Summary
Mikrofluidik är ett kraftfullt verktyg för utveckling av diagnostiska tester. Men dyr utrustning och material, liksom mödosamma tillverknings- och hanteringstekniker, krävs ofta. Här beskriver vi tillverkningsprotokollet för en akrylmikrofluidisk enhet för magnetiska mikro- och nanopartikelbaserade immunanalyser i en billig och enkel att använda miljö.
Abstract
Mikrofluidiska system har kraftigt förbättrade immunanalystekniker. Många mikrofabrikationstekniker kräver dock specialiserad, dyr eller komplicerad utrustning, vilket gör tillverkningen kostsam och oförenlig med massproduktion, vilket är en av de viktigaste förutsättningarna för att patientnära tester (POCT) ska antas i miljöer med låg resurs. Detta arbete beskriver tillverkningsprocessen för en akryl (polymetylmetakrylat, PMMA) -enhet för nanopartikelkonjugerad enzymatisk immunanalystestning med hjälp av datorns numeriska kontroll (CNC) mikrofräsningsteknik. Funktionen hos den mikrofluidiska anordningen visas genom att utföra en immunanalys för att detektera en kommersiell antikropp med användning av lysozym som ett modellantigen konjugerat till 100 nm magnetiska nanopartiklar. Denna enhet integrerar en fysisk förskjuten begränsning på endast 5 μm i höjd, som används för att fånga magnetiska mikropartiklar som utgör en magnetisk fälla genom att placera en extern magnet. På detta sätt är den magnetiska kraften på immunstödet hos konjugerade nanopartiklar tillräcklig för att fånga dem och motstå flödesmotstånd. Denna mikrofluidiska anordning är särskilt lämplig för billig massproduktion utan förlust av precision för immunanalysprestanda.
Introduction
Under de senaste åren har mikrofluidik spelat en viktig roll i immunanalystekniker1. Miniatyriseringsteknik har många enastående fördelar jämfört med traditionella immunanalyser, såsom minskad prov- och reagensförbrukning, kortare inkubationstider, effektivt lösningsutbyte och högre integration och automatisering2.
Dessutom minskar mikrofluidiska system i immunanalyser, i kombination med magnetiska nanopartiklar som immunstöd, avsevärt inkubationstiderna och uppnår hög detektionskänslighet på grund av det ökade yt-till-volym-förhållandet3. Partiklarnas bruna rörelse förbättrar reaktionskinetiken under bildandet av antigen-antikroppskomplexet 4,5. Dessutom ger nanopartiklarnas magnetiska egenskaper mångsidigheten att integreras i olika mikrofluidiska enhetskonfigurationer, vilket gör dem till en idealisk kandidat för signalering och molekylfångst i miniatyriserade biosensingsystem på chip5. Magnetiska krafter är emellertid betydligt svagare än dragkrafter på nanometerskalan på grund av det höga förhållandet mellan yta och volym6. Därför kan det vara utmanande att fånga nanopartiklar för viktiga immunanalyssteg som tvätt och detektion, och en konventionell magnet är otillräcklig4.
Ett effektivt sätt att manipulera nanopartiklarna är användningen av en mikrofluidisk magnetisk fälla bildad av järnmikropartiklar, som är förpackade i en mikrofluidisk struktur3. Därför, när en extern magnet närmar sig, skapas en komplex interaktion inom det magnetiserade porösa mediet mellan magnet- och flödeskrafterna. Den magnetiska kraften som verkar på nanopartiklarna är tillräckligt stark för att fånga dem och motstå flödesmotstånd 3,4,7. Detta tillvägagångssätt kräver mikrofabrikationstekniker som uppnår upplösningar i storleksordningen några mikrometer för att generera mikrometriska strukturer som behåller mikropartiklarna.
Nuvarande mikrofabrikationstekniker möjliggör högupplöst tillverkning av strukturer från några mikron till hundratals nanometer8. Många av dessa tekniker kräver dock specialiserad, dyr eller komplicerad utrustning. En av de största svårigheterna är kravet på ett renrum för formtillverkning, vilket fortfarande är dyrt och tidskrävande 8,9. Nyligen har mikrofluidiska ingenjörer övervunnit denna nackdel genom att utveckla en mängd alternativa tillverkningsmetoder, med olika fördelar som minskade kostnader, snabbare handläggningstider, billigare material och verktyg och ökad funktionalitet8. På detta sätt medförde utvecklingen av nya mikrofabrikationstekniker billiga, icke-renrumsmetoder som uppnår upplösningar så låga som 10 μm8. Mönstring kan användas direkt på ett substrat utan att generera ett dyrt formmönster, vilket undviker en tidskrävande process. Direkta tillverkningsmetoder inkluderar CNC-fräsning, laserablation och direkt litografi8. Alla dessa metoder är lämpliga för att producera kanaler med hög aspektförhållande i ett brett spektrum av material, oavsett hårdhet9, vilket möjliggör nya och fördelaktiga geometrier, fysiska beteenden och kvaliteter i mikrofluidiska enheter8.
CNC-mikrofräsning skapar strukturer i mikroskala med hjälp av skärverktyg som tar bort bulkmaterial från ett substrat och är en effektiv tillverkningsmetod för mikrofluidiska enheter10,11. Mikrofräsningstekniken kan vara användbar i mikrofluidiska applikationer för att skapa mikrokanaler och funktioner direkt på arbetsytan, vilket ger en viktig fördel: ett arbetsstycke kan tillverkas på kort tid (mindre än 30 minuter), vilket avsevärt minskar handläggningstiden från design till prototyp12. Dessutom gör den stora tillgången på skärtillbehör av olika material, storlekar och former CNC-fräsmaskiner till ett lämpligt verktyg som har möjliggjort tillverkning av olika funktioner i många typer av billiga engångsmaterial13.
Bland alla material som vanligtvis används vid mikrofräsning är termoplaster fortfarande ett ledande val på grund av deras många gynnsamma egenskaper och kompatibilitet med biologiska tillämpningar10,14. Termoplaster är ett attraktivt substrat för mikrofluidiska system på grund av deras betydande fördelar för att utveckla billiga engångsanalyssystem9. Dessutom är dessa material mycket mottagliga för tillverkningsprocesser med hög volym, vilket gör dem lämpliga för kommersialisering och massproduktion. Av dessa skäl har termoplaster som PMMA ansetts vara pålitliga och robusta material sedan de första åren av mikrofluidik10. Olika protokoll har beskrivits för att tillverka slutna kanaler i termoplaster, såsom lösningsmedelsbindning15, värmebindning 16 och ultraviolett (UV) / ozonytbehandlingsbindning17.
I många fall är positioneringsupplösningen som uppnås med konventionella mikrofräsmaskiner inte tillräcklig för vissa mikrofluidiska applikationer som kräver strukturer mindre än 10 μm. High-end micromilling har tillräckligt med upplösning. Tyvärr, på grund av höga priser, är dess användning begränsad till en handfull användare12. Tidigare rapporterade vår forskargrupp tillverkning och manipulation av ett billigt verktyg som möjliggör bearbetning av strukturer på mindre än 10 μm, vilket övervinner upplösningen hos konventionella fräsmaskiner12. Fixturen är en plattform tillverkad av 3D-utskrift med enkel elektronik, innehållande tre piezoelektriska ställdon. Ytan innehåller gångjärnsformade fogar som gör att den kan lyftas när de piezoelektriska elementen verkar samtidigt. Z-axelförskjutning kan styras med en upplösning på 500 nm och en noggrannhet på ±1,5 μm12.
Detta dokument presenterar stegen i tillverkningsprocessen för en akrylanordning (PMMA) genom en mikromillingteknik. Spåndesignen består av en huvudkanal 200 μm bred och 200 μm hög och en sidokanal med samma dimensioner för att rensa flödet av reagenserna. I den centrala regionen avbryts kanalen av en fysisk begränsning på endast 5 μm i höjd, tillverkad med den 3D-tryckta piezoelektriska plattformen tillverkad av denna grupp12, för att fånga magnetiska mikropartiklar som utgör en magnetisk fälla för nanopartiklar genom att placera en extern magnet. Vi visar hur den mikrofluidiska anordningen fungerar genom att utföra en immunanalys för att detektera en kommersiell antikropp med hjälp av lysozym som ett modellantigen konjugerat till 100 nm magnetiska nanopartiklar. Denna enhet kombinerar olika funktioner som gör den unik4: användningen av magnetiska nanopartiklar som immunstöd minskar den totala testtiden från timmar till minuter; Användning av ett fluorogent enzym för detektion möjliggör detektionsgränser som är jämförbara med dem för standardenzymbundna immunosorbentanalyser (ELISA). och användningen av en termoplast som tillverkningsmaterial gör den kompatibel med massproduktion, vilket inte var fallet för tidigare mikrofluidiska nanopartiklars magnetiska fällor3, och gör det till en utmärkt kandidat att utveckla POCT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikrofräsning
- Ytslipning
- Slå på mikrofräsmaskinen och den piezoelektriska styrenheten. Starta deras respektive kontrollprogramvara12.
- Välj önskade pinnfräsbitar (200 μm och 800 μm diametrar). Placera dem i lämpligt fack på fräsmaskinen (figur 1).
- Skär 9 mm x 25 mm rektanglar med 1,3 mm tjock PMMA med 800 μm pinnfräskronan. Fäst en av dessa rektanglar försiktigt med dubbelhäftande tejp på den piezoelektriska plattformen (figur 2).
OBS: Se till att alltid placera akrylrektangeln i samma läge så att ett av hörnen sammanfaller med ursprungskoordinaterna på x- och y-axlarna för bearbetning. - Anslut och placera z-sensorn på PMMA-rektangelns yta. Välj detekteringsstiftet och flytta det över sensorytan. Sänk stiftet manuellt utan att kontakta sensorn. Aktivera Z0-avkänningsläget (bild 3).
- Välj 200 μm pinnfräsbit och flytta den till x, y ursprung. Ta bort z-sensorn. Sänk borrkronan försiktigt utan att komma i kontakt med akrylytan.
- Snurra den 200 μm pinnfräsbiten vid 14 500 rpm. Sänk den långsamt till ursprungskoordinaten på z-axeln (z = 0). Återställ z-axeln 30 μm under origo. Ställ in denna koordinat som det nya z-ursprunget.
OBS: Sänk aldrig borrkronan om den inte roterar. Annars riskerar det att gå sönder. - Klicka på Klipp knappen i mikrofräsmaskinens programvara för att aktivera skärpanelen . Klicka på knappen Lägg till och välj .txt-filen (Supplemental Coding File 1) med en tidigare skapad kod för slipning av akrylytan. Klicka på Produktion för att starta processen.
- Ta med pinnfräsbiten till koordinaten där begränsningen ska bearbetas. Förhindra att pinnfräskronan lyfts från markytan när denna koordinat har nåtts genom att klicka på pausknappen. Annars flyttar du pinnfräsbiten manuellt till den här koordinaten (bild 4A).
- Fräsning av 5 μm-begränsningen
- Ställ in rotationshastigheten för pinnfräskronan till 11 000 varv/min. Höj plattformen 6,5 μm med gränssnittet för den piezoelektriska plattformen (kompletterande figur S1). Flytta pinnfräsbiten längs y-axeln med 500 μm. Återställ den piezoelektriska plattformen till dess ursprungliga värde på z-axeln med kontrollgränssnittet.
- Fräsning av mikrokanaler
- Öppna den tidigare skapade designfilen från designprogramvaran (Supplemental Design File 1). Klicka på knappen Skriv ut . Gå till menyn Egenskaper och klicka på färgfönstret som motsvarar lagret som innehåller designen som ska bearbetas. Ange tillverkningsparametrarna på verktygspanelen enligt kompletterande bild S2.
- Inaktivera oönskade lager genom att välja alternativet Ingen i rullgardinsmenyn Verktyg .
- Fräsning av hål
- Byt till 800 μm pinnfräskronan. Aktivera designskiktet på hålen med en diameter på 1,2 mm genom att klicka på motsvarande färgfönster.
- Upprepa steg 1.3.2, men ställ i så fall in motsvarande tillverkningsparametrar enligt beskrivningen i kompletterande figur S3A för hålen.
OBS: Djupet på de bearbetade hålen är hälften av akryltjockleken. - Bearbeta ytterligare två hål i rektangelns kontralaterala hörn till akrylens inriktning på ett inverterat sätt på en ny plattform (figur 4B). Skala av akrylrektangeln från den piezoelektriska plattformen. Vänd akrylen och tejpa fast den med dubbelhäftande tejp över adaptern med de bearbetade pelarna (figur 4C,D).
- Öppna filen med hålens design för motsatt ansikte från designprogramvaran (Supplemental Design File 2). Ställ in motsvarande tillverkningsparametrar enligt beskrivningen i kompletterande figur S3B. Fräs den återstående halvan av reagensinlopps- och utloppshålen med en diameter på 1,5 mm och ett djup på 0,7 mm (kompletterande figur S3C).
Bild 1: Placering av pinnfräskrona . (A) Borrkronorna på 200 μm och 800 μm placeras och fixeras genom en skruv till stålstödet. (B) Varje pinnfräsbit placeras i mikrofräsmaskinens specifika fack för automatiskt val. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Piezoelektrisk plattform. Plattformen är tillverkad av 3D-utskrift och består av två sexkantiga baser förenade med gångjärn som möjliggör en fin förskjutning i z-axeln som styrs av tre piezoelektriska ställdon. En akryladapter observeras också, på vilken PMMA-rektangeln är fäst och som möjliggör inställning av koordinaternas inriktningshörn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Kalibrering med Z-axeln. Stegen i z-axelns kalibrering är detaljerade. (A) Z-sensorn innehåller en kabel som ansluts till mikrofräsmaskinen. (B) Sensorn placeras direkt på den yta som ska bearbetas. (C) Detekteringsstiftet består av en metallstång placerad i ett speciellt fack bredvid pinnfräsbitar. (D) När båda tillbehören kommer i kontakt beräknar mikrofräsmaskinen automatiskt ursprungskoordinaten på z-axeln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Rektifierad akrylyta . (A) Ändfräsbiten med en diameter på 200 μm sveper över hela ytan på akrylrektangeln och avlägsnar ett skikt som är ungefär 30 μm högt. (B) Bilden visar de olika strukturerna frästa på ytan av den tidigare rektifierade akrylen. Kanaler och hål för reagensinlopp och utlopp observeras. Begränsningen på 5 μm kan inte ses med blotta ögat. (C) Mikrofräst yta med inriktningshål och adapter med inriktningspelare i motsatta hörn. (D) Akrylen är inriktad upp och ner på adaptern med pelare, i vilka inriktningshålen passar. Skalstreck = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Tätning av kanalen
- Rengöring av akryl
- Ta bort akrylrektangeln från pelaradapterplattformen. Ta en annan obearbetad akrylrektangel. Tvätta båda akrylplåtarna med isopropylalkohol (IPA) och skölj med destillerat vatten. Använd handskar och undvik kontakt med IPA.
- Sänk ner akrylen i ett ultraljudsbad i 10 minuter (figur 5A,B).
- Exponering för gasformig kloroform
- Torka båda akrylplåtarna perfekt. Tejpa fast dem på insidan av ett petriskålslock i glas med dubbelhäftande tejp. Var noga med att placera den exponerade sidan av den bearbetade kanalen (figur 5C). Använd handskar och undvik att röra akrylytan direkt.
- Placera basen på petriskålen i glas i en större petriskål i glas (figur 5D). Häll 1 ml kloroform i basen av petriskålen. Placera snabbt locket med akrylplåtarna fästa på insidan.
- Tillsätt omedelbart destillerat vatten till basen av den större petriskålen upp till nivån på petriskålens lock. Tillåt att akrylen exponeras för kloroformgas i 1 min (figur 5E).
OBS: Tänk på att en längre exponeringstid för kloroform kommer att attackera akrylytan, och begränsningen på 5 μm smälter, ändrar dess höjd eller försvinner helt. - Luta petriskålen för att bryta den skapade vattentätningen. Ta omedelbart bort akrylen från kloroformen genom att avslöja petriskålen. Var försiktig så att du inte spiller vattnet.
VARNING: Gör denna process i dragskåpet och använd handskar eftersom kloroform är mycket giftigt.
- Limning genom pressning och uppvärmning
- Skala båda akrylplattorna från den dubbelsidiga tejpen.
- Rikta in båda akrylerna med sidorna som utsattes för gasformig kloroform ansikte mot ansikte och bilda en smörgås. Placera akrylen i pressen vid 18 kgf/cm2 och en temperatur på 90 °C (figur 5F,G).
OBS: Det rekommenderas att placera akrylen i längdriktningen och ändra dess inriktning efter 2 minuter för en bättre tätning. Om tätningen efter denna tid är otillräcklig, placera den tillbaka i pressen i intervaller på högst 1 min. Använd stereoskopet och kontrollera kanalernas status och begränsning. Tänk på att om du överskrider presstiden finns det risk för att begränsningen elimineras.
- Slangfäste
- Skär 2-3 cm längder av slangen. Gör ett helt rakt snitt. Fäst varje slang på hålen på enheten med omedelbart torkande flytande lim (figur 6A). Förhindra att limet kommer in i chipet.
Figur 5: Tätningsprocessen för enheten . (A) Var och en av akrylplåtarna placeras i en återförslutningsbar påse med destillerat vatten och nedsänkt i ultraljudsbadet. (B) Bilden till vänster visar kanalerna strax efter tillverkning, och bilden till höger visar samma enhet efter tvätt med IPA och ultraljudsbadet, vilket tar bort alla föroreningar och akrylrester från mikrokanalen. Kanterna på begränsningen som avbryter den centrala kanalen på 200 μm observeras, vilket bekräftar den framgångsrika fräsningsprocessen. Skalstänger = 500 μm. (C) Båda akrylerna torkas och fästs på glasplattformen på locket. (D) Petriskålens botten placeras i en annan skål med större diameter. (E) När petriskålen stängs förhindrar vattentätningen att gasformig kloroform släpper ut. (F) Beskrivning av spakens delar med en vikt på 5 kg. (G) Bild av den öppna spaken, som visar i rött det område där akrylen är placerad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Förberedelse av enheten
- Fyll kanalerna med destillerat vatten med en spruta. Se till att det inte finns några läckor eller motstånd mot flöde. Sänk ner enheten i ett ultraljudsbad i 10 minuter för att ta bort eventuellt kvarvarande akryl, lim eller oönskat material inuti kanalerna.
- Töm vattnet inuti enhetens kanaler. Använd en spruta för att införa en blockerande lösning beredd med 5% (w/v) bovint serumalbumin (BSA) utspätt i 1x Tris-buffrad saltlösning (TBS) och tidigare filtrerat genom ett 0,2 μm polyetersulfon (PES) sprutfilter.
- Förbered en suspension av järnmikropartiklar med en diameter på 7,5 μm i 5% BSA.
OBS: Mikropartiklarna har tidigare funktionaliserats med ett kiseldioxid-polyetylenglykolskikt (PEG) som ger resistens mot proteinabsorption4. - Inkubera chipet och mikropartikelsuspensionen med blockeringslösningen i minst 1 h vid rumstemperatur. Tillåt om möjligt blockering över natten vid 4 °C.
4. Bildning av mikropartikelfälla
- Sätt in mikropartiklarna i chipet med en sprutnål genom sidokanalens utloppsslang. Placera chipet vertikalt och låt mikropartiklarna strömma under tyngdkraftens effekt genom sidokanalen. Vrid chipet 180 ° i två steg om 90 ° och låt mikropartiklarna rikta in sig på och komprimera vid begränsningen på 5 μm.
- Ta bort överflödiga mikropartiklar genom att tyngdkraften roterar 45° mot sidokanalen.
- Håll enheten upprätt för att undvika att ångra mikropartikelfällan. Se figur 6B för en sammanfattning av processen för bildning av mikropartikelfällor.
5. Immunanalys
- Nanopartikel beredning
- Ta 2 μl av suspensionen av 100 nm nanopartiklar som tidigare konjugerats med lysozym (antigenmodell). Tillsätt det i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör med 100 μl blockerande lösning. Inkubera över natten vid 4 °C.
- Tillsätt 150 μl tvättbuffert (1x TBS, 0,05 % tween 20).
- Placera 1,5 ml mikrocentrifugröret i en magnetisk separator. Låt stå i 15 minuter så att nanopartiklarna kan separeras (kompletterande figur S4).
OBS: Minsta volym för magnetseparatorn är 200 μL. Undvik att använda en mindre volym. - Ta bort vätskan från röret med en mikropipett. Undvik kontakt med rörets vägg där nanopartikelpelleten bildades.
- Tillsätt 250 μl färsk tvättbuffert. Håll röret under omrörning i 15 min.
- Upprepa steg 5.1.3–5.1.5. 2x mer, skakar bara i 5 min.
- Lägg till önskad koncentration av primär anti-lysozymantikropp (se materialförteckningen). Justera till en slutlig volym på 100 μl i antikroppsutspädningsmedel (1x TBS, 1% BSA, 0,05% Tween 20).
- Inkubera i 15 minuter vid 37 °C. Fortsätt skaka i ytterligare 15 minuter vid rumstemperatur.
- Upprepa tvättstegen 5.1.2.-5.1.6.
- Tillsätt 100 μl antikroppsutspädningsmedel. Tillsätt den pepparrotsperoxidaskopplade sekundära antikroppen (HRP-AbII) (se materialförteckningen) vid en spädning på 1:500.
- Upprepa tvättstegen 5.1.2.-5.1.6.
- Förvara nanopartiklarna i en slutlig volym på 50 μl antikroppsutspädningsmedel.
6. Experimentell montering
- Fyll de två 100 μl glassprutorna med vatten, anslut en 6,5 cm lång slang till varje spruta, sätt in en metallstift i slangens ände och placera båda sprutorna på den datorstyrda sprutpumpen.
- Försegla alla slangar i akrylanordningen med värme.
- Skär inloppsslangen och håll bara några millimeter. Fyll doseringsnålen med tvättbuffert och sätt in den i den skurna slangen. Låt lösningen droppa innan du ansluter nålen till enheten för att förhindra luftåtkomst till enheten.
- Skär utloppsslangen från sidokanalen. Anslut till sprutpumpen. Gör sedan samma procedur för huvudkanalens utloppsslang.
OBS: Det är viktigt att utföra steg 6.3.-6.4. i denna ordning för att undvika att packa upp mikropartikelfällan. Om möjligt, kontrollera fällans tillstånd under dessa steg med hjälp av ett förstoringsglas. - Placera en glasskiva på mikroskopscenen. Fäst magneten på bilden med dubbelsidig tejp och placera en liten bit tejp på varje sida för att fästa spånkanterna på glaset.
- Ställ in en flödeshastighet på 50 μl/h genom flikarna Flödeshastighet och Enheter i sprutpumpens styrenhet. Välj uttagsläge och klicka på Start-knappen för att aktivera tvättbuffertens flöde.
- Närma dig försiktigt enheten mot bilden med magneten på ett horisontellt sätt så att området på chipet som innehåller fällan kommer i kontakt med magneten.
- Fäst kanterna på enheten på glaset med dubbelsidig tejp för att förhindra rörelse. Undvik att blockera den optiska vägen för mikroskopi (figur 6C).
Bild 6: Slutlig enhetskonfiguration . (A) Akrylanordning med slangarna fästa vid motsvarande ingångar och utgångar. Skalan visar enhetens dimensioner i centimeter. B) Protokoll för bildandet av mikropartikelfällan. Mikropartiklar strömmar genom kanalen genom tyngdkraften när enheten placeras i vertikalt läge. Mikropartiklar koncentreras vid 5 μm-begränsningen. Överskott av mikropartiklar avlägsnas enkelt genom att rotera chipet genom sidokanalen. Chipet hålls vertikalt för att bevara fällan före immunanalys. C) Mikrofluidisk anordning monterad på en glasskiva som innehåller magneten, på scenen i det inverterade fluorescensmikroskopet. Doseringsnålen genom vilken reagenserna tillsätts observeras, liksom utloppsslangarna som ansluts till en sprutpump. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
7. Immunodetektion
- Håll tvättbufferten flytande i 10 min vid 50 μl/h för att avlägsna överskott av BSA.
- Ta bort den återstående tvättbufferten från doseringsnålen med en mikropipett. Tillsätt 50 μl av nanopartikelsuspensionen.
- Flöda suspensionen av nanopartiklar i 7 minuter med en flödeshastighet på 100 μl/h. Ändra därefter flödeshastigheten till 50 μl/h och flöde i ytterligare 15 minuter.
- Byt doseringsnålen. Flöda tvättbufferten i 10 min vid 50 μl/h. Förbered det fluorogena substratet enligt tillverkarens specifikationer under tvättsteget.
- Ta bort den återstående tvättbufferten från doseringsnålen med en mikropipett. Tillsätt 100 μl av det fluorogena substratet (se materialförteckningen). Flöda det fluorogena substratet i 6 minuter vid 50 μl/h.
- Ställ in mätparametrarna för flödeshastighet (1 μL/h, 3 μl/h, 5 μl/h och 10 μl/h) och tid (6 min) på motsvarande flikar för flödeshastighet och ställ in timer i gränssnittet som styr sprutpumpen. Var noga med att välja Uttagsläge för var och en av mätningarna som ska utföras.
- Ställ in en extra flödeshastighetsflik på 50 μl / h och ställ in timern på 3 minuter för tvättsteget.
- Slå på mikroskopets fluorescens 15 s innan substratet vid 50 μl / h stannar. Starta bildtagningen med programvaran för mikroskopkameran 10 s innan substratet stannar med en exponeringstid på 1,000 millisekunder. Utför avbildning i 6 min vid 1 bildruta /s (FPS).
- Klicka på Start-knappen för önskad flödeshastighetsparameter omedelbart efter att substratets tvättflödeshastighet vid 50 μL / h stannar. Klicka på Start-knappen för tvättflödet (50 μL/h) omedelbart efter att det valda mätflödet har stannat.
- Stoppa bildtagningen och stäng av mikroskopets fluorescens för att undvika fotoblekning av substratet.
- Upprepa steg 7.8.-7.10. för varje mätflöde som används.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det var möjligt att upprätta ett mycket reproducerbart tillverkningsprotokoll som förbättrar upplösningen av den konventionella mikromillingtekniken. Med hjälp av detta protokoll uppnås tillverkningen av en kanal så liten som 5 μm i höjd som fungerar som en förskjuten begränsning i en 200 μm hög kanal. Den enkla utformningen av den förskjutna begränsningen fångar järnmikropartiklar med en diameter på 7,5 μm som, när de komprimeras i mikrokanalen, gör det möjligt att skapa en magnetisk fälla när en extern magnet närmar sig enheten. Denna anordning gör det möjligt att utföra immunanalyser med användning av nanopartiklar konjugerade med analyten av intresse som immunologiskt stöd. I detta arbete utfördes icke-konkurrenskraftiga indirekta immunanalyser med enzymmärkt antikroppsbaserad detektion. Modellantigenet (Ag) var lysozymprotein konjugerat till nanopartiklar (NP) med en diameter på 100 nm. Kanin anti-lysozym IgG användes som primär antikropp (AbI) och detektion utfördes med hjälp av kanin pepparrotsperoxidaskonjugerad sekundär antikropp (HRP-AbII).
Detektion utfördes genom att korrelera förändringen i fluorescenssignalintensitet erhållen efter interaktionen mellan HRP-AbII och ett fluorogent substrat vid passage genom fällan med instängda nanopartiklar. För att utföra mätningarna bestämdes en region före och en region efter fällan. Figur 7A-D visar ökningen av fluorescensintensiteten för olika koncentrationer av anti-lysozym AbI: 0 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml och 1 000 ng/ml för ett givet fluorogent substratflöde (3 μl/h). Detta visar att förändringen i substratfluorescens är direkt proportionell mot koncentrationen av AbI som används.
Figur 7: Mätområden för fluorescens. Fluorescensmätningarna visas för olika koncentrationer av primär antilysozymantikropp som används: (A) 0 ng/ml, (B) 10 ng/ml, (C) 100 ng/ml och (D) 1 000 ng/ml. Blå cirklar visar området för fluorescensmätning före och efter fällan som bildas av höjdbegränsningen på 5 μm, där substratet reagerar med den HRP-konjugerade sekundära antikroppen. Alla bilder motsvarar ett flöde på 3 μl/h. Förkortning: HRP = pepparrotsperoxidas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För en given AbI-koncentration är emellertid den erhållna fluorescensnivån en funktion av den flödeshastighet som används för det fluorogena substratet. Således är omvandlingskapaciteten hos detta substrat av HRP-enzymet omvänt proportionellt mot flödeshastigheten. Olika substratflödeshastigheter på 1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h och 10 μL/h utvärderades. För varje experiment erhölls kurvorna som motsvarar skillnaden i fluorescens som ges av substratet före och efter passage genom magnetfällan. Figur 8A-C visar de kurvor som erhålls för en koncentration på 100 ng/ml för tre olika flödeshastigheter: (A) 10 μl/h, (B) 3 μl/h och (C) 1 μl/h. Beroende på vilken flödeshastighet som används varierar substratets omvandlingskapacitet av den HRP-konjugerade sekundära antikroppen placerad i magnetfällan. Den gröna kurvan representerar substratets fluorescensintensitet efter omvandling av HRP som ligger i fällan. Det kan ses att vid högre flöden sönderfaller den maximala nivån av fluorescens erhållen. Den röda kurvan representerar den basala fluorescensen innan substratet når fällan. Mätningen av substratfluorescens i detta område av fällan förblir konstant, och dess värde beror på graden av icke-specifika interaktioner om det inte finns någon effektiv blockering av kanalytan. Vi beräknade skillnaden mellan båda kurvorna, representerade av den blå kurvan.
Figur 8: Fluorescenskurvor. Grafer erhållna vid en koncentration av 100 ng/ml primärantikropp och flödeshastigheter på (A) 10 μl/h, (B) 3 μl/h och (C) 1 μl/h. De tre färgade kurvorna representerar fluorescensen som mäts före fällan (röd kurva) och efter fällan (grön kurva) och skillnaden mellan de två (blå kurvan) över tid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9A-C integrerar fluorescensskillnadskurvorna uppmätta före och efter immunreaktion för de olika flödena för AbI-koncentrationer på (A) 0 ng/ml, (B) 10 ng/ml och (C) 1 000 ng/ml. Mätningen för en flödeshastighet på 0 μl/h indikerar mätningen av immunreaktioner under statiska förhållanden där diffusion styr. För en koncentration på 1 000 ng/ml mättas fluorescensen för alla utvärderade flöden. Det förskjutna mönstret av fluorescens vid de olika flödena beror emellertid på diffusion av substratet, som reagerar med en så hög omvandlingshastighet att det övervinner de mindre flödena. Således sker en återgång av denna fluorescens till fällans uppströmszon.
Figur 9: Fluorescensskillnadsförhållanden. Sammanfattade kurvor för fluorescensskillnaderna (efter−före) för de olika flöden som används vid (A) 0 ng/ml, (B) 10 ng/ml och (C) 1 000 ng/ml. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Mätningar erhållna med denna anordning gör det möjligt att generera en standardkalibreringskurva för immunoassays utförda med lysozym som modellantigen. Figur 10 visar kalibreringskurvan erhållen från de maximala värdena för skillnaderna mellan fluorescensen före och efter immunreaktionen som utfördes i magnetfällan. Detta protokoll möjliggör detektion av den primära anti-lysozymantikroppen med koncentrationer i storleksordningen nanogram per milliliter med hjälp av flöden mellan 1 μL / h och 10 μL / h. Den höga variabiliteten och höga fluorescensnivåerna vid 1 μL / h tyder på att immunokomplexets reaktivitet är sådan att denna hastighet inte gynnar flödet av det reagerande substratet och tenderar att ackumuleras strax efter fällan, förutom det faktum att anordningens motstånd minskar enhetens upplösning för denna flödeshastighet.
Bild 10: Kalibreringskurva. Diagrammet visar det maximala värdet av skillnaderna i fluorescensintensitet hos de kurvor som erhållits med avseende på koncentrationen av primär antikropp som används (AB1) för varje flödeshastighet. I/I sat motsvarar förhållandet mellan det fluorescensvärde som erhålls för varje fluorescensmätning (I), normaliserat med avseende på det maximala fluorescensvärde som uppnås vid mättnad (Isat). Felstaplar representerar standardavvikelsen för de tre experimenten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur S1: Piezoelektriskt plattformskontrollgränssnitt. Den vänstra bilden visar gränssnittet som styr z-axelns förskjutning av den piezoelektriska plattformen. Begränsningen skapas genom att höja plattformen genom applicering av spänning till tre piezoelektriska ställdon. Den högra bilden visar gränssnittet för programvaran som styr mikrofräsmaskinen, där det är möjligt att observera de exakta koordinaterna i x- och y-axlarna där begränsningen bearbetas med en hastighet av 11 000 rpm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Enhetens konstruktion. Utformningen av enheten som skapats med hjälp av designprogramvaran ses till vänster. Designen består av två anslutna kanaler, den ena är huvudkanalen som innehåller höjdbegränsningen på 5 μm och den andra är sidokanalen för avfallsutloppet. Kanalerna är mikrofräsade med en 200 μm pinnfräs. Panelen till höger visar tillverkningsparametrarna. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S3: Mikrofräsningsparametrar för inlopps- och utloppshål. (A) 1,2 mm diameter och 0,65 mm djuphål (halva akryltjockleken) mikrofräses på den bearbetade ytan. Panelen till höger visar förskjutningshastighet, rotation och djupparametrar för pinnfräsbiten. (B) 1,5 mm diameter och 0,7 mm djuphål är mikrofrästa på motsatt yta som förbinder hålen. Panelen till höger visar tillverkningsparametrarna. Båda fallen är mikrofräsade med en 800 μm pinnfräs. (C) Reagensinloppshål (höger) och utlopp (vänster) visas efter bearbetning av båda ytorna. Dimensionerna på den större diameterhalvan gör att slangen kan kopplas, medan barriären som skapas av hälften med mindre diameter förhindrar att slangen blockerar inloppen. Skalstänger = 1 mm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S4: Separation av nanopartiklar. Med hjälp av en kommersiell magnetisk separator kan 100 nm nanopartiklar enkelt koncentreras för att utföra tvättstegen under immunanalysen. Pelleten som bildas efter 15 min observeras i den röda cirkeln. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 1: Kod för akrylytslipning. Den genererade koden visas med instruktioner för slipning av akrylytan på 25 mm x 9 mm längs x- och y-axlarna. Den sista raden i koden placerar borrkronan precis vid koordinaten där begränsningen ska bearbetas. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande designfil 1: Design av mikrokanal- och reagensinlopps- och utloppshålen. Designen innehåller två lager av olika färgade strukturer (svarta kanaler och röda hål) som bearbetas på den tidigare markerade akrylytan. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande designfil 2: Design av hålen på motsatt sida. Designen består av hål med större diameter för motsatt ansikte som kommunicerar med de tidigare och tjänar till att fixa slangarna. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En akrylmikrofluidisk anordning för immunanalyser med nanopartiklar som immunstöd tillverkades med hjälp av en mikromillingteknik. Metoden för direkt tillverkning på substratet har fördelen att man undviker användning av en huvudform och den tid och de kostnader som detta innebär. Det är dock begränsat till snabb prototypframställning och tillverkning av enheter med hög volym.
Här använde vi en tidigare rapporterad tillbehörspiezoelektrisk plattform för fräsmaskinen12. Plattformen tillverkades genom 3D-utskrift för att skapa kanaler med variabelt djup med en vertikal upplösning bättre än 10 μm upplösning för konventionella mikrofräsmaskiner. Vi uppnådde fräsning av kanaler på upp till 5 μm höga som bildar en förskjuten begränsning i den 200 μm mikrofluidiska kanalen.
Endast två pinnfräsbitar med en diameter på 200 μm och 800 μm krävs för tillverkning av mikrofluidikanordningen, utan att behöva byta borrkronor manuellt. Fräsmaskinmodellen som används utför utbyte av bitar automatiskt, vilket hjälper till med tidsoptimering. Dessutom möjliggör "Z0-avkänning" -läget bestämning av ursprunget automatiskt i z-axeln med hög precision genom att kontakta sensorn och stiftet som ingår i fräsmaskinen.
Utformningen av denna enhet är enkel och består endast av huvudkanalen avbruten av en 5 μm förskjuten begränsning och en tillbehörskanal som fungerar som en rensning och inlopp för mikropartiklar. Den höga precisionen hos sådana strukturer krävs emellertid för begränsningen att fånga järnmikropartiklar med en diameter på 7,5 μm. En större begränsning tillåter mikropartiklar att passera utan retention, vilket förhindrar deras fångst och bildandet av mikropartikelfällan. Omvänt ökar en mindre begränsning kraftigt kanalens flödesmotstånd och får reagenserna att gå ut genom sidokanalen istället för att passera genom det porösa mikropartikelmediet. Att använda mikropartiklar med större diameter för att bilda magnetfällan skulle möjliggöra en större begränsning. Till exempel behöver partiklar med en diameter på 40 μm en ~ 30 μm förskjuten begränsning. I så fall är det inte nödvändigt att använda den piezoelektriska plattformen, och tillverkningsprotokollet förenklas. Ett poröst medium som består av större mikropartiklar skulle dock fånga nanopartiklar annorlunda och skulle påverka immunanalysens prestanda; Det är dock inte klart om det skulle vara på gott och ont. Arbete pågår för att studera dessa funktioner för att optimera enheten7.
För att uppnå den erforderliga noggrannheten utfördes ytslipning för att avlägsna ett 30 μm-lager av akrylytan genom att flytta 200 μm pinnfräskronan genom hela akrylytan vid 14 500 rpm. Denna process gör det möjligt att erhålla ett nytt ursprung vid z-axeln längs hela ytan för större noggrannhet i höjd. Det är viktigt att alltid rikta akrylen i samma position så att ursprungskoordinaterna på x- och y-axlarna (tidigare inställda) sammanfaller med ett av akrylens hörn. På samma sätt bör man se till att akrylen sitter perfekt på basen; Annars kan ytan inte slitas ordentligt, vilket orsakar problem i följande monteringssteg.
När programmet har slutfört ytslipningsprocessen tar det automatiskt pinnfräsbiten till en specifik koordinat där begränsningen på 5 μm som bildar fällan kommer att bearbetas. Det är viktigt att förhindra att pinnfräsbiten lyfter från ytan när den når denna koordinat. Det rekommenderas att identifiera om mikrofräsmaskinen har ett alternativ som förhindrar att pinnfräsbiten lossnar från ytan när slipprocessen är klar. Annars kommer det att vara nödvändigt att manuellt flytta skäraren till denna koordinat, vilket kan leda till platsnoggrannhetsfel.
För att bearbeta den förskjutna begränsningen i akrylen är det nödvändigt att överdimensionera med 1,5 μm. För 5 μm höjd höjdes den piezoelektriska plattformen till 6,5 μm eftersom mikrokanalen tenderar att platta ut lite i processen att täta kanalerna. Dessutom är den slutliga längden på begränsningen i anordningen endast 50 μm; den bearbetas dock längre för att säkerställa att den kommunicerar med båda ändarna av huvudkanalen när den bearbetas efteråt. I ett steg tillverkas de 200 μm djupa kanalerna med hjälp av pinnfräskronan med en diameter på 200 μm och en rotationshastighet på 11 000 rpm. Således tar bearbetning av de 200 μm breda kanalerna i akryl bara några sekunder.
Nästa steg i tillverkningen av enheten är att bearbeta hålen som ansluter kanalerna till utsidan. Dessa hål används för att placera slangarna som gör att enheten enkelt kan anslutas till sprutpumpen som driver den. Ett av problemen som uppstår här är placeringen av slangarna. Ett optimalt avstånd är avgörande för att tillåta flödet av reagens och undvika att skapa en tätning med ytan på den obearbetade akrylen. För att övervinna denna nackdel bearbetas hålen i två steg för att skapa en gräns där slangarna inte överskrider önskat djup.
Med den 800 μm pinnfräsen frästes hålmönstret på samma tidigare mikrofrästa yta. Hål bearbetas i slutet av varje kanal med en diameter av 1,2 mm och ett djup av 0,65 mm, vilket är hälften av akrylens tjocklek. Dessutom bearbetas två hål i rektangelns kontralaterala hörn, vilket gör att akrylen kan justeras nedåt på plattformen med pelare. Det är viktigt att använda en skrapa eller skärare för att ta bort akrylen från den piezoelektriska plattformen för att undvika att den går sönder. På motsatt sida av akrylen är hålens diameter 1,5 mm (större än föregående hälft), vilket är lika med diametern på slangen som ska fixeras. Djupet är 0,7 mm och bör vara något större än hälften av det främre ansiktshålet för att säkerställa att båda de bearbetade hålen kommunicerar med varandra. Barriären som bildas av hålet med mindre diameter förhindrar att slangen når botten och blockerar inloppet. Denna implementering i protokollet förbättrar avsevärt placeringen av vätskeinlopps- och utloppsslangarna till chipet.
Ett viktigt steg i enhetstillverkningen är tätning. Det är nödvändigt att täta ansiktet som innehåller de bearbetade kanalerna med ett obearbetat akrylskydd med samma dimensioner. Tätning av arken med en metod som inte närmar sig akrylens glasövergångstemperatur möjliggör erhållande av deformationsfria kanaler. Genom den använda bindningsmetoden löser en tunn film av lösningsmedel mellan de två PMMA-arken upp en tunn film från PMMA-arkets yta, avdunstar sedan och återansluter slutligen monomererna i PMMA-arken vid en specifik driftstemperatur.
Den allmänt beskrivna metoden för exponering av kloroformånga användes för att täta denna akrylanordning. Som tidigare rapporterats i litteraturen ger kloroform hög bindningsstyrka; Men eftersom kloroform attackerar akryl mycket aggressivt, bör akryl aldrig komma i direkt kontakt med flytande kloroform, endast med gasformig kloroform. Det är viktigt att upprätthålla ett optimalt avstånd mellan den förångande kloroformen och akrylen. Vi skapade ett enkelt system med en petriskål i glas, där akrylen fästes på locket. En plattform bestående av nio bilder sammanfogade och fästa vid locket på petriskålen användes, på vilken akrylen fästes med dubbelsidig tejp för att reglera avståndet. Även om den gasformiga kloroformprocessen är mycket känslig för förändringar i omgivningstemperaturen, kan temperaturen på petriskålarna styras genom att placera dem i en polystyrenlåda. Vattentätningen förhindrar att kloroformen avdunstar för snabbt.
Däremot finns det andra rapporterade sammanfogningsmetoder som är snabbare och inte kräver specialutrustning; Vissa är dock endast lämpliga för att sammanfoga två akrylplåtar utan bearbetning. På samma sätt är det svårt att kontrollera bindningskraften eftersom lösningsmedlet måste hällas direkt mellan båda akrylplåtarna18, med stor risk för smältstrukturer av små dimensioner, såsom den mikrofrästa 5 μm-begränsningen.
Med hjälp av protokollet som beskrivs här uppnåddes homogena tätningar med en hemlagad press, med vilken tätningstrycket och temperaturen kontrollerades. För konstruktionen av denna press skapar både en ram av aluminium och ett gångjärn en spak som förstärker den mekaniska kraften som kommer från en vikt av 5 kg till en faktor 9:1. Värmeelementen överför värmen till 2 cm tjocka aluminiumplattor som är i kontakt med akrylbitarna.
När akrylskikten är förseglade är det sista steget i tillverkningsprocessen att ansluta de externa slangarna till motsvarande inlopp och utlopp på enheten. Det flytande limet appliceras externt när slangarna är inne i hålen. Om slangens diameter är mindre än hålen kan vätskelimet komma in i enheten och täppa till kanalerna.
Direkta tillverkningsmetoder på substratet, såsom mikrofräsning, har vissa nackdelar, såsom grovhet hos den bearbetade ytan och strukturer med dåligt avgränsade kanter9. Trots grovheten hos kanalernas bearbetade yta är ingen ytterligare behandling nödvändig för denna anordning. En viktig punkt att notera om detta bindningsprotokoll är att kloroform gör det möjligt att minska grovheten hos de malda mikrokanalerna genom att polera ytorna som utsätts för lösningsmedlet. Poleringen av ytan är så bra att även den optiska kvaliteten förbättras19.
När enheten har tillverkats måste den förberedas för att användas i en immunanalys. Ultraljudstvätt av enheten är av stor betydelse för att ta bort oönskade akrylskräp som kan täppa till kanalerna och störa immunanalysen.
Dessutom måste särskild uppmärksamhet ägnas åt korrekt blockering av kanalerna för att undvika icke-specifika interaktioner och höga bakgrundsbrussignaler. Blockering med 5% BSA har visat sig minska bruset från ospecifik bindning av antikroppar i kanalerna, och 1 h inkubation är tillräcklig. Järnmikropartiklarna är belagda med ett kiseldioxid-PEG-skikt för att förhindra ospecifik bindning i dem. Dessutom blockeras mikropartiklarna med BSA (samtidigt som kanalerna) innan de bildar fällan i enheten. Inkubation över natten vid 4 °C är bättre, vilket innebär att 1 dag krävs för tillverkning och inkubation av enheten före immunanalysen. Minskningen av grovheten genom kloroformen och blockeringen av ytorna för att minska icke-specifika interaktioner har visat sig fungera exceptionellt bra, vilket gör det möjligt för denna plattform att uppnå en detektionsgräns som är jämförbar med standard ELISA i en modellimmunanalys4.
Bildandet av mikropartikelfällan i mikrokanalbegränsningen är en manuell process. Även om det inte finns någon exakt kontroll av antalet mikropartiklar som kommer in, förlitar vi oss på en uppskattning av längden på de komprimerade partiklarna. Det är möjligt att göra fällan större eller ta bort överskottet enkelt. De kasserade partiklarna ackumuleras i sidokanalen och behöver inte tas bort från chipet. Det är viktigt att förhindra att mikropartiklar strömmar in i huvudkanalen, eftersom de kan interagera med nanopartiklar uppströms fällan och modifiera immunanalysmätningarna.
Som ett proof-of-concept implementerade vi immunodetektion av ett komplex bildat av lysozymprotein konjugerat till nanopartiklar med en diameter på 100 nm genom inkubation av den specifika primära antikroppen och motsvarande HRP-märkta sekundära antikropp. Immunokomplexet bildas utanför anordningen. Det är emellertid möjligt att utföra hela immunanalysen inuti enheten. Nanopartiklarnas magnetiska egenskaper möjliggör enkel manipulation med en högpresterande neodym permanentmagnetseparator. Man måste helt enkelt hålla reaktionsmikroröret i 15 minuter för att nanopartiklarna ska kunna lockas av magneten till mikrorörsväggen, vilket underlättar immunanalystvättstegen utanför enheten.
Höjdpunkten i denna enhet är att den är enkel, snabb (total analystid på 40 min 4 jämfört med4-6 h för ELISA) och billig (jämförbar med priset på ett lateralt flödestest). Alla dessa funktioner gör denna enhetsprofil till en bra kandidat för utvecklingen av POCT. Dessutom kan enheten kvantitativt detektera analytkoncentrationer som liknar guldstandarden ELISA4, vilket är extremt värdefullt för epidemiologiska studier och beslutsfattande inom folkhälsan. Vanligtvis har mikrofluidiska system för immunanalyser goda detektionsgränser men långa analystider, eller så har de korta analystider men suboptimala detektionsgränser4. Genom att kombinera magnetiska nanopartiklar som immunstöd och fluorogena enzymer för detektion har denna plattform en kort analystid och en bra detektionsgräns (i tidigare arbete fann vi en detektionsgräns på 8 pg / ml med biotin som antigen, vilket är jämförbart med en standard ELISA4). Slutligen har denna teknik en viktig fördel jämfört med laterala flödestester: möjligheten att ge kvantitativa och inte bara kvalitativa resultat ("ja" eller "nej"). Till skillnad från de flesta andra mikrofluidiska system som utvecklats i laboratorier där sällsynta material används, är detta system tillverkat av akryl (PMMA), en billig termoplast som är mycket kompatibel med massproduktion av medicinska diagnostiska anordningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Conacyt, Mexiko under bidrag 312231 av "Programa de Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológicas y de Innovación", och av AMEXCID och Mexikos utrikesministerium (SRE) under bidrag "Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2". JAHO tackar Conacyt Mexico för deras doktorandstipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.008 Endmill | KYOCERA SGS | 2204 | 2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12 |
| 0.032 Endmill | KYOCERA SGS | 2228 | 2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12 |
| Carbonyl-iron microparticles | Sigma-Aldrich | 44890 | 7 μm |
| Chloroform | Fermont | 6201 | Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate |
| CMOS camera Moment | Teledyne Photometrics | Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2 |
|
| Dr Engrave Software | Roland DGA Corporation | Engraving software to design and create the engraving path on the surface | |
| Extraction hood | Unknown | Unknown | |
| Flexible Plastic Tubing | Tygon | AAD04103 | ID = 0.020, OD = 0.060 |
| Fluorescence microsope | ZEISS | Axio Vert.A1 | |
| High Precision Dispense Needle | Loctite | 98612 | |
| Homemade piezoelectric controller application | LabView | See reference 12 for more details. | |
| Loctite 495 instant adhesive | Henkel | 49503 | Apply with micropipette tip or dispensing needle |
| MagJET Separation Rack | thermoscientific | 12 x 1.5 mL | |
| Mechanic press | Home-made | ||
| Milling Machine | Roland | MDX-50 | |
| Piezoelectric platform | Home-made | See reference 12 | |
| Polymethylmethacrylate - Sheet - PMMA, Acrylic | Goodfellow | ME303018/1 | Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent |
| PVCamTest software | Teledyne Photometrics | Version 3.10.107 | Image acquisition software |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ 7457 | |
| SuperMag Carboxyl Beads | Ocean NanoTech | KSC0100 | 100 nm |
| Syringe pump | kd Scientific | KDS200 | Can hold up to two syringes |
| Utrasonic bath | Branson | 2800 | |
| VPanel software | Windows OS | Version 1.0.3.0 | Software for controlling the micromilling machine |
References
- Ng, A. H. C., Uddayasankar, U., Wheeler, A. R.
- Berlanda, S. F., Breitfeld, M., Dietsche, C. L., Dittrich, P. S. Recent advances in microfluidic technology for bioanalysis and diagnostics. Analytical Chemistry. 93 (1), 311-331 (2021).
- Teste, B., et al. Microchip integrating magnetic nanoparticles for allergy diagnosis. Lab on a Chip. 11 (24), 4207-4213 (2011).
- Guevara-Pantoja, P. E., Sánchez-Domínguez, M., Caballero-Robledo, G. A. Micro-nanoparticles magnetic trap: Toward high sensitivity and rapid microfluidic continuous flow enzyme immunoassay. Biomicrofluidics. 14 (1), 014111 (2020).
- Khizar, S., et al. Magnetic nanoparticles in microfluidic and sensing: From transport to detection. Electrophoresis. 41 (13-14), 1206-1224 (2020).
- Podaru, G., Chikan, V. CHAPTER 1: Magnetism in nanomaterials: Heat and force from colloidal magnetic particles. Magnetic Nanomaterials: Applications in Catalysis and Life Sciences. , Royal Society of Chemistry. Cambridge, UK. 1-24 (2017).
- Reynoso-Hernández, K. B., Guevara-Pantoja, P. E., Caballero-Robledo, G. A. Capture efficiency of magnetic nanoparticles through the compaction effect of a microparticles column. Physical Review E. 104 (2), 024603 (2021).
- Gale, B. K., et al. A review of current methods in microfluidic device fabrication and future commercialization prospects. Inventions. 3 (3), 60 (2018).
- Liu, K., Fan, Z. H. Thermoplastic microfluidic devices and their applications in protein and DNA analysis. Analyst. 136 (7), 1288-1297 (2011).
- Guckenberger, D. J., de Groot, T. E., Wan, A. M. D., Beebe, D. J., Young, E. W. K. Micromilling: A method for ultra-rapid prototyping of plastic microfluidic devices. Lab on a Chip. 15 (11), 2364-2378 (2015).
- Guevara-Pantoja, P. E., Jiménez-Valdés, R. J., García-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. Pressure-actuated monolithic acrylic microfluidic valves and pumps. Lab on a Chip. 18 (4), 662-669 (2018).
- Guevara-Pantoja, P. E., Chavez-Pineda, O. G., Solis-Serrano, A. M., Garcia-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. An affordable 3D-printed positioner fixture improves the resolution of conventional milling for easy prototyping of acrylic microfluidic devices. Lab on a Chip. 20 (17), 3179-3186 (2020).
- Friedrich, C. R., Vasile, M. J. Development of the micromilling process for high-aspect-ratio microstructures. Journal of Microelectromechanical Systems. 5 (1), 33-38 (1996).
- Malayath, G., Sidpara, A. M., Deb, S. Study of different materials response in micro milling using four edged micro end mill tools. Journal of Manufacturing Processes. 56, 169-179 (2020).
- Jiang, J., et al. A single low-cost microfabrication approach for polymethylmethacrylate, polystyrene, polycarbonate and polysulfone based microdevices. RSC Advances. 5 (45), 36036-36043 (2015).
- Sun, Y., Kwok, Y. C., Nguyen, N. T. Low-pressure, high-temperature thermal bonding of polymeric microfluidic devices and their applications for electrophoretic separation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (8), 1681-1688 (2006).
- Tsao, C. W., Hromada, L., Liu, J., Kumar, P., DeVoe, D. L. Low temperature bonding of PMMA and COC microfluidic substrates using UV/ozone surface treatment. Lab on a Chip. 7 (4), 499-505 (2007).
- Bamshad, A., Nikfarjam, A., Khaleghi, H. A new simple and fast thermally-solvent assisted method to bond PMMA-PMMA in micro-fluidics devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 26 (6), 065017 (2016).
- Ogilvie, I. R. G., et al. Reduction of surface roughness for optical quality microfluidic devices in PMMA and COC. Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (6), 065016 (2010).
