Summary
Das Protokoll bietet eine detaillierte Methode der neuronalen Bildgebung in Gehirnschnitten unter Verwendung einer Gewebereinigungsmethode, ScaleSF. Das Protokoll umfasst die Vorbereitung des Hirngewebes, die Gewebeklärung, die Handhabung von abgeräumten Schnitten und die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-Bildgebung neuronaler Strukturen von mesoskopischer bis mikroskopischer Ebene.
Abstract
Hier wird ein detailliertes Protokoll bereitgestellt, um neuronale Strukturen von mesoskopischen bis hin zu mikroskopischen Ebenen im Hirngewebe sichtbar zu machen. Neuronale Strukturen, die von neuronalen Schaltkreisen bis hin zu subzellulären neuronalen Strukturen reichen, werden in Maus-Gehirnschnitten visualisiert, die mit ScaleSF optisch gelöscht wurden. Diese Clearing-Methode ist eine modifizierte Version von ScaleS und ist eine hydrophile Gewebereinigungsmethode für Gewebeschnitte, die eine starke Clearing-Fähigkeit sowie ein hohes Maß an Erhaltung von Fluoreszenzsignalen und struktureller Integrität erreicht. Eine anpassbare dreidimensionale (3D)-gedruckte Bildgebungskammer wurde für die zuverlässige Montage von gereinigtem Hirngewebe entwickelt. Mäusegehirne, denen ein Adeno-assoziierter Virusvektor injiziert wurde, der ein verbessertes grün fluoreszierendes Proteingen trägt, wurden mit 4% Paraformaldehyd fixiert und mit einem vibrierenden Gewebeschneider in Scheiben von 1 mm Dicke geschnitten. Die Gehirnschnitte wurden unter Befolgung des Clearing-Protokolls gereinigt, das sequentielle Inkubationen in drei Lösungen, nämlich Sca l eS0-Lösung, Phosphatpufferkochsalzlösung (–) und ScaleS4-Lösung, für insgesamt 10,5-14,5 h umfasst. Die gereinigten Hirnschnitte wurden auf die Bildgebungskammer montiert und in 1,5%iges Agarosegel eingebettet, gelöst in ScaleS4D25(0)-Lösung. Die 3D-Bildaufnahme der Scheiben erfolgte mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, das mit einem Multi-Immersionsobjektiv mit großem Arbeitsabstand ausgestattet war. Beginnend mit der mesoskopischen neuronalen Bildgebung ist es uns gelungen, feine subzelluläre neuronale Strukturen, wie dendritische Stacheln und axonale Boutons, in den optisch gereinigten Hirnschnitten sichtbar zu machen. Dieses Protokoll würde das Verständnis neuronaler Strukturen von Schaltkreis- bis hin zu subzellulären Komponentenskalen erleichtern.
Introduction
Gewebereinigungsmethoden haben die tiefenunabhängige Bildgebung biologischer und klinischer Proben mit Lichtmikroskopie verbessert, so dass strukturelle Informationen über intaktes Gewebe extrahiert werdenkönnen 1,2. Optische Clearing-Techniken könnten möglicherweise auch die Kosten für die histologische Analyse beschleunigen und senken. Derzeit stehen drei Hauptclearing-Ansätze zur Verfügung: hydrophile, hydrophobe und hydrogelbasierte Methoden 1,2. Hydrophile Ansätze übertreffen die Fluoreszenzsignale und die Gewebeintegrität und sind im Vergleich zu den beiden anderen Ansätzen weniger toxisch 3,4.
Eine hydrophile Clearingmethode, ScaleS, nimmt mit ihrer Erhaltung der strukturellen und molekularen Integrität sowie der starken Clearingfähigkeit (Clearing-Konservierungsspektrum) eine herausragende Position ein5. In einer früheren Studie haben wir ein schnelles und isometrisches Clearing-Protokoll, Sca l eSF, für Gewebeschnitte (~ 1 mm Dicke) entwickelt, indem wir das Clearingverfahrenvon ScaleS6 modifiziert haben. Dieses Clearing-Protokoll erfordert sequentielle Inkubationen von Gehirnschnitten in drei Lösungen für 10,5-14,5 h. Die Methode zeichnet sich durch ein hohes Clearing-Konservierungsspektrum aus, das sogar mit der elektronenmikroskopischen (EM) Analyse kompatibel ist (Ergänzende Abbildung 1), was eine hochauflösende dreidimensionale (3D) Multiskalen-Bildgebung mit genauer Signalrekonstruktionermöglicht 6. Daher sollte ScaleSF vor allem im Gehirn wirksam sein, wo neuronale Zellen überschwängliche Prozesse von enormer Länge ausarbeiten und spezialisierte feine subzelluläre Strukturen zum Senden und Empfangen von Informationen anordnen. Die Extraktion struktureller Informationen mit Skalen von Schaltkreis- bis subzellulären Ebenen auf neuronalen Zellen ist sehr nützlich, um die Gehirnfunktionen besser zu verstehen.
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Visualisierung neuronaler Strukturen mit Skalen von der mesoskopischen / Schaltung bis zur mikroskopischen / subzellulären Ebene mit ScaleSF zur Verfügung. Das Protokoll umfasst die Gewebepräparation, die Gewebeklärung, die Handhabung von gereinigtem Gewebe und die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) der Bildgebung von gereinigtem Gewebe. Unser Protokoll konzentriert sich auf die Abfrage neuronaler Strukturen von Schaltkreis- bis hin zu subzellulären Komponentenskalen. Ein detailliertes Verfahren zur Herstellung der Lösungen und zur stereotaktischen Injektion von Adeno-assoziierten Virusvektoren (AAV) in das Gehirn von Mäusen finden Sie in Miyawaki et al. 2016 7 bzw. Okamoto et al.2021 8.
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Protocol
Alle Experimente wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees der Juntendo University genehmigt (Approval No. 2021245, 2021246) und in Übereinstimmung mit den Fundamental Guidelines for Proper Conduct of Animal Experiments des Science Council of Japan (2006) durchgeführt. Hier wurden männliche C57BL/6J-Mäuse, denen AAV-Vektor injiziert wurde, das das Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) -Gen und Parvalbumin (PV) / Myristoylation-EGFP-Low-Density-Lipoproteinrezeptor C-terminale bakterielle künstliche Chromosom (BAC) transgene Mäuse (PV-FGL-Mäuse)9 injiziert wurden, verwendet. PV-FGL-Mäuse wurden im C57BL/6J-Hintergrund gewartet. In Bezug auf diese Studie wurden keine geschlechtsspezifischen Unterschiede gefunden.
1. Gewebepräparation
- Perfusionsfixierung
HINWEIS: Führen Sie die Schritte 1.1.1 bis 1.1.3 in einem Abzug aus, um die Exposition gegenüber Paraformaldehyd (PFA) zu begrenzen.- Anästhesien erwachsener männlicher Mäuse (8–16 Wochen alt) durch eine intraperitoneale Injektion einer Überdosierung von Natriumpentobarbital (200 mg/kg). Bestätigen Sie die Angemessenheit der Anästhesie durch das Fehlen von Zehenkneifentzug und Augenblinzelreflexen.
- Öffnen Sie die Brusthöhle und schneiden Sie das rechte Vorhofanhängsel mit einer chirurgischen Schere. Perfusionieren Sie die Mäuse mit 20 ml eiskalter Phosphatpufferkochsalzlösung (PBS) mit einer 23-G-Nadel, die an einer 20-ml-Spritze befestigt ist, gefolgt von einer Perfusion von 20 ml eiskaltem 4% PFA in 0,1 m Phosphatpuffer (PB) mit einer weiteren 20-ml-Spritze.
ACHTUNG: PFA ist toxisch und teratogen. Vermeiden Sie das Einatmen oder den Kontakt mit Haut, Augen und Schleimhaut. - Entfernen Sie Hirngewebe aus dem Schädel mit einer Pinzette. Übertragen Sie das Hirngewebe in ein 15-ml-Röhrchen, das 4% PFA in 0,1 Mio. PB enthält, schützen Sie die Proben vor Licht und schaukeln Sie sanft über Nacht bei 4 ° C auf einem Shaker bei 50-100 U / min.
- HINWEIS: Das entnommene Hirngewebe kann mehrere Wochen in 0,02% Natriumazid (NaN3) in PBS bei 4 °C gelagert werden.
ACHTUNG: NaN 3 ist giftig. Vermeiden Sie das Einatmen oder den Kontakt mit Haut, Augen und Schleimhaut. Behandeln Sie es in einem Abzug.
- Brain Slice Vorbereitung
- Bereiten Sie 4% Agar in PBS vor, indem Sie 2 g Agar zu 50 ml PBS hinzufügen. Mikrowelle der Mischung, bis sich das Agar vollständig aufgelöst hat. Lassen Sie die Lösung auf 40-45 °C abkühlen.
HINWEIS: Die viskose Eigenschaft, die Agaropectin, ein Hauptbestandteil von Agar, bietet, verbessert das Schneiden von Gewebeschnitten. - Fügen Sie 10 ml der Agarlösung zu einer 6-Well-Kulturplatte hinzu. Tauchen Sie das Hirngewebe mit einer Pinzette in die Agarlösung. Lassen Sie das Agar auf Eis erstarren.
- Entfernen Sie das eingebettete Hirngewebe aus dem Brunnen und schneiden Sie das Agar mit einer Rasierklinge ab. Befestigen Sie den Agarblock mit Sekundenkleber auf dem Boden des Vibratombades und gießen Sie 0,1 M PB in die Pufferschale.
- Reinigen Sie eine weitere Rasierklinge mit einem fusselfreien Seidenpapier, das in Ethanol getränkt ist, und befestigen Sie die Klinge am Klingenhalter des vibrierenden Tissue-Slicers.
- Stellen Sie die Schnittgeschwindigkeit auf 0,14 mm/s mit 1,4 mm Amplitude und die Frequenz auf 75–77 Hz ein. Schneiden Sie das Hirngewebe in 1 mm dicke Scheiben und sammeln Sie die Scheiben in einer 6-Well-Zellkulturplatte, die PBS enthält.
HINWEIS: Die Hirnschnitte können mehrere Wochen in 0,02% NaN3 in PBS bei 4 °C gelagert werden.
- Bereiten Sie 4% Agar in PBS vor, indem Sie 2 g Agar zu 50 ml PBS hinzufügen. Mikrowelle der Mischung, bis sich das Agar vollständig aufgelöst hat. Lassen Sie die Lösung auf 40-45 °C abkühlen.
2. Gewebeklärung
HINWEIS: Die Zusammensetzungen der verwendeten ScaleS-Lösungen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Proben sollten vor Licht geschützt werden, indem sie mit einer Folie abgedeckt werden. Die Löschschritte sind in Abbildung 1A dargestellt.
- 8 ml Sca l eS0-Lösung in eine Vertiefung einer 6-Well-Zellkulturplatte geben und 8 ml ScaleS4-Lösungin eine andere Vertiefung der Platte geben und in einem Inkubator auf 37 °C vorwärmen.
- Die Hirnschnitte mit einem Spatel in die vorgewärmte ScaleS0-Lösung überführen und 2 h bei 37 °C in einem Schüttelinkubator bei 90 U/min inkubieren.
- Übertragen Sie die permeabilisierten Gehirnschnitte in 8 ml PBS (–) in einer 6-Well-Zellkulturplatte mit einem Spatel und waschen Sie sie für 15 Minuten, indem Sie sie in einem Orbitalschüttler bei 40-60 U / min halten. Wiederholen Sie dies zweimal.
- Übertragen Sie die Gehirnscheiben in die vorgewärmten 8 ml ScaleS4-Lösung mit einem Spatel und reinigen Sie sie, indem Sie sie in einem Schüttelinkubator bei 90 U / min für 8–12 h bei 37 ° C inkubieren. Ein gereinigter Gehirnschnitt ist in Abbildung 1 zu sehen.
3. Halterung der Gehirnscheibe
HINWEIS: Eine anpassbare Bildgebungskammer wird für die zuverlässige Montage von abgeräumten Gehirnschnitten verwendet (Abbildung 2)6. Die Kammer besteht aus dem Kammerrahmen und dem Bodendeckglas. Die Mikroskop-Tischadapter sind auch so konzipiert, dass die Bildgebungskammer direkt auf Mikroskoptischen montiert werden kann (Abbildung 2A,B). Die Adapter für den Kammerrahmen und den Mikroskoptisch können mit internen oder ausgelagerten 3D-Druckdiensten in 3D gedruckt werden. 3D-CAD-Daten (Computer-Aided Design) der Bildgebungskammer werden in Furuta et al. 20226 bereitgestellt.
- Zur Kammervorbereitung befestigen Sie den Kammerrahmen mit einem Haftkleber an einem Deckglas.
- Bereiten Sie 1,5% Agarose in Sca l eS4D25(0) Lösung (ScaleS4 Gel) vor, indem Sie 1,5 g Agarose zu 100 ml der Lösung in einer Flasche hinzufügen. Mischen Sie die Lösung gut durch Rühren und Mikrowelle der Lösung, bis die Agarose vollständig aufgelöst ist. Lassen Sie die Lösung nach dem Fertig auf 37 ° C abkühlen.
- Montieren Sie die gereinigte Gehirnscheibe mit einem Spatel auf das untere Deckglas der Bildgebungskammer. Wischen Sie die überschüssige Lösung mit einem sauberen, fusselfreien Seidenpapier von der gereinigten Scheibe ab.
- Fügen Sie das ScaleS4-Gel mit einer Mikropipette auf die Gehirnscheibe auf, um die Bildgebungskammer zu füllen. Legen Sie ein weiteres Deckglas mit einer Pinzette darauf und legen Sie ein Stück fusselfreies Seidenpapier und einen Glasträger in dieser Reihenfolge auf das Deckglas.
- Geben Sie die Bildgebungskammer bei 4 °C in einen Kühlschrank. Legen Sie Metallgewichte auf den Glasschieber und lassen Sie sie 30 min stehen.
- Entfernen Sie die Metallgewichte, den Glasobjektträger, das fusselfreie Seidenpapier und das Deckglas aus der Bildgebungskammer und wischen Sie das überschüssige Gel ab (Abbildung 2A, B).
- Legen Sie die Bildkammer in eine 60 mm große Petrischale aus Glas und befestigen Sie den Rand der Bildkammer mit einem kittartigen Haftkleber an der Schale. Befestigen Sie die Kammer an mehreren Stellen an der Petrischale.
- Gießen Sie ScaleS4-Lösung in die Schale und schütteln Sie sie vorsichtig für 1 h bei 20-25 °C auf einem Orbitalschüttler bei 40-60 U / min. Ersetzen Sie es durch frische Lösung und entfernen Sie Luftblasen auf der Geloberfläche, indem Sie die Oberfläche vorsichtig mit einer 200 μL Pipettenspitze abkratzen. Montieren Sie die eingetauchte Bildgebungskammer auf einem Mikroskoptisch (Abbildung 2C).
4. CLSM-Bildgebung
- Erfassen Sie Bilder mit einem CLSM, das mit einem Multi-Immersionsobjektiv mit großem Arbeitsabstand (WD) (16x/0,60 numerische Blende [NA], WD = 2,5 mm) ausgestattet ist.
HINWEIS: Objektive mit hohem NA-Objektiv können eine hohe beugungsbegrenzte Auflösung bieten. - Schalten Sie alle relevanten Bildgebungsgeräte (Workstation, Mikroskop, Scanner, Laser und Quecksilberlampe) ein und starten Sie eine CLSM-Bildgebungssoftware.
- Stellen Sie den Korrekturkragen des Multi-Immersionsobjektivs auf 1,47 ein. ScaleS4-Lösung hat einen Brechungsindex (RI) von etwa 1,47 5,7. RI-Mismatch-induzierte Aberrationen können die Bildbildung stören (Abbildung 3).
- Tauchen Sie die Objektivlinse in die Lösung ein und lassen Sie sie sich langsam der Scheibe nähern. Entfernen Sie alle Luftblasen, die an der Spitze der Objektivlinse eingeschlossen sind. Finden Sie Regionen von Interesse (ROIs) in den gereinigten Geweben mit Epifluoreszenz.
- Legen Sie die Bildaufnahmeparameter fest, indem Sie die entsprechenden Einstellungen testen.
- Bestimmen Sie die Bittiefe für die Bildaufnahme. Die Datengröße des Bildes nimmt mit der Bittiefe zu.
- Stellen Sie die Detektionswellenlänge ein. Stellen Sie das entsprechende Gate für den Detektor entsprechend dem Emissionsspektrum ein. Stellen Sie sicher, dass die Detektionswellenlänge keine Laserlinien abdeckt.
- Stellen Sie die XY-Auflösung ein. Größere Formate bieten bessere XY-Auflösungen , aber es dauert länger, die Bilder zu sammeln.
- Stellen Sie die Scangeschwindigkeit ein. Eine langsamere Scangeschwindigkeit sorgt für ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis. Es erhöht jedoch auch die Pixelverweilzeit und das Risiko des Photobleachings. Wählen Sie entsprechend.
- Passen Sie die Lochgröße an. Die Lochgröße steuert die optische Schnittdicke. Eine kleinere Pinhole-Größe erzeugt einen dünneren optischen Schnitt und damit eine bessere Z-Auflösung , reduziert aber das Fluoreszenzsignal. Wenn Sie die Lochgröße vergrößern, erhalten Sie einen dickeren optischen Abschnitt mit stärkerem Fluoreszenzsignal.
- Stellen Sie die Laserleistung, die Detektor-/Verstärkerverstärkung und den Offset ein. Erhöhen Sie allmählich die Laserleistung und die Detektor-/Verstärkerverstärkung, bis ein geeignetes Bild erhalten wird. Eine hohe Laserleistung birgt die Gefahr des Photobleachings. Stellen Sie den Offset (Kontrast) entsprechend ein, um ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten.
- Bestimmen Sie die benötigte Bodenbearbeitungsfläche basierend auf der Größe des ROI. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Länge und Breite des ROI erfasst wird.
- Navigieren Sie durch das gereinigte Gewebe in allen Ebenen und legen Sie den Start- und Endpunkt des Stapels fest. Stellen Sie die Z-Schritt-Größe entsprechend der gewünschten z-Auflösung ein.
- Sammeln Sie Bilder, wenn Sie mit den Bildaufnahmeeinstellungen zufrieden sind, und zeichnen Sie aufgenommene Bilder auf. Verarbeiten Sie die Bilder mit einer Bildanalysesoftware.
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Representative Results
Die optische Klärung einer Maus-Hirnscheibe von 1 mm Dicke wurde mit diesem Protokoll erreicht. Abbildung 1B zeigt Transmissionsbilder eines Maus-Gehirnschnitts vor und nach der Clearing-Behandlung. Die Gewebereinigungsmethode machte eine 1 mm dicke Gehirnscheibe der Maus transparent. Eine leichte Ausdehnung der Endgrößen der Hirnschnitte wurde nach der Inkubation in der Clearinglösung für 12 h festgestellt (lineare Ausdehnung: 102,5% ± 1,3%). Die Erhaltung der Fluoreszenz und strukturellen Integrität der Gewebe wurde mit gezielter EGFP-Expression in der Plasmamembran in PV-FGL-Mäusen untersucht (Abbildung 1C). Bei diesen Mäusen wird der somatodendritische membrangerichtete EGFP in PV-positiven Neuronen9 exprimiert. Die auf die Plasmamembran in der somatodendritischen Region ausgerichtete EGFP-Expression wurde nach der Behandlung beibehalten (Abbildung 1C). Darüber hinaus zeigt die vorherige EM-Studie eine gut erhaltene strukturelle Integrität in Hirngeweben, die mit ScaleSF geklärt wurden (Ergänzende Abbildung 1)6.
RI-Mismatch-induzierte Aberrationen verursachten einen spürbaren Verlust der Bildhelligkeit und -auflösung (Abbildung 3). Eine 1 mm dicke Gehirnscheibe der PV-FGL-Maus wurde gelöscht und unter einem CLSM abgebildet, das mit einer Multi-Immersionsobjektivlinse eines langen WD ausgestattet war. Die Anpassung des Korrekturkragens der Objektivlinse an die Wasserposition (RI 1.33) erschwerte die klare Visualisierung von EGFP-positiven Neuronen, die sich aufgrund der geringen Helligkeit und des geringen Kontrasts in den Tiefen von 400 μm und 800 μm befinden. (Abbildung 3A,C). Diese Neuronen wurden deutlich mit dem gleichen CLSM visualisiert, als der Korrekturkragen an die ScaleS4-Lösung (RI 1.47; Abbildung 3B,D). Der RI-Abgleich zwischen einer Tauchflüssigkeit und einer Objektivlinse ist entscheidend für eine genaue 3D-Bildgebung in optisch gereinigtem Gewebe.
Schließlich wurden neokortikale Mausneuronen verwendet, um die Machbarkeit des Protokolls zu demonstrieren. Ein Mausgehirn, dem AAV2/1-SynTetOff-EGFP-Vektor10 im primären somatosensorischen Kortex (S1) injiziert wurde, wurde mit 4% PFA in 0,1 M PB fixiert. Koronale Scheiben von 1 mm Dicke wurden aus dem Gehirn mit einem vibrierenden Gewebeschneider hergestellt. Nach dem Abräumen und Montieren an der Bildgebungskammer wurde eine neuronale Bildgebung durchgeführt, die auf neokortikale Neuronen abzielte (Abbildung 4). Eine 3D-Rekonstruktion von EGFP-markierten Neuronen in der 1 mm dicken Hirnscheibe ist in Abbildung 4A dargestellt. Ein Bild mit höherer Vergrößerung zeigt einzelne dendritische Lauben, die mit dendritischen Stacheln verziert sind (Abbildung 4B). Wir zeigten ferner axonterminale Arborisationen und axonale Boutons im kontralateralen Kortex (Abbildung 4C).
Abbildung 1: Optisches Clearing von Maus-Hirnschnitten mit einer Dicke von 1 mm. (A) Der Zeitplan für die Gewebereinigung von Scal eSF. (B) Transmissionsbilder eines 1 mm dicken Gehirnschnitts vor (links) und nach (rechts) Behandlung. (C) Ein 3D-Volumen-Rendering der Großhirnrinde einer PV-FGL-Maus, die mit der Gewebereinigungsmethode geklärt wurde. (D,E) xy-Aufnahmen in (C) in Tiefen von 250 μm (D) und 750 μm (E). (F,G) Vergrößerte Ansicht der in (D) und (E) umrissenen Rechtecke. Bilder, die in (C-G) angezeigt werden, werden vor dem Rendervorgang entfaltet. Abkürzungen: pia = pia mater, WM = weiße Substanz. Maßstabsschiene: 2 mm Zoll (B), 500 μm Zoll (C), 200 μm Zoll (D,E) und 40 μm Zoll (F,G). Diese Zahl wurde von Furata et al. 20226 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Eine anpassbare 3D-gedruckte Bildgebungskammer für die Visualisierung von Gewebeschnitten. (A,B) Eine Schemazeichnung (A) und ein Bild (B) einer anpassbaren 3D-gedruckten Bildgebungskammer. Die Abbildungskammer besteht aus einem Kammerrahmen, einem Bodendeckglas und mikroskopischen Bühnenadaptern. Gereinigte Gewebescheiben werden auf das untere Deckglas gelegt und in ScaleS4 Gel eingebettet. Der Kammerrahmen, der untere Deckglas und die Mikroskop-Bühnenadapter sind je nach Größe und Dicke der Gewebescheiben anpassbar. (C) Ein bildgebender Aufbau mit der Bildgebungskammer. Die Bildgebungskammer wird in ScaleS4-Lösung in eine Petrischale getaucht und auf einer Stufe eines aufrechten CLSM montiert. Diese Zahl wurde von Furata et al. 20226 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Kompromittierte Tiefenbildgebung, die durch eine RI-Fehlanpassung zwischen einem Objektiv und einer ScaleS4-Lösung verursacht wird. (A-D) xy-Aufnahmen der Großhirnrinde einer PV-FCL-Maus in Tiefen von 400 μm (A,B) und 800 μm (C,D). Die Korrektur des Kragens eines Multi-Immersionsobjektivs wird auf 1,33 Zoll (A,C) und 1,47 Zoll (B,D) eingestellt. Bilder werden mit den gleichen Parametern aufgenommen, mit Ausnahme von RIs des Objektivs. Maßstabsbalken: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Neuronale Bildgebung in einem 1 mm dicken Gehirnschnitt der Maus, der mit ScaleSF geklärt wurde. (A) 3D-Volumen-Rendering von EGFP-markierten neokortikalen Mausneuronen im S1. Neokortikale Neuronen sind mit dem AAV2/1 SynTetOff-EGFP-Vektor markiert. (B) Dendritische Lauben von EGFP-markierten neokortikalen Neuronen. Es wird ein MIP-Bild (Maximum Intensity Projection) aus einer Tiefe von 39 μm bis 48 μm dargestellt. Pfeilspitzen zeigen dendritische Stacheln an. (C) EGFP-markierte Axonterminals im kontralateralen Kortex. Es wird ein MIP-Bild aus einer Tiefe von 481,5 μm bis 513 μm dargestellt. Pfeilspitzen zeigen axonale Boutons an. Bilder, die in (B) und (C) erscheinen, sind entfaltet. Maßstabsstäbe: 300 μm in (A) und 10 μm in (C). Der Balken in (C) gilt auch für (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1: Ultrastruktur in Gehirnschnitten, die mit ScaleSF, CUBIC und PACT geklärt wurden. (A-C) Übertragung von EM-Bildern der Großhirnrinde der Maus, die mit ScaleSF (A), CUBIC (B) und PACT (C) geklärt wurden. Mäusegehirne sind mit 4% PFA fixiert, das 1% Glutaraldehyd enthält. Ultradünne Schnitte werden aus abgeräumten Hirnschnitten hergestellt. Membranstrukturen werden in Hirnschnitten, die mit CUBIC (B) und PACT (C) gereinigt wurden, stark geschädigt. Pfeilspitzen zeigen postsynaptische Membranen an. Maßstabsbalken: 500 nm Diese Zahl wurde von Furata et al. 20226 geändert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
| Rezepte für ScaleS-Lösungen | |
| ScaleS0 Lösung | |
| Reagenz | Endkonzentration |
| D-Sorbit | 20% (w/v) |
| Glycerin | 5% (w/v) |
| Methyl-β-cyclodextrin | 1 mM |
| γ-Cyclodextrin | 1 mM |
| Dimethylsulfoxid | 3% (v/v) |
| 10x PBS(–) | 1x |
| ScaleS4 Lösung | |
| Reagenz | Endkonzentration |
| Harnstoff | 4 Mio. |
| D-Sorbit | 40% (w/v) |
| Glycerin | 10% (w/v) |
| Triton X-100 | 0,2% (w/v) |
| Dimethylsulfoxid | 25% (v/v) |
| ScaleS4D25(0) Lösung | |
| Reagenz | Endkonzentration |
| Harnstoff | 4 Mio. |
| D-Sorbit | 40% (w/v) |
| Glycerin | 10% (w/v) |
| Dimethylsulfoxid | 25% (v/v) |
Tabelle 1: Zusammensetzung der drei ScaleS-Lösungen. Die Zusammensetzungen der Lösungen Sca l eS0, Scal eS4 und ScaleS4D25(0) sind aufgeführt. Ein detailliertes Verfahren zur Vorbereitung dieser Lösungen finden Sie in Miyawaki et al. 20167.
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Discussion
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
Es gibt ein paar kritische Schritte im Protokoll, die mit äußerster Vorsicht durchgeführt werden sollten, um aussagekräftige Ergebnisse zu erzielen. Eine gleichmäßige Fixierung der Proben ist für die 3D-Bildgebung in großflächigen Geweben unerlässlich. Die Objektivlinse, die Probe und die Tauchflüssigkeit sollten über eine passende RI verfügen. RI-Mismatch zwischen ihnen führt zu einer stark gestörten Bildgebung von EGFP-exprimierenden Zellen innerhalb der gereinigten Gehirnschnitte (Abbildung 3). Die Korrekturkragenanpassung der Objektivlinse an die Tauchflüssigkeit minimiert tiefeninduzierte sphärische Aberrationen, um das Signal, den Kontrast und die räumliche Auflösung in der 3D-Bildgebung zu maximieren. Die RIs der vorbereiteten Lösungen können mit einem Refraktometer gemessen werden.
Fehlerbehebung der Technik
Eine längere Speicherung der Lösungen kann die Clearingfähigkeit und ihre Fähigkeit zur Konservierung von Fluoreszenzsignalen und struktureller Integrität beeinträchtigen. Es sollten frisch zubereitete Lösungen verwendet werden. Diese Lösungen können bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert werden. Isometrität ist entscheidend für eine effektive und effiziente neuronale Bildgebung mit genauer Signalrekonstruktion. Obwohl nach der Inkubation für 12 h eine leichte Ausdehnung der Stichprobengrößen beobachtet wurde (Abbildung 1B), kann die Ausdehnung durch Verringerung der Inkubationszeit zwischen 8-12 h kontrolliert werden. Für eine genauere 3D-Tiefenbildgebung muss der Korrekturkragen aufgrund der tiefeninduzierten sphärischen Aberration möglicherweise in einer bestimmten Ebene angepasst werden.
Modifikationen der Technik
In der vorliegenden Studie haben wir Hirngewebe der Maus verwendet, um die Machbarkeit des Protokolls zu demonstrieren. Das hier beschriebene Protokoll kann aber auch für großhirnige Tiere wie Primaten verwendet werden. Tatsächlich wurde dieses Protokoll in gewöhnlichen Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) Hirngeweben verwendet und es gelang ihm, neuronale Schaltkreise und subzelluläre Strukturen seiner kortikostriatalen Schaltkreise gleichzeitig zu visualisieren6. Die Mikroskop-Tischadapter sind so konzipiert, dass sie die Bildgebungskammer direkt auf Mikroskoptischen 6 montieren können (Abbildung 2A,B). Gereinigte Gewebeschnitte sind mit einem inversen Mikroskop durch das untere Deckglas der Abbildungskammer beobachtbar. Nach der Wiederherstellung des gereinigten Hirngewebes mit PBS(-) (deSca l ing)5,11 können wir Gewebeschnitte von 20 μm bis 50 μm Dicke aus Hirngewebe herstellen, die mit ScaleSF (Resektionierung)6 gereinigt wurden. Subzelluläre Strukturen, die in gereinigten Geweben erfasst wurden, können bei Resektionen mit einer hohen NA-Objektivlinse einer kurzen WD erneut abgebildet werden. Die Beseitigung von Gehirnschnitten, die mit Fixiermitteln durchblutet sind, die Glutaraldehyd enthalten, wurde mit diesem Protokoll erreicht, was eine überlegene Ultrastrukturkonservierungbietet 6. ScaleSF erreicht ein hohes Maß an Ultrastrukturerhaltung, das eine EM-Analyse in optisch gereinigtenGeweben ermöglicht 6 (Ergänzende Abbildung 1). Die EM-Kompatibilität dieser Methode ist besonders nützlich für die Abbildung von Strukturen mit den Skalen von makroskopischer bis nanoskopischer Ebene.
Einschränkungen der Technik
Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht es uns, neuronale Strukturen von Schaltkreis- bis zu subzellulären Skalen in Gehirnschnitten von 1 mm Dicke zu visualisieren. Das Protokoll enthält jedoch weiterhin drei Einschränkungen. Die erste ist die Clearing-Fähigkeit des Clearing-Protokolls. ScaleSF ist ein Clearing-Protokoll für Gehirnschnitte, nicht für das ganze Gehirn. Obwohl Gehirnschnitte von 1 mm Dicke gute Kenntnisse über dendritische und lokale axonale Lauben12 liefern können, sind Informationen über axonale Projektionen, die das gesamte Gehirn überspannen, fragmentarisch und unvollständig in den Scheiben13,14,15,16. Die zweite ist die Bildauflösung. Mit dem hier beschriebenen Protokoll ist es uns gelungen, subzelluläre neuronale Strukturen, wie dendritische Stacheln und axonale Boutons, in einem optisch geklärten Hirnschnitt sichtbar zu machen (Abbildung 4). Die Auflösung der in dieser Studie verwendeten Objektivlinse, xy-Auflösung von 400-750 nm, reicht jedoch nicht aus, um feinere Strukturen neuronaler Zellen aufzulösen. Da Objektive mit hohem NA-Gehalt typischerweise für Ölimmersion ausgelegt sind (RI 1.52), kann eine RI-Fehlanpassung mit den Lösungen (RI 1.47) eine hochauflösende Bildgebung mit diesen Objektiven verhindern. Die dritte ist die fluoreszierende Proteinmarkierung neuronaler Zellen. Das Etikettierverfahren schränkt die breiten Einsatzmöglichkeiten unserer bildgebenden Verfahren ein. Histochemische und/oder immunhistochemische Techniken, die großflächige Gewebe unter Wahrung der Gewebeintegrität kennzeichnen, würden das hier bereitgestellte Protokoll erheblich voranbringen.
Bedeutung im Hinblick auf bestehende Methoden und zukünftige Anwendungen der Technik
In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die neuronale Bildgebung von mesoskopischen bis zu mikroskopischen Strukturen unter Verwendung von Scal eSFTissue Clearing. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht es, neuronale Strukturen von Schaltkreis- bis subzellulärer Ebene in angemessener Zeit ohne spezielle Ausrüstung zu visualisieren, was das Verständnis neuronaler Strukturen von Schaltkreis- bis zu Komponentenskalen erleichtert. Neuronen entwickeln überschwängliche Prozesse von enormer Länge und ordnen spezialisierte feine Strukturen zum Senden und Empfangen von Informationen an. Daher erfordert die neuronale Bildgebung eine Gewebereinigungsmethode, die eine starke Clearingfähigkeit sowie ein hohes Maß an Gewebekonservierung für die gleichzeitige Visualisierung großer und kleiner Strukturen ausübt. Gewebereinigungsmethoden mit hohen Clearing-Fähigkeiten entfernen jedoch aggressiv Lipide und Pigmente für eine umfassende Gewebeklärung3,4, was die Gewebeintegrität beeinträchtigt 5,6,17 (ergänzende Abbildung 1). Dies steht in krassem Gegensatz zu dem hier verwendeten Clearingprotokoll, das einen hohen Grad an Strukturerhalterreicht 6 (Ergänzende Abbildung 1). Daher ermöglicht ScaleSF Tissue Clearing eine effektive und effiziente neuronale Bildgebung, die eine hochauflösende 3D-Bildgebung mit mehreren Skalen und genauer Signalrekonstruktion erfordert.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren danken Yoko Ishida (Juntendo University) für die AAV-Vektorproduktion und Kisara Hoshino (Juntendo University) für die technische Unterstützung. Diese Studie wurde unterstützt von JSPS KAKENHI (JP20K07231 to K.Y.; JP21H03529 bis T.F.; JP20K07743 bis M.K.; JP21H02592 bis H.H.) und wissenschaftliche Forschung zum innovativen Bereich "Resonance Bio" (JP18H04743 bis H.H.). Diese Studie wurde auch von der Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (JP21dm0207112 to T.F. and H.H.), Moonshot R&D von der Japan Science and Technology Agency (JST) (JPMJMS2024 to H.H.), Fusion Oriented Research for disruptive Science and Technology (FOREST) von JST (JPMJFR204D to H.H.), Grants-in-Aid des Research Institute for Diseases of Old Age an der Juntendo University School of Medicine (X2016 to K.Y.; X2001 to H.H.), und das Private School Branding Project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16x multi-immersion objective lens | Leica Microsystems | HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR | |
| Agar | Nacalai Tesque | 01028-85 | |
| Agarose | TaKaRa Bio | L03 | |
| Dimethyl sulfoxide | Nacalai Tesque | 13407-45 | |
| D-Sorbitol | Nacalai Tesque | 06286-55 | |
| γ-cyclodextrin | Wako Pure Chemical Industries | 037-10643 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Huygens Essential | Scientific Volume Imaging | ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b | |
| Imaris | Bitplane | ver. 9.0.0 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | LAS X, ver. 3.5.5.19976 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo Chemical Industry | M1356 | |
| Paraformaldehyde | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4) | Nacalai Tesque | 27575-31 | 10x PBS(–) |
| Sodium azide | Nacalai Tesque | 31233-55 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
| TCS SP8 | Leica Microsystems | N/A | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Urea | Nacalai Tesque | 35940-65 | |
| Vibrating tissue slicer | Dosaka EM | PRO7N |
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