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Adipocytes de souris différenciés en culture primaire: un modèle de résistance à l’insuline

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/63979
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM)

Summary

Ce protocole décrit l’isolement des préadipocytes de souris de la graisse sous-cutanée, leur différenciation en adipocytes matures et l’induction de la résistance à l’insuline. L’action de l’insuline est évaluée par la phosphorylation/activation des membres de la voie de signalisation de l’insuline par transfert Western. Cette méthode permet de déterminer directement la résistance/sensibilité à l’insuline dans les adipocytes primaires.

Abstract

La résistance à l’insuline est un effet réduit de l’insuline sur ses cellules cibles, généralement dérivé d’une diminution de la signalisation des récepteurs de l’insuline. La résistance à l’insuline contribue au développement du diabète de type 2 (DT2) et d’autres maladies dérivées de l’obésité à forte prévalence dans le monde entier. Par conséquent, la compréhension des mécanismes sous-jacents à la résistance à l’insuline est d’une grande pertinence. Plusieurs modèles ont été utilisés pour étudier la résistance à l’insuline in vivo et in vitro; Les adipocytes primaires représentent une option intéressante pour étudier les mécanismes de la résistance à l’insuline et identifier les molécules qui contrecarrent cette condition et les cibles moléculaires des médicaments sensibilisants à l’insuline. Ici, nous avons établi un modèle de résistance à l’insuline en utilisant des adipocytes primaires en culture traités avec le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α).

Les cellules précurseurs adipocytaires (APC), isolées du tissu adipeux sous-cutané de souris digéré par collagéase par la technologie de séparation cellulaire magnétique, sont différenciées en adipocytes primaires. La résistance à l’insuline est ensuite induite par un traitement au TNF-α, une cytokine pro-inflammatoire qui réduit la phosphorylation / activation de la tyrosine des membres de la cascade de signalisation de l’insuline. La diminution de la phosphorylation du récepteur de l’insuline (IR), du substrat du récepteur de l’insuline (IRS-1) et de la protéine kinase B (AKT) est quantifiée par transfert Western. Cette méthode fournit un excellent outil pour étudier les mécanismes médiant la résistance à l’insuline dans le tissu adipeux.

Introduction

L’insuline est une hormone anabolique produite par les β-cellules des îlots pancréatiques et le régulateur clé du métabolisme du glucose et des lipides. Parmi ses nombreuses fonctions, l’insuline régule l’absorption du glucose, la synthèse du glycogène, la gluconéogenèse, la synthèse des protéines, la lipogenèse et la lipolyse1. Le signal moléculaire initial après interaction de l’insuline avec son récepteur (IR) est l’activation de l’activité intrinsèque de la protéine tyrosine kinase de l’IR2, entraînant son autophosphorylation3 et l’activation ultérieure d’une famille de protéines connues sous le nom de substrats des récepteurs de l’insuline (PID), qui se lie aux protéines adaptatrices conduisant à l’activation d’une cascade de protéines kinases4 . L’insuline active deux voies de signalisation principales: la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)-protéine kinase B (AKT) et la protéine kinase activée par Ras-mitogène (MAPK). Le premier constitue un point de branche ou nœud majeur 4,5 pour l’activation de nombreux effecteurs en aval impliqués dans diverses fonctions physiologiques, y compris la régulation de l’homéostasie du carburant, tandis que le second régule la croissance et la différenciation cellulaires 4,6. Les actions de l’insuline dépendent en fin de compte du type cellulaire et du contexte physiologique7.

L’un des principaux tissus métaboliques sensibles à l’insuline est le tissu adipeux. Le tissu adipeux blanc est le type de graisse le plus abondant chez les humains et les rongeurs, distribué dans la graisse sous-cutanée (entre la peau et les muscles) et la graisse viscérale (autour des organes de la cavité abdominale). Compte tenu de leur grand volume, les adipocytes ou cellules graisseuses sont le type de cellule le plus abondant dans le tissu adipeux. Ces cellules graisseuses peuvent être brunes/beiges (thermogéniques), roses (dans la glande mammaire) et blanches 8,9. Les adipocytes blancs conservent les principales réserves d’énergie dans le corps sous forme de triglycérides, un processus insulino-dépendant. L’insuline favorise le transport du glucose et la lipogenèse, tout en inhibant la lipolyse ou la dégradation des lipides 7,10. Il facilite également la différenciation des préadipocytes en adipocytes – les cellules matures stockant les graisses11.

La résistance à l’insuline se produit lorsqu’un taux d’insuline normal produit une réponse biologique atténuée, entraînant une hyperinsulinémie compensatoire12. La résistance à l’insuline est une affection associée au surpoids et à l’obésité5 qui, lorsqu’elle est combinée, entraîne le diabète de type 2 (DT2) et d’autres maladies métaboliques13. L’hyperinsulinémie compense la résistance à l’insuline dans les tissus périphériques pour maintenir une glycémie normale14. Cependant, la perte ou l’épuisement éventuel de cellules β, ainsi qu’une résistance exacerbée à l’insuline, entraînent une glycémie élevée compatible avec le DT25. Par conséquent, la résistance à l’insuline et l’hyperinsulinémie peuvent contribuer au développement de maladies métaboliques dérivées de l’obésité15. En outre, l’obésité peut provoquer une inflammation locale chronique de bas grade favorisant la résistance à l’insuline dans le tissu adipeux15,16,17. En outre, les altérations du tissu adipeux dérivées de l’obésité, telles que la fibrose, l’inflammation et la réduction de l’angiogenèse et de l’adipogenèse, entraînent une baisse des taux sériques d’adiponectine (un sensibilisant à l’insuline) et une augmentation de la sécrétion de facteurs tels que l’inhibiteur de l’activateur du plasminogène 1 (PAI-1), les acides gras libres et les exosomes dans la circulation sanguine, exacerbant la résistance à l’insuline17.

De nombreux aspects sous-jacents à la résistance à l’insuline restent inconnus. Des modèles in vitro et in vivo ont été développés pour étudier les mécanismes médiant la résistance à l’insuline dans les principaux tissus cibles, y compris le tissu adipeux. L’avantage des modèles in vitro est que les chercheurs ont plus de contrôle sur les conditions environnementales et peuvent évaluer la résistance à l’insuline dans des types cellulaires spécifiques. En particulier, les cellules précurseurs adipocytaires (APC) ont le phénotype individuel du tissu donneur, ce qui pourrait mieux refléter la physiologie que les lignées cellulaires adipocytes. L’un des principaux facteurs induisant la résistance à l’insuline in vitro est le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α). Le TNF-α est une cytokine pro-inflammatoire sécrétée par les adipocytes et les macrophages dans le tissu adipeux18. Bien qu’elle soit nécessaire pour un remodelage et une expansion appropriés du tissu adipeux19, l’exposition à long terme au TNF-α induit une résistance à l’insuline dans le tissu adipeux in vivo et dans les adipocytes in vitro20. Le traitement chronique par le TNF-α de plusieurs types cellulaires entraîne une augmentation de la phosphorylation de la sérine de l’IR et de l’IRS-1, favorisant ainsi une diminution de la phosphorylation de la tyrosine21. L’augmentation de la phosphorylation de l’IRS-1 sur les résidus de sérine inhibe l’activité de la tyrosine kinase IR et peut être l’un des principaux mécanismes par lesquels le traitement chronique par le TNF-α altère l’action de l’insuline22,23. Le TNF-α active des voies impliquant l’inhibiteur de la sérine/thréonine kinase du facteur nucléaire ĸB kinase β (IKKβ) et de la kinase terminale c-Jun N (JNK)24. JNK induit un programme transcriptionnel pro-inflammatoire complexe mais phosphoryle aussi directement IRS-16.

Comprendre la pathogenèse de la résistance à l’insuline est devenu de plus en plus important pour guider le développement de futures thérapies contre le DT2. Les APC se sont révélés être un excellent modèle pour l’étude de la biologie des cellules adipeuses, y compris la sensibilité et la résistance à l’insuline, et pour identifier les propriétés intrinsèques des adipocytes indépendamment de l’environnement systémique. Les APC peuvent être facilement obtenus à partir de différents dépôts adipeux et, dans les conditions appropriées, différenciés en adipocytes matures. Avec cette méthode, les effets directs sur la résistance / sensibilité à l’insuline peuvent être évalués dans les adipocytes.

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Protocol

Toutes les expériences sur les rongeurs ont été approuvées par le Comité de bioéthique de l’Institut de neurobiologie de l’UNAM, protocole numéro 075.

1. Isolement de cellules précurseurs adipocytaires de souris

  1. Euthanasier des souris C57BL/6 mâles âgées de 8 à 10 semaines (p. ex. par inhalation de CO2 et luxation cervicale subséquente) (quatre animaux par isolement). Désinfectez les souris en frottant avec de l’éthanol à 70% et obtenez le tissu adipeux immédiatement après le sacrifice.
    REMARQUE: Après l’euthanasie des rongeurs, isoler immédiatement le tissu adipeux et effectuer toutes les étapes à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire stérile. Les souris sont maintenues sous des cycles lumière/obscurité de 12 h avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau.
  2. Disséquer le tissu adipeux sous-cutané inguinal de chaque souris. Retirer seulement le tissu adipeux, en évitant l’ablation du muscle, de la peau ou de tout autre tissu, et le recueillir dans un tube conique de 50 mL contenant 15 mL de solution de collagénase de type 1 (1,5 mg/mL) sur de la glace. Dissoudre la collagénase de type 1 dans l’albumine sérique bovine (BSA) à haute teneur en glucose et 1% de Dulbecco Eagle Medium (DMEM) et filtrer à travers des filtres à seringue de 0,2 μm.
  3. Couper le tissu adipeux en petits morceaux avec des ciseaux chirurgicaux stériles et digérer les échantillons par incubation avec une solution de collagénase de type 1 à 37 °C dans un agitateur orbital (150 tr/min) pendant 30 min (placer le tube contenant de la graisse et de la collagénase en position horizontale pour une plus grande surface agitée). Vérifiez la digestion toutes les 10 minutes pour vous assurer qu’elle fonctionne (la dégradation des tissus est visible) et pour éviter la surdigestion (voir la figure supplémentaire S1).
  4. Filtrer à l’aide d’une seringue à mailles de 200 μm (préalablement autoclavée) pour éliminer les tissus non digérés avec de la collagénase. Passez le filtre sur le bord du tube pour drainer autant de cellules que possible dans la solution. Ajouter 15 mL de DMEM-1% BSA froid pour arrêter la digestion et centrifuger à 400 × g pendant 10 min à 4 °C.
  5. Aspirer la couche supérieure contenant les adipocytes matures et la majeure partie de la couche liquide; Évitez de toucher ou de déranger le granulé. Ajouter 20 mL de sérum de bœuf bovin fœtal (PBS) tamponné au phosphate froid (PBS) à 2 % et remettre le granulé en suspension. Centrifuger à 400 × g pendant 5 min à 4 °C.
  6. Retirez le surnageant, en aspirant d’abord la couche supérieure pour éliminer les adipocytes et la graisse restants. Remettez la pastille en suspension dans 1 mL de tampon de lyse de chlorure d’ammonium potassium (ACK) (pour lyser les globules rouges) et incuber sur de la glace pendant 5 min. Ajouter 10 mL de PBS-2% FBS, mélanger et centrifuger à 400 × g pendant 5 min à 4 °C.
  7. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 200 μL de solution anti-Fc (CD16/CD32 anti-souris de rat purifié dilué dans du FBS PBS-2% [1:150]) pour réduire la liaison médiée par le récepteur Fc par les anticorps d’intérêt. Incuber sur la glace pendant 5 min. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 5 mL qui s’insère dans les racks prérefroidis d’un séparateur de cellules magnétiques et centrifuger à 400 × g pendant 5 min à 4 °C.
  8. Éliminer le surnageant, ajouter 200 μL du mélange d’anticorps monoclonal CD31(PECAM-1) (390)-biotine (1:100) et d’anticorps monoclonal CD45 (30-F11)-biotine (1:100), bien mélanger et incuber sur glace pendant 15 minutes (préparer les dilutions d’anticorps dans une solution anti-Fc; voir Tableau 1). Ajouter 400 μL de PBS-2% FBS et centrifuger à 400 × g pendant 5 min à 4 °C.
    NOTE: CD31 et CD45 sont des marqueurs des cellules endothéliales et des cellules hématopoïétiques, respectivement.
  9. Aspirer le surnageant et incuber dans 100 μL de microbilles antibiotines (1:5) pendant 15 min sur glace (préparer des dilutions d’anticorps dans une solution anti-Fc, voir le tableau 1). Ajouter 400 μL de PBS-2% FBS et centrifuger à 400 × g pendant 5 min à 4 °C.
  10. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 350 μL de PBS-2% FBS. Éliminer les agrégats cellulaires ou les grosses particules des suspensions unicellulaires à l’aide d’un filtre de préséparation (70 μm). Tout d’abord, activez le filtre avec 100 μL de PBS-2% FBS, passez la suspension cellulaire à travers le filtre (recueillir dans un tube propre) et enfin lavez le filtre avec 100 μL de PBS-2% FBS.
  11. Effectuer la séparation magnétique des cellules en utilisant la stratégie de séparation négative avec un séparateur de cellules magnétiques.
    1. Placer l’échantillon dans la position A de la grille de refroidissement (s’assurer que la grille est prérefroidie) et deux tubes vides en position B et C pour récupérer les cellules non marquées et étiquetées, respectivement.
    2. Chargez le tampon de lavage et le tampon de fonctionnement dans les bouteilles correspondantes avant d’allumer l’équipement. Programmer l’équipement pour effectuer la séparation magnétique des cellules avec le protocole DEPLETE .
      REMARQUE: Ce protocole est pour la déplétion en mode standard pour l’élimination des cellules avec une expression antigénique normale (dans ce cas, les cellules marquées avec anti-CD31 et anti-CD45), si la récupération est la plus haute priorité.
    3. Dans la section de séparation , sélectionnez le nombre d’échantillons à séparer et sélectionnez le protocole DEPLETE . Appuyez sur Exécuter et démarrez la séparation. À la fin du programme, récupérer les cellules non marquées et centrifuger à 400 × g pendant 5 min à 4 °C.
  12. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 500 μL de milieu de croissance (tableau 1).
  13. Ensemencer les APC dans un puits d’une plaque de 12 puits préalablement recouverte d’une matrice membranaire basale à 2,5 % (environ 50 000 à 75 000 cellules sont obtenues). Ajouter 400 μL de matrice membranaire basale à 2,5 % pour couvrir toute la surface de chaque puits. Immédiatement après avoir retiré l’excès de solution et ne laisser qu’une petite couche, laissez sécher la plaque (sans couvercle) à l’intérieur de la hotte à flux laminaire pendant au moins 1 h. Incuber à 37 °C dans une atmosphère de 5% de CO2 . Changez le milieu toutes les 48 heures jusqu’à ce que les cellules atteignent 80% de confluence.
  14. À 80% de confluence, retirer complètement le milieu et laver avec 350 μL de PBS-2% FBS. Récolter les cellules avec 350 μL de trypsine-EDTA à 0,05% pendant 2 min à 37 °C. Ajouter 2 mL de milieu de croissance et recueillir les cellules dans un nouveau tube conique de 50 mL, puis centrifuger à 400 × g pendant 5 min.
  15. Passage des APC vers des plaques à 12 puits (10 000 à 20 000 cellules par puits) préalablement recouvertes d’une matrice membranaire basale à 2,5 %. Incuber à 37 °C avec 5% de CO2. Changez le milieu toutes les 48 heures jusqu’à ce que les cellules atteignent 80% de confluence.
    REMARQUE: Les APC peuvent être passés une fois. Par la suite, ils perdent leur capacité à proliférer et à se différencier. Voir le workflow pour le processus d’isolation des APC dans la figure supplémentaire S2.

2. Différenciation des adipocytes et induction de la résistance à l’insuline

REMARQUE : Maintenir les cellules à 37 °C dans 5 % de CO2 et effectuer des étapes impliquant un changement de milieu et des traitements avec du TNF-α et de l’insuline à l’intérieur d’une cagoule stérile.

  1. À 80% de confluence, commencer le processus de différenciation; aspirer tout milieu de croissance et le remplacer par 500 μL de milieu de différenciation (tableau 1) contenant 3,3 nM de protéine morphogénétique osseuse (BMP4) dans chaque puits.
  2. Après 48 h, remplacer le milieu par le milieu de différenciation (500 μL par puits) et le cocktail de différenciation (tableau 1).
  3. Retirer le milieu 72 h plus tard et ajouter 100 nM d’insuline dans 500 μL de milieu de différenciation frais.
    REMARQUE: Les cellules commencent à montrer un aspect rond avec de petites gouttelettes lipidiques à l’intérieur.
  4. Aspirer tout milieu de différenciation et le remplacer par 500 μL de milieu simple - FBS à 2% (tableau 1) 48 h plus tard. Induire une résistance à l’insuline avec 4 ng/mL de TNF-α. Inclure les puits témoins sans traitement au α au TNF.
  5. Après 24 heures d’incubation, ajouter 4 ng/mL de TNF-α dans du FBS simple à 0 % (tableau 1). Maintenir les puits de contrôle sans traitement au α TNF.
  6. Activer la voie de signalisation de l’insuline 24 h plus tard en ajoutant 100 nM d’insuline et incuber pendant 15 min à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5%. Retirer le milieu et laver avec 500 μL de PBS. Inclure les puits témoins sans traitement à l’insuline.

3. Évaluation de la voie de signalisation de l’insuline par transfert Western

  1. Extraction et quantification des protéines
    1. Lavez chaque puits de cellules avec 500 μL de PBS et conservez-les sur la glace pour lyser les cellules dans 50 μL de tampon RIPA (tableau 1) contenant un cocktail d’inhibiteurs de protéase à 1 % ajouté juste avant l’isolement de l’échantillon. Grattez toute la surface du puits avec une pointe et transférez le lysat dans un tube microcentrifuge de 0,6 mL (garder sur la glace).
    2. Incuber pendant 1 h à 4 °C dans un agitateur rotatif, mélanger par tourbillon, centrifuger à 8 000 × g pendant 15 min à 4 °C et récupérer le surnageant (garder sur la glace).
    3. Déterminer la concentration en protéines à l’aide du test de Bradford (ne pas diluer l’échantillon pour quantifier).
    4. Prélever le volume nécessaire correspondant à 40-60 μg et dénaturer avec 6x tampon Laemmli (tableau 1) en incubant à 97 °C pendant 15 min tout en agitant à 550 tr/min. Congeler jusqu’à utilisation.
  2. Électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS
    1. Effectuer une électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS (SDS-PAGE) avec un gel de polyacrylamide à 7,5% d’épaisseur de 1,5 mm. Insérez le gel dans le réservoir et remplissez-le de tampon courant (tableau 1).
    2. Ajouter 3 μL de protéine étalon précolorée au premier puits du gel et charger chaque échantillon dans les puits suivants.
    3. Exécutez le gel à 80 V pendant environ 15 minutes pour s’assurer que l’échantillon pénètre dans la matrice de gel du concentrateur de polyacrylamide. Par la suite, augmentez la tension à 90 V pendant 2,5 h ou jusqu’à ce que le marqueur de poids moléculaire de 37 kDa puisse être vu sur le bord inférieur du gel.
    4. Transférer les protéines du gel vers une membrane de nitrocellulose dans une chambre semi-sèche pendant 35 min à 25 V. Au préalable, immergez le gel, la membrane et les filtres dans un tampon de transfert (tableau 1) pendant quelques minutes.
  3. Western blot
    1. Après le transfert, laver la membrane avec une solution saline tamponnée Tris (TBS) contenant 0,1 % de Tween 20 (TBS-T 0,1 %) (tableau 1) pendant 3 min en agitant à 30 tr/min.
    2. Bloquer la membrane avec une solution de blocage (tableau 1) à 4 °C pendant 1 h en rotation constante.
    3. Couper la membrane en trois parties selon le marqueur de poids moléculaire à incuber pendant une nuit avec différents anticorps primaires (dilués dans une solution bloquante) à 4 °C en rotation constante : anticorps Phospho-IRS1 (Tyr608) (1:1 000), bande attendue à 180 kDa ; Anticorps β récepteur phospho-insuline (Tyr1150/1151) (1:1 000), bande attendue à 95 kDa; Anticorps Phospho-Akt (Ser473) (1:1 000), bande attendue à 60 kDa.
    4. Lavez les membranes 5x pendant 5 min chacune avec TBS-T 0,1%.
    5. Incuber les membranes avec l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase correspondant (dilué dans une solution bloquante) pendant 2 h à température ambiante en rotation constante : peroxydase affiniPure ânesse anti-lapin IgG (H+L) (1:5 000).
    6. Lavez les membranes 5x pendant 5 min chacune avec TBS-T 0,1%.
    7. Détecter les protéines à l’aide du système de détection par chimiluminescence. Préparez le substrat conformément aux instructions du fabricant.
    8. Placez le transfert dans un sac en plastique et ajoutez 200 μL de substrat chimioluminescent pour recouvrir complètement la membrane. Vidangez l’excès de substrat et éliminez les bulles d’air.
    9. Exposez chaque transfert pendant 30-60 s dans un système d’imagerie haute performance compatible avec la chimiluminescence.
    10. Dénuder les membranes (étapes 10 à 13 de la section Western blot) pour briser les interactions anticorps-antigène et permettre ainsi aux membranes de nitrocellulose d’être regonflées. Récupérer les membranes et laver 3x pendant 5 min chacune avec TBS-T 1% à 50 tr/min.
    11. Incuber pendant 7 min avec 10 mL de NaOH 0,2 M à 50 rpm.
    12. Laver 3x pendant 5 min chacun avec de l’eau du robinet à 50 tr/min.
    13. Laver pendant 10 min avec TBS-T 1 % à 50 tr/min.
    14. Répéter les étapes 2 à 9 de la section Western blot pour incuber la membrane avec de la tubuline anti-bêta (55 kDa) comme contrôle de charge en utilisant une dilution de 1:1 000.
    15. Effectuer une analyse densitométrique25 pour chaque protéine à l’aide du logiciel ImageJ (https://imagej.nih.gov/).

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Representative Results

Au cours des dernières années, la prévalence accrue de l’obésité et du DT2 a suscité une recherche intense des mécanismes médiant la résistance à l’insuline dans le tissu adipeux. Avec le protocole décrit ici, les APC peuvent être différenciés en adipocytes matures pour évaluer la résistance et la sensibilité à l’insuline. Une fois que les APC atteignent la confluence, il faut 10 jours pour compléter leur différenciation en adipocytes matures et leur induction de résistance à l’insuline médiée par le TNF α (Figure 1).

Les APC présentent une morphologie de type fibroblaste, caractérisée par leur forme plate et allongée et leur adhérence à la plaque complétée 48 h après l’ensemencement (Figure 2A). Les CPA mettent de 2 à 5 jours pour atteindre 80 % de confluence (selon le nombre de cellules ensemencées), un moment auquel le processus de différenciation est lancé par l’exposition au cocktail de différenciation (Figure 2A). Les adipocytes matures commencent à apparaître dans les 6-8 jours suivants. Les adipocytes différenciés sont caractérisés par une morphologie ronde et l’accumulation intracellulaire de gouttelettes lipidiques. Jusqu’à 80% des cellules sont différenciées à la fin du processus de différenciation (Figure 2B).

La résistance à l’insuline est induite dans les adipocytes primaires par un traitement au TNF-α (4 ng/mL) pendant 48 h ; cette concentration de TNF-α n’altère pas la viabilité cellulaire (figure supplémentaire S3). Par la suite, la voie de signalisation de l’insuline est activée en ajoutant 100 nM d’insuline pendant 15 minutes, et la phosphorylation des principales molécules de signalisation (IR, IRS-1 et AKT) est mesurée par transfert Western. L’insuline stimule la phosphorylation de ces trois molécules (Figure 3) par rapport aux adipocytes différenciés témoins non traités. Le TNF-α réduit la phosphorylation induite par l’insuline de l’IR (30 %), de l’IRS-1 (20 %) et de l’AKT (45 %) (Figure 3). Les cellules insulino-résistantes montrent moins d’activation de la voie de signalisation de l’insuline par rapport aux cellules insulino-sensibles. De plus, le traitement par le TNF-α diminue l’expression de l’ARNm des marqueurs connus de sensibilité à l’insuline : Insr, Irs2, Glut4 et Adipoq (figure supplémentaire S4). Ces résultats confirment que le TNF-α réduit l’action de l’insuline dans les adipocytes primaires, et induit ainsi une résistance à l’insuline.

Figure 1
Figure 1 : Chronologie schématique représentant le processus de différenciation des cellules précurseurs adipocytaires et l’induction de la résistance à l’insuline. Les APC sont isolés du tissu adipeux sous-cutané à l’aide d’un traitement à la collagénase et d’une technologie de séparation cellulaire magnétique. Ensuite, ils subissent un processus de différenciation de 7 jours pour obtenir des adipocytes primaires. Par la suite, la résistance à l’insuline est induite avec le TNF-α pendant 48 h, les 24 premières heures en milieu contenant 2% de FBS et les 24 heures suivantes avec un milieu sans sérum pour empêcher l’activation de la voie de signalisation de l’insuline. La cascade de signalisation est activée avec de l’insuline et la protéine est extraite pour l’analyse par transfert Western 10 jours après le début du processus de différenciation afin d’évaluer la phosphorylation / activation de l’IR, de l’IRS-1 et de l’AKT. Abréviations : APC = cellules précurseurs adipocytes; BMP4 = Protéine morphogénétique osseuse; IBMX = 3-isobutyl-1-méthylxanthine; TNF-α = facteur de nécrose tumorale α; FBS = sérum fœtal bovin; IR = récepteur de l’insuline; PID = substrat du récepteur de l’insuline; AKT = protéine kinase B; Tx = traitement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Morphologie des cellules précurseurs des adipocytes et des adipocytes matures. (A) APC sous-cutanés à 80% de confluence avant induction de la différenciation dans des plaques de culture à 12 puits. (B) Adipocytes primaires sous-cutanés après 7 jours d’induction de la différenciation dans des plaques de culture à 12 puits. Les images ont été prises à un grossissement de 10x. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviation : APC = cellules précurseurs adipocytes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Résistance à l’insuline induite par le TNF-α dans les adipocytes primaires sous-cutanés démontrée par une diminution de la phosphorylation induite par l’insuline de l’IR, de l’IRS-1 et de l’AKT. Les adipocytes sous-cutanés ont été traités avec du TNF-α (4 ng / mL) pendant 48 heures et privés de sérum pendant les 24 dernières heures. Après la stimulation à l’insuline (100 nM) pendant 15 min, 40 μg de protéines totales ont été chargés sur des gels à 7,5% et soumis à SDS-PAGE, transférés sur des membranes de nitrocellulose et bloqués dans du lait écrémé à 4% dans TBS-T 0,1%. La membrane a été sondée avec un IR anti-phosphorylé (pIR), un IRS-1 anti-phosphorylé (pIRS-1) et un AKT anti-phosphorylé (pAKT), ainsi qu’avec un anticorps secondaire HRP anti-lapin. Le signal a été visualisé avec détection par chimiluminescence et la tubuline anti-β a été utilisée comme contrôle de charge. (A) des transferts représentatifs et (B) la quantification à partir de trois expériences indépendantes. Les données sont moyennes ± SEM; *, p < 0,05 par rapport au contrôle. Abréviations : TNF-α = facteur de nécrose tumorale α; IR = récepteur de l’insuline; PID = substrat du récepteur de l’insuline; pX = forme phosphorylée de X; b-Tub = bêta-tubuline; HRP = peroxydase de raifort; Ctrl = contrôle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Solution anti-Fc Rat purifié anti-souris CD16 / CD32 dilué dans PBS–2% FBS [1:150]
TBS-T 0,1 % 0,01 M Tris-HCl (pH 8), 0,15 M NaCl, 0,1% Tween 20
Solution bloquante 4 % de lait écrémé en poudre dilué dans TBS-T 0,1 %
Milieu de culture 60% DMEM faible glucose, 40% MCDB 201 milieu, 1x pénicilline-streptomycine, 1 nM de dexaméthasone, 0,1 mM d’acide L-ascorbique 2-phosphate, 1x insuline, transferrine, sodium, supplément de sélénite (ITS), 1x acide linoléique-albumine de BSA, 10% FBS, 10 ng / mL de facteur de croissance épidermique (EGF), 10 ng / mL de facteur inhibiteur de la leucémie (LIF), 10 ng / mL de facteur de croissance dérivé des plaquettes BB (PDGF-BB), 5 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes basiques (FGFb) et 50 μg/mL de normocine
Moyen de différenciation 60% DMEM faible glucose, 40% MCDB 201 milieu, 1x pénicilline-streptomycine, 1 nM de dexaméthasone, 0,1 mM d’acide L-ascorbique 2-phosphate, 1x supplément de milieu liquide ITS, 1x acide linoléique-albumine de BSA, et 2% FBS
Cocktail de différenciation 0,5 μM 3-isobutyl-1-méthylxanthine [IBMX], 1 μM de dexaméthasone, 10 μM de rosiglitazone et 100 nM d’insuline
Moyen simple-2% FBS 60% DMEM faible glucose, 40% MCDB 201 moyen, 1x pénicilline-streptomycine et 2% FBS
Moyen simple–0 % FBS 60% DMEM faible teneur en glucose, 40% MCDB 201 moyenne, 1x pénicilline-streptomycine
Tampon RIPA 50 mM de Tris-HCl, 1 mM d’EGTA, 1 mM d’EDTA, 1 % d’octylphénoxy poly(éthylèneoxy)éthanol, 1 mM deNa3VO4, 48,8 mM de NaF, 8,2 mMNa4P2O7et 0,26 M desaccharose
6x tampon Laemmli 1,2 g de SDS, 6 mg de bleu de bromophénol, 4,7 mL de glycérol, 1,2 mL de Tris base 0,5 M pH 6,8, 845 μL de 2-mercaptoéthanol et 2,1 mL H2O
Exécution de la mémoire tampon 25 mM Tris base, 192 mM glycine, 1% SDS
Tampon de transfert 25 mM Tris-base, 192 mM glycine, 20% méthanol

Tableau 1 : Solutions utilisées dans ce protocole.

Figure supplémentaire S1 : Tissu adipeux sous-cutané digéré avec la collagénase. Une fois le tissu adipeux retiré, il est coupé en petits morceaux avec des ciseaux pour démarrer le processus de digestion (A), puis il est incubé pendant 30 min avec de la collagénase de type 1 à 37 °C, 150 rpm (B). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2 : Schéma du processus d’isolement cellulaire des précurseurs adipocytes. Disséquer le tissu adipeux sous-cutané inguinal et digérer les échantillons avec de la collagénase. Éliminer les adipocytes matures par centrifugation et laver la pastille pour éliminer l’excès de graisse. Lyser les globules rouges et les bloquer pour réduire la liaison non spécifique. Marquez les cellules endothéliales et les macrophages avec des anticorps couplés à des particules magnétiques. Effectuer la séparation magnétique des cellules en utilisant la stratégie de séparation négative avec un séparateur de cellules magnétique. Ensemencer des APC (cellules non marquées) dans des plaques recouvertes d’une matrice membranaire basale. Changez le milieu toutes les 48 heures jusqu’à ce que les cellules atteignent 80% de confluence. Abréviations : APC = cellules précurseurs adipocytes; BSA = albumine sérique bovine; FBS = sérum fœtal bovin. Créé avec Biorender.com. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S3 : Le traitement par le TNF-α pour induire une résistance à l’insuline n’altère pas la viabilité des adipocytes. La viabilité des adipocytes matures a été mesurée par le test MTT après traitement avec 4 ng / mL de TNF-α pendant 48 h. Les données sont moyennes ± SEM. Abréviations : TNF-α = facteur de nécrose tumorale α; Ctrl = contrôle. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S4 : Le traitement par le TNF-α dans les adipocytes diminue l’expression des marqueurs de sensibilité à l’insuline. L’expression de l’ARNm d’Insr, Irs, Glut4 et Adipoq a été mesurée par PCR en temps réel après traitement avec 4 ng / mL de TNF-α pendant 48 heures. Les données sont moyennes ± SEM; *, p < 0,05 par rapport au contrôle. Abréviations : TNF-α = facteur de nécrose tumorale α; Ctrl = contrôle. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Cet article fournit une méthode pour étudier la résistance à l’insuline qui utilise des adipocytes primaires dans la culture traitée avec le TNF-α. Ce modèle présente l’avantage que les adipocytes primaires peuvent être cultivés dans des conditions définies pendant de longues périodes avec un contrôle étroit des facteurs environnementaux cellulaires26. La durée du test est de 15 à 20 jours, bien que des variations dans le pourcentage d’adipocytes différenciés puissent se produire entre les expériences. Les adipocytes primaires présentent des avantages par rapport aux lignées cellulaires puisqu’ils n’ont pas été continuellement développés en culture et capturent plus étroitement la diversité des tissus dont ils sont dérivés27. De plus, les adipocytes primaires permettent d’étudier les donneurs dans différents contextes physiopathologiques, tels que maigre versus obèse, mâle versus femelle, jeune versus vieux, et les cellules de différents dépôts de graisse. Un autre avantage de cette méthode est que des lignées cellulaires de souris CRE et knockout peuvent être générées après l’isolement des APC.

Un problème possible lors de l’isolement et de la différenciation des APC est que ces cellules peuvent perdre la capacité de se différencier, ce qui se produirait probablement lorsque 80% de confluence est dépassée au début du processus de différenciation. Le milieu doit également être changé très doucement, surtout après l’accumulation de lipides, car les adipocytes différenciés se détachent facilement de la boîte de culture. De plus, chaque lot de collagénase doit être testé pour l’efficacité de la digestion, le rendement cellulaire et la cytotoxicité26. Des techniques ont été développées pour identifier et isoler les APC de la fraction stromovasculaire du tissu adipeux blanc, en utilisant des marqueurs négatifs tels que CD31 et CD45, ainsi que des marqueurs positifs de population de cellules souches tels que CD34 et Sca128,29. Dans ce protocole, nous n’effectuons qu’une séparation négative, éliminant les cellules endothéliales et les macrophages de la fraction stromovasculaire, évitant ainsi la perte de préadipocytes dans la séparation positive.

Bien que les cultures primaires permettent d’étudier la variabilité et la complexité des donneurs27,30, l’établissement du modèle expérimental introduit des limites. Par exemple, les adipocytes isolés chez des animaux âgés auront une capacité de différenciation plus faible et un taux de lipotoxicité plus élevé que ceux provenant de jeunes animaux31,32. Le protocole pourrait également être adapté pour utiliser différentes techniques de séparation cellulaire. Si un séparateur automatique de cellules magnétiques n’est pas disponible, la séparation manuelle des cellules peut être réalisée avec des colonnes ou un tri FACS. La méthode décrite ici pour l’isolement des APC à l’aide d’un séparateur de cellules magnétiques est une version adaptée et simplifiée du protocole de tri FACS décrit par Macotela et al.28.

Plusieurs cytokines inflammatoires ont été utilisées pour induire une résistance à l’insuline dans les cellules adipeuses, y compris le TNF-α, l’IL-1β et l’IL-6 18,33,34,35,36. Les adipocytes 3T3-L1 en culture exposés au TNF-α devenir insulino-résistants en quelques jours, comme l’évalue la capacité réduite de l’insuline à stimuler l’absorption du glucose37. Ces résultats montrent que le TNF-α diminue la phosphorylation induite par l’insuline de l’IR, de l’IRS-1 et de l’AKT21,23, mesurée par la détection par transfert Western de protéines totales extraites des adipocytes primaires. Cependant, les protéases et les phosphatases libérées pendant la lyse cellulaire pourraient influencer la détection par transfert Western. L’état actif des protéines doit être préservé par l’ajout d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase au tampon de lyse et, après quantification des protéines, en mélangeant l’échantillon avec un tampon de Laemmli. En conclusion, cette méthode fournit un outil utile pour étudier les mécanismes de médiation de la résistance à l’insuline dans les adipocytes différenciés des APC de souris.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Nous remercions Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla et María Antonieta Carbajo pour leur assistance technique, et Jessica Gonzalez Norris pour l’édition critique du manuscrit. Ce protocole a été soutenu par Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (à Y.M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Isolation mouse adipocyte precursor cells
ACK lysing buffer  LONZA 10-548E
Anti-Biotin Microbeads  Miltenyi 130-090-485
Anti-CD31 eBioscience 13-0311-85
AutoMACS Pro Separator Miltenyi
Basement membrane matrix (matrigel) Corning 354234
bFGF Sigma F0291 Growth factor
BSA Equitech-Bio, Inc. BAC63-1000
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin  eBioscience 13-0451-85
Collagenase, Type 1 Worthington Biochem LS004197
Dexamethasone Sigma D1756
DMEM GIBCO 12800017
DMEM low glucose GIBCO 31600-034
EGF Peprotech 315-09 Growth factor
FBS GIBCO 26140-079
ITS mix Sigma I3146
L-ascorbic acid 2-phosphate Sigma A8960
LIF Millipore ESG1107 Growth factor
Linoleic acid-albumin Sigma L9530
MCDB 201 medium Sigma M6770
Normocin InvivoGen ant-nr-2
PDGF-BB  Peprotech 315-18 Growth factor
Peniciline-Streptomycine BioWest L0022-100
Pre-Separation Filters (70 µm) Miltenyi 130-095-823
Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32  BD Pharmingen 553142
Trypsin-EDTA  GIBCO 25300062
2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction
3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX] Sigma I5879 Differentiation cocktail
BMP4 R&D Systems 5020-BP-010 Differentiation cocktail
Dexamethasone Sigma D1756 Differentiation cocktail
Insulin Sigma I9278
Rosiglitazone Cayman 71742 Differentiation cocktail
TNFα R&D Systems 210-TA-005 
3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot
Anti-beta tubulin antibody Abcam ab6046
Bromophenol blue BioRad 161-0404 Laemmli buffer
EDTA Sigma E5134 RIPA buffer
EGTA Sigma E4378 RIPA buffer
FluorChem E system ProteinSimple
Glycerol Sigma G6279 Laemmli buffer
Glycine Sigma G7126 Running and Transfer buffer
Igepal Sigma I3021 RIPA buffer
2- mercaptoethanol Sigma M3148 Laemmli buffer
Methanol JT Baker 907007 Transfer buffer
NaCl JT Baker 3624-05 TBS-T
NaF Sigma 77F-0379 RIPA buffer
NaOH  JT Baker 3722-19
Na4P2O7 Sigma 114F-0762 RIPA buffer
Na3VO4 Sigma S6508 RIPA buffer
Nitrocellulose membrane  BioRad 1620112
Nonfat dry milk BioRad 1706404 Blocking solution
Prestained protein standard  BioRad 1610395
Protease inhibitor cocktail  Sigma P8340-5ML
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)  Jackson ImmunoResearch 711-035-132
Phospho- Insulin Receptor β  Cell signaling 3024
Phospho-Akt (Ser473) Antibody Cell signaling 9271
Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody Millipore 9432
Saccharose  JT Baker 407205 RIPA buffer
SDS BioRad 1610302 Running and laemmli buffer
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34577
Tris-base Promega H5135 Running, transfer and laemmli buffer
Tris-HCl JT Baker 4103-02 RIPA buffer - TBS
Tween 20 Sigma P1379 TBS-T

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Biologie numéro 192 isolement des préadipocytes graisse sous-cutanée action de l’insuline TNF-α
Adipocytes de souris différenciés en culture primaire: un modèle de résistance à l’insuline
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Ruiz-Herrera, X., Luzardo-Ocampo, I., Martínez de la Escalera, G., Clapp, C., Macotela, Y. Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance. J. Vis. Exp. (192), e63979, doi:10.3791/63979 (2023).

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