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Neuroscience

Abstammungsverfolgung von induzierbaren fluoreszenzmarkierten Stammzellen im erwachsenen Mäusegehirn

Published: May 20, 2022 doi: 10.3791/63998
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 1,2
1Graduate School of Biomedical Science and Engineering, University of Maine, 2Department of Neurosurgery, Ohio State University Wexner Medical Center, 3Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School

Summary

Die Fähigkeit, Stammzellen und ihre Nachkommen mit einem Fluorophor unter Verwendung einer induzierbaren transgenen Linienverfolgungs-Mauslinie dauerhaft zu markieren, ermöglicht eine räumliche und zeitliche Analyse von Aktivierung, Proliferation, Migration und / oder Differenzierung in vivo. Die Abstammungsverfolgung kann neue Informationen über die Verpflichtung der Abstammung, die Reaktion auf Interventionen und die Multipotenz aufdecken.

Abstract

Eine Telomerase-Reverse-Transkriptase (Tert) -Linie zur Verfolgung der Maus wurde entwickelt, um das Verhalten und Schicksal von adulten Gewebestammzellen zu untersuchen, indem das "Tet-On" -System der Tet-Cre-Maus mit einem neuartigen Reverse-Tetracyclin-Transaktivator-Transgen (rtTA) gekreuzt wurde, das mit dem Tert-Promotor verbunden ist, von dem wir gezeigt haben, dass es eine neuartige Population von adulten Hirnstammzellen markiert. Hier markiert die Verabreichung des Tetracyclinderivats Doxycyclin an mTert-rtTA::oTet-Cre-Mäuse unauslöschlich eine Population von Zellen, die ein 4,4 kb Fragment der Promotorregion des Gens Tert exprimieren. In Kombination mit dem Rosa-mTmG-Reporter exprimieren mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-Mäuse die Membran tdTomato (mTomato), bis die Doxycyclin-Behandlung den Ersatz der mTomato-Expression durch Membran-EGFP (mGFP) in Zellen induziert, die auch Tert exprimieren. Wenn diese dreifach transgenen Linienverfolgungsmäuse Doxycyclin erhalten (die "Pulsperiode", in der TERT-exprimierende Zellen markiert werden), werden diese Zellen zu unauslöschlich markierten mGFP + -Zellen, die nach der Doxycyclinentfernung (der "Chase" -Periode) für jede wünschenswerte Zeit verfolgt werden können, selbst wenn die Tert-Expression anschließend verloren geht. Gehirne werden dann perfusionsfixiert und für Immunfluoreszenz und andere nachgelagerte Anwendungen verarbeitet, um Veränderungen der Stammzellaktivierung, Proliferation, Abstammungsbindung, Migration zu verschiedenen Gehirnnischen und Differenzierung zu reifen Zelltypen zu interpretieren. Mit diesem System kann jede rtTA-Maus mit oTet-Cre und einem Rosa-Reporter verbunden werden, um Doxycyclin-induzierbare "Pulse-Chase" -Lineage-Tracing-Experimente mit Markern von Stammzellen durchzuführen.

Introduction

Wert einer Linie mit der Ablaufverfolgung der Mauslinie
Die Analyse von Stammzellen in vivo kann schwierig sein, da sich viele Assays, die solche Zellen untersuchen, nur auf die Charakterisierung dieser Zellen zum Zeitpunkt des Todes des Tieres konzentrieren, was eine terminale Momentaufnahme in der Zeit darstellt. Um die Prozesse der Proliferation, Differenzierung und Migration von Vorläufer-, Zwischen- / Übergangszelltypen und reifen Zellen im Laufe der Zeit besser zu verstehen, ist ein Längsschnittanalyseansatz erforderlich. Dies kann mit Lineage-Tracing-Studien erreicht werden, bei denen Stamm-/Vorläuferzellen unauslöschlich markiert werden und danach beliebig lange verfolgt werdenkönnen 1.

Im erwachsenen Säugetiergehirn wurde der Prozess der Neurogenese, bei dem erwachsene Neuronen aus Stamm- und Vorläuferzellen gebildet werden, zunächst mittels Markierungsretention mit Thymidin-H3 2,3,4 oder 5-Brom-2'-desoxyuridin (BrdU) 5,6,7,8 analysiert. . In diesen Studien wurden proliferative Zellen mit dem Thyminanalogon markiert, das während der Replikation und Zellteilung / -proliferation in die DNA der Zellen eingebaut wurde. Die markierte Zelle sowie ihre Nachkommen enthielten daher dieses Analogon, das dann post mortem identifiziert wurde. WährendThymidin-H3 und BrdU jedoch die Markierung von proliferativen Zellen und ihren Nachkommen in Gehirnregionen ermöglichten, in denen Stammzellen kaum verstanden wurden, wurden diese Studien durch die Nachteile dieser Werkzeuge behindert. Thymidin-H3 induziert Zellzyklus-Stillstand, Apoptose und dosisabhängige DNA-Synthesehemmung9, während BrdU Zellen in Abhängigkeit vom Verabreichungsweg10 auf unterschiedlichen Ebenen markiert und von Zellen während der Reparatur oder Apoptose sowie während der Zellteilung11 aufgenommen wird. In letzter Zeit wurden effizientere Markierungsmethoden verwendet, wie z.B. die Markierung mit 5-Ethynyl-2'-desoxyuridin (EdU), aber viele der gleichen Probleme wie BrdU bleibenimmer noch 12. Diese Ansätze sind auch insofern einschränkend, als sie jede proliferative Zelle markieren, nicht nur Stammzellen, und somit die Interpretation der Ergebnisse durcheinander gebracht werden kann. In der neurogenen Linie behalten alle Stamm- und Vorläuferzellen die mitotische Kapazität, und nur terminale / reife Neuronen sind nicht proliferativ. Für Astrozyten und Mikroglia, aber nicht für Oligodendrozyten, wird die Proliferation auf unbestimmte Zeitaufrechterhalten 13,14,15.

Transgene Mäuse, die verwendet werden, um nur Zellen zu verfolgen, die ein Protein von Interesse ausdrücken, wie z.B. eines, das bestätigt wurde, adulte Stammzellen zu identifizieren, wie wir es hier verwenden, sind daher bei der Untersuchung von Stammzellen und ihren Nachkommen häufiger geworden. Obwohl es schwierig ist, sie durch transgene Ansätze der Maus zu erzeugen, ermöglichen Abstammungsverfolgungs-Mauslinien die Verfolgung von spezifisch markierten Zellen im Gehirn und verlassen sich nicht nur auf die Proliferation. Im transgenen Tet-On-Maussystem induziert die Verabreichung von Tetracyclin oder Doxycyclin (ein Tetracyclinderivat) die Cre-Rekombinase-Expression in Zellen, die mit einem Reverse-Tetracyclin-Transaktivator (rtTA) hergestellt wurden, der von einem Promotor von Interesse transkribiert wird. Die Tet-induzierbare Cre-gesteuerte Rekombination aktiviert dann die Expression eines unauslöschlichen fluoreszierenden oder lumineszierenden Proteins in den interessierenden Zellen, abhängig von der verwendeten Rosa-Reporter-Maus. Diese unauslöschlich markierten Zellen exprimieren diesen Reporter weiterhin nach der Teilung, Differenzierung oder Migration, was die Verfolgung dieser Zellen und ihrer Nachkommen im Laufe der Zeit oder nach verschiedenen Interventionenermöglicht 16. Zu den Vorteilen transgener Lineage-Tracing-Ansätze gehören: 1) Spezifität der Rückverfolgung zu einer bestimmten Zelllinie oder Vorläufer-/Stammzelle, die durch die rtTA markiert ist, 2) unauslöschliche Expression des fluoreszierenden oder lumineszierenden Proteins trotz Zellumsatz oder Differenzierung, 3) geringe Toxizität, 4) bedingte Aktivierung zu jedem Zeitpunkt im Lebenszyklus des Tieres und 5) Benutzerfreundlichkeit mit gängigen Assays, einschließlich Immunfärbung/Immunfluoreszenz16.

Andere Methoden von zeitlich induzierbaren Reporterwerkzeugen bei Mäusen umfassen die Verwendung von Cre-ERT2-Mäusen, die mit ROSA-GFP, ROSA-mTmG oder anderen fluoreszierenden Reportertransgenen gepaart werden können. Bei diesen Tieren treibt ein zellspezifisches regulatorisches Element, wie z.B. eine interessierende Promotor- oder Enhancerregion, die Produktion der Cre-Rekombinase an, die nur über die Gabe von Tamoxifen aktiviert werden kann. Während Cre-ERT2-Mauslinien die Induktion von Cre in bestimmten Zelllinien ermöglichen, gibt es eine Fülle von Kenntnissen über die Auswirkungen von Tamoxifen auf die adulte Neurogenese17,18. Darüber hinaus gibt es viele ROSA-gesteuerte fluoreszierende Reportergene, die anstelle von GFP oder mTmG verwendet werden können, einschließlich YFP oder CFP, was eine alternative Fluoreszenzmarkierung in anderen fluoreszierenden Wellenlängen ermöglichen würde. Diese fluoreszierenden Reportergene können mit Tet-On- oder Cre-ERT2-Systemen verwendet werden.

Telomerase-Reverse-Transkriptase (TERT) ist die geschwindigkeitsbegrenzende Komponente des Holoenzyms Telomerase, das die Telomere verlängert, nachdem sie während der Zellteilungverkürzt wurden 19,20. TERT wurde als Marker für adulte Gewebestammzellen im Darm 21,22, im Knochenmark 21, in der Leber 23, im Fett 24, im Endometrium 25,26 und im Knochen 1 identifiziert. Ob die TER-Expression in diesen adulten Stammzellen ausschließlich der Telomerase-verlängernden Aktivität oder der Durchführung nicht-kanonischer TER-Rollen27 dient, ist noch nicht bekannt. TERT-exprimierende ruhende adulte Stammzellen (qASCs) wurden identifiziert und im ganzen Körper mit transgenen Linien-Tracing-Mäusen verfolgt, um die Multipotenz und Selbsterneuerungsfähigkeit dieser Stammzellen sowie ihr Potenzial zur Aktivierung, Vermehrung, Differenzierung und Migration von 1,22,23,28 zu untersuchen. Die Erzeugung des Tert-rtTA-Transgens wurde zuvordurchgeführt 1. In diesem Artikel werden wir die Verwendung einer PERT-Mauslinie beschreiben, die eine Linie verfolgt, um TERT + qASCs zu untersuchen, die wir als neuartige ASC-Population im erwachsenen Mäusegehirn identifiziert haben.

Generierung einer transgenen Linie Tracing Mauslinie
Um mit dem Tet-On-System eine Linie der Maus zu erzeugen, müssen drei Transgene durch Mauspaarung in einem einzigen Tier kombiniert werden. Die erste ist eine rtTA, die unter der Kontrolle des Promotors des interessierenden Gens (unseres ist TERT-rtTA) exprimiert wird. In einer Zelle, die dieses Gen von Interesse exprimiert, wird daher die rtTA exprimiert. Das zweite ist ein oTet-Cre-Gen, das ein Tetracyclin-Antwortelement (TRE) enthält, das die Transkription der Cre-Rekombinase in Gegenwart eines rtTA-Fusionstranskripts und Tetracyclin oder Doxycyclin ermöglicht. Tetracyclin oder Doxycyclin kann einem Tier über Trinkwasser oder Chow29 verabreicht werden. Schließlich muss es ein Gen geben, das durch die Cre-Rekombinase-Spaltung aktiviert wird. In diesem Manuskript ist das Markierungsgen, das wir beschreiben werden, das Rosa26-mTmG-Gen, das bis zur Cre-Rekombination die mTomate (rote Membranfluoreszenz in allen Zellen) ubiquitär transkribiert. Wenn jedoch eine Zelle das rtTA-Transkript exprimiert und Tetracyclin oder Doxycyclin enthält, verändert die Cre-Rekombination einer Reihe von lox-P-Stellen zwischen den mTomato- und mGFP-Stellen die R26-Stelle und bewirkt, dass die Zelle Membran-EGFP (mGFP oder Membrangrünfluoreszenz) anstelle von Membrantomaten produziert. Die unauslöschliche Natur dieses mGFP-Signals wird eine In-vivo-Markierung und Rückverfolgung von Zellen ermöglichen, während sie sich vermehren, migrieren und differenzieren. Nach der Spur können Zellen auf die Expression von GFP über Immunfluoreszenz in Standard-Kryosektionen oder dickeren optisch gereinigten Gehirnen analysiert werden.

In diesem Artikel beschreiben wir die Verwendung der spezifischen Mauslinie mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Um diese dreifache transgene Mauslinie zu erstellen, haben wir zuerst oTet-Cre-Tiere (The Jackson Lab Stamm #006234) mit Rosa-mTmG-Tieren (The Jackson Lab Stamm #007676) gepaart, um oTet-Cre::Rosa-mTmG doppelte transgene Mäuse zu erzeugen. Diese Tiere wurden mit Primern und PCR-Schablonen genotypisiert, die in den ergänzenden Tabellen 1 und 2 angegeben sind. mTert-rtTA-Mäuse (erstellt von David Breault 1) wurden mit oTet-Cre::Rosa-mTmG-Tieren verpaart, um mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-Mäuse zu erzeugen (Abbildung 1A)1,30. Der Wirkmechanismus der mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-Mauslinie ist in Abbildung 1B dargestellt.

Doxycyclin-Induktions- und Puls-Chase-Design
Bei der Planung von Experimenten ist es wichtig, mehrere Faktoren zu berücksichtigen, die das Ergebnis von Linienverfolgungsexperimenten beeinflussen, einschließlich des Alters des Tieres bei der Doxycyclinduktion, der Länge der Doxycyclin-Verabreichung (der "Puls" -Periode), der Zeitspanne nach der Doxycyclinentfernung vor der Gewebeentnahme (die "Chase" -Periode) und dem Zeitpunkt von Eingriffen während dieser Prozesse. Diese Überlegungen zum Studiendesign sind für das Verständnis der markierten Zellen und ihrer Nachkommen am Ende des Experiments unerlässlich. Der erste Schritt in diesem Prozess besteht darin, das Alter des Interesses des Tieres und die Dauer der Doxycyclin-Verabreichung zu identifizieren. Längere Pulsperioden werden es ermöglichen, dass mehr Zellen den rtTA-verknüpften Promotor exprimieren und mehr Zellen von Interesse unauslöschlich markiert werden. Ein Zelltyp, der eine vorübergehende Expression des interessierenden Gens aufweist, kann eine längere Pulsperiode erfordern als Zellen, die das interessierende Gen kontinuierlich exprimieren. Wenn das Ziel der Studie jedoch darin besteht, kurzfristige Auswirkungen der interessierenden Zelle oder einer akuten Intervention zu verstehen, kann die Pulsperiode nicht zu lang sein, da eine Zelle, sobald sie markiert ist, durch eine beliebige Anzahl von Veränderungen während des Rests der Pulsperiode verfolgt wird. In einigen unserer Studien wurde ein 2-tägiger Puls ohne Verfolgungszeit verwendet, um einen Direktreporter für TERT genauer nachzuahmen. Dies liegt daran, dass die Mindestdauer für die Rekombination des Rosa-mTmG-Gens 2 Tage31 beträgt.

Die nächste wesentliche Periode in einem Puls-Chase-Experiment ist die Länge zwischen der Entfernung von Doxycyclin und der Perfusion des Tieres, auch bekannt als "Chase". Die Halbwertszeit von Doxycyclin in Mäusen beträgt unabhängig vom Verabreichungsweg etwa 170 Minuten, was den Schluss zulässt, dass die Doxycyclinduktion wahrscheinlich mehrere Stunden nach der Entfernung nicht mehr auftritt32. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass der Doxycyclinstoffwechsel bei gealterten Mäusen langsamer ist, was zu längeren effektiven "Pulsperioden" führen kann als bei Jungtieren33.

Während der Verfolgungszeit werden markierte Zellen weiterhin markiert, auch nach Proliferation, Differenzierung oder Migration. Die Nachkommen dieser Zellen werden ebenfalls markiert. Das Ziel der Studie wird die Länge des Puls-Chase-Paradigmas prägen. Wenn das Ziel der Studie darin besteht, die Regeneration eines Gewebes über einen langen Zeitraum mit den interessierenden Zellen zu verstehen, kann eine lange Verfolgungszeit erforderlich sein. Schließlich muss der Zeitpunkt etwaiger Eingriffe oder Behandlungen festgelegt werden. Die Verabreichung während der Pulsperiode wirkt sich auf die Zellen aus, die das Gen von Interesse ausdrücken, sowie auf alle Nachkommen, die während dieser Zeit erzeugt werden, während die Verabreichung während der Chase-Periode hauptsächlich Nachkommen der interessierenden Zellen betreffen kann, obwohl dies davon abhängt, wie schnell sich die markierten Zellen teilen oder differenzieren. Beispiele für experimentelle Pulse-Chase-Designs, die wir verwendet haben, sind in Abbildung 2A dargestellt.

Es ist auch wichtig, sich der Möglichkeit eines Hintergrund-GFP-Signals aufgrund eines undichten Ausdrucks bewusst zu sein. Die undichte Expression tritt als Folge des inhärenten Bindungspotentials zwischen rtTA und den Otet-Sequenzen in Abwesenheit von Doxycyclin und der Restaktivität des Otet-Transgens in Abwesenheit von rtTA auf (überprüft in34). Die undichte Expression stellt eine Schwäche der Tet-Systeme dar, und obwohl das Leck oft ein akzeptabler Nachteil für das System ist, können Situationen, in denen die undichte Expression zu Toxizität und Mortalität führen kann, wie z. B. bei Diphtherietoxin (DTA) bei Otet-DTA-Tieren, die Verwendung dieser Systemeeinschränken 35.

Gehirnverarbeitung, Schnitt und Immunfluoreszenz von Dünnschnitten für die Mikroskopie
Um die Gehirne von Mäusen nach einem Linienverfolgungsexperiment zu analysieren, müssen Mäuse zuerst durch transkardiale Perfusion durchblutet werden, um Blut und Liquor zu entfernen, die zu einer hohen Autofluoreszenz im Gehirn führen können. Es gibt zwei häufig verwendete Fixiermittel, mit denen das Tier durchblutet werden kann: Histochoice Tissue Fixative, ein Glyoxalfixiermittel (GF), oder 4% Paraformaldehyd (PFA). Glyoxale Fixiermittel ermöglichen einen relativ schonenden Fixationsprozess mit weniger Vernetzung als PFA. Dies reduziert die Gewebesteifigkeit, reduziert den Bedarf an Antigenrückgewinnung und ermöglicht weniger konzentrierte Antikörperlösungen während der Immunfärbung. Wenn sie jedoch Methanol enthalten, kann dies dazu dienen, die Autofluoreszenzzu erhöhen 36. Auf der anderen Seite ermöglicht PFA oft eine robustere Fixierung, und während während die Antigengewinnung während der Immunfärbung erforderlich ist, gibt es Antikörper, die nur mit PFA-fixiertem Gewebe arbeiten, und eine Perfusion mit 4% PFA ist für die später beschriebene optische Clearingtechnik erforderlich.

Nach der Perfusion folgt ein Post-Fixationsschritt, bei dem das Gehirn über Nacht in die gleiche Art von Fixiermittel eingetaucht wird, das während der Perfusion verwendet wird. Dies ermöglicht es allen Gehirnregionen, die während der Perfusion möglicherweise nicht vollständig fixiert wurden, sich weiter zu fixieren. Als nächstes wird das Gehirn in Saccharose in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) inkubiert, um vor dem Gefrierschritt so viel Wasser wie möglich zu entfernen, um Eisbildung im Gewebe zu verhindern ("Kryokonservierung"). Gehirne können dann zur Verarbeitung in eine beliebige Anzahl von sagittalen, koronalen oder transversalen Gewebeabschnitten geschnitten werden. Sowohl für die Präzision als auch für die Reproduzierbarkeit müssen kalibrierte Gehirnblöcke so verwendet werden, dass konsistente Bregma-Schnitte zwischen Tieren gewährleistet sind. Der wichtigste Faktor, der beeinflussen kann, wie Gehirne geschnitten werden, sind die interessierenden Gehirnregionen. Zum Beispiel, während ein sagittaler Schnitt es ermöglichen kann, mehr Gehirnregionen in einem Gewebeabschnitt zu analysieren, wird dieser Schnitt keine Analyse von neuro- / gliogenen Regionen der ventrikulär-subventrikulären Zone (V-SVZ) ermöglichen, da die lateralen und medialen Seiten des lateralen Ventrikels in dieser Dimension unmöglich zu erkennen sind und besser in der koronalen Ebene beobachtet werden. Dies kann eine wichtige Unterscheidung in Studien zur adulten Neurogenese sein, da die laterale Seite des lateralen Ventrikels das neurogene V-SVZ enthält, während die mediale Wand des lateralen Ventrikels eine eher gliogene Nische37 ist.

Nachdem das Gewebe in koronale, sagittale oder transversale Abschnitte unterteilt wurde, werden sie mit der Einbettungslösung Optimal Cooling Temperature (OCT) in Blöcke eingefroren. Hier werden Gehirne in diesem Einbettungsmaterial eingefroren, wobei eine Mischung aus Trockeneis und Ethanol verwendet wird. Wenn eine Dünnschnittanalyse erforderlich ist, werden Blöcke auf einem Kryostaten geschnitten und können je nach nachgeschalteter Analyse als Dünnschnitte (<20 μm) an positiv geladene Glasobjektträger haften. Glasobjektträger, die nicht aufgeladen sind, können ebenfalls verwendet werden, aber die Verwendung von ungeladenen Objektträgern kann dazu führen, dass sich Gewebe von den Objektträgernlösen 38. Wenn freischwebende Gewebeschnitte mittlerer Dicke (>20 μm) erforderlich sind, werden Gewebe als frei schwebende Abschnitte gesammelt. Wenn dicke Abschnitte (0,5-4 mm) erforderlich sind, ist das Schneiden von nicht gefrorenen Hirnschnitten mit einem Vibratom erforderlich. Es ist wichtig, die Speicherunterschiede zwischen Abschnitten auf Dias, die bei -20 bis -80 ° C eingefroren werden müssen, und frei schwebenden Abschnitten, die bei 4 ° C gelagert werden, zu beachten.

Gehirn-Clearing und Whole-Mount-Immunfluoreszenz-konfokalmikroskopie
Wenn eine breitere, aber weniger detaillierte Analyse der nach der Abstammung verfolgten Zellen im Gehirn der Maus gewünscht wird, ist eine umfassende Analyse dickerer Segmente des Hirngewebes mit iDISCO brain clearing39 möglich, gefolgt von Immunfärbung und gekachelter konfokaler Z-Stack-Mikroskopie oder Lichtblattmikroskopie. Hier werden große Teile des Mäusegehirns optisch gereinigt (ein Prozess der Delipidierung39), was eine fluoreszierende Signalabbildung über einen 1-mm-Gewebeschnitt besser ermöglicht. Die Nachteile dieses Prozesses sind eine hohe Autofluoreszenz und eine verminderte Fähigkeit, hochauflösende Bilder der Zellmorphologie und detaillierte Co-Färbeanalysen zu erhalten, aufgrund der erhöhten Arbeitsabstände, die im Vergleich zu traditionelleren Methoden (dünne Kryosektionen oder frei schwebende Abschnitte) erforderlich sind. Aus diesem Grund empfehlen wir die Gehirnreinigung, um die groß angelegten Ergebnisse der Linienverfolgung in mehreren Gehirnbereichen zu analysieren, anstatt zu versuchen, einzelne Zellen zu charakterisieren oder zu analysieren.

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Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Ohio State University genehmigt.

1. Erstellung einer Linienverfolgung der Tet-On-Mauslinie, Zuchtstrategien und Genotypisierung für experimentelle Kohortenmäuse

HINWEIS: Hier beschreiben wir die Erstellung eines Tet-On-Maussystems mit Rosa-mTmG als fluoreszierendem Reportergen, das einer Cre-Rekombination unterzogen wird, aber auch verschiedene andere Cre-Rekombinations-gesteuerte Reporterlinien können mit dem Tet-On-System verwendet werden.

  1. Richten Sie einen Paarungskäfig aus einem oTet-Cre (+/-) Männchen mit einem oder mehreren R26 (mTmG) (+/+) Weibchen ein. Eine Übersicht über den experimentellen Mauspaarungsaufbau finden Sie in Abbildung 1.
  2. Resultierende Welpen (F1) sind oTet-Cre (+/-) oder oTet-Cre (-/-) und R26 (mTmG) (+/-). Führen Sie eine Genotypisierung gemäß den Grundierungen in der Ergänzenden Tabelle 1 und den Protokollen in der Ergänzenden Tabelle 2 durch.
  3. Führen Sie beim Absetzen Keimbahntests durch, indem Sie von jeder Entwöhnung einen Ohrschlag nehmen. Untersuchen Sie den Ohrlocher unter einem Epifluoreszenzmikroskop im GFP / FITC-Spektrum, um festzustellen, ob das Tier in der Entwicklung eine Keimbahnrekombination durchlaufen hat. Wenn ja, wird das Tier GFP in jeder Zelle exprimieren, und der Ohrschlag wird mit mGFP-Signal fluoreszieren. Diese Tiere können nicht für Paarungen oder Experimente verwendet werden.
    HINWEIS: Ohrclips von Mäusen, die keine Keimbahn sind, zeigen nur endogene Fluoreszenz unter dem Mikroskop (Abbildung 1C), während Keimbahntiere ein helles GFP-Signal zeigen (Abbildung 1D). Kontrollohren können von Mäusen stammen, die keine fluoreszierenden Transgene enthalten. Als Anmerkung: Ohrhaare haben eine hohe endogene Fluoreszenz und dürfen nicht als bestimmender Faktor verwendet werden (Abbildung 1C). Darüber hinaus werden Unterschiede in der endogenen Fluoreszenz zwischen Mäusen weißer vs. schwarzer Fellfarbe beobachtet, und Kontrollen von Mäusen mit der gleichen Fellfarbe wie Mäuse, die getestet werden, müssen in dieser Analyse verwendet werden.
  4. Verbinden Sie ein männliches oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/-) mit einer oder mehreren weiblichen oTet-Cre (-/-) x R26 (mTmG) Mäusen.
  5. Die resultierende Generation (F2) wird 1/4 R26 (mTmG) (+/+) und 1/2 Cre (+/-) sein. Kreuzen Sie diese Tiere mit mTert-rtTA (+/+) Tieren, indem Sie ein oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) mit einem oder mehreren mTert-rtTA (+/+) Tieren paaren.
    HINWEIS: Wir haben mTert-rtTA (+/+) Tiere verwendet, aber dieser Prozess kann mit jeder rtTA-Mauslinie30 durchgeführt werden.
  6. Richten Sie für Versuchstiere Zuchten ein, um mTert-rtTA (+/+) oder (+/-) x oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) oder (+/-) zu erzeugen.

2. Doxycyclin-Induktion von Cre und Pulse-Chase-Design

  1. Wenn die Tiere das richtige Alter für den Beginn der Studie erreicht haben, ersetzen Sie ihr Trinkwasser durch Doxwasser: Trinkwasser mit 5% Saccharose und 2 mg/ml Doxycyclinhyclat. Verwenden Sie Cre-negative Tiere, die die gleiche Doxycyclin-Pulsjagd wie Versuchstiere erhalten, als Kontrollgruppe für die resultierenden fluoreszierenden Expressionsmuster.
    1. Nach der Zubereitung Doxwasser bis zu 1 Monat bei 4 °C lagern. Weitere Informationen finden Sie in Tabelle 1. Dox-Wasser kann Tieren in Trinkflaschen bis zu 5 Tage lang verabreicht werden, bevor es ausgetauscht wird, da Pilzwachstum auftreten kann, wenn Doxwasser bei Raumtemperatur für längere Zeit ausgelassen wird.
      HINWEIS: Für die Induktion des mGFP-Signals ist bei Verwendung des mTmG-Transgens (erstes mTmG-Papier) ein Doxycyclin-Puls von mindestens 2 Tagen erforderlich.
      HINWEIS: Wir haben keine anderen Doxycyclin-Konzentrationen als 2 mg / ml getestet. Frühere Literatur hat gezeigt, dass diese Konzentration die höchsten Auswirkungen hat, wenn sie durch Trinkwasser verabreichtwird 29. Die Menge an abgegebenem Doxycyclin kann je nach der Menge des Trinkens jedes Tieres variieren. Doxycyclin-Injektion oder -Gavage kann auch durchgeführt werden, um zwischen Tieren40 konsistent zu sein.
  2. Nachdem die Pulsperiode beendet ist, entfernen Sie Dox-Wasser aus den Käfigen und ersetzen Sie es durch normales Trinkwasser. Die Tiere werden nun bis zum Tod in der "Jagdphase" sein.

3. Transkardiale Perfusion und Hirndissektion

  1. Entfernen Sie eine Maus aus ihrem Käfig und halten Sie das Tier mit dem linken Daumen und Zeigefinger fest. Injizieren Sie dem Tier über eine intraperitoneale (i.p.) Injektion mit einer Lösung von 100 mg/ml Ketamin und 20 mg/ml Xylazin in 0,9% steriler Kochsalzlösung für eine Endkonzentration von 200 mg/kg Ketamin und 20 mg/kg Xylazin. Weitere Informationen finden Sie in Tabelle 1.
    ACHTUNG: Die Protokolle für die Anästhesie können je nach Land unterschiedlich sein. Darüber hinaus gibt es Auswirkungen von Anästhetika auf das Gehirn, einschließlich Veränderungen der Mikrogliamorphologie und -wirkung und der Corticosteronspiegel, die bei der Durchführung von Perfusionen zum Zwecke der Gehirnsammlung und -analyse verstanden werden müssen41,42.
  2. Nach ca. 1-2 min verliert das Tier seinen Aufrichtenden Reflex. Um dies zu testen, rollen Sie das Tier einfach auf den Rücken und wenn es nicht wieder auf die Füße rollen kann, hat es den Aufrichtungsreflex verloren.
  3. Nach ca. 5-10 min verliert das Tier seinen Pedalreflex. Um den Pedalreflex zu überprüfen, drücken Sie mit Daumen und Zeigefinger jeden der Füße des Tieres zusammen. Wenn es keine Reaktion in Form eines Sprungs oder Muskelkrämpfens gibt, verwenden Sie die Nägel von Daumen und Zeigefinger, um jeden der Füße des Tieres zu kneifen. Wenn es keine Reaktion gibt, hat das Tier den Pedalreflex verloren.
    HINWEIS: Wenn das Tier länger als 15 Minuten nach der Injektion auf den Pedalreflex reagiert, kann eine zusätzliche Injektion von 1/2 der anfänglichen Ketamin/Xylazin-Injektion erforderlich sein. Alter, Geschlecht, Genotyp, Phänotyp und Behandlung können die Reaktion des Tieres auf diesen Medikamentencocktail beeinflussen.
  4. Nachdem die Aufricht- und Pedalreflexe verloren gegangen sind, testen Sie den Augenreflex, indem Sie den Mausaugapfel mit einem behandschuhten Finger leicht berühren. Ein Mangel an Reaktion zeigt an, dass der Augenreflex verloren gegangen ist.
  5. Befestigen Sie die Maus in Rückenlage, wobei die Pfoten an einer feststellbaren Arbeitsfläche befestigt sind.
  6. Machen Sie einen Schnitt durch die Haut mit einer chirurgischen Schere entlang der thorakalen Mittellinie etwa 1-2 cm unterhalb des Xiphoidfortsatzes. Schneiden Sie überlegen bis zum Xiphoid-Prozess.
  7. Greifen Sie den Knorpel des Xiphoidprozesses mit einer Pinzette an. Führen Sie eine Schere ein und schneiden Sie die Muskulatur und den Brustkorb diagonal entlang der rechten Seite der Maus bis zur Höhe der Schlüsselbeine.
    1. Heben Sie die Brustmuskulatur mit einer Pinzette an und schneiden Sie durch das Zwerchfell, bis das Herz sichtbar gemacht werden kann. Machen Sie dann einen identischen diagonalen Schnitt entlang der linken Seite der Maus und achten Sie darauf, jeglichen Kontakt mit dem Herzen zu vermeiden. Verwenden Sie einen Hämostat, um die Brustmuskulatur von der Höhle fernzuhalten.
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt kann die Maus nicht mehr atmen, also arbeiten Sie schnell, um den Tod vor den nächsten Schritten zu verhindern.
  8. Sichern Sie das schlagende Herz mit stumpfer Pinzette und führen Sie eine Dosiernadel durch die Basis des Aortenbogens in den linken Ventrikel ein.
  9. Klemmen Sie die Nadelbasis an den linken Ventrikel direkt über der Einführstelle.
  10. Machen Sie einen Schnitt in den rechten Vorhof und beginnen Sie beim ersten Anzeichen eines Blutflusses, das Tier mit 20 ml 1x PBS bei 8,11 ml / Minute zu durchbluten.
  11. Nachdem die 1x PBS den Körper durchblutet hat, wechseln Sie auf das entsprechende Fixiermittel für die nachgeschaltete Anwendung und perfusionieren Sie die Maus mit 20 ml Fixiermittel.
    1. Für gefrorene Schnitte und Immunfärbung perfuse Tier mit dem Glyoxal fixativ für die Gehirnreinigung, perfuse Tier mit 4% PFA in 1x PBS (pH 7,4).
      HINWEIS: Anzeichen einer erfolgreichen Perfusion sind Tiersteifigkeit (leichte Steifheit mit Glyoxal, intensive Steifheit mit PFA) und ein Mangel an sichtbaren Blutgefäßen im gesamten Gewebe.
  12. Enthaupten Sie die Maus und entfernen Sie das Gehirn, indem Sie eine Schere in den Hirnstamm einführen und entlang der Plattenepittion bis zur frontomaxillären Naht auf jeder Seite schneiden. Schneiden Sie dann über die fontonasale Naht, um die Schädeldecke zu entfernen, und achten Sie darauf, den Riechkolben nicht zu beschädigen. Von dort aus drehen Sie den Schädel auf den Kopf und verwenden Sie eine gekrümmte Pinzette, um das Gehirn zu entfernen, wobei Sie sicherstellen, dass der Sehnerv durchtrennt wird.
  13. Legen Sie das durchblutete Gehirn in eine Gewebekartusche und tauchen Sie ein in das Fixiermittel, mit dem das Tier über Nacht bei 4 ° C durchblutet wird.

4. Gehirnbehandlung, Schneiden und Immunfärbung

  1. Gehirnbehandlung und Schneiden
    1. Entfernen Sie Gehirnpatronen aus dem Glyoxalfixiermittel und inkubieren Sie in 15% Saccharose in 1x PBS für 2 Tage bei 4 ° C oder bis das Gehirn sinkt.
    2. Entfernen Sie Gehirnpatronen aus 15% Saccharose und inkubieren Sie in 30% Saccharose in 1x PBS für 2 Tage bei 4 ° C oder bis das Gehirn sinkt.
      HINWEIS: Weitere Informationen finden Sie in Tabelle 1.
    3. Entfernen Sie Gehirne aus 30% Saccharose in 1x PBS und trennen Sie das Gehirn in verschiedene "Blöcke" mit einem koronalen Gehirnblock oder einem sagittalen Gehirnblock.
    4. Betten Sie koronale oder sagittale Hirnabschnitte in OCT-Verbindung ein, indem Sie Gehirnabschnitte auf eine Mischung aus Trockeneis und Ethanol (EtOH) legen. Nachdem OCT weiß geworden und fest geworden ist, aus dem Trockeneis-EtOH-Gemisch entfernen und in Parafilm eingewickelt in einem luftdichten Beutel bei -20 °C lagern.
    5. Entfernen Sie gefrorene Blöcke aus dem Gefrierschrank und legen Sie sie in einen Kryostaten mit einer Innentemperatur von -20 ° C. Verwenden Sie OCT, um den Block an einem Metallfutter zu befestigen, so dass das Gewebe fest befestigt ist. Lassen Sie ~ 5 Minuten einwirken, damit das Gewebe am Futter gefriert. Schneiden Sie das Gewebe mit 7 μm in Scheiben und legen Sie jede Gewebescheibe auf einen geladenen Glasobjektträger.
    6. Lassen Sie die Objektträger über Nacht bei 37 ° C backen und legen Sie sie dann auf -20 ° C, bis sie zur Immunfärbeung verwendet werden.
  2. Immunfärbung
    1. Auf Raumtemperatur (RT) warmen und 15 min mit eiskaltem Aceton fixieren.
    2. Waschschienen für 5 Minuten im 1x Spülpuffer (z. B. IHC Select TBS Spülpuffer) und schütteln Sie bei 60 U / min bei RT zwischen den einzelnen Schritten.
    3. Permeabilize zur Färbung von Kernantigenen mit 0,3% Triton X-100 für 10 min bei RT. Permeabilize zur Färbung von zytoplasmatischen Antigenen mit 0,3% Tween-20 für 10 min bei RT.
    4. Führen Sie den Antigenabruf durch Mikrowellenobjektträger in 50-100 ml 1x DAKO Antigen Retrieval Solution auf niedrigem Niveau für 10 min, zweimal durch. Dann mit Spülpuffer für 5 min bei RT spülen.
    5. Inkubieren Sie Objektträger in 0,3% Typogen Schwarz in 70% EtOH für 20 min bei RT und waschen Sie sie dann mit Spülpuffer.
    6. Ziehen Sie eine hydrophobe Barriere um jedes Gewebe, ohne das Gewebe trocknen zu lassen. Dann für 20 Minuten bei 37 ° C mit 1 Tropfen Millipore Blocking Reagenz pro Gewebe blockieren. Dann 100 μL primärer Antikörper, verdünnt in Antikörperverdünnungsmittel, zu jedem Gewebe geben und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
    7. Inkubieren Sie am nächsten Tag Abschnitte in Alexa Fluor-Sekundärantikörpern für 10 Minuten bei RT. Dann Waschen Sie die Dias im Spülpuffer.
    8. Decken Sie Gehirnabschnitte in 100 μL 1:500 Anti-GFP-Antikörpern ab, die an AlexaFluor 488 konjugiert sind, um die endogenen GFP-Signalmarkierungszellen zu verstärken und über Nacht bei 4 ° C zu inkubieren.
    9. Am nächsten Tag mit Spülpuffer 2x waschen und dann in fließendem DI-Wasser für 5 Minuten waschen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, vorsichtig mit DI-Wasser zu waschen, und achten Sie darauf, fließendes Wasser auf Rutschen selbst zu vermeiden, das Gehirnabschnitte von Rutschen entfernen könnte.
    10. Gegenfleck mit 100 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) für 5 min. Dann in fließendem DI-Wasser für 5 min waschen.
    11. Fügen Sie einen Tropfen Montagemedium auf jeden Gewebeabschnitt und verschließen Sie ihn mit einem 22 mm x 22 mm großen Deckglas. Die Bildgebung wird am Tag der Montage empfohlen, um ein optimales Signal zu gewährleisten.

5. iDISCO Gehirnreinigung (angepasst ab39)

  1. Fixierung und Schnitt
    1. Post-Fix-Gehirne in 4% PFA über Nacht bei 4 °C und dann wieder für 1 h bei RT.
    2. Waschen Sie Gehirne in 1x PBS für eine Stunde, zweimal, bei RT. Dann mit dem notwendigen Hirnblock in 1 mm dicke Abschnitte schneiden und in 5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 1x PBS legen.
  2. Methanol-Vorbehandlung (mit Methanol)
    HINWEIS: Aufgrund der Möglichkeit, dass Methanol die Immunfärbung bestimmter Proteine beeinflusst, möchten die Autoren den Leser auf Renier et al. 2014 für ein Protokoll zu einem methanolfreien iDISCO-ProtokollAlternative 39 hinweisen. Weitere Informationen zu den folgenden Lösungen finden Sie in Tabelle 1 in diesem Abschnitt.
    1. Mit 1x PBS für 1 h zweimal (Schütteln) bei RT waschen.
    2. 50% Methanol (in PBS) für 1 h (Schütteln) bei RT waschen.
    3. 80% Methanol für 1 h (Schütteln) bei RT waschen.
    4. 100% Methanol für 1 h zweimal (Schütteln) bei RT waschen.
    5. Bleichmittelproben mit 5% Wasserstoffperoxid (H2O2) in 20% Dimethylsulfoxid (DMSO)/Methanol (1 Volumen 30%H2O2/1 Volumen DMSO/4 Volumen Methanol, Eiskalt) bei 4 °C über Nacht (Schütteln).
    6. Nach dem Bleichen die Proben zweimal 1 h in Methanol waschen (Schütteln) bei RT.
    7. 20% DMSO/Methanol für 1 h zweimal (Schütteln) bei RT waschen.
    8. 80% Methanol für 1 h (Schütteln) bei RT waschen.
    9. 50% Methanol für 1 h (Schütteln) bei RT waschen.
    10. In PBS für 1 h zweimal (Schütteln) bei RT waschen.
    11. In PBS/0,2% Triton X-100 für 1 h zweimal (Schütteln) bei RT waschen.
  3. Immunfärbung von klärenden Gehirnen
    1. Inkubieren Sie Proben in 1x PBS/0,2% Triton X-100/20% DMSO/0,3 M Glycin bei 37 °C über Nacht auf einem Orbitalschüttler.
    2. Blockieren Sie 1x PBS/0,2% Triton X-100/10% DMSO/6% Ziegenserum bei 37 °C für 3 Tage auf einem Orbitalschüttler.
    3. Proben in 1x PBS/0,2% Tween-20/10 μg/ml Heparin-Natriumsalz aus Schweineschleimhaut zweimal für 1 h bei 37 °C waschen und dann in 1x PBS/0,2% Tween-20/10 μg/ml Heparin/5% DMSO/3% Ziegenserum mit 1:500 Konzentration Kaninchen-Anti-GFP AlexaFluor 488 bei 37 °C auf einem Orbitalschüttler für 2 Tage inkubieren.
    4. Waschen Sie Proben in 1x PBS/0,2% Tween-20 mit 10 μg/ml Heparin für 1 h bei 37 °C auf Orbitalschüttler, dreimal und dann einmal täglich für 2 Tage.
    5. Inkubieren Sie Proben über Nacht in 10 ml 50% v/v Tetrahydrofuran (THF)/H2 Oin einem konischen 15-ml-Rohr.
    6. Inkubieren Sie Proben für 1 h in 10 ml von 80% THF/H2O.
    7. Inkubieren Sie Proben zweimal für 1 h in 100% THF.
    8. Proben mit einem sterilen Tuch trocknen und in Dichlormethan inkubieren, bis sie auf den Boden der Durchstechflasche sinken (ca. 40 min). Nicht >60 Min. inkubieren
      HINWEIS: Achten Sie darauf, Dichlormethan unter einem Abzug zu handhaben.
    9. Inkubieren Sie Proben in 18 ml Dibenzylether (DBE), bis sie klar sind (>2 h).
    10. Speichern Sie Beispiele in DBE bei RT, bis sie für das Image bereit sind.
      HINWEIS: Für beste Ergebnisse ist es wichtig, die Proben so schnell wie möglich nach Abschluss des Löschens abzubilden.

6. Abbildung von gefärbten Objektträgern oder gereinigten Gehirnen

  1. Um immungefärbte Hirnschnitte abzubilden, analysieren Sie Objektträger mittels konfokaler Mikroskopie, bei denen die Co-Expression mehrerer Antikörper bestätigt werden kann. Wir verwenden ein Leica Stellaris 5 Mikroskop mit HyD S Hybriddetektoren, aber jedes punktuelle konfokale Rastermikroskop funktioniert. Zu den Zielen gehören HC PL APO 10x/0.40 CS2, HC PL APO 40x/1.30 OIL CS2 und HC PL APO 63x/1.40.
    1. Konfigurieren Sie die richtigen Laserlinien und Emissionsfilter. Die benötigten Laser und die entsprechenden Laserintensitäten unterliegen den verwendeten Mikroskop- und Fluorophorkombinationen.
      HINWEIS: Wir verwenden eine Kombination aus Diode 405 nm und Weißlichtlasern, um Anregungs- und Emissionsspektren für jeden Fluorophor oder Gruppen von Fluorophoren zu optimieren, die zur Reduzierung und Beseitigung von Übersprechen verwendet werden. Ähnliche Ergebnisse können auch mit herkömmlichen Laser-Filter-Kombinationen erzielt werden, aber achten Sie genau auf die Kanaldurchblutung. Das Durchbluten kann identifiziert werden, indem eine einzelne Laserlinie in Verbindung mit jeder der gewünschten Emissionsfilterkombinationen eingeschaltet wird, um zu sehen, welche Kanäle von jedem spezifischen Laser beeinflusst werden. Wenn beispielsweise der Diodenlaser 405 nm sichtbare Fluoreszenz im GFP-Emissionsfilter erzeugt, kommt es zu einem Durchbluten. Stellen Sie sicher, dass mehrere Kanäle nacheinander Bild für Bild abgebildet werden, um das Auftreten von Durchblutungen erheblich zu reduzieren.
    2. Für co-gefärbte Tet-On-Gehirne mit einem mTmG-Reporter wählen Sie DAPI (z. B. 405 nm, em. 450 nm), GFP (ex. 488 nm, em. 509 nm), tdTomato (ex. 555 nm, em. 582 nm) und das entsprechende far-red Fluorophor, um dem Fluorophor zu entsprechen, das auf dem sekundären Antikörper verwendet wird. Wir empfehlen Alexa Fluor 647 (ex. 651 nm, em. 667 nm).
    3. Legen Sie zuerst Einstellungen mit einem Cre-Control-Gehirn fest, das sowohl mit GFP als auch mit der fluoreszierenden Secondary gefärbt ist. Diese Gehirnschnitte kontrollieren die Hintergrundfluoreszenz der fluoreszierenden Antikörper und zeigen kein echtes GFP-Signal.
    4. Analysieren Sie jeden Gehirnabschnitt von oben nach unten, von links nach rechts, um sicherzustellen, dass in der Analyse kein Signal übersehen wurde. Wenn Sie den gleichen Gehirnabschnitt bei verschiedenen Vergrößerungen abbilden, wird empfohlen, zuerst die niedrigeren Vergrößerungen zu verwenden, da die höhere Vergrößerung das mTomato-Signal schneller ausbleichen wird.
  2. Um bereinigte Gehirne abzubilden, verwenden Sie ein invertiertes konfokales Mikroskop mit einer automatisierten Bühne und einer automatisierten Kachelfunktion. Wir verwenden das Leica Stellaris 5 Mikroskop. Da die Proben so dick sind (>500 μm), sind größere Arbeitsabstände erforderlich, was die effektiv erreichbare Vergrößerung einschränkt. Wir verwenden das HC PL APO 10x/0.40 CS2 Objektiv für alle geklärten Bildgebungen des Gehirns.
    1. Beginnen Sie, indem Sie einen gereinigten Gehirnabschnitt flach gegen eine Glasbodenschale legen und in Dibenzylether eintauchen.
      HINWEIS: Dibenzylether ist für die meisten Objektive und die meisten Kunststoffe korrosiv. Aus diesem Grund muss jeder Innenkunststoff in der Glasbodenschale mit einem schnell trocknenden Silikonelastomer beschichtet werden.
    2. Konfigurieren Sie die richtigen Laserlinien und Emissionsfilter. Für co-gefärbte Tet-On-Gehirne mit einem mTmG-Reporter wählen Sie DAPI, GFP, tdTomato und das entsprechende tiefrote Fluorophor, um dem Fluorophor zu entsprechen, das auf dem sekundären Antikörper verwendet wird. Stellen Sie die gewünschte Auflösung ein, wir empfehlen mindestens 1024 x 1024. Stellen Sie das Loch auf 1 AU ein.
    3. Ermitteln Sie zuerst die Laserintensität und den Detektorgewinn mit einem Cre-Kontrollgehirn, das sowohl mit GFP als auch mit der fluoreszierenden Secondary gefärbt ist. Diese Gehirnschnitte kontrollieren die Hintergrundfluoreszenz der fluoreszierenden Antikörper und zeigen kein echtes GFP-Signal.
    4. Sobald die Laserintensitäten und die Detektorverstärkung optimiert wurden, kartieren Sie das Gehirn für die Bildgebung. Beginnen Sie damit, den gesamten Umfang des Gehirnabschnitts zu lokalisieren, um die X- und Y-Achse der Bildaufnahme festzulegen. Identifizieren Sie als Nächstes die Z-Achse, indem Sie den Fokuspunkt auf ungefähr die Zentrumstiefe des Gewebes einstellen, und verwenden Sie Z-Positionierungskontrollen, um den "höchsten" Punkt des Gewebes (positivster Z-Wert) zu lokalisieren. Scannen Sie verschiedene Bereiche des Gewebes und erhöhen Sie bei Bedarf die maximale Höhe der Z-Achse.
      1. Wiederholen Sie dies für den "niedrigsten" (negativsten Z-Wert) Punkt, der erforderlich ist, um die gesamte Dicke des Gewebes zu erhalten. Der Stellaris 5 hat ein Limit von ± 250 um des Brennpunkts. Dies begrenzt optische Abschnitte auf 500 μm Dicke in der Z-Achse. Der 3D-Bereich des Hirnschnitts ist mittlerweile bekannt.
    5. Stellen Sie die Z-Step-Größe auf 6 μm ein und beginnen Sie mit der Aufnahme des Bildes. Die Erfassungszeit hängt von mehreren Faktoren ab und kann je nach gewünschten Parametern von Stunden bis zu Tagen reichen. Um die Bildaufnahmezeit zu verkürzen, versuchen Sie, die Auflösung zu verringern, die Laserscangeschwindigkeit zu erhöhen oder die Schrittweite zu erhöhen.
    6. Sobald das gekachelte Bild des gesamten gelöschten Gehirnabschnitts erfasst wurde, analysieren Sie wie gewünscht.

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Representative Results

Während das Fluoreszenzsignal, das sich aus einem Tet-On-System mit einem fluoreszierenden Reporter ergibt, je nach Interessenträger und verwendetem Fluorophor(en) variiert, werden wir beschreiben, wie die Ergebnisse mit mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-Tieren analysiert wurden. Die Analyse von erwachsenen Gehirnen nach einer Pulsjagd führte zu Membran-GFP-exprimierenden Zellen in verschiedenen anatomischen Nischen. Der Unterschied in der Fluoreszenzintensität zwischen verschiedenen Zelltypen muss beachtet werden. Eine Variable hinsichtlich der Fluoreszenzintensität ist die Größe der Zellmembran. Zum Beispiel haben Aderhautepithelzellen (CPECs) im Plexus choroidalis eine dicke Zellmembran und ein starkes Fluoreszenzsignal, das leicht von den umgebenden Zellen unterschieden wurde (Abbildung 4A, B). Andere kleinere und derzeit nicht identifizierte Zelltypen im Gliederplexusstroma hatten jedoch ein schwächeres GFP-Signal (Abbildung 4C). Im Kleinhirn exprimierten Bergmann-Gliazellen höhere mGFP-Spiegel als Korbzellen, und es gab sogar Variationen in der mGFP-Expression zwischen einzelnen Korbzellen (Abbildung 4D). Geruchssensorische Neuronenaxone in der glomerulären Schicht des Riechkolbens exprimierten ebenfalls hohe mGFP-Spiegel (Abbildung 4A, E). Um sicherzustellen, dass alle mGFP+-Zellen identifiziert werden, ist es daher wichtig, sowohl helle als auch schwache GFP+-Zellen im gesamten Gehirn von mTmG-Tieren zu identifizieren. Bei mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-Tieren beobachteten wir eine niedrige mGFP-Expression im Hintergrund in Hirnregionen, einschließlich der Großhirnrinde (Abbildung 4A). Interessanterweise zeigten das Kleinhirn und der Hirnstamm auf diese Weise eine geringere mGFP-Expression im Hintergrund (Abbildung 4A).

Während der Analyse von Hirngewebe nach einer Linienspur wird es Unterschiede in den mGFP- und mTomato-Expressionsmustern sowohl in den Hirnregionen als auch in den Zelltypen geben. Geruchssensorische Neuronenaxone, die die glomeruläre Schicht des Riechkolbens füllen, exprimierten im Vergleich zu den meisten anderen Hirnregionen hohe Konzentrationen von Membrantomaten, selbst wenn die gleichen Neuronen mGFP+ sind, was darauf hindeutet, dass einige Zellen das mTomatensignal langsamer zu verlieren schienen (Abbildung 4D). Im Gegensatz dazu exprimierten mGFP+-Zellen im Plexus choroid eine niedrige mTomate (Abbildung 4B,C). In den meisten anderen Hirnregionen ist das Tomatensignal gleichmäßig auf die Zelltypen verteilt, wobei Endothelzellen zu den einzigen Zellen gehören, deren fluoreszierendes Signal hell genug war, um sich vom rot fluoreszierenden Hintergrund abzuheben (Abbildung 4B). Die Aktivierung der mGFP-Expression und der Spaltung von mTomato aus dem Genom während der Rekombination führt zu einem Verlust der mTomato-Expression, aber die mTomato-Fluorophore, die auf der Membran exprimiert werden, bleiben erhalten, bis sie abgebaut werden. Aus diesem Grund exprimieren mGFP+-Zellen oft ein variables mTomato-Signal, das von der Rezenz der Rekombination, dem Zelltyp und der Größe der Zellmembran abhängt. Daher ist es wichtig, Zellen basierend auf der Expression von mGFP zu analysieren und sie nicht von der Analyse auszuschließen, wenn sie sowohl mGFP als auch mTomato exprimieren.

Alternative Reporter können auch in Verbindung mit dem Tet-On-System eingesetzt werden. Die Cre-Rekombination kann die Expression von GFP oder RFP in Zellen induzieren, die normalerweise keine fluoreszierende Markierung in Rosa-GFP- oder Rosa-RFP-Tieren exprimieren. Hier zeigt die Analyse von GFP oder RFP die Expression des interessierenden Promotors an, und es wird kein Fluorophorsignal entfernt, wie bei mTmG-Tieren. Einzelfluorophor-Reporter ermöglichen eine Immunfärbung mit mehr fluoreszierenden Antikörperkombinationen, da die Membrantomate bei mTmG-Tieren eine Färbung in der roten Wellenlänge verhindert.

Figure 1
Abbildung 1. Generierung einer Tet-On-Mauslinie. (A) Überblick über das Zuchtschema für die Schaffung von mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-Mäusen aus einzelnen Mauslinien. (B) Schematische Darstellung des Tet-On-Systems in der mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-Mauslinie. (C-D) Repräsentative Bilder von Ohrclips, die mit dem FITC-Kanal eines Epifluoreszenzmikroskops von Nicht-Keimbahn- (C) und Keimbahn- (D) mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-Mäusen aufgenommen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2. Experimentelle Designs mit Tet-On-Mäusen nach der Abstammung. Illustrationen von Experimenten, die mit Tet-On-Mäusen möglich sind, von der basalen Proliferation, Migration und Differenzierung (1) bis hin zu Behandlungen während des Dox-Pulses ohne Jagd nach Regeneration oder Re-Gleichgewicht (2), Interventionen während des Pulses mit der Möglichkeit, Langzeiteffekte zu visualisieren (3). Ein kurzer Puls von 2 Tagen ohne anschließende Jagd gibt Einblick in einen nahezu basalen Zustand von TERT+-Zellen, da diese Zellen wenig Zeit haben, sie zu aktivieren, zu vermehren, zu migrieren oder zu differenzieren (4). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3. Gehirn-Clearing von mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG Mausgehirnen. (A) Sagittale Schnitte von 1 mm Hirnschnitt nach der Fixierung. (B) Einzelne Hirnschnitte werden in 5-ml-Röhrchen für iDISCO-Gehirnreinigung39 platziert. (C) Gereinigte Gehirne werden in Glasbodenschüsseln gelegt und in DBE getaucht, um den Brechungsindex während der Bildaufnahme abzugleichen. (D) Erfassen Sie den gesamten Bereich des Gehirns als eine Reihe von Z-Stacks, die zu einem umfassenden 3D-Bild des Gehirns zusammengefliest werden. Dies kann dann mit der maximalen Z-Intensität projiziert werden, um ein 2D-Bild aus dem 3D-Datensatz zu erstellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4. Abstammungsverfolgung von erwachsenen mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-Mausgehirnen nach einem 3-wöchigen Puls und einer 11-tägigen Jagd nach Doxycyclin. (A) Geklärter Hirnschnitt der erwachsenen mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-Maus mit spezifischen Bereichen des mGFP-Signals mit Einsätzen (N = 3 männliche Mäuse). (B-C) Repräsentatives Bild des mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-Aderhautplexus zur Identifizierung von mGFP+ CPECs (B) und kleineren, schwächeren mGFP+ Zelltypen (C; N = 4 Männer, N = 6 Weibchen). (D) Repräsentatives Bild von mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG Kleinhirn-Bergmann-Glia (hell) und Korbzellen in der molekularen Schicht des Kleinhirns (dim; N = 4 Männer, N = 6 Weibchen). (E) Repräsentatives Bild der olfaktorischen glomerulären Schicht des mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-Gehirns. Gepunktete Linien zeigen glomeruläre Kompartimente an (N = 4 Männchen, N = 6 Weibchen). Maßstabsstäbe sind 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

Eine Methode zur Erzeugung, Nutzung und Analyse einer dreifachen transgenen Linienverfolgung von Mauslinienmarkierungsstammzellen im erwachsenen Mäusegehirn in vivo wird beschrieben. In Kombination mit Immunverfärtung oder Gehirnreinigung kann die Identifizierung und Charakterisierung von Fluoreszenzzellen im gesamten Gehirn erreicht werden. Diese Technik bietet die Fähigkeit, das plastische/regenerative/Umbaupotenzial markierter Stammzellen zu verstehen, wenn sie sich aktivieren, migrieren, differenzieren oder vermehren. Während frühere Daten, die über die Retention von Markierungen mit Thymidin-H3 und BrdU erhalten wurden, zu dem Schluss kamen, dass die V-SVZ, der Riechkolben und die subgranulare Zone des Gyrus dentatus die einzigen neurogenen Hirnregionen bei erwachsenen Säugetieren 2,3,4,5,6,7,8,43 waren, ist es jetzt bekannt, dass die adulte Neurogenese auch im Kortex 44 auftritt. Hypothalamus 45,46 und Striatum47,48,49 sowie möglicherweise andere neuartige Nischen, die nicht gut untersucht wurden. Die adulte Gliogenese, der Prozess, bei dem Glia-Vorläuferzellen neugeborene Astrozyten und Oligodendrozyten bilden, tritt ebenfalls im gesamten Gehirnauf 37, und es wird angenommen, dass Glia und Neuronen von derselben multipotenten Stammzelle stammen. Aus diesen Gründen waren Studien zur Linienverfolgung ein wesentlicher Bestandteil des Verständnisses der Rolle verschiedener Stammzelltypen, die zur Auffüllung und Regeneration von Neuronen und Gliazellen im Gehirn erwachsener Säugetiere beitragen (überprüft in50).

Für Studien zur Plastizität des Gehirns bei Erwachsenen ist das optimale Alter 12 Wochen alt, wenn das murine Gehirn die Entwicklungabgeschlossen hat 51. Bei der Planung der Länge des Doxycyclin-Pulses und der anschließenden Verfolgungsjagd ist ein Verständnis des interessierenden Prozesses von entscheidender Bedeutung, damit das Puls-Chase-Timing lang genug ist, um die interessierenden Prozesse zu ermöglichen. Zum Beispiel beträgt die Bildung von neugeborenen Neuronen im Riechkolben aus adulten neuralen Stammzellen (ANSCs) im V-SVZ ungefähr 4 Wochen, wie durch frühere Lineage-Tracing-Studien52 bestimmt. Eine Puls-Chase-Studie, die die ANSCs im V-SVZ kennzeichnet, muss daher innerhalb dieses Zeitrahmens stattfinden, damit sich die ANSCs im V-SVZ teilen können, damit sich diese ANSCs in Zwischenzelltypen differenzieren und diese Zwischenzelltypen in den Riechkolben migrieren und sich in erwachsene Neuronen differenzieren können. Die Länge der Jagd bestimmt, wie lange markierte Zellen und ihre Nachkommen ihre Migration und Differenzierung fortsetzen müssen, obwohl diese Prozesse auch während des Pulses auftreten werden. Zusammengenommen ist es wichtig, die beteiligten Prozesse zu verstehen, da die Zeitleiste jedes Linienverfolgungsexperiments es ermöglichen muss, dass die richtigen Prozesse stattfinden.

Während dieses Manuskript das Tet-On-System detailliert beschreibt, gibt es andere Transgene zur Verfolgung von Linien, die verwendet werden können. DasCreER-T2-Transgen ermöglicht die Expression einer Cre-Rekombinase, die nur in Gegenwart von Tamoxifen oder 4-OHT, einem Tamoxifenderivat, aktiv ist. Wenn dieses Cre von einem Promotor von Interesse reguliert wird, erzeugt die 4-OHT- oder Tamoxifen-Verabreichung nur eine Cre-Rekombination in Zellen, die diesen Promotor exprimieren. In Kombination mit einem Reportergen wie Rosa-LSL-GFP oder Rosa-mTmG markiert die Cre-lox-Rekombination unauslöschlich die Zellen, die Cre während der Tamoxifen-Verabreichung exprimieren. Ein Nachteil dieses Systems ist die Verwendung von Tamoxifen, das lang anhaltende nachteilige Auswirkungen auf die Neurogenese sowohl im pränatalen als auch im erwachsenen Gehirnhat 17. Aus diesem Grund müssen Studien zur Linienverfolgung mit CreERT2-Linien die damit verbundenen Vorbehalte berücksichtigen.

Linienverfolgungsstudien im erwachsenen Gehirn werden häufig mit Markern von Stammzellen wie Nestin oder Markern von Gliavorläuferzellen einschließlich NG253,54 durchgeführt. Während die resultierenden Daten den Umsatz und die Differenzierung dieser Zellen in neugeborene reife Zelltypen anzeigen, kann die Expression dieser Marker durch verschiedene andere Zelltypen im erwachsenen Gehirn verwirrend sein. Zum Beispiel wird Nestin, ein intermediäres Filamentprotein, das an der Mitose55 beteiligt ist, auch von reifen Neuronen 56 und meningealen Zelltypen57 exprimiert. Andere Stammzellmarker sind gliales fibrilläres saures Protein (GFAP) 58,59 und Glutamataspartattransporter 1 (GLAST)60, die von Astrozyten im gesamten erwachsenen Gehirn sowie 61 exprimiert werden. Aus diesem Grund sind Abstammungsverfolgungsstudien mit zusätzlichen Markern erforderlich. Während wir mehr über die breiten Auswirkungen der adulten Plastizität im Gehirn erfahren, bleibt die Charakterisierung und Analyse der Zellen, die bei diesen Prozessen und ihren Nachkommen eine Rolle spielen, für unser Verständnis der neurogenen und gliogenen Signalwege, die an der neurodegenerativen Gesundheit beteiligt sind, und mehr von entscheidender Bedeutung.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Die Autoren danken Dr. Diana Carlone (Boston Children's Hospital, Harvard Medical School) und Dr. Matthew Lynes (Joslin Diabetes Center; Maine Medical Center Research Institute) zur Orientierung unter Verwendung von mTert-rtTA-Tieren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody diluent Agilent S080983-2
Antigen Retrieval Solution Agilent S2367
anti-GFP antibody Invitrogen A2311 Use at 1:500-1:000
Acetone Fisher Scientific A18-4
B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J The Jackson Laboratory JAX:006234
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J The Jackson Laboratory JAX:007676
Blocking Solution (IHC) Millipore Sigma 20773
Blunt needle BSTEAN X0012SYHIV
Coronal brain block Braintree BS-2000C
Cover slip Corning 2850-22
Cryostat Leica CM1900
DAPI Sigma-Aldrich D564
Dibenzyl ether Millipore Sigma 33630
Dichloromethane Sigma-Aldrich 270997
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
Donkey Serum Sigma-Aldrich D9663
Doxycycline Hyclate Sigma-Aldrich D9891
Glycine Bio-Rad 161-0718
Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa Sigma-Aldrich H3393
Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative Amresco H120 This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)
Hydrogen Peroxide Solution Sigma-Aldrich 516813
IHC Select TBS Rinse Buffer Millipore Sigma 20845
Ketamine Westward 0143-95095-10 This product requires a DEA license for storage and use.
Methanol Fisher Scientific A452-4
Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
Milipore Block Millipore 20773
Mounting medium Millipore Sigma 5013
Optimal Cutting Temperature Solution Sakura 4583
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS Solution (10X) Teknova P0496
Sagittal brain block Braintree RBM-2000S
Saline Braun S8004-5264
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Sudan (Typogen) Black Millipore Sigma 199664
Tetrahydrofuran Sigma-Aldrich 186562
Tissue cartridge Simport M512
Triton X-100 Bio-Rad 1610407
Tween-20 Millipore Sigma 655205
Xylazine AnaSed sc-362950Rx

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neuroscience Ausgabe 183
Abstammungsverfolgung von induzierbaren fluoreszenzmarkierten Stammzellen im erwachsenen Mäusegehirn
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Jensen, G. S., Willows, J. W.,… More

Jensen, G. S., Willows, J. W., Breault, D. T., Townsend, K. L. Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain. J. Vis. Exp. (183), e63998, doi:10.3791/63998 (2022).

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