die Gefahr, dass es bricht. - Klicken Sie in der Mikrofräsmaschinensoftware auf die Schaltfläche Schneiden , um das Cut-Panel zu aktivieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen und wählen Sie die .txt Datei (Supplemental Coding File 1) mit einem zuvor erstellten Code zum Schleifen der Acryloberfläche aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausgabe , um den Vorgang zu starten.
- Bringen Sie den Schaftfräser zu der Koordinate, an der die Restriktion bearbeitet wird. Verhindern Sie, dass der Schaftfräser von der Bodenoberfläche abhebt, sobald diese Koordinate erreicht ist, indem Sie auf die Schaltfläche Pause klicken. Andernfalls positionieren Sie den Schaftfräser manuell auf diese Koordinate (Abbildung 4A).
- Fräsen der 5-μm-Einschränkung
- Stellen Sie die Drehzahl des Schaftfräsers auf 11.000 U/min ein. Heben Sie die Plattform um 6,5 μm mit der Schnittstelle der piezoelektrischen Plattform an (ergänzende Abbildung S1). Bewegen Sie den Schaftfräser um 500 μm entlang der y-Achse. Setzen Sie die piezoelektrische Plattform mit der Steuerschnittstelle auf ihren Anfangswert auf der z-Achse zurück.
- Fräsen von Mikrokanälen
- Öffnen Sie die zuvor erstellte Designdatei aus der Designsoftware (Supplemental Design File 1). Klicken Sie auf die Schaltfläche Drucken . Öffnen Sie das Menü Eigenschaften und klicken Sie auf das Farbfenster, das der Schicht entspricht, die das zu bearbeitende Design enthält. Stellen Sie die Fertigungsparameter im Werkzeugfenster ein, wie in der ergänzenden Abbildung S2 angegeben.
- Deaktivieren Sie unerwünschte Ebenen, indem Sie im Pulldown-Menü Extras die Option Keine auswählen.
- Fräsen von Löchern
- Schalten Sie auf den 800 μm Schaftfräser um. Aktivieren Sie die Designschicht der Löcher mit 1,2 mm Durchmesser durch Klicken auf das entsprechende Farbfenster.
- Wiederholen Sie Schritt 1.3.2., stellen Sie in diesem Fall jedoch die entsprechenden Fertigungsparameter ein, wie in der ergänzenden Abbildung S3A für die Bohrungen beschrieben.
HINWEIS: Die Tiefe der bearbeiteten Löcher beträgt die Hälfte der Acryldicke. - Bearbeiten Sie zwei zusätzliche Löcher an kontralateralen Ecken des Rechtecks zur umgekehrten Ausrichtung des Acryls auf einer neuen Plattform (Abbildung 4B). Ziehen Sie das Acrylrechteck von der piezoelektrischen Plattform ab. Drehen Sie das Acryl um und kleben Sie es mit doppelseitigem Klebeband über den Adapter mit den bearbeiteten Säulen (Abbildung 4C,D).
- Öffnen Sie die Datei mit dem Entwurf der Bohrungen für die gegenüberliegende Fläche aus der Konstruktionssoftware (Supplemental Design File 2). Stellen Sie die entsprechenden Fertigungsparameter ein, wie in der ergänzenden Abbildung S3B beschrieben. Fräsen Sie die verbleibende Hälfte der Ein- und Auslasslöcher des Reagenzes mit einem Durchmesser von 1,5 mm und einer Tiefe von 0,7 mm (Ergänzende Abbildung S3C).
Abbildung 1: Platzierung der Schaftfräsermeißel . (A) Die 200 μm und 800 μm Schaftfräser werden platziert und durch eine Schraube am Stahlträger befestigt. (B) Jeder Schaftfräser wird zur automatischen Auswahl in das spezifische Fach der Mikrofräsmaschine gelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Piezoelektrische Plattform. Die Plattform wird im 3D-Druck hergestellt und besteht aus zwei sechseckigen Basen, die durch Scharniere verbunden sind, die eine feine Verschiebung in der z-Achse ermöglichen, die von drei piezoelektrischen Aktuatoren gesteuert wird. Es wird auch ein Acryladapter beobachtet, an dem das PMMA-Rechteck befestigt ist und der die Einstellung der Ausrichtungsecke der Koordinaten ermöglicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Z-Achsen-Kalibrierung. Die Schritte der Z-Achsen-Kalibrierung sind detailliert. (A) Der Z-Sensor enthält ein Kabel, das in die Mikrofräse eingesteckt wird. (B) Der Sensor wird direkt auf der zu bearbeitenden Oberfläche platziert. (C) Der Detektionsstift besteht aus einem Metallstab, der in einem speziellen Fach neben Schaftfräsern platziert ist. (D) Wenn beide Zubehörteile in Kontakt kommen, berechnet die Mikrofräse automatisch die Ursprungskoordinate auf der z-Achse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Rektifizierte Acryloberfläche . (A) Der Schaftfräser mit einem Durchmesser von 200 μm streicht über die gesamte Oberfläche des Acrylrechtecks und entfernt eine etwa 30 μm hohe Schicht. (B) Das Bild zeigt die verschiedenen Strukturen, die auf der Vorderseite des zuvor rektifizierten Acryls gefräst sind. Kanäle und Löcher für den Ein- und Auslass von Reagenzien werden beobachtet. Die 5 μm-Einschränkung ist mit bloßem Auge nicht zu erkennen. (C) Mikrogefräste Oberfläche mit Ausrichtlöchern und Adapter mit Ausrichtsäulen an gegenüberliegenden Ecken. (D) Das Acryl ist kopfüber auf dem Adapter mit Säulen ausgerichtet, in die die Ausrichtlöcher passen. Maßstabsbalken = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
2. Kanalabdichtung
- Acrylreinigung
- Entfernen Sie das Acrylrechteck von der Säulenadapterplattform. Nehmen Sie ein weiteres unbearbeitetes Acrylrechteck. Waschen Sie beide Acrylplatten mit Isopropylalkohol (IPA) und spülen Sie sie mit destilliertem Wasser ab. Tragen Sie Handschuhe und vermeiden Sie den Kontakt mit IPA.
- Tauchen Sie das Acryl 10 Minuten lang in ein Ultraschallbad (Abbildung 5A,B).
- Gasförmige Chloroform-Exposition
- Trocknen Sie beide Acrylplatten perfekt. Kleben Sie sie mit doppelseitigem Klebeband auf die Innenseite eines Glasdeckels für Petrischalen. Stellen Sie sicher, dass Sie die Seite des bearbeiteten Kanals freilegen (Abbildung 5C). Tragen Sie Handschuhe und vermeiden Sie es, die Acryloberfläche direkt zu berühren.
- Legen Sie den Boden der Glas-Petrischale in eine größere Glas-Petrischale (Abbildung 5D). Gießen Sie 1 ml Chloroform in den Boden der Petrischale. Platzieren Sie schnell den Deckel mit den an der Innenseite befestigten Acrylplatten.
- Fügen Sie sofort destilliertes Wasser auf den Boden der größeren Petrischale bis zur Höhe des Petrischalendeckels hinzu. Lassen Sie das Acryl 1 min lang Chloroformgas einwirken (Abbildung 5E).
HINWEIS: Bedenken Sie, dass eine längere Belichtungszeit mit Chloroform die Acryloberfläche angreift und die 5-μm-Einschränkung schmilzt, ihre Höhe ändert oder vollständig verschwindet. - Neigen Sie die Petrischale, um die erzeugte Wasserdichtung zu brechen. Entfernen Sie sofort das Acryl von der Chloroform, indem Sie die Petrischale freilegen. Achten Sie darauf, das Wasser nicht zu verschütten.
VORSICHT: Führen Sie diesen Vorgang im Abzug durch und verwenden Sie Handschuhe, da Chloroform hochgiftig ist.
- Verklebung durch Pressen und Erhitzen
- Ziehen Sie beide Acrylplatten vom doppelseitigen Klebeband ab.
- Richten Sie beide Acrylfarben an den Seiten aus, die von Angesicht zu Angesicht gasförmigem Chloroform ausgesetzt waren, und bilden Sie ein Sandwich. Legen Sie das Acryl bei 18 kgf/cm2 und einer Temperatur von 90 °C in die Presse (Abbildung 5F,G).
HINWEIS: Es wird empfohlen, das Acryl längs ausgerichtet zu platzieren und seine Ausrichtung nach 2 Minuten für eine bessere Abdichtung zu ändern. Wenn die Dichtung nach dieser Zeit nicht ausreicht, legen Sie sie für Intervalle von nicht mehr als 1 min wieder in die Presse. Überprüfen Sie mit dem Stereoskop den Status der Kanäle und die Einschränkung. Bedenken Sie, dass bei Überschreitung der Dringlichkeitszeit die Gefahr besteht, dass die Einschränkung aufgehoben wird.
- Schlauchbefestigung
- Schneiden Sie 2-3 cm Schlauchlängen. Machen Sie einen völlig geraden Schnitt. Befestigen Sie jeden Schlauch mit einem sofort trocknenden flüssigen Klebstoff an den Löchern des Geräts (Abbildung 6A). Verhindern Sie, dass der Klebstoff in den Chip gelangt.
Abbildung 5: Versiegelungsprozess des Geräts. (A) Jede der Acrylplatten wird in einen wiederverschließbaren Beutel mit destilliertem Wasser gegeben und in das Ultraschallbad getaucht. (B) Das Bild links zeigt die Kanäle unmittelbar nach der Herstellung, und das Bild rechts zeigt das gleiche Gerät nach dem Waschen mit IPA und dem Ultraschallbad. die alle Verunreinigungen und Acrylrückstände aus dem Mikrokanal entfernt. Die Kanten der Restriktion, die den zentralen Kanal von 200 μm unterbricht, werden beobachtet, was den erfolgreichen Fräsprozess bestätigt. Maßstabsbalken = 500 μm. (C) Beide Acrylfarben werden getrocknet und auf der Glasplattform auf dem Deckel geklebt. (D) Der Boden der Petrischale befindet sich in einer anderen Schale mit größerem Durchmesser. (E) Beim Schließen der Petrischale verhindert die Wasserdichtung, dass gasförmiges Chloroform entweichen kann. (F) Beschreibung der Elemente des Hebels mit einem Gewicht von 5 kg. (G) Abbildung des offenen Hebels, der in Rot den Bereich zeigt, in dem das Acryl platziert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
3. Gerätevorbereitung
- Füllen Sie die Kanäle mit destilliertem Wasser mit einer Spritze. Stellen Sie sicher, dass keine Leckagen oder Strömungsbeständigkeit vorhanden sind. Tauchen Sie das Gerät 10 Minuten lang in ein Ultraschallbad, um verbleibendes Acryl, Klebstoff oder unerwünschtes Material in den Kanälen zu entfernen.
- Entleeren Sie das Wasser in den Gerätekanälen. Verwenden Sie eine Spritze, um eine blockierende Lösung einzuführen, die mit 5% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) hergestellt wurde, verdünnt in 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) und zuvor durch einen 0,2 μm Polyethersulfon (PES) Spritzenfilter filtriert.
- Bereiten Sie eine Suspension von Eisenmikropartikeln von 7,5 μm Durchmesser in 5% BSA vor.
HINWEIS: Die Mikropartikel werden zuvor mit einer Siliciumdioxid-Polyethylenglykol-Schicht (PEG) funktionalisiert, die eine Beständigkeit gegen Proteinabsorption verleiht4. - Inkubieren Sie den Chip und die Mikropartikelsuspension mit der Blocklösung für mindestens 1 h bei Raumtemperatur. Wenn möglich, über Nacht bei 4 °C blockieren lassen.
4. Bildung von Mikropartikelfallen
- Führen Sie die Mikropartikel mit einer Spritzennadel durch den Seitenkanalauslassschlauch in den Chip ein. Platzieren Sie den Chip senkrecht und lassen Sie die Mikropartikel unter der Wirkung der Schwerkraft durch den Seitenkanal fließen. Drehen Sie den Chip um 180° in zwei Schritten von 90° und lassen Sie die Mikropartikel bei der Beschränkung von 5 μm anvisieren und verdichten.
- Entfernen Sie überschüssige Mikropartikel durch Schwerkraft, die sich um 45° in Richtung Seitenkanal dreht.
- Halten Sie das Gerät aufrecht, um zu vermeiden, dass die Mikropartikelfalle aufgehoben wird. Siehe Abbildung 6B für eine Zusammenfassung des Prozesses zur Bildung von Mikropartikelfallen.
5. Immunoassay
- Herstellung von Nanopartikeln
- Nehmen Sie 2 μL der Suspension von 100 nm Nanopartikeln, die zuvor mit Lysozym konjugiert wurden (Antigenmodell). Fügen Sie es in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 μL Blockierlösung hinzu. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Fügen Sie 150 μL Waschpuffer hinzu (1x TBS, 0,05% Tween 20).
- Setzen Sie das 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen in einen Magnetabscheider ein. 15 min aufbewahren, um die Trennung der Nanopartikel zu ermöglichen (Zusatzabbildung S4).
HINWEIS: Das Mindestvolumen für den Magnetabscheider beträgt 200 μL. Vermeiden Sie die Verwendung eines kleineren Volumens. - Entfernen Sie die Flüssigkeit mit einer Mikropipette aus dem Röhrchen. Vermeiden Sie den Kontakt mit der Wand der Röhre, in der das Nanopartikelpellet gebildet wurde.
- Fügen Sie 250 μL frischen Waschpuffer hinzu. Halten Sie das Rohr 15 min unter Bewegung.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.1.3.-5.1.5. 2x mehr, nur 5 min schütteln.
- Fügen Sie die gewünschte Konzentration des primären Anti-Lysozym-Antikörpers hinzu (siehe Materialtabelle). Auf ein Endvolumen von 100 μL in Antikörperverdünnungsmittel einstellen (1x TBS, 1% BSA, 0,05% Tween 20).
- 15 min bei 37 °C inkubieren. Schütteln Sie weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur.
- Wiederholen Sie die Waschschritte 5.1.2.-5.1.6.
- Fügen Sie 100 μL Antikörperverdünnungsmittel hinzu. Fügen Sie den Meerrettichperoxidase-gekoppelten sekundären Antikörper (HRP-AbII) (siehe Materialtabelle) in einer Verdünnung von 1:500 hinzu.
- Wiederholen Sie die Waschschritte 5.1.2.-5.1.6.
- Halten Sie die Nanopartikel in einem Endvolumen von 50 μL Antikörperverdünnungsmittel.
6. Experimentelle Montage
- Füllen Sie die beiden 100-μL-Glasspritzen mit Wasser, verbinden Sie einen 6,5 cm langen Schlauch mit jeder Spritze, führen Sie einen Metallstift in das Ende des Schlauchs ein und legen Sie beide Spritzen auf die computergesteuerte Spritzenpumpe.
- Versiegeln Sie alle Schläuche des Acrylgeräts mit Hitze.
- Schneiden Sie den Einlassschlauch ab und halten Sie nur wenige Millimeter. Füllen Sie die Dosiernadel mit Waschpuffer und führen Sie sie in den geschnittenen Schlauch ein. Lassen Sie die Lösung tropfen, bevor Sie die Nadel an das Gerät anschließen, um den Luftzugriff auf das Gerät zu verhindern.
- Schneiden Sie den Auslassschlauch vom seitlichen Kanal ab. Schließen Sie die Spritzenpumpe an. Führen Sie als Nächstes das gleiche Verfahren für den Hauptkanalauslassschlauch aus.
HINWEIS: Es ist wichtig, die Schritte 6.3.-6.4 durchzuführen. in dieser Reihenfolge, um das Auspacken der Mikropartikelfalle zu vermeiden. Wenn möglich, überprüfen Sie den Zustand der Falle während dieser Schritte mit Hilfe einer Lupe. - Legen Sie einen Objektträger auf den Mikroskoptisch. Befestigen Sie den Magneten mit doppelseitigem Klebeband am Objektträger und legen Sie auf jeder Seite ein kleines Stück Klebeband, um die Chipkanten am Glas zu befestigen.
- Stellen Sie einen Durchfluss von 50 μL/h über die Registerkarten Durchflussrate und Einheiten in der Spritzenpumpensteuerung ein. Wählen Sie den Auszahlungsmodus und klicken Sie auf die Schaltfläche Start , um den Fluss des Waschpuffers zu aktivieren.
- Nähern Sie sich vorsichtig dem Gerät in Richtung des Objektträgers mit dem Magneten in horizontaler Weise, so dass der Bereich des Chips, der die Falle enthält, den Magneten berührt.
- Kleben Sie die Kanten des Geräts mit doppelseitigem Klebeband auf das Glas, um Bewegungen zu verhindern. Vermeiden Sie es, den optischen Pfad für die Mikroskopie zu blockieren (Abbildung 6C).
Abbildung 6: Endgültiges Gerät . (A) Acrylgerät, bei dem die Schläuche an den entsprechenden Ein- und Ausgängen befestigt sind. Die Skala zeigt die Abmessungen des Gerätes in Zentimetern an. b) Protokoll für die Bildung der Mikropartikelfalle. Mikropartikel fließen durch die Schwerkraft durch den Kanal, wenn das Gerät in einer vertikalen Position platziert wird. Mikropartikel werden bei der 5 μm-Einschränkung konzentriert. Überschüssige Mikropartikel lassen sich leicht entfernen, indem der Chip durch den Seitenkanal gedreht wird. Der Chip wird vertikal gehalten, um die Falle vor dem Immunoassay zu erhalten. (C) Mikrofluidische Vorrichtung, die auf einem Glasobjektträger montiert ist, der den Magneten enthält, auf dem Tisch des inversen Fluoreszenzmikroskops. Die Dosiernadel, durch die die Reagenzien zugegeben werden, sowie die Auslassschläuche, die mit einer Spritzenpumpe verbunden sind, werden beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
7. Immundetektion
- Lassen Sie den Waschpuffer 10 Minuten lang bei 50 μL/h fließen, um überschüssiges BSA zu entfernen.
- Entfernen Sie den restlichen Waschpuffer mit einer Mikropipette von der Dosiernadel. Fügen Sie 50 μL der Nanopartikelsuspension hinzu.
- Lassen Sie die Suspension der Nanopartikel für 7 min bei einer Flussrate von 100 μL / h fließen. Anschließend die Durchflussrate auf 50 μL/h ändern und weitere 15 min durchströmen.
- Wechseln Sie die Dosiernadel. Den Waschpuffer 10 min bei 50 μL/h laufen lassen. Bereiten Sie das fluorogene Substrat während des Waschschritts nach Herstellerangaben vor.
- Entfernen Sie den restlichen Waschpuffer mit einer Mikropipette von der Dosiernadel. Fügen Sie 100 μL des fluorogenen Substrats hinzu (siehe Materialtabelle). Lassen Sie das fluorogene Substrat 6 min bei 50 μL/h fließen.
- Stellen Sie die Messparameter Durchflussrate (1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h und 10 μL/h ) und die Zeit (6 min) in den entsprechenden Registerkarten Durchflussrate und Timer einstellen der Schnittstelle ein, die die Spritzenpumpe steuern. Stellen Sie sicher, dass Sie für jede der durchzuführenden Messungen den Auszahlungsmodus auswählen.
- Stellen Sie eine zusätzliche Durchflussregisterkarte auf 50 μL/h ein und stellen Sie den Timer auf 3 Minuten für den Waschschritt ein.
- Schalten Sie die Fluoreszenz des Mikroskops 15 s ein, bevor das Substrat bei 50 μL/h stoppt. Starten Sie die Bildaufnahme mit der Software der Mikroskopkamera 10 s bevor das Substrat mit einer Belichtungszeit von 1.000 Millisekunden stoppt. Führen Sie die Bildgebung 6 Minuten lang bei 1 Bild/s (FPS) durch.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Start des gewünschten Durchflussparameters, unmittelbar nachdem der Substratwaschdurchfluss bei 50 μL/h gestoppt wurde. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start des Waschstroms (50 μL/h), unmittelbar nachdem der gewählte Messfluss gestoppt wurde.
- Stoppen Sie die Bildaufnahme und schalten Sie die Fluoreszenz des Mikroskops aus, um ein Photobleichen des Substrats zu vermeiden.
- Wiederholen Sie die Schritte 7.8.-7.10. für jede verwendete Messdurchflussrate.
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Representative Results
Es konnte ein hochreproduzierbares Fertigungsprotokoll etabliert werden, das die Auflösung der konventionellen Mikrofrästechnik verbessert. Mit diesem Protokoll wird die Herstellung eines Kanals von nur 5 μm Höhe erreicht, der als versetzte Einschränkung in einem 200 μm hohen Kanal arbeitet. Das einfache Design der versetzten Restriktion fängt Eisenmikropartikel mit einem Durchmesser von 7,5 μm ein, die, wenn sie im Mikrokanal verdichtet werden, die Erzeugung einer Magnetfalle ermöglichen, wenn sich ein externer Magnet dem Gerät nähert. Dieses Gerät ermöglicht die Durchführung von Immunoassays mit Nanopartikeln, die mit dem interessierenden Analyten als immunologische Unterstützung konjugiert sind. In dieser Arbeit wurden nicht-kompetitive indirekte Immunoassays mit enzymmarkiertem Antikörper-basiertem Nachweis durchgeführt. Das Modellantigen (Ag) war ein Lysozymprotein, das an Nanopartikel (NPs) mit einem Durchmesser von 100 nm konjugiert wurde. Kaninchen-Anti-Lysozym-IgG wurde als primärer Antikörper (AbI) verwendet und der Nachweis wurde unter Verwendung von Kaninchenmeerrettichperoxidase-konjugierten sekundären Antikörpern (HRP-AbII) durchgeführt.
Der Nachweis erfolgte durch Korrelation der Änderung der Fluoreszenzsignalintensität, die nach der Wechselwirkung des HRP-AbII mit einem fluorogenen Substrat beim Durchgang durch die Falle mit eingeschlossenen Nanopartikeln erhalten wurde. Um die Messungen durchzuführen, wurden eine Region vor und eine Region nach der Falle bestimmt. Abbildung 7A-D zeigt den Anstieg der Fluoreszenzintensität für verschiedene Konzentrationen von Anti-Lysozym AbI: 0 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml und 1.000 ng/ml für eine gegebene fluorogene Substratflussrate (3 μL/h). Dies zeigt, dass die Änderung der Substratfluoreszenz direkt proportional zur Konzentration des verwendeten AbI ist.
Abbildung 7: Fluoreszenzmessbereiche. Die Fluoreszenzmessungen werden für verschiedene Konzentrationen der verwendeten primären Anti-Lysozym-Antikörper gezeigt: (A) 0 ng/ml, (B) 10 ng/ml, (C) 100 ng/ml und (D) 1.000 ng/ml. Blaue Kreise zeigen den Bereich der Fluoreszenzmessung vor und nach der durch die 5 μm Höhenbeschränkung gebildeten Falle, in der das Substrat mit dem HRP-konjugierten sekundären Antikörper reagiert. Alle Bilder entsprechen einem Durchfluss von 3 μL/h. Abkürzung: HRP = Meerrettichperoxidase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Für eine gegebene AbI-Konzentration ist der erhaltene Fluoreszenzgrad jedoch eine Funktion der für das fluorogene Substrat verwendeten Durchflussrate. Somit ist die Umwandlungskapazität dieses Substrats durch das HRP-Enzym umgekehrt proportional zur Flussrate. Es wurden verschiedene Substratflussraten von 1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h und 10 μL/h bewertet. Für jedes Experiment wurden die Kurven erhalten, die dem Unterschied in der Fluoreszenz entsprechen, den das Substrat vor und nach dem Passieren der Magnetfalle gegeben hat. Abbildung 8A-C zeigt die Kurven für eine Konzentration von 100 ng/ml für drei verschiedene Durchflussraten: (A) 10 μL/h, (B) 3 μL/h und (C) 1 μL/h. Abhängig von der verwendeten Flussrate variiert die Umwandlungskapazität des Substrats durch den HRP-konjugierten sekundären Antikörper, der in der Magnetfalle platziert wird. Die grüne Kurve stellt die Fluoreszenzintensität des Substrats nach Umwandlung durch das in der Falle befindliche HRP dar. Es ist ersichtlich, dass bei höheren Flüssen das maximale Niveau der erhaltenen Fluoreszenz zerfällt. Die rote Kurve stellt die basale Fluoreszenz dar, bevor das Substrat die Falle erreicht. Die Messung der Substratfluoreszenz in diesem Bereich der Falle bleibt konstant und ihr Wert hängt vom Grad der unspezifischen Wechselwirkungen ab, wenn es keine effiziente Blockierung der Kanaloberfläche gibt. Wir haben die Differenz zwischen beiden Kurven berechnet, dargestellt durch die blaue Kurve.
Abbildung 8: Fluoreszenzkurven. Graphen, erhalten bei einer Konzentration von 100 ng/ml primärer Antikörper und Flussraten von (A) 10 μL/h, (B) 3 μL/h und (C) 1 μL/h. Die drei farbigen Kurven stellen die vor der Falle (rote Kurve) und nach der Falle (grüne Kurve) gemessene Fluoreszenz und die Differenz zwischen den beiden (blaue Kurve) über die Zeit dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 9A-C integriert die vor und nach der Immunreaktion gemessenen Fluoreszenzdifferenzkurven für die verschiedenen Strömungen für AbI-Konzentrationen von (A) 0 ng/ml, (B) 10 ng/ml und (C) 1.000 ng/ml. Die Messung für einen Durchfluss von 0 μL/h zeigt die Messung der Immunreaktion unter statischen Bedingungen, unter denen die Diffusion herrscht. Bei einer Konzentration von 1.000 ng/ml sättigt die Fluoreszenz für alle ausgewerteten Strömungen. Das gestaffelte Muster der Fluoreszenz bei den verschiedenen Strömungen ist jedoch auf die Diffusion des Substrats zurückzuführen, das mit einer so hohen Umwandlungsrate reagiert, dass es die kleineren Strömungen überwindet. Somit kommt es zu einer Rückkehr dieser Fluoreszenz in die stromaufwärts gelegene Zone der Falle.
Abbildung 9: Fluoreszenzdifferenzverhältnisse. Zusammengefasste Kurven der Fluoreszenzdifferenzen (nach−vorher) für die verschiedenen verwendeten Flüsse bei (A) 0 ng/ml, (B) 10 ng/ml und (C) 1.000 ng/ml. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Messungen mit diesem Gerät ermöglichen es, eine Standardkalibrierkurve für Immunoassays zu erstellen, die mit Lysozym als Modellantigen durchgeführt werden. Abbildung 10 zeigt die Kalibrierkurve, die aus den Maximalwerten der Differenzen zwischen der Fluoreszenz vor und nach der in der Magnetfalle durchgeführten Immunreaktion ermittelt wird. Dieses Protokoll ermöglicht den Nachweis des primären Anti-Lysozym-Antikörpers mit Konzentrationen in der Größenordnung von Nanogramm pro Milliliter unter Verwendung von Flüssen zwischen 1 μL/h und 10 μL/h. Die hohe Variabilität und die hohen Fluoreszenzwerte bei 1 μL / h deuten darauf hin, dass die Reaktivität des Immunkomplexes so ist, dass diese Rate den Fluss des reagierenden Substrats nicht begünstigt und dazu neigt, sich unmittelbar nach der Falle anzusammeln, zusätzlich zu der Tatsache, dass der Widerstand des Geräts die Auflösung des Geräts für diese Flussrate reduziert.
Abbildung 10: Kalibrierkurve. Die Grafik zeigt den Maximalwert der Unterschiede in der Fluoreszenzintensität der Kurven, die in Bezug auf die Konzentration des verwendeten primären Antikörpers (AB1) für jede Flussrate erhalten werden. I/Isat entspricht dem Verhältnis des für jede Fluoreszenzmessung erhaltenen Fluoreszenzwertes (I), normiert in Bezug auf den maximalen Fluoreszenzwert, der bei der Sättigung erreicht wird (Isat). Fehlerbalken stellen die Standardabweichung der drei Experimente dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung S1: Piezoelektrische Plattform-Controller-Schnittstelle. Das linke Bild zeigt die Schnittstelle, die die z-Achsenverschiebung der piezoelektrischen Plattform steuert. Die Einschränkung wird durch Anheben der Plattform durch Anlegen von Spannung an drei piezoelektrische Aktuatoren erzeugt. Das rechte Bild zeigt die Schnittstelle der Software, die die Mikrofräse steuert, wo es möglich ist, die genauen Koordinaten in der x- und y-Achse zu beobachten, wo die Restriktion mit einer Geschwindigkeit von 11.000 U/min bearbeitet wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S2: Aufbau des Gerätes. Das Design des Geräts, das mit der Designsoftware erstellt wurde, ist links zu sehen. Das Design besteht aus zwei miteinander verbundenen Kanälen, von denen einer der Hauptkanal ist, der die Höhenbeschränkung von 5 μm enthält, und der andere der Seitenkanal für den Abfallauslass. Die Kanäle werden mit einem 200 μm Schaftfräser mikrogefräst. Das Feld rechts zeigt die Fertigungsparameter. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S3: Mikrofräsparameter von Ein- und Auslassbohrungen. (A) 1,2 mm Durchmesser und 0,65 mm tiefe Löcher (halbe Acryldicke) werden auf der bearbeiteten Oberfläche mikrogefräst. Das Bild rechts zeigt die Verdrängungsgeschwindigkeit, die Rotation und die Tiefenparameter des Schaftfräsers. (B) Löcher mit einem Durchmesser von 1,5 mm und eine Tiefe von 0,7 mm werden auf der gegenüberliegenden Seite, die die Löcher verbindet, mikrogefräst. Das Feld rechts zeigt die Fertigungsparameter. Beide Gehäuse werden mit einem 800 μm Schaftfräser mikrogefräst. (C) Nach der Bearbeitung beider Flächen sind die Einlass- und Auslasslöcher des Reagenzieneinlasses (rechts) und des Auslasses (links) dargestellt. Die Abmessungen der größeren Durchmesserhälfte ermöglichen das Ankuppeln des Schlauchs, während die durch die kleinere Durchmesserhälfte erzeugte Barriere verhindert, dass der Schlauch die Einlässe blockiert. Maßstäbe = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S4: Nanopartikeltrennung. Mit einem kommerziellen Magnetabscheider können 100-nm-Nanopartikel leicht konzentriert werden, um die Waschschritte während des Immunoassays durchzuführen. Das nach 15 min gebildete Pellet wird im roten Kreis beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Kodierungsdatei 1: Code für das Schleifen von Acryloberflächen. Der generierte Code wird mit Anweisungen zum Schleifen der 25 mm x 9 mm großen Acryloberfläche entlang der x- und y-Achse angezeigt. Die letzte Zeile des Codes positioniert den Bohrer genau an der Koordinate, an der die Einschränkung bearbeitet wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Designdatei 1: Entwurf der Mikrokanal- und Reagenzieneinlass- und -auslasslöcher. Das Design enthält zwei Schichten unterschiedlich farbiger Strukturen (schwarze Kanäle und rote Löcher), die auf der zuvor geschliffenen Acryloberfläche bearbeitet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Bemessungsdatei 2: Bemessung der Löcher auf der gegenüberliegenden Seite. Das Design besteht aus Löchern mit größerem Durchmesser für die gegenüberliegende Seite, die mit den vorherigen kommunizieren und zur Befestigung der Schläuche dienen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Ein mikrofluidisches Acrylgerät für Immunoassays mit Nanopartikeln als Immununterstützung wurde unter Verwendung einer Mikrofrästechnik hergestellt. Die Methode der direkten Herstellung auf dem Substrat hat den Vorteil, dass die Verwendung einer Masterform und der damit verbundene Zeit- und Kostenaufwand vermieden werden. Es beschränkt sich jedoch auf Rapid Prototyping und die Herstellung von Geräten in großen Stückzahlen.
Hier haben wir eine zuvor berichtete piezoelektrische Zubehörplattform für die Fräsmaschine12 verwendet. Die Plattform wurde durch 3D-Druck hergestellt, um Kanäle mit variabler Tiefe mit einer vertikalen Auflösung zu erzeugen, die besser ist als die Auflösung von 10 μm herkömmlicher Mikrofräsmaschinen. Wir haben das Fräsen von bis zu 5 μm hohen Kanälen erreicht, die im 200 μm Mikrofluidikkanal eine versetzte Einschränkung bilden.
Für die Herstellung der mikrofluidischen Vorrichtung werden nur zwei Schaftfräser mit einem Durchmesser von 200 μm und 800 μm benötigt, ohne dass die Bits manuell gewechselt werden müssen. Das verwendete Fräsmaschinenmodell führt den Austausch der Bits automatisch durch, was zur Zeitoptimierung beiträgt. Darüber hinaus ermöglicht der Modus "Z0 Sensing" die automatische Bestimmung des Ursprungs in der z-Achse mit hoher Präzision durch Kontaktaufnahme mit dem Sensor und dem in der Fräsmaschine enthaltenen Pin.
Das Design dieses Geräts ist einfach und besteht nur aus dem Hauptkanal, der durch eine 5 μm versetzte Einschränkung unterbrochen wird, und einem Zubehörkanal, der als Spül- und Einlass für Mikropartikel dient. Die hohe Präzision solcher Strukturen ist jedoch erforderlich, um Eisenmikropartikel von 7,5 μm Durchmesser einzufangen. Eine größere Einschränkung lässt Mikropartikel ohne Retention passieren, was ihre Erfassung und die Bildung der Mikropartikelfalle verhindert. Umgekehrt erhöht eine kleinere Einschränkung den Strömungswiderstand des Kanals stark und bewirkt, dass die Reagenzien durch den Seitenkanal austreten, anstatt durch das poröse Mikropartikelmedium zu gelangen. Die Verwendung von Mikropartikeln mit einem größeren Durchmesser zur Bildung der Magnetfalle würde eine größere Einschränkung ermöglichen. Zum Beispiel benötigen Partikel mit einem Durchmesser von 40 μm eine ~30 μm gestaffelte Einschränkung. In diesem Fall ist es nicht notwendig, die piezoelektrische Plattform zu verwenden, und das Herstellungsprotokoll wird vereinfacht. Ein poröses Medium, das aus größeren Mikropartikeln besteht, würde Nanopartikel jedoch unterschiedlich einfangen und die Leistung des Immunoassays beeinträchtigen. Es ist jedoch nicht klar, ob es zum Guten oder zum Schlechten wäre. Derzeit wird daran gearbeitet, diese Funktionen zur Optimierung des Gerätszu untersuchen 7.
Um die erforderliche Genauigkeit zu erreichen, wurde durch Oberflächenschleifen eine 30 μm Schicht der Acryloberfläche entfernt, indem der 200 μm Schaftfräser mit 14.500 U/min durch die gesamte Acryloberfläche bewegt wurde. Dieser Prozess ermöglicht es, einen neuen Ursprung an der z-Achse entlang der gesamten Oberfläche für eine höhere Genauigkeit in der Höhe zu erhalten. Es ist wichtig, das Acryl immer an der gleichen Position auszurichten, damit die Ursprungskoordinaten auf der x- und y-Achse (zuvor eingestellt) mit einer der Ecken des Acryls übereinstimmen. Ebenso sollte man darauf achten, dass das Acryl perfekt auf dem Sockel sitzt; Andernfalls kann es zu einer nicht ordnungsgemäßen Abnutzung der Oberfläche kommen, was zu Problemen in den folgenden Montageschritten führt.
Sobald das Programm den Flachschleifprozess abgeschlossen hat, bringt es den Schaftfräser automatisch zu einer bestimmten Koordinate, wo die 5-μm-Randbedingung, die die Falle bildet, bearbeitet wird. Es ist wichtig zu verhindern, dass der Schaftfräser von der Oberfläche abhebt, sobald er diese Koordinate erreicht hat. Es wird empfohlen festzustellen, ob die Mikrofräsmaschine über eine Option verfügt, die verhindert, dass sich der Schaftfräser nach Abschluss des Mahlvorgangs von der Oberfläche löst. Andernfalls muss der Fräser manuell auf diese Koordinate umpositioniert werden, was zu Fehlern bei der Standortgenauigkeit führen kann.
Um die versetzte Restriktion im Acryl zu bearbeiten, ist es notwendig, um 1,5 μm zu überdimensionieren. Für 5 μm Höhe wurde die piezoelektrische Plattform auf 6,5 μm angehoben, da der Mikrokanal beim Abdichten der Kanäle dazu neigt, etwas abzuflachen. Darüber hinaus beträgt die endgültige Länge der Einschränkung im Gerät nur 50 μm; Es wird jedoch länger bearbeitet, um sicherzustellen, dass es mit beiden Enden des Hauptkanals kommuniziert, wenn es danach bearbeitet wird. In einem Schritt werden die 200 μm tiefen Kanäle mit dem Schaftfräser mit 200 μm Durchmesser und einer Drehzahl von 11.000 U/min gefertigt. So dauert die Bearbeitung der 200 μm breiten Kanäle in Acryl nur wenige Sekunden.
Der nächste Schritt bei der Herstellung des Geräts besteht darin, die Löcher zu bearbeiten, die die Kanäle mit der Außenseite verbinden. Diese Löcher werden verwendet, um die Schläuche zu platzieren, die es ermöglichen, das Gerät einfach an die Spritzenpumpe anzuschließen, die es betreibt. Eines der Probleme, die hier auftreten, ist die Platzierung der Schläuche. Ein optimaler Abstand ist entscheidend, um den Fluss von Reagenzien zu ermöglichen und eine Abdichtung mit der Oberfläche des unbearbeiteten Acryls zu vermeiden. Um diesen Nachteil zu überwinden, werden die Löcher in zwei Schritten bearbeitet, um eine Grenze zu schaffen, an der die Schläuche die gewünschte Tiefe nicht überschreiten.
Mit dem 800 μm Schaftfräser wurde das Lochmuster auf die gleiche zuvor mikrogefräste Fläche gefräst. In das Ende jedes Kanals werden Löcher mit einem Durchmesser von 1,2 mm und einer Tiefe von 0,65 mm gefräst, was der halben Dicke des Acryls entspricht. Zusätzlich sind in den kontralateralen Ecken des Rechtecks zwei Löcher gefräst, die es ermöglichen, das Acryl mit der Vorderseite nach unten auf der Plattform mit Säulen auszurichten. Es ist wichtig, einen Schaber oder Cutter zu verwenden, um das Acryl von der piezoelektrischen Plattform zu entfernen, um es nicht zu brechen. Auf der gegenüberliegenden Seite des Acryls beträgt der Durchmesser der Löcher 1,5 mm (größer als die vorherige Hälfte), was dem Durchmesser des zu befestigenden Schlauchs entspricht. Die Tiefe beträgt 0,7 mm und sollte etwas größer als die Hälfte der vorderen Stirnbohrung sein, um sicherzustellen, dass beide bearbeiteten Bohrungen miteinander kommunizieren. Die Barriere, die durch das Loch mit kleinerem Durchmesser gebildet wird, verhindert, dass der Schlauch den Boden erreicht und den Einlass blockiert. Diese Implementierung im Protokoll verbessert die Platzierung der Flüssigkeitseinlass- und -auslassschläuche zum Chip erheblich.
Ein wichtiger Schritt in der Geräteherstellung ist die Abdichtung. Es ist notwendig, die Fläche, die die bearbeiteten Kanäle enthält, mit einer unbearbeiteten Acrylabdeckung mit den gleichen Abmessungen zu versiegeln. Das Versiegeln der Platten mit einem Verfahren, das sich der Glasübergangstemperatur von Acryl nicht nähert, ermöglicht es, verformungsfreie Kanäle zu erhalten. Durch das verwendete Bindungsverfahren löst ein dünner Lösungsmittelfilm zwischen den beiden PMMA-Platten einen dünnen Film von der Oberfläche der PMMA-Folie, verdampft dann und verbindet schließlich die Monomere der PMMA-Platten bei einer bestimmten Betriebstemperatur wieder.
Die weithin beschriebene Methode der Chloroform-Dampfbelichtung wurde verwendet, um dieses Acrylgerät zu versiegeln. Wie bereits in der Literatur berichtet, bietet Chloroform eine hohe Haftfestigkeit; Da Chloroform Acryl jedoch sehr aggressiv angreift, sollte Acryl niemals in direkten Kontakt mit flüssigem Chloroform kommen, sondern nur mit gasförmigem Chloroform. Es ist wichtig, einen optimalen Abstand zwischen dem verdampfenden Chloroform und dem Acryl einzuhalten. Wir haben ein einfaches System mit einer Glas-Petrischale geschaffen, bei der das Acryl auf den Deckel geklebt wurde. Zum Einsatz kam eine Plattform aus neun verbundenen und am Deckel der Petrischale befestigten Objektträgern, auf die die Acrylfarben mit doppelseitigem Klebeband geklebt wurden, um den Abstand zu regulieren. Obwohl der gasförmige Chloroform-Prozess sehr empfindlich auf Änderungen der Umgebungstemperatur reagiert, kann die Temperatur der Petrischalen gesteuert werden, indem sie in eine Styroporbox gelegt werden. Die Wasserdichtung verhindert, dass das Chloroform zu schnell verdunstet.
Im Gegensatz dazu gibt es andere Fügeverfahren, die schneller sind und keine spezielle Ausrüstung erfordern. Einige eignen sich jedoch nur zum Verbinden von zwei Acrylplatten ohne Bearbeitung. Ebenso ist es schwierig, die Bindungskraft zu kontrollieren, da das Lösungsmittel direkt zwischen beiden Acrylplatten18 gegossen werden muss, mit einem hohen Risiko des Schmelzens von Strukturen kleiner Abmessungen wie der mikrogefrästen 5 μm Einschränkung.
Unter Verwendung des hier beschriebenen Protokolls wurden homogene Dichtungen mit einer selbstgebauten Presse erreicht, mit der der Dichtungsdruck und die Temperatur gesteuert wurden. Für den Bau dieser Presse erzeugen sowohl ein Rahmen aus Aluminium als auch ein Scharnier einen Hebel, der die mechanische Kraft von einem Gewicht von 5 kg auf einen Faktor von 9:1 verstärkt. Die Heizelemente übertragen ihre Wärme auf 2 cm dicke Aluminiumplatten, die mit den Acrylstücken in Kontakt kommen.
Sobald die Acrylschichten versiegelt sind, besteht der letzte Schritt im Herstellungsprozess darin, die externen Schläuche mit den entsprechenden Ein- und Auslässen des Geräts zu verbinden. Der flüssige Klebstoff wird extern aufgetragen, sobald sich die Schläuche in den Löchern befinden. Wenn der Durchmesser des Schlauchs kleiner als die Löcher ist, kann der flüssige Klebstoff in das Gerät gelangen und die Kanäle verstopfen.
Direkte Fertigungsverfahren auf dem Substrat, wie z. B. Mikrofräsen, haben einige Nachteile, wie z. B. die Rauheit der bearbeiteten Oberfläche und Strukturen mit schlecht abgegrenzten Kanten9. Trotz der Rauheit der bearbeiteten Oberfläche der Kanäle ist für dieses Gerät keine zusätzliche Behandlung erforderlich. Ein wichtiger Punkt bei diesem Bindungsprotokoll ist, dass Chloroform es ermöglicht, die Rauheit der gefrästen Mikrokanäle zu verringern, indem die dem Lösungsmittel ausgesetzten Oberflächen poliert werden. Das Polieren der Oberfläche ist so gut, dass sogar die optische Qualität verbessert wird19.
Wenn das Gerät hergestellt wurde, muss es für die Verwendung in einem Immunoassay vorbereitet werden. Das Ultraschallwaschen des Geräts ist von großer Bedeutung, um unerwünschte Acrylablagerungen zu entfernen, die die Kanäle verstopfen und den Immunoassay stören können.
Darüber hinaus muss besonders auf die korrekte Blockierung der Kanäle geachtet werden, um unspezifische Wechselwirkungen und hohe Hintergrundgeräuschsignale zu vermeiden. Es hat sich gezeigt, dass die Blockierung mit 5% BSA das Rauschen der unspezifischen Bindung von Antikörpern in den Kanälen reduziert, und 1 Stunde Inkubation ist ausreichend. Die Eisenmikropartikel sind mit einer Siliziumdioxid-PEG-Schicht beschichtet, um eine unspezifische Bindung in ihnen zu verhindern. Darüber hinaus werden die Mikropartikel (gleichzeitig mit den Kanälen) mit BSA blockiert, bevor sie die Falle im Gerät bilden. Eine Inkubation über Nacht bei 4 °C ist besser, was bedeutet, dass 1 Tag für die Herstellung und Inkubation des Geräts vor dem Immunoassay benötigt wird. Die Verringerung der Rauheit durch das Chloroform und die Verstopfung der Oberflächen zur Reduzierung unspezifischer Wechselwirkungen haben sich als außergewöhnlich gut erwiesen, so dass diese Plattform eine Nachweisgrenze erreichen kann, die mit dem Standard-ELISA in einem Modellimmunoassay4 vergleichbar ist.
Die Bildung der Mikropartikelfalle in der Mikrokanalrestriktion ist ein manueller Prozess. Obwohl es keine genaue Kontrolle über die Anzahl der eindringenden Mikropartikel gibt, verlassen wir uns auf eine Schätzung der Länge der verdichteten Partikel. Es ist möglich, die Falle zu vergrößern oder den Überschuss leicht zu entfernen. Die ausrangierten Partikel sammeln sich im Seitenkanal an und müssen nicht vom Chip entfernt werden. Es ist wichtig, zu verhindern, dass Mikropartikel in den Hauptkanal fließen, da sie mit Nanopartikeln vor der Falle interagieren und die Immunoassay-Messungen modifizieren können.
Als Proof-of-Concept implementierten wir die Immundetektion eines Komplexes, der aus einem Lysozymprotein gebildet wird, das an Nanopartikel mit einem Durchmesser von 100 nm konjugiert ist, indem der spezifische primäre Antikörper und der entsprechende HRP-markierte sekundäre Antikörper inkubiert werden. Der Immunkomplex wird außerhalb des Geräts gebildet. Es ist jedoch möglich, den gesamten Immunoassay im Gerät durchzuführen. Die magnetischen Eigenschaften der Nanopartikel ermöglichen eine einfache Handhabung mit einem leistungsstarken Neodym-Permanentmagnet-Separator. Man muss einfach das Reaktionsmikroröhrchen für 15 Minuten halten, damit die Nanopartikel vom Magneten an die Mikroröhrchenwand gezogen werden können, was die Immunoassay-Waschschritte außerhalb des Geräts erleichtert.
Das Highlight dieses Geräts ist, dass es einfach, schnell (Gesamtuntersuchungszeit von 40 min 4 im Vergleich zu4-6 h für ELISA) und billig (vergleichbar mit dem Preis eines Lateral-Flow-Tests) ist. All diese Eigenschaften machen dieses Geräteprofil zu einem guten Kandidaten für die Entwicklung von POCT. Darüber hinaus kann das Gerät Analytkonzentrationen ähnlich dem Goldstandard ELISA4 quantitativ nachweisen, was für epidemiologische Studien und die Entscheidungsfindung im öffentlichen Gesundheitswesen äußerst wertvoll ist. In der Regel haben mikrofluidische Systeme für Immunoassays gute Nachweisgrenzen, aber lange Assay-Zeiten, oder sie haben kurze Assay-Zeiten, aber suboptimale Nachweisgrenzen4. Durch die Kombination von magnetischen Nanopartikeln als Immununterstützung und fluorogenen Enzymen für den Nachweis hat diese Plattform eine kurze Assay-Zeit und eine gute Nachweisgrenze (in früheren Arbeiten fanden wir eine Nachweisgrenze von 8 pg / ml unter Verwendung von Biotin als Antigen, was mit einem Standard-ELISA4 vergleichbar ist). Schließlich hat diese Technologie einen wichtigen Vorteil gegenüber Lateral-Flow-Tests: die Möglichkeit, quantitative und nicht nur qualitative Ergebnisse ("ja" oder "nein") zu liefern. Im Gegensatz zu den meisten anderen mikrofluidischen Systemen, die in Laboratorien entwickelt wurden, in denen seltene Materialien verwendet werden, besteht dieses System aus Acryl (PMMA), einem kostengünstigen Thermoplast, der sehr gut mit der Massenproduktion medizinischer Diagnosegeräte kompatibel ist.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von Conacyt, Mexiko im 312231 Rahmen des "Programa de Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológicas y de Innovación" und von AMEXCID und dem mexikanischen Außenministerium (SRE) im Rahmen des Zuschusses "Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2" unterstützt. JAHO dankt Conacyt Mexiko für das Promotionsstipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.008 Endmill | KYOCERA SGS | 2204 | 2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12 |
| 0.032 Endmill | KYOCERA SGS | 2228 | 2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12 |
| Carbonyl-iron microparticles | Sigma-Aldrich | 44890 | 7 μm |
| Chloroform | Fermont | 6201 | Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate |
| CMOS camera Moment | Teledyne Photometrics | Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2 |
|
| Dr Engrave Software | Roland DGA Corporation | Engraving software to design and create the engraving path on the surface | |
| Extraction hood | Unknown | Unknown | |
| Flexible Plastic Tubing | Tygon | AAD04103 | ID = 0.020, OD = 0.060 |
| Fluorescence microsope | ZEISS | Axio Vert.A1 | |
| High Precision Dispense Needle | Loctite | 98612 | |
| Homemade piezoelectric controller application | LabView | See reference 12 for more details. | |
| Loctite 495 instant adhesive | Henkel | 49503 | Apply with micropipette tip or dispensing needle |
| MagJET Separation Rack | thermoscientific | 12 x 1.5 mL | |
| Mechanic press | Home-made | ||
| Milling Machine | Roland | MDX-50 | |
| Piezoelectric platform | Home-made | See reference 12 | |
| Polymethylmethacrylate - Sheet - PMMA, Acrylic | Goodfellow | ME303018/1 | Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent |
| PVCamTest software | Teledyne Photometrics | Version 3.10.107 | Image acquisition software |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ 7457 | |
| SuperMag Carboxyl Beads | Ocean NanoTech | KSC0100 | 100 nm |
| Syringe pump | kd Scientific | KDS200 | Can hold up to two syringes |
| Utrasonic bath | Branson | 2800 | |
| VPanel software | Windows OS | Version 1.0.3.0 | Software for controlling the micromilling machine |
References
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