Summary
Het protocol biedt een gedetailleerde methode van neuronale beeldvorming in hersensegmenten met behulp van een weefselzuiveringsmethode, ScaleSF. Het protocol omvat hersenweefselvoorbereiding, weefselverheldering, behandeling van gewiste plakjes en confocale laserscanmicroscopie beeldvorming van neuronale structuren van mesoscopische tot microscopische niveaus.
Abstract
Een gedetailleerd protocol wordt hier verstrekt om neuronale structuren van mesoscopische tot microscopische niveaus in hersenweefsels te visualiseren. Neuronale structuren, variërend van neurale circuits tot subcellulaire neuronale structuren, worden gevisualiseerd in hersensneden van muizen die optisch zijn gewist met ScaleSF. Deze clearingmethode is een aangepaste versie van ScaleS en is een hydrofiele weefselzuiveringsmethode voor weefselplakken die krachtige clearingcapaciteit bereikt, evenals een hoog niveau van behoud van fluorescentiesignalen en structurele integriteit. Een aanpasbare driedimensionale (3D) geprinte beeldkamer is ontworpen voor betrouwbare montage van vrijgemaakte hersenweefsels. Muizenhersenen geïnjecteerd met een adeno-geassocieerde virusvector met verbeterd groen fluorescerend eiwitgen werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde en in plakjes van 1 mm dikte gesneden met een trillende weefselsnijder. De hersenschijfjes werden gewist door het clearingprotocol te volgen, dat sequentiële incubaties in drie oplossingen omvat, namelijk ScaleS0-oplossing, fosfaatbufferzoutoplossing (–) en ScaleS4-oplossing, voor een totaal van 10,5-14,5 uur. De gewiste hersenplakken werden op de beeldkamer gemonteerd en ingebed in 1,5% agarose-gel opgelost in ScaleS4D25(0)-oplossing. De 3D-beeldacquisitie van de plakjes werd uitgevoerd met behulp van een confocale laserscanmicroscoop uitgerust met een multi-immersie objectieflens van een lange werkafstand. Beginnend met mesoscopische neuronale beeldvorming, slaagden we erin om fijne subcellulaire neuronale structuren, zoals dendritische stekels en axonale boutons, in de optisch geklaarde hersenplakken te visualiseren. Dit protocol zou het begrip van neuronale structuren van circuit- tot subcellulaire componentschalen vergemakkelijken.
Introduction
Weefselopruimingsmethoden hebben de diepte-onafhankelijke beeldvorming van biologische en klinische monsters met lichtmicroscopie verbeterd, waardoor structurele informatie over intacte weefsels kan worden geëxtraheerd 1,2. Optische clearingtechnieken kunnen mogelijk ook versnellen en de kosten voor histologische analyse verlagen. Momenteel zijn er drie belangrijke clearingbenaderingen beschikbaar: hydrofiele, hydrofobe en hydrogel-gebaseerde methoden 1,2. Hydrofiele benaderingen overtreffen in het behoud van fluorescentiesignalen en weefselintegriteit en zijn minder toxisch in vergelijking met de andere twee benaderingen 3,4.
Een hydrofiele clearingmethode, ScaleS, heeft een onderscheidende positie met zijn behoud van structurele en moleculaire integriteit en krachtige clearingcapaciteit (clearing-preservation spectrum)5. In een eerdere studie ontwikkelden we een snel en isometrisch clearingprotocol, ScaleSF, voor weefselplakken (~ 1 mm dikte) door de clearingprocedure van ScaleS6 te wijzigen. Dit clearingprotocol vereist sequentiële incubaties van hersenplakken in drie oplossingen gedurende 10,5-14,5 uur. De methode is voorzien van een hoog clearing-preserveringsspectrum, dat zelfs compatibel is met elektronenmicroscopie (EM) -analyse (aanvullende figuur 1), waardoor multischaal hoge resolutie driedimensionale (3D) beeldvorming met nauwkeurige signaalreconstructiemogelijk is 6. ScaleSF zou dus effectief moeten zijn, vooral in de hersenen, waar neuronale cellen uitbundige processen van enorme lengte uitwerken en gespecialiseerde fijne subcellulaire structuren regelen voor het verzenden en ontvangen van informatie. Het extraheren van structurele informatie met schalen van circuit- tot subcellulaire niveaus op neuronale cellen is heel nuttig voor een beter begrip van hersenfuncties.
Hier bieden we een gedetailleerd protocol om neuronale structuren te visualiseren met schalen van het mesoscopische / circuit tot microscopisch / subcellulair niveau met behulp van ScaleSF. Het protocol omvat weefselvoorbereiding, weefselzuivering, behandeling van gewiste weefsels en confocale laserscanmicroscopie (CLSM) beeldvorming van gewiste weefsels. Ons protocol richt zich op het ondervragen van neuronale structuren van circuit- tot subcellulaire componentschalen. Voor een gedetailleerde procedure voor de bereiding van de oplossingen en stereotaxische injectie van adeno-geassocieerde virus (AAV) vectoren in muizenhersenen, zie respectievelijk Miyawaki et al. 20167 en Okamoto et al. 20218.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees van Juntendo University (Approval No. 2021245, 2021246) en uitgevoerd in overeenstemming met de Fundamental Guidelines for Proper Conduct of Animal Experiments door de Science Council of Japan (2006). Hier werden mannelijke C57BL/6J-muizen geïnjecteerd met AAV-vector met verbeterd groen fluorescerend eiwit (EGFP) gen en parvalbumine (PV)/myristoylation-EGFP-low-density lipoproteïne receptor C-terminale bacteriële kunstmatige chromosoom (BAC) transgene muizen (PV-FGL muizen)9 gebruikt. PV-FGL-muizen werden onderhouden in C57BL / 6J-achtergrond. Er werden geen op geslacht gebaseerde verschillen gevonden met betrekking tot deze studie.
1. Weefselvoorbereiding
- Perfusiefixatie
OPMERKING: Voer de stappen 1.1.1 tot en met 1.1.3 uit in een zuurkast om de blootstelling aan paraformaldehyde (PFA) te beperken.- Anesthetiseer volwassen mannelijke muizen (8-16 weken oud) door een intraperitoneale injectie van overdosering van natriumpentobarbital (200 mg / kg). Bevestig de adequaatheid van de anesthesie door de afwezigheid van teen-knijpneutrek en oogknipperreflexen.
- Open de thoracale holte en knip het rechter atriumaanhangsel met een chirurgische schaar. Perfuseer de muizen met 20 ml ijskoude fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) met behulp van een naald van 23 G bevestigd aan een spuit van 20 ml, gevolgd door perfusie van 20 ml ijskoude 4% PFA in 0,1 M fosfaatbuffer (PB) met behulp van een andere spuit van 20 ml.
LET OP: PFA is toxisch en teratogeen. Vermijd inademing of contact met huid, ogen en slijmvlies. - Verwijder hersenweefsels uit de schedel met een pincet. Breng de hersenweefsels over naar een buis van 15 ml met 4% PFA in 0,1 M PB, bescherm de monsters tegen licht en schommel zachtjes een nacht bij 4 °C op een shaker bij 50-100 tpm.
- OPMERKING: De geoogste hersenweefsels kunnen enkele weken worden opgeslagen in 0,02% natriumazide (NaN3) in PBS bij 4 °C.
LET OP: NaN3 is giftig. Vermijd inademing of contact met huid, ogen en slijmvlies. Behandel het in een zuurkast.
- Voorbereiding van hersensneden
- Bereid 4% agar in PBS door 2 g agar toe te voegen aan 50 ml PBS. Magnetron het mengsel totdat de agar volledig is opgelost. Laat de oplossing afkoelen tot 40-45 °C.
OPMERKING: De viskeuze eigenschap van agaropectine, een belangrijk onderdeel van agar, verbetert het gemak van het snijden van plakjes weefsel. - Voeg 10 ml van de agar-oplossing toe aan een kweekplaat met 6 putten. Dompel het hersenweefsel onder in de agar-oplossing met behulp van een tang. Laat de agar stollen op ijs.
- Verwijder het ingebedde hersenweefsel uit de put en trim de agar met een scheermesje. Bevestig het agarblok met secondelijm op de bodem van het vibratombad en giet 0,1 M PB in de bufferbak.
- Reinig een ander scheermesje met een pluisvrij tissuepapier gedrenkt in ethanol en bevestig het mesje aan de meshouder van de trillende weefselsnijder.
- Stel de sectiesnelheid in op 0,14 mm/s met 1,4 mm amplitude en de frequentie op 75-77 Hz. Snijd het hersenweefsel in plakken van 1 mm dik en verzamel de plakjes in een 6-well celkweekplaat met PBS.
OPMERKING: De hersenplakken kunnen enkele weken worden bewaard in 0,02% NaN3 in PBS bij 4 °C.
- Bereid 4% agar in PBS door 2 g agar toe te voegen aan 50 ml PBS. Magnetron het mengsel totdat de agar volledig is opgelost. Laat de oplossing afkoelen tot 40-45 °C.
2. Weefselverheldering
OPMERKING: De samenstellingen van de gebruikte ScaleS-oplossingen zijn vermeld in tabel 1. Monsters moeten worden beschermd tegen licht door af te dekken met een folie. De opruimstappen zijn weergegeven in figuur 1A.
- Voeg 8 ml ScaleS0-oplossing toe aan een putje van een 6-wells celkweekplaat en voeg 8 ml ScaleS4-oplossing toe aan een andere put van de plaat en verwarm voor tot 37 °C in een incubator.
- Breng de hersenschijfjes over naar de voorverwarmde ScaleS0-oplossing met een spatel en incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C in een schuddende incubator bij 90 tpm.
- Breng de gepermeabiliseerde hersenschijfjes over in 8 ml PBS(–) in een 6-wells celkweekplaat met een spatel en was gedurende 15 minuten door in een orbitale shaker op 40-60 rpm te houden. Herhaal dit twee keer.
- Breng de hersenschijfjes over in de voorverwarmde 8 ml ScaleS4-oplossing met een spatel en maak ze schoon door ze gedurende 8-12 uur bij 37 °C in een schuddende incubator bij 90 tpm te broeden. Een opgeruimde hersenschijf is te zien in figuur 1.
3. Montage van hersensegmenten
OPMERKING: Een aanpasbare beeldkamer wordt gebruikt voor betrouwbare montage van vrijgemaakte hersensegmenten (figuur 2) 6. De kamer bestaat uit het kamerframe en de onderste afdekplaat. De microscooptrapadapters zijn ook ontworpen om de beeldkamer rechtstreeks op microscoopstadia te monteren (figuur 2A, B). Het kamerframe en de microscooptrapadapters kunnen worden 3D-geprint met behulp van interne of uitbestede 3D-printservices. 3D computer-aided design (CAD) gegevens van de beeldkamer zijn te vinden in Furuta et al. 20226.
- Bevestig voor de kamervoorbereiding het kamerframe aan een afdekplaat met behulp van een drukgevoelige lijm.
- Bereid 1,5% agarose in ScaleS4D25(0)-oplossing (ScaleS4-gel) door 1,5 g agarose toe te voegen aan 100 ml van de oplossing in een fles. Meng de oplossing goed door te roeren en magnetron de oplossing totdat de agarose volledig is opgelost. Laat de oplossing na afloop afkoelen tot 37 °C.
- Monteer de vrijgemaakte hersenschijf op de onderste deklip van de beeldvormende kamer met een spatel. Veeg de overtollige oplossing van de opgeruimde plak weg met een schoon pluisvrij tissuepapier.
- Voeg de ScaleS4-gel toe aan het hersenschijfje met behulp van een micropipette om de beeldkamer te vullen. Leg er nog een coverslip op met een tang en plaats in deze volgorde een stuk pluisvrij tissuepapier en een glasplaat op de coverslip.
- Breng de beeldkamer over in een koelkast bij 4 °C. Plaats metalen gewichten op de glazen glijbaan en laat ze 30 minuten staan.
- Verwijder de metalen gewichten, glasschuif, pluisvrij tissuepapier en coverslip uit de beeldkamer en veeg de overtollige gel weg (figuur 2A, B).
- Plaats de beeldkamer in een glazen petrischaal van 60 mm en bevestig de rand van de beeldkamer aan de schaal met een stopverfachtige drukgevoelige lijm. Bevestig de kamer op meerdere punten aan de petrischaal.
- Giet ScaleS4-oplossing in de schaal en schud voorzichtig gedurende 1 uur bij 20-25 °C op een orbitale shaker bij 40-60 tpm. Vervang door een verse oplossing en verwijder luchtbellen op het geloppervlak door het oppervlak voorzichtig te schrapen met een pipetpunt van 200 μL. Monteer de ondergedompelde beeldkamer op een microscooptrap (figuur 2C).
4. CLSM beeldvorming
- Verkrijg beelden met behulp van een CLSM uitgerust met een multi-immersie objectieflens van een lange werkafstand (WD) (16x / 0,60 numeriek diafragma [NA], WD = 2,5 mm).
OPMERKING: Lenzen met een hoge NA-doelstelling kunnen een hoge diffractie-beperkte resolutie bieden. - Schakel alle relevante beeldverwerkingsapparatuur in (werkstation, microscoop, scanner, lasers en kwiklamp) en start een CLSM-beeldvormingssoftware.
- Stel de correctiekraag van de multi-immersie objectieflens in op 1,47. ScaleS4-oplossing heeft een brekingsindex (RI) van ongeveer 1,47 5,7. RI mismatch-geïnduceerde aberraties kunnen de beeldvorming verstoren (figuur 3).
- Dompel de objectieflens onder in de oplossing en laat deze het segment langzaam benaderen. Verwijder alle luchtbellen die vastzitten op de punt van de objectieflens. Zoek interessante regio's (ROIs) in de geklaarde weefsels met behulp van epifluorescentie.
- Stel parameters voor het verkrijgen van afbeeldingen in door de juiste instellingen te testen.
- Bepaal de bitdiepte voor beeldacquisitie. De gegevensgrootte van de afbeelding neemt toe met de bitdiepte.
- Stel de detectiegolflengte in. Pas de juiste poort voor de detector aan volgens het emissiespectrum. Zorg ervoor dat de detectiegolflengte geen laserlijnen bedekt.
- Stel de xy-resolutie in. Grotere formaten bieden betere xy-resoluties , maar het duurt langer om de afbeeldingen te verzamelen.
- Stel de scansnelheid in. Een lagere scansnelheid zorgt voor een hoge signaal-ruisverhouding. Het verhoogt echter ook de pixelverblijftijd en het risico op fotobleaching. Kies dienovereenkomstig.
- Pas de grootte van het gaatje aan. De grootte van het gaatje regelt de dikte van de optische sectie. Een kleiner gaatje zorgt voor een dunner optisch gedeelte, en dus een betere z-resolutie , maar vermindert het fluorescentiesignaal. Door het gaatje groter te maken, krijgt u een dikker optisch gedeelte met een sterker fluorescentiesignaal.
- Stel het laservermogen, de versterking van de detector/versterker en de offset in. Verhoog geleidelijk het laservermogen en de versterking van de detector/versterker totdat een geschikt beeld is verkregen. Een hoog laservermogen brengt het risico van fotobleaching met zich mee. Pas de offset (contrast) op de juiste manier aan om een hoge signaal-ruisverhouding te verkrijgen.
- Bepaal het benodigde grondbewerkingsgebied op basis van de grootte van de ROI. Zorg ervoor dat de volledige lengte en breedte van de ROI wordt vastgelegd.
- Navigeer door de gewiste weefsels in alle vlakken en stel het begin- en eindpunt van de stapel in. Stel de z-step grootte in volgens de gewenste z-resolutie.
- Verzamel afbeeldingen wanneer u tevreden bent met de instellingen voor beeldacquisitie en neem vastgelegde afbeeldingen op. Verwerk de beelden met behulp van een beeldanalysesoftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optische clearing van een muis hersenschijf van 1 mm dikte werd bereikt met behulp van dit protocol. Figuur 1B geeft transmissiebeelden weer van een muizenhersenschijf voor en na de clearingbehandeling. De weefselopruimingsmethode maakte een 1 mm dik muizenhersenschijfje transparant. Een lichte uitbreiding van de uiteindelijke grootte van hersenschijfjes werd gevonden na de incubatie in de clearingoplossing gedurende 12 uur (lineaire expansie: 102,5% ± 1,3%). Het behoud van fluorescentie en structurele integriteit van de weefsels werd beoordeeld met gerichte EGFP-expressie in het plasmamembraan bij PV-FGL-muizen (figuur 1C). Bij deze muizen wordt somatodendritische membraangerichte EGFP uitgedrukt in PV-positieve neuronen9. EGFP-expressie gericht op het plasmamembraan in het somatodendritische gebied werd na de behandeling gehandhaafd (figuur 1C). Bovendien toont de vorige EM-studie een goed bewaarde structurele integriteit in hersenweefsels die zijn geklaard met ScaleSF (aanvullende figuur 1) 6.
RI mismatch-geïnduceerde aberraties veroorzaakten een merkbaar verlies van beeldhelderheid en resolutie (figuur 3). Een 1 mm dikke hersenschijf van de PV-FGL-muis werd gewist en in beeld gebracht onder een CLSM uitgerust met een multi-immersie objectieflens van een lange WD. Aanpassing van de correctiekraag van de objectieflens aan de waterpositie (RI 1.33) belemmerde een duidelijke visualisatie van EGFP-positieve neuronen op de diepten van 400 μm en 800 μm als gevolg van lage helderheid en laag contrast. (Figuur 3A,C). Deze neuronen werden duidelijk gevisualiseerd met dezelfde CLSM, toen de correctiekraag werd aangepast aan de ScaleS4-oplossing (RI 1,47; Figuur 3B,D). RI-matching tussen een dompelvloeistof en een objectieve lens is van cruciaal belang voor nauwkeurige 3D-beeldvorming in optisch geklaarde weefsels.
Ten slotte werden neocorticale neuronen van muizen gebruikt om de haalbaarheid van het protocol aan te tonen. Een muizenbrein geïnjecteerd met AAV2/1-SynTetOff-EGFP vector10 in de primaire somatosensorische cortex (S1) werd gefixeerd met 4% PFA in 0,1 M PB. Coronale plakjes van 1 mm dikte werden vanuit de hersenen bereid met een trillende weefselsnijder. Na het opruimen en monteren op de beeldvormende kamer werd neuronale beeldvorming gericht op neocorticale neuronen uitgevoerd (figuur 4). Een 3D-reconstructie van EGFP-gelabelde neuronen in de 1 mm dikke hersenschijf is weergegeven in figuur 4A. Een afbeelding met een hogere vergroting toont individuele dendritische prieeltjes versierd met dendritische stekels (figuur 4B). We toonden verder axon terminale prieelverbehoren en axonale boutons in de contralaterale cortex (figuur 4C).
Figuur 1: Optische clearing van muizenhersendelen van 1 mm dikte. (A) Het schema voor het opruimen van ScaleSF-weefsel. (B) Overdrachtsbeelden van een 1 mm dikke hersenschijf voor (links) en na (rechts) behandeling. (C) Een 3D-volumeweergave van de hersenschors van een PV-FGL-muis die wordt gewist met behulp van de weefselzuiveringsmethode. (D,E) xy beelden in (C) op de diepten van 250 μm (D) en 750 μm (E). (F,G) Vergrote weergave van de rechthoeken die zijn omlijnd in (D) en (E). Afbeeldingen die in (C-G) worden weergegeven, worden vóór het renderingproces gedeconvoluteerd. Afkortingen: pia = pia mater, WM = witte stof. Schaalbalk: 2 mm in (B), 500 μm in (C), 200 μm in (D,E) en 40 μm in (F,G). Dit cijfer is aangepast van Furata et al. 20226. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Een aanpasbare 3D-geprinte beeldkamer voor visualisatie van weefselsegmenten. (A,B) Een schematekening (A) en afbeelding (B) van een aanpasbare 3D-geprinte beeldbewerkingskamer. De beeldkamer bestaat uit een kamerframe, een bodemdeksellip en microscooptrapadapters. Opgeruimde plakjes weefsel worden op de onderste coverslip geplaatst en ingebed in ScaleS4-gel. Het kamerframe, de bodemafdekkingslip en de microscooptrapadapters zijn aanpasbaar op basis van de grootte en dikte van weefselplakken. (C) Een beeldvormingsopstelling met de beeldkamer. De beeldkamer wordt ondergedompeld in ScaleS4-oplossing in een petrischaal en gemonteerd op een podium van een rechtopstaande CLSM. Dit cijfer is aangepast van Furata et al. 20226. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Gecompromitteerde diepe beeldvorming veroorzaakt door een RI-mismatch tussen een objectieve lens en ScaleS4-oplossing. (A-D) xy beelden van de hersenschors van een PV-FGL-muis op diepten van 400 μm (A,B) en 800 μm (C,D). De correctie van de kraag van een multi-immersie objectieflens is aangepast naar 1,33 in (A,C) en 1,47 in (B,D). Beelden worden verkregen met dezelfde parameters, behalve voor RI's van de objectieflens. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Neuronale beeldvorming in een 1 mm dikke hersenschijf van de muis, gewist met ScaleSF. (A) 3D-volumeweergave van EGFP-gelabelde neocorticale neuronen van muizen in de S1. Neocorticale neuronen zijn gelabeld met de AAV2/1 SynTetOff-EGFP vector. (B) Dendritische prieeltjes van EGFP-gelabelde neocorticale neuronen. Een mip-beeld (maximum intensity projection) van een diepte van 39 μm tot 48 μm wordt weergegeven. Pijlpunten duiden op dendritische stekels. (C) EGFP-gelabelde axonterminals in de contralaterale cortex. Een MIP-beeld van een diepte van 481,5 μm tot 513 μm wordt weergegeven. Pijlpunten duiden op axonale boutons. Afbeeldingen in (B) en (C) zijn gedeconvolueerd. Schaalstaven: 300 μm in (A) en 10 μm in (C). De balk in (C) geldt ook voor (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Ultrastructuur in hersensegmenten gewist met ScaleSF, CUBIC en PACT. (A-C) Transmissie EM-beelden van de hersenschors van muizen gewist met ScaleSF (A), CUBIC (B) en PACT (C). Muizenhersenen zijn gefixeerd met 4% PFA met 1% glutaaraldehyde. Ultradunne secties worden bereid uit gewiste hersenplakken. Membraanstructuren worden ernstig beschadigd in hersensegmenten die zijn vrijgemaakt met CUBIC (B) en PACT (C). Pijlpunten geven postsynaptische membranen aan. Schaalbalk: 500 nm. Dit cijfer is aangepast van Furata et al. 20226. Klik hier om dit bestand te downloaden.
| Recepten voor ScaleS-oplossingen | |
| ScaleS0 oplossing | |
| Reagens | Eindconcentratie |
| D-sorbitol | 20% (zonder v) |
| Glycerol | 5% (zonder) |
| Methyl-β-cyclodextrine | 1 mM |
| γ-cyclodextrine | 1 mM |
| Dimethylsulfoxide | 3% (v/v) |
| 10x PBS(–) | 1x |
| ScaleS4 oplossing | |
| Reagens | Eindconcentratie |
| Ureum | 4 meter |
| D-sorbitol | 40% (zonder v) |
| Glycerol | 10% (zonder v) |
| Triton X-100 | 0,2% (w/v) |
| Dimethylsulfoxide | 25% (v/v) |
| ScaleS4D25(0) oplossing | |
| Reagens | Eindconcentratie |
| Ureum | 4 meter |
| D-sorbitol | 40% (zonder v) |
| Glycerol | 10% (zonder v) |
| Dimethylsulfoxide | 25% (v/v) |
Tabel 1: Samenstelling van de drie ScaleS-oplossingen. De samenstellingen van de oplossingen ScaleS0, ScaleS4 en ScaleS4D25(0) worden vermeld. Voor een gedetailleerde procedure voor de bereiding van deze oplossingen, zie Miyawaki et al. 20167.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritieke stappen binnen het protocol
Er zijn een paar kritieke stappen in het protocol die met de grootste voorzichtigheid moeten worden uitgevoerd om zinvolle resultaten te verkrijgen. Uniforme fixatie van monsters is noodzakelijk voor 3D-beeldvorming in grootschalige weefsels. De objectieflens, het monster en de onderdompelingsvloeistof moeten overeenkomende RI hebben. RI-mismatch tussen hen zal leiden tot zeer verstoorde beeldvorming van EGFP-expresserende cellen in de gewiste hersenplakken (figuur 3). De correctiekraagaanpassing van de objectieflens aan de dompelvloeistof minimaliseert diepte-geïnduceerde sferische aberraties om het signaal, contrast en ruimtelijke resolutie in 3D-beeldvorming te maximaliseren. De RI's van de bereide oplossingen kunnen worden gemeten met behulp van een refractometer.
Probleemoplossing van de techniek
Langere opslag van de oplossingen kan van invloed zijn op de clearingcapaciteit en de capaciteit voor het behoud van fluorescentiesignalen en structurele integriteit. Vers bereide oplossingen moeten worden gebruikt. Deze oplossingen kunnen tot 1 maand bij 4 °C bewaard worden. Isometrie is van cruciaal belang voor effectieve en efficiënte neuronale beeldvorming met nauwkeurige signaalreconstructie. Hoewel een lichte uitbreiding van de steekproefgrootte werd waargenomen na incubatie gedurende 12 uur (figuur 1B), kan de expansie worden gecontroleerd door de incubatietijd tussen 8-12 uur te verkorten. Voor nauwkeurigere 3D-dieptebeelden moet de correctiekraag mogelijk op een bepaald vlak worden aangepast vanwege diepte-geïnduceerde sferische aberratie.
Aanpassingen van de techniek
In de huidige studie hebben we hersenweefsels van muizen gebruikt om de haalbaarheid van het protocol aan te tonen. Toch kan het hier beschreven protocol ook worden gebruikt voor dieren met grote hersenen, zoals primaten. Inderdaad, dit protocol is gebruikt in gemeenschappelijke marmoset (Callithrix jacchus) hersenweefsels, en is erin geslaagd in gelijktijdige visualisatie van neurale circuit en subcellulaire structuren van zijn corticostriatale circuits6. De microscooptrapadapters zijn ontworpen om de beeldkamer direct op microscoopstadia6 te monteren (figuur 2A, B). Gewiste weefselplakken zijn waarneembaar met behulp van een omgekeerde microscoop door de onderste coverslip van de beeldkamer. Na herstel van geklaarde hersenweefsels met PBS(-) (deScaling)5,11 kunnen we weefselsecties van 20-μm tot 50-μm dikte bereiden uit hersenweefsels die zijn opgeruimd met ScaleSF (re-sectioning)6. Subcellulaire structuren die zijn vastgelegd in geklaarde weefsels kunnen opnieuw worden afgebeeld op resecties met een lens met een hoog NA-objectief van een korte WD. Het opruimen van hersenplakken doordrenkt met fixatieven die glutaaraldehyde bevatten, is bereikt met behulp van dit protocol, waardoor een superieure ultrastructuurconserveringwordt geboden 6. ScaleSF bereikt een hoog niveau van ultrastructuurconservering dat EM-analyse in optisch geklaarde weefselsmogelijk maakt 6 (aanvullende figuur 1). De EM-compatibiliteit van deze methode is met name nuttig voor beeldvormingsstructuren met de schalen van macroscopisch tot nanoscopisch niveau.
Beperkingen van de techniek
Het hier beschreven protocol stelt ons in staat om neuronale structuren van circuit tot subcellulaire schalen te visualiseren in hersensegmenten van 1 mm dikte. Er blijven echter drie beperkingen in het protocol. De eerste is de clearingcapaciteit van het clearingprotocol. ScaleSF is een clearing protocol voor hersenplakken, niet voor de hele hersenen. Hoewel hersenschijfjes van 1 mm dikte een goede kennis kunnen bieden van dendritische en lokale axonaleprieeltjes 12, is informatie over axonale projecties die de hele hersenen beslaan fragmentarisch en onvolledig in de plakjes 13,14,15,16. De tweede is de beeldresolutie. Met behulp van het hier beschreven protocol zijn we erin geslaagd om subcellulaire neuronale structuren, zoals dendritische stekels en axonale boutons, te visualiseren in een optisch geklaarde hersenschijf (figuur 4). De resolutie van de objectieve lens die in deze studie wordt gebruikt, xy-resolutie van 400-750 nm, is echter niet voldoende om meer fijne structuren van neuronale cellen op te lossen. Aangezien lenzen met een hoog NA-objectief doorgaans zijn ontworpen voor olie-immersie (RI 1.52), kan RI-mismatch met de oplossingen (RI 1.47) beeldvorming met hoge resolutie met deze objectieve lenzen voorkomen. De derde is fluorescerende eiwitetikettering van neuronale cellen. De etiketteringsmethode beperkt brede toepassingen van onze beeldvormingstechniek. Histochemische en/of immunohistochemische technieken die grootschalige weefsels labelen met behoud van de weefselintegriteit, zouden het hier verstrekte protocol aanzienlijk verbeteren.
Betekenis met betrekking tot bestaande methoden en toekomstige toepassingen van de techniek
In de huidige studie beschrijven we een gedetailleerd protocol voor neuronale beeldvorming van mesoscopische tot microscopische structuren met behulp van ScaleSF-weefselzuivering. Het hier beschreven protocol maakt het mogelijk om neuronale structuren van circuit tot subcellulaire niveaus in een redelijke hoeveelheid tijd te visualiseren zonder gespecialiseerde apparatuur, waardoor het begrip van neuronale structuren van circuit- tot componentschalen wordt vergemakkelijkt. Neuronen werken uitbundige processen van enorme lengte uit en regelen gespecialiseerde fijne structuren voor het verzenden en ontvangen van informatie. Neuronale beeldvorming vereist dus een weefselzuiveringsmethode die krachtige clearingcapaciteit uitoefent, evenals een hoog niveau van weefselbehoud voor gelijktijdige visualisatie van zowel grote als kleinschalige structuren. Weefselzuiveringsmethoden met hoge clearingmogelijkheden verwijderen echter agressief lipiden en pigmenten voor uitgebreide weefselzuivering 3,4, waardoor de weefselintegriteit in gevaar komt 5,6,17 (aanvullende figuur 1). Dit staat in schril contrast met het hier gebruikte clearingprotocol dat een hoog niveau van structuurbehoudbereikt 6 (aanvullende figuur 1). Daarom maakt ScaleSF-weefselzuivering effectieve en efficiënte neuronale beeldvorming mogelijk die multischaal 3D-beeldvorming met hoge resolutie vereist met nauwkeurige signaalreconstructie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Yoko Ishida (Juntendo University) voor AAV vectorproductie en Kisara Hoshino (Juntendo University) voor technische assistentie. Deze studie werd ondersteund door JSPS KAKENHI (JP20K07231 tot K.Y.; JP21H03529 naar T.F.; JP20K07743 naar M.K.; JP21H02592 naar H.H.) en Wetenschappelijk onderzoek naar innovatief gebied "Resonantie Bio" (JP18H04743 tot H.H.). Deze studie werd ook ondersteund door het Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (JP21dm0207112 tot T.F. en H.H.), Moonshot R&D van het Japan Science and Technology Agency (JST) (JPMJMS2024 tot H.H.), Fusion Oriented Research for disruptive Science and Technology (FOREST) van JST (JPMJFR204D tot H.H.), Grants-in-Aid van het Research Institute for Diseases of Old Age aan de Juntendo University School of Medicine (X2016 tot K.Y.; X2001 tot H.H.), en het Private School Branding Project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16x multi-immersion objective lens | Leica Microsystems | HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR | |
| Agar | Nacalai Tesque | 01028-85 | |
| Agarose | TaKaRa Bio | L03 | |
| Dimethyl sulfoxide | Nacalai Tesque | 13407-45 | |
| D-Sorbitol | Nacalai Tesque | 06286-55 | |
| γ-cyclodextrin | Wako Pure Chemical Industries | 037-10643 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Huygens Essential | Scientific Volume Imaging | ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b | |
| Imaris | Bitplane | ver. 9.0.0 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | LAS X, ver. 3.5.5.19976 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo Chemical Industry | M1356 | |
| Paraformaldehyde | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4) | Nacalai Tesque | 27575-31 | 10x PBS(–) |
| Sodium azide | Nacalai Tesque | 31233-55 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
| TCS SP8 | Leica Microsystems | N/A | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Urea | Nacalai Tesque | 35940-65 | |
| Vibrating tissue slicer | Dosaka EM | PRO7N |
References
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Furuta, T., et al. Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF. iScience. 25 (1), 103601 (2022).
- Miyawaki, A., et al. Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy. Protocol Exchange. , (2016).
- Okamoto, S., et al. Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system. STAR Protocols. 2 (1), 100230 (2021).
- Kameda, H., et al. Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites. The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).
- Sohn, J., et al. A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system. PLoS One. 12 (1), 0169611 (2017).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).
- Kuramoto, E., et al. Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors. Cerebral Cortex. 19 (9), New York, N.Y. 2065-2077 (2009).
- Matsuda, W., et al. Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).
- Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
- Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6, 34331 (2016).
