Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Präadipozyten der Maus aus subkutanem Fett, ihre Differenzierung in reife Adipozyten und die Induktion einer Insulinresistenz. Die Insulinwirkung wird durch die Phosphorylierung/Aktivierung von Mitgliedern des Insulin-Signalwegs durch Western Blot bewertet. Diese Methode ermöglicht die direkte Bestimmung der Insulinresistenz/-sensitivität in primären Adipozyten.
Abstract
Insulinresistenz ist eine verminderte Wirkung von Insulin auf seine Zielzellen, die in der Regel auf eine verminderte Signalübertragung der Insulinrezeptoren zurückzuführen ist. Insulinresistenz trägt zur Entwicklung von Typ-2-Diabetes (T2D) und anderen durch Fettleibigkeit verursachten Krankheiten mit hoher Prävalenz weltweit bei. Daher ist es von großer Relevanz, die Mechanismen zu verstehen, die der Insulinresistenz zugrunde liegen. Mehrere Modelle wurden verwendet, um die Insulinresistenz sowohl in vivo als auch in vitro zu untersuchen. Primäre Adipozyten stellen eine attraktive Option dar, um die Mechanismen der Insulinresistenz zu untersuchen und Moleküle zu identifizieren, die diesem Zustand entgegenwirken, sowie die molekularen Ziele von insulinsensibilisierenden Medikamenten. In dieser Arbeit haben wir ein Insulinresistenzmodell mit primären Adipozyten in Kulturen etabliert, die mit Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) behandelt wurden.
Adipozyten-Vorläuferzellen (APCs), die aus Kollagenase-verdautem subkutanem Fettgewebe der Maus mittels Magnetzelltrennungstechnologie isoliert wurden, werden in primäre Adipozyten differenziert. Die Insulinresistenz wird dann durch die Behandlung mit TNF-α induziert, einem proinflammatorischen Zytokin, das die Tyrosinphosphorylierung/-aktivierung von Mitgliedern der Insulinsignalkaskade reduziert. Die verminderte Phosphorylierung des Insulinrezeptors (IR), des Insulinrezeptorsubstrats (IRS-1) und der Proteinkinase B (AKT) wird mittels Western Blot quantifiziert. Diese Methode bietet ein hervorragendes Werkzeug, um die Mechanismen zu untersuchen, die die Insulinresistenz im Fettgewebe vermitteln.
Introduction
Insulin ist ein anaboles Hormon, das von den β-Zellen der Pankreasinsel produziert wird und der Schlüsselregulator des Glukose- und Fettstoffwechsels ist. Insulin reguliert unter anderem die Glukoseaufnahme, die Glykogensynthese, die Gluconeogenese, die Proteinsynthese, die Lipogenese und die Lipolyse1. Das erste molekulare Signal nach der Interaktion von Insulin mit seinem Rezeptor (IR) ist die Aktivierung der intrinsischen Tyrosinkinase-Aktivität von IR2, was zu seiner Autophosphorylierung3 und der anschließenden Aktivierung einer Familie von Proteinen führt, die als Insulinrezeptorsubstrate (IRS) bekannt sind und an Adapterproteine binden, was zur Aktivierung einer Kaskade von Proteinkinasenführt 4 . Insulin aktiviert zwei Hauptsignalwege: die Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K)-Proteinkinase B (AKT) und die Ras-Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK). Ersterer stellt einen wichtigen Verzweigungspunkt oder Knoten 4,5 für die Aktivierung zahlreicher nachgeschalteter Effektoren dar, die an verschiedenen physiologischen Funktionen beteiligt sind, einschließlich der Regulation der Brennstoffhomöostase, während letzterer das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung reguliert 4,6. Die Insulinwirkung hängt letztendlich vom Zelltyp und dem physiologischen Kontext ab7.
Eines der wichtigsten insulinempfindlichen Stoffwechselgewebe ist das Fettgewebe. Weißes Fettgewebe ist die am häufigsten vorkommende Art von Fett bei Menschen und Nagetieren, verteilt in subkutanem Fett (zwischen Haut und Muskeln) und viszeralem Fett (um die Organe in der Bauchhöhle). Aufgrund ihres großen Volumens sind Adipozyten oder Fettzellen der am häufigsten vorkommende Zelltyp im Fettgewebe. Diese Fettzellen können braun/beige (thermogen), rosa (in der Brustdrüse) und weiß sein 8,9. Weiße Adipozyten halten die wichtigsten Energiereserven im Körper in Form von Triglyceriden, einem insulinabhängigen Prozess. Insulin fördert den Glukosetransport und die Lipogenese, während es die Lipolyse oder den Lipidabbau hemmt 7,10. Es erleichtert auch die Differenzierung von Präadipozyten in Adipozyten – die reifen fettspeichernden Zellen11.
Eine Insulinresistenz tritt auf, wenn ein normaler Insulinspiegel eine abgeschwächte biologische Reaktion hervorruft, was zu einer kompensatorischen Hyperinsulinämie führt12. Insulinresistenz ist eine Erkrankung, die mit Übergewicht und Adipositas einhergeht5 und in Kombination zu Typ-2-Diabetes (T2D) und anderen Stoffwechselerkrankungen führt13. Hyperinsulinämie kompensiert die Insulinresistenz im peripheren Gewebe, um einen normalen Blutzuckerspiegel aufrechtzuerhalten14. Ein eventueller Verlust oder eine Erschöpfung β Zellen führt jedoch zusammen mit einer verschlimmerten Insulinresistenz zu erhöhten Blutzuckerspiegeln, die mit T2D5 übereinstimmen. Daher können Insulinresistenz und Hyperinsulinämie zur Entwicklung von Adipositas-bedingten Stoffwechselerkrankungen beitragen15. Darüber hinaus kann Adipositas eine chronische, niedriggradige lokale Entzündung verursachen, die die Insulinresistenz im Fettgewebe fördert15,16,17. Darüber hinaus führen durch Fettleibigkeit verursachte Veränderungen des Fettgewebes, wie z. B. Fibrose, Entzündungen und eine verminderte Angiogenese und Adipogenese, zu niedrigeren Adiponektin-Serumspiegeln (einem Insulinsensibilisator) und einer erhöhten Sekretion von Faktoren wie dem Plasminogen-Aktivator-Inhibitor 1 (PAI-1), freien Fettsäuren und Exosomen in den Blutkreislauf, was die Insulinresistenz verschlimmert17.
Viele Aspekte, die der Insulinresistenz zugrunde liegen, sind noch unbekannt. In-vitro- und In-vivo-Modelle wurden entwickelt, um die Mechanismen zu untersuchen, die die Insulinresistenz in wichtigen Zielgeweben, einschließlich des Fettgewebes, vermitteln. Der Vorteil von In-vitro-Modellen besteht darin, dass die Forscher die Umweltbedingungen besser kontrollieren und die Insulinresistenz in bestimmten Zelltypen beurteilen können. Insbesondere Adipozyten-Vorläuferzellen (APCs) weisen den individuellen Phänotyp des Spendergewebes auf, der die Physiologie besser widerspiegeln könnte als Adipozyten-Zelllinien. Ein Hauptfaktor, der die Insulinresistenz in vitro induziert, ist der Tumornekrosefaktor-α (TNF-α). TNF-α ist ein proinflammatorisches Zytokin, das von Adipozyten und Makrophagen im Fettgewebe sezerniertwird 18. Während es für den korrekten Umbau und die Expansion des Fettgewebes erforderlich ist19, induziert eine langfristige Exposition gegenüber TNF-α eine Insulinresistenz im Fettgewebe in vivo und in Adipozyten in vitro20. Die chronische TNF-α-Behandlung verschiedener Zelltypen führt zu einer erhöhten Serinphosphorylierung sowohl von IR als auch von IRS-1, wodurch eine verminderte Tyrosinphosphorylierung gefördertwird 21. Eine erhöhte Phosphorylierung von IRS-1 auf Serinresten hemmt die Aktivität der IR-Tyrosinkinase und könnte einer der Schlüsselmechanismen sein, durch die eine chronische TNF-α-Behandlung die Insulinwirkung beeinträchtigt22,23. TNF-α aktiviert Signalwege, die den Serin/Threonin-Kinase-Inhibitor der nukleären Faktor-ĸB-Kinase β (IKKβ) und der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK) betreffen24. JNK induziert ein komplexes proinflammatorisches Transkriptionsprogramm, phosphoryliert aber auch direkt IRS-16.
Das Verständnis der Pathogenese der Insulinresistenz wird immer wichtiger, um die Entwicklung zukünftiger Therapien gegen T2D zu steuern. APCs haben sich als hervorragendes Modell für die Untersuchung der Fettzellbiologie, einschließlich der Sensitivität und Resistenz gegenüber Insulin, und für die Identifizierung der intrinsischen Eigenschaften von Adipozyten unabhängig von der systemischen Umgebung erwiesen. APCs können leicht aus verschiedenen Fettdepots gewonnen und unter geeigneten Bedingungen in reife Adipozyten differenziert werden. Mit dieser Methode können direkte Effekte auf die Insulinresistenz/-sensitivität in Adipozyten untersucht werden.
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Protocol
Alle Nagetierexperimente wurden von der Bioethikkommission des Instituts für Neurobiologie der UNAM, Protokollnummer 075, genehmigt.
1. Isolierung von Adipozyten-Vorläuferzellen der Maus
- 8-10 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse einschläfern (z. B. durch CO2 -Inhalation und anschließende Zervixluxation) (vier Tiere pro Isolierung). Desinfizieren Sie die Mäuse durch Einreiben mit 70%igem Ethanol und erhalten Sie das Fettgewebe sofort nach der Opferung.
Anmerkungen: Isolieren Sie nach der Euthanasie von Nagetieren sofort das Fettgewebe und führen Sie alle Schritte in einer sterilen Laminar-Flow-Haube durch. Mäuse werden unter 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklen mit freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten. - Präparieren Sie das inguinale subkutane Fettgewebe jeder Maus. Entfernen Sie nur das Fettgewebe, vermeiden Sie die Entfernung von Muskeln, Haut oder anderem Gewebe und sammeln Sie es in einem konischen 50-ml-Röhrchen mit 15 ml Kollagenaselösung Typ 1 (1,5 mg/ml) auf Eis. Lösen Sie Typ-1-Kollagenase in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit hohem Glukose-1%-Kälberserumalbumin (BSA) auf und filtrieren Sie durch 0,2-μm-Spritzenvorsatzfilter.
- Schneiden Sie das Fettgewebe mit einer sterilen chirurgischen Schere in kleine Stücke und verdauen Sie die Proben durch Inkubation mit Kollagenaselösung Typ 1 bei 37 °C in einem Orbitalschüttler (150 U/min) für 30 min (legen Sie das Röhrchen mit Fett und Kollagenase in eine horizontale Position, um eine größere Schüttelfläche zu erhalten). Überprüfen Sie die Verdauung alle 10 Minuten, um sicherzustellen, dass sie funktioniert (Gewebeabbau ist sichtbar) und um eine Überverdauung zu verhindern (siehe ergänzende Abbildung S1).
- Filtern Sie mit einer 200-μm-Netzspritze (zuvor autoklaviert), um Gewebe zu entfernen, das nicht mit Kollagenase verdaut wurde. Führen Sie den Filter über den Rand des Röhrchens, um so viele Zellen wie möglich in die Lösung zu entleeren. Fügen Sie 15 ml kaltes DMEM-1% BSA hinzu, um den Aufschluss zu stoppen, und zentrifugieren Sie bei 400 × g für 10 min bei 4 °C.
- Saugen Sie die oberste Schicht mit reifen Adipozyten und den größten Teil der Flüssigkeitsschicht ab. Vermeiden Sie es, das Pellet zu berühren oder zu stören. Fügen Sie 20 ml kalte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) - 2 % fötales Kälberserum (FBS) hinzu und resuspendieren Sie das Pellet. Bei 400 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Entfernen Sie den Überstand und saugen Sie zuerst die obere Schicht ab, um die verbleibenden Adipozyten und das Fett zu entfernen. Das Pellet wird in 1 ml Ammoniumchlorid-Kalium-Lysepuffer (ACK) (zur Lyse der roten Blutkörperchen) resuspendiert und 5 Minuten lang auf Eis inkubiert. 10 ml PBS-2% FBS zugeben, mischen und bei 400 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie das Pellet in 200 μl Anti-Fc-Lösung (gereinigtes Anti-Maus-CD16/CD32 der Ratte, verdünnt in PBS-2% FBS [1:150]), um die Fc-Rezeptor-vermittelte Bindung durch interessierende Antikörper zu reduzieren. 5 Minuten auf Eis inkubieren. Die Zellsuspension wird in ein 5-ml-Röhrchen überführt, das in die vorgekühlten Racks eines Magnetzellenseparators passt, und bei 400 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Den Überstand entfernen, 200 μl der Mischung aus monoklonalem CD31(PECAM-1)-Antikörper (390)-Biotin (1:100) und monoklonalem CD45-Antikörper (30-F11)-Biotin (1:100) zugeben, gut mischen und 15 min auf Eis inkubieren (Antikörperverdünnungen in Anti-Fc-Lösung vorbereiten; siehe Tabelle 1). 400 μl PBS-2% FBS zugeben und bei 400 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
HINWEIS: CD31 und CD45 sind Marker von Endothelzellen bzw. hämatopoetischen Zellen. - Den Überstand absaugen und in 100 μl Anti-Biotin-Mikrokügelchen (1:5) 15 min auf Eis inkubieren (Antikörperverdünnungen in Anti-Fc-Lösung vorbereiten, siehe Tabelle 1). 400 μl PBS-2% FBS zugeben und bei 400 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 350 μl PBS-2% FBS. Entfernen Sie Zellaggregate oder große Partikel mit einem Vorzerlegungsfilter (70 μm) aus den Einzelzellsuspensionen. Aktivieren Sie zuerst den Filter mit 100 μl PBS-2% FBS, führen Sie die Zellsuspension durch den Filter (sammeln Sie sie in einem sauberen Röhrchen) und waschen Sie den Filter schließlich mit 100 μl PBS-2% FBS.
- Führen Sie die magnetische Trennung von Zellen mit der negativen Trennstrategie mit einem magnetischen Zellseparator durch.
- Platzieren Sie die Probe in Position A des Kühlracks (stellen Sie sicher, dass das Rack vorgekühlt ist) und zwei leere Röhrchen in Position B und C, um die nicht markierten bzw. markierten Zellen zu gewinnen.
- Füllen Sie den Waschpuffer und den Laufpuffer in die entsprechenden Flaschen, bevor Sie das Gerät einschalten. Programmieren Sie das Gerät so, dass es die magnetische Trennung von Zellen mit dem DEPLETE-Protokoll durchführt.
HINWEIS: Dieses Protokoll ist für die Depletion im Standardmodus zur Entfernung von Zellen mit normaler Antigenexpression (in diesem Fall Zellen, die mit anti-CD31 und anti-CD45 markiert sind) vorgesehen, wenn die Wiederherstellung die höchste Priorität hat. - Wählen Sie im Abschnitt "Trennung" die Anzahl der zu trennenden Proben aus und wählen Sie das DEPLETE-Protokoll aus. Drücken Sie auf Ausführen und starten Sie die Trennung. Am Ende des Programms werden die unmarkierten Zellen zurückgewonnen und bei 400 × g für 5 Minuten bei 4 °C zentrifugiert.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl Wachstumsmedium (Tabelle 1).
- Die APCs werden in einer Vertiefung einer 12-Well-Platte ausgesät, die zuvor mit einer 2,5-prozentigen Basalmembranmatrix beschichtet wurde (es werden ca. 50.000 bis 75.000 Zellen gewonnen). Fügen Sie 400 μl 2,5 % Basalmembranmatrix hinzu, um die gesamte Oberfläche jeder Vertiefung abzudecken. Lassen Sie die Platte unmittelbar nach dem Entfernen der überschüssigen Lösung und nur einer kleinen Schicht (ohne Deckel) mindestens 1 Stunde lang in der Laminar-Flow-Haube trocknen. Inkubieren bei 37 °C in einer 5%igen CO2 -Atmosphäre. Wechseln Sie das Medium alle 48 Stunden, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben.
- Bei einer Konfluenz von 80 % das Medium vollständig entfernen und mit 350 μl PBS-2 % FBS waschen. Die Zellen werden mit 350 μl 0,05%igem Trypsin-EDTA für 2 min bei 37 °C geerntet. Fügen Sie 2 ml Wachstumsmedium hinzu und sammeln Sie die Zellen in einem neuen konischen 50-ml-Röhrchen, dann zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 400 × g .
- Passage der APCs zu 12-Well-Platten (10.000-20.000 Zellen pro Well), die zuvor mit einer 2,5%igen Basalmembranmatrix beschichtet wurden. Inkubieren bei 37 °C mit 5% CO2. Wechseln Sie das Medium alle 48 Stunden, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben.
HINWEIS: Schützenpanzer können einmal durchgelassen werden. In der Folge verlieren sie ihre Fähigkeit, sich zu vermehren und zu differenzieren. Sehen Sie sich den Workflow für den APC-Isolationsprozess in der ergänzenden Abbildung S2 an.
2. Adipozytendifferenzierung und Induktion der Insulinresistenz
HINWEIS: Halten Sie die Zellen bei 37 °C in 5% CO2 und führen Sie Schritte durch, die einen Medienwechsel und Behandlungen mit TNF-α und Insulin in einer sterilen Haube umfassen.
- Beginnen Sie bei 80 % Konfluenz mit dem Differenzierungsprozess. Saugen Sie ein beliebiges Nährmedium ab und ersetzen Sie es durch 500 μl Differenzierungsmedium (Tabelle 1), das in jeder Vertiefung 3,3 nM knochenmorphogenetisches Protein (BMP4) enthält.
- Nach 48 h wird das Medium durch das Differenzierungsmedium (500 μl pro Well) und den Differenzierungscocktail ersetzt (Tabelle 1).
- Entfernen Sie das Medium 72 h später und geben Sie 100 nM Insulin in 500 μl frisches Differenzierungsmedium.
Anmerkungen: Die Zellen beginnen ein rundes Aussehen mit kleinen Lipidtröpfchen im Inneren zu zeigen. - Saugen Sie ein beliebiges Differenzierungsmedium ab und ersetzen Sie es 48 h später durch 500 μl einfaches Medium-2% FBS (Tabelle 1). Induzieren Sie eine Insulinresistenz mit 4 ng/ml TNF-α. Kontrollvertiefungen ohne TNF-α-Behandlung.
- Nach 24 h Inkubation werden 4 ng/ml TNF-α in einfachem mittel-0%igem FBS zugegeben (Tabelle 1). Aufrechterhaltung der Kontrollbrunnen ohne TNF-α-Behandlung.
- 24 h später wird der Insulin-Signalweg durch Zugabe von 100 nM Insulin aktiviert und 15 min bei 37 °C in einer 5%igen CO2 -Atmosphäre inkubiert. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie es mit 500 μl PBS. Integrieren Sie Kontrollvertiefungen ohne Insulinbehandlung.
3. Evaluierung des Insulin-Signalwegs mittels Western Blot
- Proteinextraktion und -quantifizierung
- Waschen Sie jede Vertiefung der Zellen mit 500 μl PBS und lassen Sie sie auf Eis, um die Zellen in 50 μl RIPA-Puffer (Tabelle 1) zu lysieren, der 1 % Protease-Inhibitor-Cocktail enthält, der kurz vor der Probenisolierung hinzugefügt wurde. Kratzen Sie die gesamte Oberfläche der Vertiefung mit einer Spitze ab und übertragen Sie das Lysat in ein 0,6-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (auf Eis aufbewahren).
- 1 h bei 4 °C in einem rotierenden Schüttler inkubieren, durch Vortexen mischen und bei 8.000 × g 15 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand zurückgewinnen (auf Eis aufbewahren).
- Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay (verdünnen Sie die Probe nicht, um sie zu quantifizieren).
- Das erforderliche Volumen entsprechend 40-60 μg entnehmen und mit 6x Laemmli-Puffer (Tabelle 1) denaturieren, indem bei 97 °C für 15 min unter Schütteln mit 550 U/min inkubiert wird. Bis zur Verwendung einfrieren.
- SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
- Führen Sie eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) mit einem 7,5%igen Polyacrylamid-Gel mit einer Dicke von 1,5 mm durch. Geben Sie das Gel in den Tank und füllen Sie es mit laufendem Puffer (Tabelle 1).
- Geben Sie 3 μl vorgefärbten Proteinstandard in die erste Vertiefung des Gels und laden Sie jede Probe in nachfolgende Vertiefungen.
- Lassen Sie das Gel ca. 15 Minuten lang bei 80 V laufen, um sicherzustellen, dass die Probe in die Gelmatrix des Polyacrylamidkonzentrators gelangt. Danach erhöhen Sie die Spannung für 2,5 h auf 90 V oder bis der 37 kDa Molekulargewichtsmarker am unteren Rand des Gels zu sehen ist.
- Übertragen Sie die Proteine aus dem Gel auf eine Nitrozellulosemembran in einer halbtrockenen Kammer für 35 Minuten bei 25 V. Tauchen Sie zuvor das Gel, die Membran und die Filter für einige Minuten in Transferpuffer (Tabelle 1).
- Westlicher Fleck
- Nach dem Transfer wird die Membran mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) mit 0,1 % Tween 20 (TBS-T 0,1 %) (Tabelle 1) 3 Minuten lang unter Schütteln bei 30 U/min gewaschen.
- Blockieren Sie die Membran mit Blockierlösung (Tabelle 1) bei 4 °C für 1 h in konstanter Rotation.
- Schneiden Sie die Membran entsprechend dem Molekulargewichtsmarker in drei Teile, um über Nacht mit verschiedenen Primärantikörpern (verdünnt in Blockierungslösung) bei 4 °C in konstanter Rotation zu inkubieren: Phospho-IRS1 (Tyr608)-Antikörper (1:1.000), erwartete Bande bei 180 kDa; Phospho-Insulinrezeptor-β Antikörper (Tyr1150/1151) (1:1.000), erwartete Bande bei 95 kDa; Phospho-Akt (Ser473)-Antikörper (1:1.000), erwartete Bande bei 60 kDa.
- Waschen Sie die Membranen 5x für je 5 min mit TBS-T 0,1%.
- Inkubieren Sie die Membranen mit dem entsprechenden Peroxidase-gekoppelten Sekundärantikörper (verdünnt in Blockierlösung) für 2 h bei Raumtemperatur in ständiger Rotation: Peroxidase affiniPure donkey anti-rabbit IgG (H+L) (1:5.000).
- Waschen Sie die Membranen 5x für je 5 min mit TBS-T 0,1%.
- Weisen Sie die Proteine mit dem Chemilumineszenz-Detektionssystem nach. Bereiten Sie den Untergrund gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
- Legen Sie den Blot in eine Plastiktüte und fügen Sie 200 μl chemilumineszierendes Substrat hinzu, um die Membran vollständig zu bedecken. Überschüssiges Substrat abtropfen lassen und alle Luftblasen entfernen.
- Belichten Sie jeden Blot für 30-60 s in einem leistungsstarken Bildgebungssystem, das mit Chemilumineszenz kompatibel ist.
- Entfernen Sie die Membranen (Schritte 10-13 des Western-Blot-Abschnitts), um die Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen zu unterbrechen und so die Nitrozellulosemembranen erneut zu blotten. Erholen Sie die Membranen und waschen Sie sie 3x für je 5 min mit TBS-T 1% bei 50 U/min.
- 7 min mit 10 ml 0,2 M NaOH bei 50 U/min inkubieren.
- 3x für je 5 min mit Leitungswasser bei 50 U/min waschen.
- 10 min mit TBS-T 1% bei 50 U/min waschen.
- Wiederholen Sie die Schritte 2-9 des Western-Blot-Abschnitts, um die Membran mit Anti-Beta-Tubulin (55 kDa) als Beladungskontrolle mit einer Verdünnung von 1:1.000 zu inkubieren.
- Führen Sie eine densitometrische Analyse25 für jedes Protein mit der ImageJ-Software (https://imagej.nih.gov/) durch.
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Representative Results
Die zunehmende Prävalenz von Adipositas und T2D hat in den letzten Jahren zu einer intensiven Suche nach den Mechanismen geführt, die die Insulinresistenz im Fettgewebe vermitteln. Mit dem hier beschriebenen Protokoll können APCs in reife Adipozyten differenziert werden, um die Insulinresistenz und -sensitivität zu bewerten. Sobald die APCs die Konfluenz erreicht haben, dauert es 10 Tage, bis ihre Differenzierung in reife Adipozyten und ihre TNF-α-vermittelte Induktion der Insulinresistenz abgeschlossen sind (Abbildung 1).
APCs zeigen eine fibroblastenähnliche Morphologie, die durch ihre flache und längliche Form und ihre Adhäsion an der Platte 48 h nach der Aussaat gekennzeichnet ist (Abbildung 2A). APCs benötigen 2-5 Tage, um eine Konfluenz von 80 % zu erreichen (abhängig von der Anzahl der besiedelten Zellen), ein Zeitpunkt, an dem der Differenzierungsprozess durch die Exposition gegenüber dem differenzierenden Cocktail gestartet wird (Abbildung 2A). Reife Adipozyten beginnen in den folgenden 6-8 Tagen zu erscheinen. Differenzierte Adipozyten zeichnen sich durch eine runde Morphologie und die intrazelluläre Akkumulation von Lipidtröpfchen aus. Bis zu 80 % der Zellen werden am Ende des Differenzierungsprozesses differenziert (Abbildung 2B).
Die Insulinresistenz wird in primären Adipozyten durch TNF-α-Behandlung (4 ng/ml) für 48 h induziert; Diese Konzentration von TNF-α verändert die Lebensfähigkeit der Zellen nicht (ergänzende Abbildung S3). Anschließend wird der Insulin-Signalweg durch Zugabe von 100 nM Insulin für 15 min aktiviert und die Phosphorylierung der Hauptsignalmoleküle (IR, IRS-1 und AKT) mittels Western Blot gemessen. Insulin stimuliert die Phosphorylierung dieser drei Moleküle (Abbildung 3) im Vergleich zu kontrollierten, nicht behandelten differenzierten Adipozyten. TNF-α reduziert die Insulin-induzierte Phosphorylierung von IR (30 %), IRS-1 (20 %) und AKT (45 %) (Abbildung 3). Insulinresistente Zellen zeigen im Vergleich zu insulinempfindlichen Zellen eine geringere Aktivierung des Insulin-Signalwegs. Darüber hinaus verringert die TNF-α-Behandlung die mRNA-Expression bekannter Insulinsensitivitätsmarker: Insr, Irs2, Glut4 und Adipoq (ergänzende Abbildung S4). Diese Ergebnisse bestätigen, dass TNF-α die Wirkung von Insulin in primären Adipozyten reduziert und dadurch eine Insulinresistenz induziert.
Abbildung 1: Schematische Zeitleiste, die den Prozess der Differenzierung von Adipozytenvorläuferzellen und die Induktion der Insulinresistenz darstellt. APCs werden aus subkutanem Fettgewebe mittels Kollagenase-Behandlung und Magnetzelltrennungstechnologie isoliert. Anschließend durchlaufen sie einen 7-tägigen Differenzierungsprozess, um primäre Adipozyten zu erhalten. Anschließend wird die Insulinresistenz mit TNF-α für 48 h induziert, die ersten 24 h in einem Medium, das 2% FBS enthält, und die nächsten 24 h mit serumfreiem Medium, um die Aktivierung des Insulinsignalwegs zu verhindern. Die Signalkaskade wird mit Insulin aktiviert und 10 Tage nach Beginn des Differenzierungsprozesses wird das Protein für die Western-Blot-Analyse extrahiert, um die Phosphorylierung/Aktivierung von IR, IRS-1 und AKT zu bewerten. Abkürzungen: APCs = Adipozyten-Vorläuferzellen; BMP4 = Knochenmorphogenetisches Protein; IBMX = 3-Isobutyl-1-methylxanthin; TNF-α = Tumornekrosefaktor-α; FBS = fötales Kälberserum; IR = Insulinrezeptor; IRS = Insulinrezeptorsubstrat; AKT = Proteinkinase B; Tx = Behandlung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Morphologie von Adipozyten-Vorläuferzellen und reifen Adipozyten . (A) Subkutane APCs bei 80%iger Konfluenz vor der Induktion der Differenzierung in 12-Well-Kulturplatten. (B) Subkutane primäre Adipozyten nach 7 Tagen Differenzierungsinduktion in 12-Well-Kulturplatten. Die Bilder wurden mit 10-facher Vergrößerung aufgenommen. Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzung: APCs = Adipozyten-Vorläuferzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Durch TNF-α induzierte Insulinresistenz in subkutanen primären Adipozyten, nachgewiesen durch eine verminderte insulininduzierte Phosphorylierung von IR, IRS-1 und AKT. Subkutane Adipozyten wurden 48 h lang mit TNF-α (4 ng/ml) behandelt und in den letzten 24 h mit Serummangel behandelt. Nach der Stimulation mit Insulin (100 nM) für 15 min wurden 40 μg Gesamtprotein auf 7,5%ige Gele geladen und SDS-PAGE unterzogen, auf Nitrozellulosemembranen überführt und in 4%iger fettfreier Milch in TBS-T 0,1% blockiert. Die Membran wurde mit anti-phosphoryliertem IR (pIR), anti-phosphoryliertem IRS-1 (pIRS-1) und anti-phosphoryliertem AKT (pAKT) sowie mit einem Anti-Kaninchen-HRP-Sekundärantikörper untersucht. Das Signal wurde mit Chemilumineszenz-Detektion visualisiert und Anti-β Tubulin als Beladungskontrolle verwendet. (A) Repräsentative Blots und (B) Quantifizierung aus drei unabhängigen Experimenten. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM; *, p < .05 im Vergleich zur Kontrolle. Abkürzungen: TNF-α = Tumornekrosefaktor-α; IR = Insulinrezeptor; IRS = Insulinrezeptorsubstrat; pX = phosphorylierte Form von X; b-Tub = Beta-Tubulin; HRP = Meerrettichperoxidase; Strg = Steuerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Anti-Fc-Lösung | gereinigtes Ratten-Anti-Maus-CD16 / CD32, verdünnt in PBS–2% FBS [1:150] | |||
| TBS-T 0,1% | 0,01 M Tris-HCl (pH 8), 0,15 M NaCl, 0,1 % Tween 20 | |||
| Blockierende Lösung | 4% fettfreie Trockenmilch verdünnt in TBS-T 0,1% | |||
| Nährmedium | 60% DMEM Low Glucose, 40% MCDB 201 medium, 1x Penicillin-Streptomycin, 1 nM Dexamethason, 0,1 mM L-Ascorbinsäure 2-phosphat, 1x Insulin, Transferrin, Natrium, Selenit (ITS) flüssiges Medium Supplement, 1x Linolsäurealbumin aus BSA, 10% FBS, 10 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), 10 ng/ml leukämiehemmender Faktor (LIF), 10 ng/ml Thrombozyten-Wachstumsfaktor BB (PDGF-BB), 5 ng/ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor-basisch (bFGF) und 50 μg/ml Normocin | |||
| Differenzierungsmedium | 60% DMEM low glucose, 40% MCDB 201 medium, 1x Penicillin-Streptomycin, 1 nM Dexamethason, 0,1 mM L-Ascorbinsäure-2-phosphat, 1x ITS-Flüssigmedien-Supplement, 1x Linolsäurealbumin aus BSA und 2% FBS | |||
| Differenzierungs-Cocktail | 0,5 μM 3-Isobutyl-1-methylxanthin [IBMX], 1 μM Dexamethason, 10 μM Rosiglitazon und 100 nM Insulin | |||
| Einfaches mittel-2% FBS | 60 % DMEM niedriger Blutzucker, 40 % MCDB 201 medium, 1x Penicillin-Streptomycin und 2 % FBS | |||
| Einfaches Mittel – 0 % FBS | 60% DMEM low glucose, 40% MCDB 201 medium, 1x Penicillin-Streptomycin | |||
| RIPA-Puffer | 50 mM Tris-HCl, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1 % Octylphenoxypoly(ethylenoxy)ethanol, 1 mMNa3VO4, 48,8 mM NaF, 8,2 mMNa4P2O7und 0,26 M Saccharose | |||
| 6x Laemmli-Puffer | 1,2 g SDS, 6 mg Bromphenolblau, 4,7 ml Glycerin, 1,2 ml Trisbase 0,5 M pH 6,8, 845 μl 2-Mercaptoethanol und 2,1 mlH2O | |||
| Laufender Puffer | 25 mM Tris-Base, 192 mM Glycin, 1 % SDS | |||
| Transfer-Puffer | 25 mM Tris-Base, 192 mM Glycin, 20% Methanol | |||
Tabelle 1: Lösungen, die in diesem Protokoll verwendet werden.
Ergänzende Abbildung S1: Subkutanes Fettgewebe, das mit Kollagenase verdaut wurde. Sobald das Fettgewebe entfernt ist, wird es mit einer Schere in kleine Stücke geschnitten, um den Verdauungsprozess zu starten (A), dann wird es 30 Minuten lang mit Kollagenase Typ 1 bei 37 °C, 150 U/min (B) inkubiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S2: Schema des Isolationsprozesses von Adipozyten-Vorläuferzellen. Präparieren Sie das inguinale subkutane Fettgewebe und verdauen Sie die Proben mit Kollagenase. Beseitigen Sie reife Adipozyten durch Zentrifugation und waschen Sie das Pellet, um überschüssiges Fett zu entfernen. Lyseieren Sie die roten Blutkörperchen und blockieren Sie, um die unspezifische Bindung zu reduzieren. Markieren Sie die Endothelzellen und Makrophagen mit Antikörpern, die an magnetische Partikel gekoppelt sind. Führen Sie die magnetische Trennung von Zellen mit der negativen Trennstrategie mit einem magnetischen Zellseparator durch. Seed APCs (unmarkierte Zellen) in Platten, die mit einer Basalmembranmatrix bedeckt sind. Wechseln Sie das Medium alle 48 Stunden, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben. Abkürzungen: APCs = Adipozyten-Vorläuferzellen; BSA = Rinderserumalbumin; FBS = fötales Kälberserum. Erstellt mit Biorender.com. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S3: Die Behandlung mit TNF-α zur Induktion einer Insulinresistenz verändert die Lebensfähigkeit der Adipozyten nicht. Die Viabilität reifer Adipozyten wurde mit dem MTT-Assay nach Behandlung mit 4 ng/ml TNF-α für 48 h gemessen. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. Abkürzungen: TNF-α = Tumornekrosefaktor-α; Strg = Steuerung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S4: Die TNF-α-Behandlung in Adipozyten verringert die Expression von Insulinsensitivitätsmarkern. Die mRNA-Expression von Insr, Irs, Glut4 und Adipoq wurde mittels real-time PCR nach Behandlung mit 4 ng/ml TNF-α für 48 h gemessen. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM; *, p < .05 im Vergleich zur Kontrolle. Abkürzungen: TNF-α = Tumornekrosefaktor-α; Strg = Steuerung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
In dieser Arbeit wird eine Methode zur Untersuchung der Insulinresistenz vorgestellt, bei der primäre Adipozyten in Kulturen verwendet werden, die mit TNF-α behandelt wurden. Dieses Modell hat den Vorteil, dass primäre Adipozyten unter definierten Bedingungen über lange Zeiträume mit einer strengen Kontrolle zellulärer Umweltfaktoren kultiviert werden können26. Die Testdauer beträgt 15-20 Tage, obwohl es zwischen den Experimenten zu Abweichungen im Prozentsatz der differenzierten Adipozyten kommen kann. Primäre Adipozyten haben gegenüber Zelllinien Vorteile, da sie in Kultur nicht kontinuierlich vermehrt wurden und die Vielfalt des Gewebes, aus dem sie gewonnen werden, besser erfassen27. Darüber hinaus ermöglichen primäre Adipozyten die Untersuchung von Spendern in verschiedenen physiopathologischen Kontexten, wie z.B. mager versus fettleibig, männlich versus weiblich, jung versus alt und Zellen aus verschiedenen Fettdepots. Ein weiterer Vorteil dieser Methode besteht darin, dass nach der Isolierung von APCs Zelllinien aus CRE- und Knockout-Mäusen erzeugt werden können.
Ein mögliches Problem bei der Isolierung und Differenzierung von APCs besteht darin, dass diese Zellen die Fähigkeit zur Differenzierung verlieren können, was wahrscheinlich der Fall wäre, wenn zu Beginn des Differenzierungsprozesses eine Konfluenz von 80 % überschritten wird. Das Medium sollte auch sehr schonend gewechselt werden, insbesondere nach einer Lipidakkumulation, da sich differenzierte Adipozyten leicht von der Kulturschale lösen. Darüber hinaus muss jede Kollagenase-Charge auf Verdauungseffizienz, Zellausbeute und Zytotoxizität getestet werden26. Es wurden Techniken entwickelt, um APCs aus der stromovaskulären Fraktion des weißen Fettgewebes zu identifizieren und zu isolieren, wobei negative Marker wie CD31 und CD45 sowie positive Stammzellpopulationsmarker wie CD34 und Sca1 verwendet werden28,29. In diesem Protokoll führen wir nur eine negative Trennung durch, bei der Endothelzellen und Makrophagen aus der stromovaskulären Fraktion eliminiert werden, wodurch der Verlust von Präadipozyten bei der positiven Trennung vermieden wird.
Obwohl Primärkulturen die Untersuchung der Variabilität und Komplexität von Spendern ermöglichen27,30, bringt das Festlegen des experimentellen Modells Einschränkungen mit sich. So weisen beispielsweise Adipozyten, die aus alten Tieren isoliert wurden, eine geringere Differenzierungsfähigkeit und eine höhere Lipotoxizitätsrate auf als solche von Jungtieren31,32. Das Protokoll könnte auch angepasst werden, um verschiedene Zelltrennungstechniken zu verwenden. Wenn kein automatischer Magnetzellenseparator zur Verfügung steht, kann eine manuelle Vereinzelung der Zellen mit Säulen oder FACS-Sortierung erreicht werden. Die hier beschriebene Methode zur Isolierung von APCs unter Verwendung eines magnetischen Zellseparators ist eine angepasste und vereinfachte Version des FACS-Sortierprotokolls, das von Macotela et al.28 beschrieben wurde.
Mehrere inflammatorische Zytokine wurden verwendet, um eine Insulinresistenz in Fettzellen zu induzieren, darunter TNF-α, IL-1β und IL-6 18,33,34,35,36. Kultivierte 3T3-L1-Adipozyten, die TNF-α ausgesetzt sind, werden innerhalb weniger Tage insulinresistent, was sich an der verminderten Fähigkeit des Insulins zur Stimulierung der Glukoseaufnahme zeigt37. Diese Ergebnisse zeigen, dass TNF-α die Insulin-induzierte Phosphorylierung von IR, IRS-1 und AKT21,23 verringert, gemessen durch die Western-Blot-Detektion des Gesamtproteins, das aus primären Adipozyten extrahiert wurde. Proteasen und Phosphatasen, die während der Zelllyse freigesetzt werden, könnten jedoch die Western-Blot-Detektion beeinflussen. Der aktive Zustand der Proteine sollte durch Zugabe von Protease- und Phosphataseinhibitoren zum Lysepuffer und nach der Proteinquantifizierung durch Mischen der Probe mit Laemmli-Puffer erhalten werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode ein nützliches Werkzeug darstellt, um die Mechanismen zu untersuchen, die die Insulinresistenz in Adipozyten vermitteln, die sich von Maus-APCs unterscheiden.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla und María Antonieta Carbajo für ihre technische Unterstützung und Jessica Gonzalez Norris für die kritische Bearbeitung des Manuskripts. Dieses Protokoll wurde vom Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), dem Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (an Y.M.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Isolation mouse adipocyte precursor cells | |||
| ACK lysing buffer | LONZA | 10-548E | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi | 130-090-485 | |
| Anti-CD31 | eBioscience | 13-0311-85 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | ||
| Basement membrane matrix (matrigel) | Corning | 354234 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | Growth factor |
| BSA | Equitech-Bio, Inc. | BAC63-1000 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin | eBioscience | 13-0451-85 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochem | LS004197 | |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | |
| DMEM | GIBCO | 12800017 | |
| DMEM low glucose | GIBCO | 31600-034 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Growth factor |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| ITS mix | Sigma | I3146 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Growth factor |
| Linoleic acid-albumin | Sigma | L9530 | |
| MCDB 201 medium | Sigma | M6770 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 315-18 | Growth factor |
| Peniciline-Streptomycine | BioWest | L0022-100 | |
| Pre-Separation Filters (70 µm) | Miltenyi | 130-095-823 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO | 25300062 | |
| 2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction | |||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX] | Sigma | I5879 | Differentiation cocktail |
| BMP4 | R&D Systems | 5020-BP-010 | Differentiation cocktail |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Differentiation cocktail |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Rosiglitazone | Cayman | 71742 | Differentiation cocktail |
| TNFα | R&D Systems | 210-TA-005 | |
| 3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot | |||
| Anti-beta tubulin antibody | Abcam | ab6046 | |
| Bromophenol blue | BioRad | 161-0404 | Laemmli buffer |
| EDTA | Sigma | E5134 | RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E4378 | RIPA buffer |
| FluorChem E system | ProteinSimple | ||
| Glycerol | Sigma | G6279 | Laemmli buffer |
| Glycine | Sigma | G7126 | Running and Transfer buffer |
| Igepal | Sigma | I3021 | RIPA buffer |
| 2- mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Laemmli buffer |
| Methanol | JT Baker | 907007 | Transfer buffer |
| NaCl | JT Baker | 3624-05 | TBS-T |
| NaF | Sigma | 77F-0379 | RIPA buffer |
| NaOH | JT Baker | 3722-19 | |
| Na4P2O7 | Sigma | 114F-0762 | RIPA buffer |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | RIPA buffer |
| Nitrocellulose membrane | BioRad | 1620112 | |
| Nonfat dry milk | BioRad | 1706404 | Blocking solution |
| Prestained protein standard | BioRad | 1610395 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-5ML | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-132 | |
| Phospho- Insulin Receptor β | Cell signaling | 3024 | |
| Phospho-Akt (Ser473) Antibody | Cell signaling | 9271 | |
| Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody | Millipore | 9432 | |
| Saccharose | JT Baker | 407205 | RIPA buffer |
| SDS | BioRad | 1610302 | Running and laemmli buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| Tris-base | Promega | H5135 | Running, transfer and laemmli buffer |
| Tris-HCl | JT Baker | 4103-02 | RIPA buffer - TBS |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | TBS-T |
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