Summary
유도성 트랜스제닉 계보 추적 마우스 라인을 사용하여 줄기 세포 및 그의 자손을 형광단으로 영구적으로 표시하는 능력은 생체내에서 활성화, 증식, 이동 및/또는 분화의 공간적 및 시간적 분석을 가능하게 한다. 계보 추적은 혈통 헌신, 개입에 대한 반응 및 다능성에 대한 새로운 정보를 나타낼 수 있습니다.
Abstract
텔로머라아제 역전사효소(Tert) 계보-추적 마우스 라인은 성체조직 줄기세포의 거동과 운명을 조사하기 위해 개발되었으며, 'Tet-On' 시스템 oTet-Cre 마우스와 Tert 프로모터에 연결된 신규한 역테트라사이클린 트랜스액티베이터(rtTA) 전이유전자를 교차시킴으로써, 이는 성체 뇌 줄기세포의 새로운 집단을 표시함을 입증하였다. 여기서, 테트라사이클린 유도체 독시사이클린을 mTert-rtTA::oTet-Cre 마우스에 투여하면 Tert 유전자의 프로모터 영역의 4.4 kb 단편을 발현하는 세포 집단을 불가분하게 표시할 것이다. Rosa-mTmG 리포터를 조합하면, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG 마우스는 독시사이클린 처리가 mTomato 발현의 대체를 유도할 때까지 막 tdTomato(mTomato)를 발현할 것이고, 또한 Tert를 발현하는 세포에서 막 EGFP(mGFP)로 대체한다. 따라서, 이들 삼중-트랜스제닉 혈통 추적 마우스가 독시사이클린(TERT 발현 세포가 마크되는 "펄스" 기간)을 수신하면, 이들 세포는 불가분하게 마크된 mGFP+ 세포가 될 것이며, 이는 해독사이클린 제거 후 임의의 바람직한 시간 동안("추격" 기간) 동안 추적될 수 있으며, 이는 Tert 발현이 후속적으로 소실되더라도. 그런 다음 뇌는 줄기 세포 활성화, 증식, 혈통 투입, 다양한 뇌 틈새 시장으로의 이동 및 성숙한 세포 유형으로의 분화에 대한 변화를 해석하기 위해 면역 형광 및 기타 하류 응용 프로그램을 위해 관류 고정 및 처리됩니다. 이 시스템을 사용하여, 임의의 rtTA 마우스를 oTet-Cre 및 Rosa 리포터에 교배시켜 줄기 세포의 마커를 사용하여 독시사이클린-유도성 "펄스-체이스" 계보 추적 실험을 수행할 수 있다.
Introduction
계보 추적 마우스 줄의 값
생체 내에서 줄기 세포의 분석은 이러한 세포를 검사하는 많은 분석이 동물의 죽음시에 이들 세포를 특성화하는 데에만 초점을 맞추기 때문에 어려울 수 있으며, 이는 시간에 따라 말단 스냅 샷을 나타냅니다. 선조, 중간/전이 세포 유형 및 시간이 지남에 따라 성숙한 세포의 증식, 분화 및 이동 과정을 더 잘 이해하려면 종단 분석 접근법이 필요합니다. 이것은 줄기 / 선조 세포가 지울 수 없게 표시되고1 이후 임의의 시간 동안 추적 될 수있는 혈통 추적 연구를 통해 달성 될 수 있습니다.
성인 포유류 뇌에서, 성인 태생 뉴런이 줄기 및 전구 세포로부터 생성되는 신경 생성 과정은 티미 딘-H3 2,3,4 또는 5-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU)5,6,7,8로 표지 보유를 통해 먼저 분석되었다. . 이 연구에서, 증식성 세포는 티민 유사체로 표시되었고, 이는 복제 및 세포 분열/증식 동안 세포의 DNA에 통합되었다. 따라서 표시된 세포와 자손은이 유사체를 포함했으며, 그 후 사후 확인되었습니다. 그러나 티미딘-H3와 BrdU는 줄기 세포가 제대로 이해되지 않은 뇌 영역에서 증식 세포와 그 자손의 표시를 허용했지만, 이러한 연구는 이러한 도구의 단점에 의해 방해 받았다. 티미딘-H3는 세포주기 정지, 아폽토시스 및 용량-의존적 DNA 합성 억제9를 유도하는 반면, BrdU는 투여 경로(10)에 따라 다양한 수준으로 세포를 표시하고, 수복 또는 아폽토시스 동안뿐만 아니라 세포 분열(11) 동안에도 세포에 의해 흡수된다. 최근 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU)을 사용한 라벨링과 같이 보다 효율적인 라벨링 방법이 활용되고 있지만, BrdU와 동일한 많은 문제들이 여전히12개로 남아 있다. 이러한 접근법은 또한 줄기 세포뿐만 아니라 모든 증식 세포를 표시한다는 점에서 제한적이며 따라서 결과의 해석은 혼란 스러울 수 있습니다. 신경 인성 혈통에서 모든 줄기와 전구 세포는 유사분열 능력을 유지하며 말단 / 성숙 뉴런 만 증식하지 않습니다. 성상세포 및 미세아교세포의 경우, 올리고덴드로세포는 아니지만, 증식은 무기한 유지된다(13,14,15).
우리가 여기에서 사용하는 성체 줄기 세포를 확인하기 위해 확인 된 것과 같이 관심있는 단백질을 발현하는 세포 만 혈통화하는 데 사용되는 형질전환 마우스는 줄기 세포와 그 자손을 조사 할 때 더 일반적이되었습니다. 마우스 트랜스제닉 접근법을 통해 생성하기가 어렵지만, 혈통-추적 마우스 라인은 뇌에서 특이적으로 표시된 세포의 추적을 허용하고, 증식에만 의존하지 않는다. Tet-On 트랜스제닉 마우스 시스템에서, 테트라사이클린 또는 독시사이클린(테트라사이클린 유도체)의 투여는 관심 있는 프로모터에 의해 전사되는 역테트라사이클린 트랜스활성화제(rtTA)로 조작된 세포에서 Cre-재조합효소 발현을 유도한다. 테트-유도성 Cre-구동 재조합은 이어서 채용된 로사-리포터 마우스에 따라 관심있는 세포에서 지울 수 없는 형광 또는 발광 단백질의 발현을 활성화시킬 것이다. 이러한 불가분하게 표시된 세포는 분열, 분화 또는 이동 후에도 이 리포터를 계속 발현하여, 시간이 지남에 따라 또는 상이한 개입 후에 이들 세포 및 그들의 자손의 추적을 허용한다(16). 형질전환 계보 추적 접근법의 장점은 1) rtTA로 표시된 특정 세포 계보 또는 전구/줄기 세포에 대한 추적의 특이성, 2) 세포 회전율 또는 분화에도 불구하고 형광 또는 발광 단백질의 지울 수 없는 발현, 3) 낮은 독성, 4) 동물의 수명주기의 어느 시점에서든 조건부 활성화, 5) 일반적인 분석으로 사용의 용이성, 면역염색/면역형광 포함16.
마우스에서 시간적으로 유도성 리포터 도구의 다른 방법에는 ROSA-GFP, ROSA-mTmG 또는 다른 형광 리포터 전이유전자와 짝을 이룰 수 있는 Cre-ERT2 마우스의 사용이 포함된다. 이들 동물에서, 관심 있는 프로모터 또는 인핸서 영역과 같은 세포 특이적 조절 요소는 타목시펜의 투여를 통해서만 활성화될 수 있는 Cre 재조합효소의 생산을 유도한다. Cre-ERT2 마우스 라인은 특정 세포주에서 Cre의 유도를 허용하지만, 성인 신경 발생에 대한 타목시펜의 효과를 자세히 설명하는 풍부한 지식이 있습니다17,18. 추가적으로, YFP 또는 CFP를 포함하여 GFP 또는 mTmG 대신에 활용될 수 있는 많은 ROSA 구동 형광 리포터 유전자가 존재하며, 이는 다른 형광 파장에서 대체 형광 표지를 허용할 것이다. 이들 형광 리포터 유전자는 Tet-On 또는 Cre-ERT2 시스템과 함께 사용될 수 있다.
텔로머라아제 역전사효소(TERT)는 홀로엔자임 텔로머라제의 속도 제한 성분으로, 세포 분열19,20 동안 텔로미어가 단축된 후 텔로미어를 연장시키는 작용을 한다. TERT는 장 21,22, 골수 21, 간 23, 지방24, 자궁내막 25,26, 및 골1에서 성체 조직 줄기 세포의 마커로서 확인되었다. 이들 성체 줄기세포에서의 TERT 발현이 텔로머라아제-연장 활성을 전적으로 위한 것인지 또는 비-정준 TERT 역할(27)을 수행하는지에 대한 것인지는 아직 알려지지 않았다. TERT 발현 정지 성체 줄기 세포 (qASCs)는 이러한 줄기 세포의 다능성 및 자기 재생 능력뿐만 아니라 활성화, 증식, 분화 및 이동 가능성을 연구하기 위해 트랜스제닉 혈통 추적 마우스로 몸 전체에서 확인되고 추적되었습니다 1,22,23,28. Tert-rtTA 전이유전자의 생성은 이전에1 수행되었다. 이 논문에서는 성인 마우스 뇌에서 새로운 ASC 집단으로 확인 한 TERT + qASC를 연구하기 위해 혈통 추적 TERT 마우스 라인을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.
트랜스제닉 혈통 추적 마우스 라인의 생성
Tet-On 시스템을 사용하여 계보 추적 마우스 라인을 생성하려면 마우스 짝짓기를 통해 단일 동물 내에서 세 개의 전이유전자를 결합해야 합니다. 첫 번째는 관심 유전자의 프로모터의 제어하에 발현되는 rtTA입니다 (우리는 TERT-rtTA입니다). 이 관심 유전자를 발현하는 세포에서, rtTA는 따라서 발현될 것이다. 두 번째는 rtTA 융합 전사체와 테트라사이클린 또는 독시사이클린 둘 다의 존재하에서 Cre 재조합효소의 전사를 허용하는 테트라사이클린 반응 요소(TRE)를 함유하는 oTet-Cre 유전자이다. 테트라사이클린 또는 독시사이클린은 식수 또는 차우29를 통해 동물에게 투여될 수 있다. 마지막으로, Cre 재조합효소 절단에 의해 활성화될 유전자가 있어야 한다. 이 원고에서 우리가 설명 할 표지 유전자는 Rosa26-mTmG 유전자이며, Cre 재조합이 유비쿼터스 할 때까지 mTomato (모든 세포에서 막 적색 형광)를 전사합니다. 그러나, 세포가 rtTA 전사체를 발현하고 테트라사이클린 또는 독시사이클린을 함유하는 경우, mTomato와 mGFP 부위 사이의 일련의 lox P 부위의 Cre 재조합은 R26 부위를 변화시키고 세포가 막 토마토 대신에 막 EGFP(mGFP, 또는 막 녹색 형광)를 생성하게 할 것이다. 이 mGFP 신호의 지울 수없는 특성은 세포가 증식, 이동 및 분화 할 때 세포의 생체 내 표지 및 추적을 허용합니다. 추적에 따라, 세포는 표준 냉동 절편 또는 더 두꺼운 광학적으로 제거된 뇌에서 면역형광을 통해 GFP의 발현에 대해 분석될 수 있다.
이 백서에서는 특정 마우스 라인인 mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG의 사용에 대해 설명합니다. 이 삼중 트랜스제닉 마우스 라인을 만들기 위해, 우리는 먼저 oTet-Cre 동물(잭슨 랩 균주 #006234)을 Rosa-mTmG 동물(잭슨 랩 균주 #007676)과 교배시켜 oTet-Cre::Rosa-mTmG 이중 트랜스제닉 마우스를 만들었습니다. 이들 동물은 보충표 1 및 2에 표시된 프라이머 및 PCR 주형으로 유전자형화되었다. mTert-rtTA 마우스(David Breault 1에 의해 생성됨)를 oTet-Cre::Rosa-mTmG 동물과 교배시켜 mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG 마우스(도 1A)1,30를 생성하였다. mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG 마우스 라인의 작용 메카니즘은 도 1B에 예시되어 있다.
독시사이클린 유도 및 펄스 체이스 설계
실험을 계획 할 때 독시사이클린 유도시 동물의 나이, 독시사이클린 투여 기간 ( "맥박"기간), 독시사이클린 제거 후 조직 수집 전 시간 ( "추적"기간) 및 이러한 과정 중 개입의시기를 포함하여 계보 추적 실험의 결과에 영향을 줄 수있는 몇 가지 요소를 고려하는 것이 중요합니다. 이러한 연구 설계 고려 사항은 실험이 끝날 때 표지 된 세포와 그 자손을 이해하는 데 필수적입니다. 이 과정의 첫 번째 단계는 동물의 관심 연령과 독시사이클린 투여 기간을 확인하는 것입니다. 더 긴 펄스 기간은 더 많은 세포가 발현되는 rtTA 결합 프로모터를 발현할 가능성이 있고 더 많은 관심있는 세포가 불가분의 표시될 가능성을 허용할 것이다. 관심 유전자의 일시적인 발현을 나타내는 세포 유형은 관심 유전자를 지속적으로 발현하는 세포보다 더 긴 맥박 기간을 필요로 할 수 있다. 그러나 연구의 목표가 관심있는 세포의 단기 효과 또는 급성 개입을 이해하는 것이라면 일단 세포가 표시되면 맥박 기간의 나머지 기간 동안 여러 가지 변화를 통해 추적되므로 맥박 기간이 너무 길어질 수 없습니다. 우리의 연구 중 일부에서, 추격 기간이없는 2 일간의 맥박은 TERT의 직접 기자를보다 밀접하게 모방하는 데 사용되었습니다. 이는 Rosa-mTmG 유전자의 재조합을 위한 최소 시간이 2일31일이기 때문이다.
맥박 체이스 실험의 다음 필수 기간은 독시사이클린의 제거와 동물의 관류 사이의 길이이며, 이는 '추격전'으로도 알려져 있습니다. 마우스에서 독시사이클린의 반감기는 투여 경로에 관계없이 약 170분이며, 이는 독시사이클린 유도가 제거32 후 몇 시간 후에 더 이상 발생하지 않을 가능성이 높다는 결론을 허용한다. 그러나, 독시사이클린 대사는 노화된 마우스에서 느리며, 이는 어린 동물(33)보다 더 긴 효과적인 '맥박' 기간을 초래할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다.
추격 기간 동안, 표지된 세포는 증식, 분화, 또는 이동 후에도 계속 표지될 것이다. 이들 세포의 자손도 또한 라벨링될 것이다. 이 연구의 목표는 펄스 체이스 패러다임의 길이를 형성 할 것입니다. 연구의 목표가 관심있는 세포와 함께 장기간에 걸친 조직의 재생을 이해하는 것이라면 긴 추격 기간이 필요할 수 있습니다. 마지막으로, 중재 또는 치료의시기가 결정되어야합니다. 펄스 기간 동안의 투여는 이 시간 동안 생성된 임의의 자손뿐만 아니라 관심있는 유전자를 발현하는 세포에 영향을 미칠 것이며, 반면에 추격 기간 동안의 투여는 주로 관심있는 세포의 자손에 영향을 미칠 수 있지만, 이것은 표지된 세포가 얼마나 빨리 분열하거나 분화하는지에 의존할 것이다. 우리가 활용한 펄스 체이스 실험 설계의 예는 그림 2A에 요약되어 있습니다.
또한 누출 발현으로 인한 배경 GFP 신호의 가능성을 인식하는 것이 중요합니다. 새는 발현은 독시사이클린의 부재 하에 rtTA와 오테트 서열 사이의 고유 결합 전위의 결과로서 발생하고, rtTA의 부재 하에서의 오테트 전이유전자의 잔류 활성의 결과로서 발생한다(도 34에서 검토됨). 누출 발현은 Tet 시스템의 하나의 약점을 나타내며, 누출이 종종 시스템에 수용가능한 단점이지만, 누출 발현이 Otet-DTA 동물에서 딥테리아 독소 (DTA)와 같은 독성 및 사망률을 초래할 수있는 상황은 이러한 시스템(35)의 사용을 제한 할 수 있습니다.
현미경 검사를위한 얇은 절편의 뇌 처리, 단면화 및 면역 형광
혈통 추적 실험 후 마우스의 뇌를 분석하려면 먼저 뇌에서 높은 자기 형광을 유발할 수있는 혈액과 CSF를 제거하기 위해 수심 관류를 통해 마우스를 관류해야합니다. 동물이 관류 될 수있는 두 가지 일반적으로 사용되는 고정제가 있습니다 : 조직 조직 고정제, 글리 옥살 고정 제 (GF) 또는 4 % 파라포름 알데히드 (PFA). 글리옥살 고정제는 PFA보다 가교결합이 적은 비교적 부드러운 고정 공정을 가능하게 한다. 이것은 조직 경직을 감소시키고, 항원 검색의 필요성을 감소시키며, 면역염색 동안 덜 농축된 항체 용액을 허용한다. 그러나, 메탄올을 함유할 경우 이는 자가형광(36)을 증가시키는 역할을 할 수 있다. 한편, PFA는 종종 보다 강력한 고정을 허용하며, 면역염색 중에 항원 검색이 필요하지만, PFA 고정 조직에서만 작동하는 항체가 존재하며, 후술하는 광학 클리어링 기술을 위해서는 4% PFA를 사용한 관류가 요구된다.
관류 후 관류 단계는 뇌가 하룻밤 사이에 관류 중에 사용되는 동일한 유형의 고정제에 잠기는 사후 고정 단계입니다. 이것은 관류 중에 완전히 고정되지 않았을 수도있는 뇌 영역이 계속 고정되도록합니다. 다음으로, 뇌는 조직 내 얼음 형성을 방지하기 위해 동결 단계 전에 가능한 한 많은 물을 제거하기 위해 인산염 완충 식염수 (PBS) 중의 수크로스에서 인큐베이션될 것이다 ("동결-보존"). 그런 다음 뇌는 처리를 위해 임의의 수의 시상, 코로나 또는 횡단 조직 절편으로 절단 될 수 있습니다. 정밀도와 재현성 모두를 위해, 보정된 뇌 블록은 동물 사이에서 일관된 브레그마 절단을 보장하는 방식으로 사용되어야 합니다. 뇌가 어떻게 단면화되는지에 영향을 줄 수있는 가장 중요한 요소는 관심있는 뇌 영역입니다. 예를 들어, 시상 절단은 한 조직 절편에서 더 많은 뇌 영역을 분석 할 수 있지만, 측심실의 측면 및 내측 측면이 그 차원에서 식별하기가 불가능하고 관상 평면에서 더 잘 관찰되기 때문에이 절단은 심실 - 심실 하부 영역 (V-SVZ)의 신경 / 교세포 형성 영역의 분석을 허용하지 않습니다. 이것은 성인 신경 생성 연구에서 중요한 구별이 될 수 있는데, 측심실의 측면 측에는 신경 인성 V-SVZ가 포함되어 있고 측심실의 내측 벽은 더 교세포 생성 틈새 시장입니다37.
조직이 관상식, 시상 또는 횡단 섹션으로 나뉘어지면 최적 냉각 온도 (OCT) 임베딩 용액을 사용하여 블록으로 얼어 붙습니다. 여기에서, 뇌는 드라이 아이스와 에탄올의 혼합물을 사용하여이 임베딩 물질 내에서 얼어 붙습니다. 얇은 단면 분석이 필요한 경우, 블록은 냉동 스탯 상에서 슬라이스되고, 요구되는 다운스트림 분석에 따라 양전하를 띤 유리 슬라이드를 얇은 단면(<20 μm)으로 부착할 수 있다. 충전되지 않은 유리 슬라이드도 사용될 수 있지만, 충전되지 않은 슬라이드의 사용은 조직이 슬라이드(38)로부터 막히지 않게 되는 결과를 초래할 수 있다. 중간 두께의 자유 부유 조직 절편 (>20 μm)이 필요한 경우, 조직은 자유 부유 섹션으로 수집됩니다. 두꺼운 섹션 (0.5-4 mm)이 필요한 경우, vibratome으로 얼지 않은 뇌 섹션을 슬라이스해야합니다. -20 ~ -80 °C에서 동결해야하는 슬라이드의 섹션과 4 ° C에서 저장되는 동결 부동 섹션 간의 저장 차이에 유의하는 것이 중요합니다.
뇌 제거 및 전체 마운트 면역 형광 공초점 현미경 검사
마우스 뇌에서 혈통 추적 세포에 대한 더 광범위하면서도 덜 상세한 분석이 필요한 경우, iDISCO 뇌 클리어링39 다음에 면역 염색 및 타일 z-스택 공초점 현미경 또는 광 시트 현미경 검사로 뇌 조직의 두꺼운 세그먼트에 대한 포괄적 인 분석이 가능합니다. 여기서, 마우스 뇌의 큰 절편은 광학적으로 제거될 것이고(탈형화 과정(39)), 이는 1mm 조직 절편에 걸쳐 형광 신호 이미징을 더 잘 허용한다. 이 과정의 단점은 높은 자기 형광과 세포 형태학의 고해상도 이미지를 얻는 능력이 감소하고 더 전통적인 방법 (얇은 냉동 절편 또는 자유 부유 섹션)과 비교할 때 필요한 작업 거리가 증가했기 때문에 상세한 공동 염색 분석입니다. 이러한 이유로, 우리는 개별 세포를 특성화하거나 분석하려고 시도하는 대신 여러 뇌 영역에서 대규모 혈통 추적 결과를 분석하기 위해 뇌 지우기를 권장합니다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 방법은 오하이오 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.
1. 실험 코호트 마우스에 대한 Tet-On 마우스 라인, 번식 전략 및 유전자형 분석을 추적하는 계보 생성
참고: 여기에서는 Cre 재조합을 겪는 형광 리포터 유전자로서 Rosa-mTmG를 사용한 Tet-On 마우스 시스템의 생성에 대해 간략하게 설명하지만, 다양한 다른 Cre-recombination-driven 리포터 라인은 Tet-On 시스템에서도 활용될 수 있습니다.
- 하나 이상의 R26 (mTmG) (+/+) 암컷과 함께 하나의 oTet-Cre (+/-) 남성의 짝짓기 케이지를 설정하십시오. 실험적 마우스 결합 설정에 대한 개요는 그림 1 을 참조하십시오.
- 결과 새끼 (F1)는 oTet-Cre (+/-) 또는 oTet-Cre (-/-) 및 R26 (mTmG) (+/-)입니다. 보충 표 1의 프라이머와 보충 표 2의 프로토콜에 따라 유전자형을 수행한다.
- 이유식에서 각 이유식에서 귀 펀치를 취하여 생식선 검사를 수행하십시오. GFP/FITC 스펙트럼의 후성형광 현미경으로 귀 펀치를 검사하여 동물이 발달 중에 생식계열 재조합을 받았는지 여부를 확인합니다. 그렇다면 동물은 모든 세포에서 GFP를 발현하고 귀 펀치는 mGFP 신호로 형광을 띠게됩니다. 이 동물들은 교미나 실험에 사용할 수 없습니다.
참고: 생식계열이 아닌 마우스의 귀 클립은 현미경으로 내인성 형광만 표시하는 반면(그림 1C), 생식계열 동물은 밝은 GFP 신호를 표시합니다(그림 1D). 대조군 귀는 형광 전이유전자를 함유하지 않는 마우스로부터의 것일 수 있다. 참고로, 귀 털은 내인성 형광이 높기 때문에 결정 인자로 사용해서는 안 됩니다(그림 1C). 추가적으로, 내인성 형광의 차이는 백색 대 흑색 외투 색의 마우스들 사이에서 관찰되며, 시험되는 마우스와 동일한 외투 색의 마우스로부터의 대조군이 이 분석에 사용될 필요가 있을 것이다. - 하나의 수컷 oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/-)을 하나 이상의 암컷 oTet-Cre (-/-) x R26 (mTmG) 마우스와 짝짓기하십시오.
- 결과 생성(F2)은 1/4 R26(mTmG)(+/+) 및 1/2 Cre(+/-)가 됩니다. 하나의 oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) (+/+) 동물을 하나 이상의 mTert-rtTA (+/+) 동물과 교미하여 mTert-rtTA (+/+) 동물과 교차시킨다.
참고: 우리는 mTert-rtTA (+/+) 동물을 사용했지만, 이 과정은 모든 rtTA 마우스 라인30에서 수행할 수 있습니다. - 실험 동물의 경우 mTert-rtTA (+/+) 또는 (+/-) x oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) 또는 (+/-)를 생성하도록 번식을 설정하십시오.
2. Cre의 독시사이클린 유도 및 펄스 체이스 설계
- 동물이 연구를 시작하기에 적절한 나이에있을 때, 식수를 dox 물로 대체하십시오 : 5 % 자당과 2 mg / mL 독시사이클린 히클레이트를 함유 한 식수. 생성된 형광 발현 패턴에 대한 대조군으로서 실험동물과 동일한 독시사이클린 펄스체이스를 받는 Cre 음성 동물을 사용한다.
- 준비 후, 독스 물을 4°C에서 최대 1개월 동안 저장한다. 자세한 내용은 표 1 을 참조하십시오. Dox 물은 dox 물이 실온에서 더 오랜 기간 동안 방치되면 곰팡이 성장이 발생할 수 있기 때문에 바뀌기 전에 최대 5 일 동안 마시는 병에있는 동물에게 투여 될 수 있습니다.
참고: mTmG 전이유전자(초기 mTmG 페이퍼)를 이용할 때 mGFP 신호의 유도를 위해 적어도 2일의 독시사이클린 펄스가 필요하다.
참고 : 우리는 2 mg / mL 이외의 독시사이클린 농도를 테스트하지 않았습니다. 이전의 문헌들은 이 농도가 음용수(29)를 통해 투여될 때 가장 높은 효과를 갖는다는 것을 확인하였다. 전달되는 독시사이클린의 양은 각 동물이 마시는 양에 따라 다를 수 있습니다. 독시사이클린 주사 또는 위관은 또한 동물(40) 사이에서 일치하기 위해 행해질 수 있다.
- 준비 후, 독스 물을 4°C에서 최대 1개월 동안 저장한다. 자세한 내용은 표 1 을 참조하십시오. Dox 물은 dox 물이 실온에서 더 오랜 기간 동안 방치되면 곰팡이 성장이 발생할 수 있기 때문에 바뀌기 전에 최대 5 일 동안 마시는 병에있는 동물에게 투여 될 수 있습니다.
- 맥박 기간이 끝나면 케이지에서 dox 물을 제거하고 정상적인 식수로 교체하십시오. 동물들은 이제 죽을 때까지 '추격'기간에있을 것입니다.
3. 심경 관류와 뇌 해부
- 새장에서 마우스를 제거하고 왼쪽 엄지 손가락과 검지를 사용하여 동물을 제지하십시오. 복강 내 (i.p.) 주사를 통해 동물에게 0.9 % 멸균 식염수에 100 mg / mL 케타민과 20 mg / mL 자일라진 용액을 주사하여 200 mg / kg 케타민과 20 mg / kg 자일라진의 최종 농도를 얻으십시오. 자세한 내용은 표 1 을 참조하십시오.
주의: 마취 프로토콜은 국가에 따라 다를 수 있습니다. 추가적으로, 뇌 수집 및 분석의 목적을 위해 관류를 수행할 때 이해되어야 하는 미세아교세포 형태학 및 작용 및 코르티코스테론 수준의 변화를 포함하여 뇌에 대한 마취제의 효과가 있다(41,42). - 약 1-2 분 후에 동물은 오른쪽 반사를 잃게됩니다. 이것을 테스트하기 위해 동물을 등에 대고 발로 굴러 갈 수 없다면 오른쪽 반사를 잃어 버렸습니다.
- 약 5-10 분 후에 동물은 페달 반사를 잃게됩니다. 페달 반사를 확인하려면 엄지와 검지를 사용하여 동물의 발을 꼬집습니다. 반응이 없으면 점프 또는 근육 경련의 형태로 엄지와 검지의 손톱을 사용하여 동물의 발을 꼬집습니다. 반응이 없으면 동물은 페달 반사를 잃어 버렸습니다.
참고 : 동물이 주사 후 15 분 이상 페달 반사에 반응하면 초기 케타민 / 자일라진 주사의 1/2의 추가 주사가 필요할 수 있습니다. 나이, 성별, 유전자형, 표현형 및 치료는이 약물 칵테일에 대한 동물의 반응에 영향을 줄 수 있습니다. - 오른쪽 및 페달 반사가 손실 된 후, 장갑을 낀 손가락으로 마우스 안구를 가볍게 접촉시켜 안구 반사를 테스트하십시오. 반응의 부족은 안구 반사가 손실되었음을 나타냅니다.
- 핀이 가능한 작업 표면에 고정된 발로 마우스를 수핀 위치에 고정시킵니다.
- xiphoid 과정 아래 약 1-2cm 아래의 흉부 중추를 따라 외과 용 가위로 피부를 절개하십시오. xiphoid 과정까지 우수하게 자릅니다.
- 포셉으로 xiphoid 과정의 연골을 잡으십시오. 가위를 삽입하고 쥐의 오른쪽을 따라 대각선으로 쇄골 수준까지 근육 조직과 흉곽을 자릅니다.
- 포셉으로 흉부 근육 조직을 올리고 심장이 시각화 될 때까지 횡격막을 통해 슬라이스하십시오. 그런 다음 마우스의 왼쪽을 따라 동일한 대각선을 잘라 심장과의 접촉을 방지하십시오. 지혈제를 사용하여 흉부 근육 조직을 구멍에서 멀리 떨어 뜨립니다.
참고: 이 시점에서 마우스는 더 이상 숨을 쉴 수 없으므로 다음 단계 전에 사망을 방지하기 위해 신속하게 작업하십시오.
- 포셉으로 흉부 근육 조직을 올리고 심장이 시각화 될 때까지 횡격막을 통해 슬라이스하십시오. 그런 다음 마우스의 왼쪽을 따라 동일한 대각선을 잘라 심장과의 접촉을 방지하십시오. 지혈제를 사용하여 흉부 근육 조직을 구멍에서 멀리 떨어 뜨립니다.
- 무딘 포셉으로 박동하는 심장을 고정시키고 대동맥 아치의 바닥을 통해 좌심실에 분배 바늘을 삽입하십시오.
- 바늘 베이스를 삽입 부위 바로 위의 좌심실에 고정시킵니다.
- 오른쪽 심방을 절개하고 혈류의 첫 징후가 나타나면 8.11 mL / 분에서 20 mL의 1x PBS로 동물을 관류하기 시작하십시오.
- 1x PBS가 신체를 관류시킨 후, 다운스트림 적용을 위한 적절한 고정제로 전환하고 마우스를 20 mL의 고정제로 관류시킨다.
- 냉동 절편화 및 면역염색을 위해, 뇌 제거를 위한 글리옥살 고정제와 함께 동물을 관류시키고, 동물을 1x PBS (pH 7.4) 중의 4% PFA로 퍼퓨즈한다.
참고 : 성공적인 관류의 징후로는 동물의 뻣뻣함 (글리옥살로 약간의 뻣뻣함, PFA로 강렬한 뻣뻣함) 및 조직 전체에 보이는 혈관이 부족합니다.
- 냉동 절편화 및 면역염색을 위해, 뇌 제거를 위한 글리옥살 고정제와 함께 동물을 관류시키고, 동물을 1x PBS (pH 7.4) 중의 4% PFA로 퍼퓨즈한다.
- 마우스를 무력화시키고 뇌간으로 가위를 삽입하고 양쪽의 전두엽 봉합사까지 스쿼모살 봉합사를 따라 절단하여 뇌를 제거합니다. 그런 다음 fontonasal 봉합사를 가로 질러 두개골 뚜껑을 제거하고 후각 전구가 손상되지 않도록주의하십시오. 거기에서 두개골을 거꾸로 돌리고 구부러진 포셉을 사용하여 뇌를 제거하고 시신경을 절단하십시오.
- 관류된 뇌를 조직 카트리지에 넣고, 4°C에서 밤새 동물을 관류시키기 위해 사용된 고정제에 침지시킨다.
4. 뇌 치료, 슬라이스 및 면역 염색
- 뇌 치료 및 슬라이싱
- 글리옥살 고정제로부터 뇌 카트리지를 제거하고, 4°C에서 2일 동안 또는 뇌가 가라앉을 때까지 1x PBS 중의 15% 수크로오스에서 인큐베이션한다.
- 15% 수크로오스로부터 뇌 카트리지를 제거하고, 4°C에서 2일 동안 또는 뇌가 가라앉을 때까지 1x PBS 중의 30% 수크로오스에서 인큐베이션한다.
참고: 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오. - 1x PBS에서 30 % 수크로오스에서 뇌를 제거하고 코로나 뇌 블록 또는 시상 뇌 블록을 사용하여 뇌를 다양한 '블록'으로 분리하십시오.
- OCT 화합물에 코로나 또는 시상 뇌 절편을 임베드하여 드라이 아이스와 에탄올 (EtOH)의 혼합물 위에 뇌 절편을 배치한다. OCT가 백색으로 변하고 고체가 된 후, 드라이아이스-EtOH 혼합물로부터 제거하고, 파라필름으로 싸서 -20°C에서 밀폐된 백 내부에 보관한다.
- 냉동실에서 얼어 붙은 블록을 제거하고 내부 온도가 -20 °C로 설정된 냉동 장치 내부에 놓습니다. OCT를 사용하여 블록을 금속 척에 부착하여 조직이 단단히 부착되도록 합니다. 조직이 척에 얼어 붙을 때까지 ~ 5 분 정도 기다리십시오. 조직을 7 μm로 슬라이스하고, 각 조직 조각을 충전된 유리 슬라이드 상에 놓는다.
- 슬라이드를 37°C에서 하룻밤 동안 베이킹하도록 허용하고, 이어서 면역염색에 사용될 때까지 -20°C에서 놓는다.
- 면역 염색
- 실온 (RT)으로 슬라이드를 따뜻하게하고 얼음처럼 차가운 아세톤으로 15 분 동안 포스트 픽싱하십시오.
- 슬라이드를 1x 헹굼 완충액 (예를 들어, IHC Select TBS 린스 완충액)에서 5분 동안 세척하고, 각 단계 사이에 RT에서 60 rpm으로 진탕한다.
- RT에서 10분 동안 0.3% 트리톤 X-100으로 핵 항원을 염색하기 위해 투과화합니다. RT에서 10분 동안 0.3% Tween-20으로 세포질 항원을 염색하기 위해 투과화하십시오.
- 1x DAKO 항원 검색 용액의 50-100 mL에서 마이크로웨이빙 슬라이드를 10분 동안 두 번 마이크로웨이빙하여 항원 검색을 수행한다. 그런 다음 RT에서 5 분 동안 헹굼 완충액으로 헹구십시오.
- 슬라이드를 RT에서 20분 동안 70% EtOH 중의 0.3% Typogen Black에서 인큐베이션한 다음, 헹굼 완충액으로 세척한다.
- 조직이 건조되지 않고 각 조직 주위에 소수성 장벽을 그립니다. 그 후 조직당 밀리포어 차단시약 1방울로 37°C에서 20분간 차단한다. 그 후 항체 희석제에 희석된 100 μL 일차 항체를 각 조직에 첨가하고 4°C에서 밤새 배양한다.
- 다음날, RT에서 10분 동안 알렉사 플루오르 이차 항체의 절편을 인큐베이션한다. 그런 다음 헹굼 버퍼에서 슬라이드를 씻으십시오.
- AlexaFluor 488에 접합된 1:500 항-GFP 항체의 100 μL의 뇌 절편을 표지하여 내인성 GFP 신호 마킹 추적 세포를 부스트하고 4°C에서 밤새 인큐베이션한다.
- 다음날, 헹굼 완충액 2x로 씻은 다음, 실행 중인 DI 물에서 5분 동안 세척한다.
참고: DI 물로 부드럽게 씻고, 슬라이드에서 뇌 부분을 제거할 수 있는 슬라이드 자체의 흐르는 물이 없도록 주의하십시오. - 5분 동안 100 ng/mL 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 카운터염색을 합니다. 그런 다음 실행 DI 물에서 5 분 동안 씻으십시오.
- 각 조직 섹션 위에 장착 배지 한 방울을 추가하고 22mm x 22mm 커버슬립으로 밀봉합니다. 최적의 신호를 보장하기 위해 장착 당일에 이미징을 권장합니다.
5. iDISCO 두뇌 지우기 (39에서 적응)
- 고정 및 단면화
- 뇌를 4°C에서 하룻밤 동안 4% PFA로 고정시킨 다음, RT에서 1시간 동안 다시 고정시킨다.
- RT에서 1 시간, 두 번 1x PBS로 뇌를 씻으십시오. 그런 다음 필요한 뇌 블록을 사용하여 1mm 두께의 절편으로 절단하고 1x PBS를 함유하는 5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다.
- 메탄올 전처리 (메탄올 사용)
참고 : 메탄올이 특정 단백질의 면역 염색에 영향을 미칠 가능성으로 인해 저자들은 메탄올이없는 iDISCO 프로토콜 대안39에 대한 프로토콜에 대해 Renier et al. 2014에 독자를 지적하고자합니다. 이 섹션의 다음 해결 방법에 대한 자세한 내용은 표 1 을 참조하십시오.- RT에서 1 h 두 번 (진탕) 동안 1x PBS로 세척하십시오.
- RT에서 1 h (진탕) 동안 50% 메탄올 (PBS 중)로 세척한다.
- RT에서 1 h (진탕) 동안 80% 메탄올로 세척한다.
- RT에서 100% 메탄올로 1시간 두 번 세척(진탕)한다.
- 표백제 샘플을20% 디메틸설폭사이드(DMSO)/메탄올(1 부피 30% H2O2/1 부피 DMSO/4 부피 메탄올, 얼음 냉기) 중 5% 과산화수소(H2O2)로 4°C에서 하룻밤 (진탕)시켰다.
- 표백 후, 샘플을 RT에서 1시간 동안 메탄올로 두 번 세척(진탕)한다.
- RT에서 1 시간 동안 20 % DMSO / 메탄올로 두 번 씻으십시오 (진탕).
- RT에서 1 h (진탕) 동안 80% 메탄올로 세척한다.
- RT에서 1 h (진탕) 동안 50% 메탄올로 세척한다.
- RT에서 PBS로 1시간 동안 두 번 세척(진탕)한다.
- PBS/0.2% 트리톤 X-100에서 RT에서 1시간 2회(진탕)로 세척한다.
- 맑은 뇌의 면역 염색
- 샘플을 오비탈 진탕기 상에서 하룻밤 동안 37°C에서 1x PBS/0.2% 트리톤 X-100/20% DMSO/0.3 M 글리신으로 인큐베이션한다.
- 오비탈 진탕기 상에서 3일 동안 37°C에서 1x PBS/0.2% 트리톤 X-100/10% DMSO/6% 염소 혈청으로 차단한다.
- 샘플을 돼지 점막으로부터 1x PBS/0.2% 트윈-20/10 μg/mL 헤파린 나트륨 염으로 37°C에서 1시간 동안 세척한 다음, 1x PBS/0.2% 트윈-20/10 μg/mL 헤파린/5% DMSO/3% 염소 혈청을 함유하는 1:500 농도의 토끼 항-GFP AlexaFluor 488을 함유하는 37°C에서 2일 동안 오비탈 진탕기에서 인큐베이션한다.
- 샘플을 1x PBS/0.2% Tween-20으로 10 μg/mL 헤파린으로 오비탈 진탕기에서 37°C에서 1시간 동안 3회, 2일 동안 하루에 한 번 세척한다.
- 샘플을 15mL 코니컬 튜브의 50% v/v 테트라하이드로퓨란(THF)/H2O10mL에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- 샘플을 80% THF/H2O의 10 mL에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
- 샘플을 100% THF에서 1시간 동안 두 번 인큐베이션한다.
- 멸균된 닦아내기로 샘플을 건조시키고 바이알 바닥에 가라앉을 때까지 디클로로메탄에서 배양한다(약 40분). >60 분 동안 배양하지 마십시오.
참고 : 흄 후드 아래에서 디클로로 메탄을 처리해야합니다. - 샘플을 맑을 때까지 (>2 h) 디벤질 에테르 (DBE) 18 mL로 인큐베이션한다.
- 이미지를 만들 준비가 될 때까지 샘플을 RT의 DBE에 저장합니다.
참고: 최상의 결과를 얻으려면 지우기가 완료된 후 가능한 한 빨리 샘플을 이미지화하는 것이 중요합니다.
6. 얼룩진 슬라이드 또는 맑은 뇌의 이미징
- 면역염색된 뇌 절편을 이미지화하려면 여러 항체의 동시 발현을 확인할 수 있는 공초점 현미경을 통해 슬라이드를 분석합니다. 우리는 HyD S 하이브리드 검출기와 함께 라이카 스텔라리스 5 현미경을 사용하지만 모든 포인트 스캐닝 공초점 현미경이 작동합니다. 목표는 HC PL APO 10x/0.40 CS2, HC PL APO 40x/1.30 OIL CS2 및 HC PL APO 63x/1.40을 포함합니다.
- 올바른 레이저 라인과 방출 필터를 구성합니다. 필요한 레이저 및 상응하는 레이저 강도는 사용되는 현미경 및 형광단 조합의 적용을 받습니다.
참고: 다이오드 405nm와 백색광 레이저의 조합을 사용하여 누화를 줄이고 제거하는 데 사용되는 각 형광단 또는 형광단 그룹에 대한 여기 및 방출 스펙트럼을 미세 조정합니다. 전통적인 레이저/필터 조합도 사용하여 비슷한 결과를 얻을 수 있지만 채널 블리드에 세심한주의를 기울이십시오. 블리드 스루는 각각의 특정 레이저에 의해 어떤 채널이 영향을 받는지 확인하기 위해 각각의 원하는 방출 필터 조합과 함께 단일 레이저 라인을 켜서 식별할 수 있다. 예를 들어, 다이오드 405 nm 레이저가 GFP 방출 필터에서 가시적 형광을 생성하는 경우, 발생하는 스루드가 있다. 여러 채널을 프레임별로 순차적으로 이미지화하여 블리드가 발생하지 않도록 크게 줄입니다. - mTmG 리포터와 공동 염색된 Tet-On 뇌의 경우, DAPI (ex. 405 nm, em. 450 nm), GFP (ex. 488 nm, em. 509 nm), tdTomato (ex. 555 nm, em. 582 nm), 및 상응하는 원거리 적색 형광단을 선택하여 이차 항체에 사용된 형광단과 일치시킨다. Alexa Fluor 647(예: 651nm, em. 667nm)을 권장합니다.
- 먼저 GFP와 형광 보조로 염색된 Cre-대조군 뇌로 설정을 확립한다. 이러한 뇌 절편은 형광 항체로부터의 배경 형광을 조절하고 실제 GFP 신호를 나타내지 않을 것이다.
- 위에서 아래로, 왼쪽에서 오른쪽으로 각 뇌 섹션을 분석하여 분석에서 누락 된 신호가 없는지 확인하십시오. 동일한 뇌 섹션을 다양한 배율로 이미징하는 경우 배율이 높을수록 mTomato 신호를 더 빨리 표백하므로 낮은 배율을 먼저 사용하는 것이 좋습니다.
- 올바른 레이저 라인과 방출 필터를 구성합니다. 필요한 레이저 및 상응하는 레이저 강도는 사용되는 현미경 및 형광단 조합의 적용을 받습니다.
- 맑은 뇌를 이미지화하려면 자동화 된 단계와 자동화 된 타일링 기능이있는 거꾸로 된 공초점 현미경을 사용하십시오. 우리는 라이카 스텔라리스 5 현미경을 사용합니다. 샘플이 너무 두껍기 때문에(>500μm), 효과적으로 달성할 수 있는 배율을 제한하는 더 큰 작동 거리가 필요합니다. 우리는 HC PL APO 10x/0.40 CS2 목표를 모든 클리어된 뇌 영상에 사용합니다.
- 유리 바닥 접시에 평평한 뇌 섹션을 깔고 디벤질 에테르에 잠기는 것으로 시작하십시오.
참고 : Dibenzyl ether는 대부분의 대물 렌즈와 대부분의 플라스틱에 부식성이 있습니다. 이러한 이유로 유리 바닥 접시의 모든 내부 플라스틱은 빠른 건조 실리콘 엘라스토머로 코팅해야합니다. - 올바른 레이저 라인과 방출 필터를 구성합니다. mTmG 리포터와 함께 Tet-On 뇌를 공동 염색하려면 DAPI, GFP, tdTomato 및 상응하는 원거리 적색 형광단을 선택하여 보조 항체에 사용된 형광단과 일치시킵니다. 원하는 해상도를 설정하면 최소 1024 x 1024를 사용하는 것이 좋습니다. 핀홀을 1 AU로 설정합니다.
- 레이저 강도 및 검출기 이득을 먼저 GFP와 형광 이차 둘 다로 염색된 Cre-대조군 뇌로 확립한다. 이러한 뇌 절편은 형광 항체로부터의 배경 형광을 조절하고 실제 GFP 신호를 나타내지 않을 것이다.
- 레이저 강도와 검출기 이득이 최적화되면 이미징을 위해 뇌를 매핑하십시오. 먼저 뇌 섹션의 전체 둘레를 찾아 이미지 획득의 X 축과 Y 축을 설정합니다. 다음으로, 초점을 조직의 중심 깊이에 대해 설정하여 Z축을 식별하고 Z 위치 지정 컨트롤을 사용하여 조직의 "가장 높은" 지점(가장 양수 Z-값)을 찾습니다. 조직의 다양한 영역을 스캔하여 필요에 따라 최대 Z축 높이를 증가시킨다.
- 조직의 전체 두께를 얻기 위해 필요한 "가장 낮은"(가장 음의 Z-값) 점에 대해 반복하십시오. 스텔라리스 5는 초점의 ± 250 um의 한계를 가지고 있습니다. 이로 인해 광학 섹션은 Z축에서 500μm 두께로 제한됩니다. 뇌 부분의 3D 영역이 이제 알려져 있습니다.
- Z 스텝 크기를 6μm로 설정하고 이미지 획득을 시작합니다. 획득 시간은 여러 요인에 따라 다르며 원하는 매개 변수에 따라 몇 시간에서 며칠까지 다양 할 수 있습니다. 이미지 수집 시간을 줄이려면 해상도를 줄이거나, 레이저 스캔 속도를 높이거나, 스텝 크기를 늘려 보십시오.
- 클리어 된 전체 뇌 섹션의 타일 이미지가 캡처되면 원하는대로 분석하십시오.
- 유리 바닥 접시에 평평한 뇌 섹션을 깔고 디벤질 에테르에 잠기는 것으로 시작하십시오.
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Representative Results
형광 리포터가 있는 Tet-On 시스템에서 발생하는 형광 신호는 관심 있는 프로모터 및 사용된 형광단에 따라 달라지지만, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG 동물로 결과를 분석한 방법을 설명합니다. 펄스 체이스 후 성인 뇌의 분석은 다양한 해부학 적 틈새 시장에 걸쳐 GFP 발현 세포를 막으로 만들었습니다. 다양한 세포 유형 간의 형광 강도의 차이에 유의해야합니다. 형광 강도에 관한 한 가지 변수는 세포막의 크기입니다. 예를 들어, 맥락막 신경총의 맥락막 상피 세포 (CPECs)는 두꺼운 세포막과 주변 세포와 쉽게 구별되는 강한 형광 신호를 가지고 있습니다 (그림 4A, B). 그러나, 맥락막 신경총에서 다른 더 작고 현재 확인되지 않은 세포 유형은 더 약한 GFP 신호를 가졌다 (도 4C). 소뇌에서, 베르그만 신경교세포는 바스켓 세포보다 더 높은 수준의 mGFP를 발현했고, mGFP 발현의 변화는 심지어 개별 바스켓 세포 사이에 존재하였다(도 4D). 후각 전구의 사구체층 내의 후각 감각 뉴런 축삭은 또한 높은 수준의 mGFP를 발현했다 (그림 4A, E). 따라서 모든 mGFP+ 세포가 확인되도록 하기 위해서는 mTmG 동물의 뇌를 통해 밝고 희미한 GFP+ 세포를 모두 확인하는 것이 중요하다. mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG 동물에서, 우리는 대뇌 피질을 포함한 뇌 영역에 걸쳐 낮은 배경 mGFP 발현을 관찰하였다(도 4A). 흥미롭게도, 소뇌 및 뇌간은 이러한 방식으로 더 낮은 배경 mGFP 발현을 보였다 (도 4A).
혈통 추적 후 뇌 조직을 분석하는 동안 뇌 영역과 세포 유형 모두에서 mGFP 및 mTomato 발현 패턴에 차이가 있습니다. 후각 전구의 사구체층을 채우는 후각 감각 뉴런 축삭은 대부분의 다른 뇌 영역과 비교할 때 토마토막을 높은 수준으로 발현했으며, 동일한 뉴런이 mGFP+인 경우에도 일부 세포가 mTomato 신호를 더 느리게 잃는 것으로 나타났음을 나타낸다(도 4D). 대조적으로, 맥락막 신경총에서, mGFP+ 세포는 낮은 mTomato를 발현하였다(도 4B,C). 대부분의 다른 뇌 영역에서는 토마토 신호가 세포 유형간에 고르게 퍼져 있으며, 내피 세포는 형광 신호가 적색 형광 배경에서 눈에 띄기에 충분히 밝은 유일한 세포 중 일부입니다 (그림 4B). 재조합 동안 게놈으로부터 mGFP 발현의 활성화 및 mTomato의 절단은 mTomato 발현의 손실을 초래하지만, 막 상에서 발현되는 mTomato 형광단은 분해될 때까지 유지된다. 이러한 이유로, mGFP+ 세포는 종종 가변 mTomato 신호를 발현할 것이며, 이는 재조합의 최신성, 세포 유형 및 세포막의 크기에 의존할 것이다. 따라서 mGFP의 발현을 기반으로 세포를 분석하고 mGFP와 mTomato를 모두 발현하는 경우 분석에서 제외하지 않는 것이 중요합니다.
대안적인 리포터들은 또한 Tet-On 시스템과 함께 활용될 수 있다. Cre 재조합은 일반적으로 Rosa-GFP 또는 Rosa-RFP 동물에서 어떠한 형광 태그도 발현하지 않는 세포에서 GFP 또는 RFP의 발현을 유도하는 작용을 할 수 있다. 여기서, GFP 또는 RFP의 분석은 관심있는 프로모터의 발현을 지시할 것이고, mTmG 동물과 같이 형광단 신호는 제거되지 않을 것이다. 단일 형광단 리포터는 mTmG 동물의 막 토마토가 적색 파장에서 염색되는 것을 방지하기 때문에 더 많은 형광 항체 조합으로 면역 염색을 허용합니다.
그림 1. Tet-On 마우스 라인의 생성. (A) 개별 마우스 라인에서 mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG 마우스의 생성을 위한 번식 계획의 개요. (b) mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG 마우스 라인에서 Tet-On 시스템의 개략도. (C-D) 비생식계열(C) 및 생식계열(D) mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG 마우스로부터의 후성형광 현미경의 FITC 채널로 이미지화된 귀 클립의 대표적인 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 계보 추적 Tet-On 마우스를 사용한 실험 설계. 기저 증식, 이동 및 분화에서 Tet-On 마우스로 가능한 실험의 그림 (1) 재생 또는 재 평형을위한 추격전이없는 독스 펄스 동안의 치료로 (2), 장기 효과를 시각화 할 수있는 기회가있는 맥박 동안의 개입 (3). 후속 추적없이 2 일의 짧은 펄스는 TERT + 세포의 거의 기저 상태에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다.이 세포는 활성화, 증식, 이동 또는 분화 할 시간이 거의 없기 때문입니다 (4). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG 마우스 뇌의 뇌 제거. (A) 고정 후 1mm 뇌 절편의 궁수 절편. (B) 개별 뇌 절편은 iDISCO 뇌 클리어링(39)을 위해 5mL 튜브에 배치된다. (C) 클리어 된 두뇌는 유리 바닥 접시에 넣고 이미지 획득 중에 굴절률 일치를 위해 DBE에 잠겨 있습니다. (D) 뇌의 전체 영역을 일련의 Z 스택으로 캡처하여 뇌의 포괄적 인 3D 이미지를 형성합니다. 그런 다음 3D 데이터 세트에서 2D 이미지를 만들기 위해 투영된 Z 최대 강도가 될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 성인 mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG 마우스 뇌의 계보 추적은 3 주간의 맥박과 독시사이클린의 11 일 추격 후에 발생합니다. (A) 인셋으로 표시된 mGFP 신호의 특정 영역을 갖는 성인 mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG 마우스의 뇌 섹션을 지웠다(N=3마리의 수컷 마우스). (B-C) mTert-rtTA의 대표적인 이미지::oTet-Cre::Rosa-mTmG 맥락막 신경총은 mGFP+ CPECs (B) 및 더 작은, 희미한 mGFP+ 세포 유형 (C; N = 남성 4 명, N = 여성 6 명). (D) mTert-rtTA의 대표적인 이미지::oTet-Cre::Rosa-mTmG 소뇌 베르그만 글리아(밝은) 소뇌의 분자층에 있는 바스켓 세포(희미한; N = 남성 4 명, N = 여성 6 명). (E) mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG 뇌의 후각 사구체층의 대표적인 이미지. 점선은 사구체 구획을 나타냅니다 (N = 4 남성, N = 6 여성). 배율 막대는 100μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 2. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
생체 내에서 성체 마우스 뇌 내에서 줄기 세포를 마킹하는 삼중 트랜스제닉 계보 추적 마우스 라인의 생성, 활용 및 분석을 위한 방법이 기재되어 있다. 면역 염색 또는 뇌 제거와 결합하면 뇌를 가로 지르는 추적 된 형광 세포의 확인 및 특성화가 달성 될 수 있습니다. 이 기술은 표지 된 줄기 세포가 활성화, 이동, 분화 또는 증식 할 때 플라스틱 / 재생 / 리모델링 잠재력을 이해하는 기능을 제공합니다. 티미 딘-H3 및 BrdU와의 라벨 보유를 통해 얻은 이전의 데이터는 상아질 자이러스의 V-SVZ, 후각 구근 및 과립 하부 영역이 성인 포유류 2,3,4,5,6,7,8,43에서 유일한 신경 인성 뇌 영역이라고 결론 지었지만, 이제는 성인 신경 발생이 피질44에서도 발생한다는 것이 이해되고, 시상 하부45,46, 및 선조체47,48,49뿐만 아니라 잘 연구되지 않은 잠재적으로 다른 새로운 틈새 시장. 아교세포 전구체 세포가 신생아 성상세포와 희소돌기아교세포를 만드는 과정인 성체 교형성은 뇌 전역에서도 발생하며37, 아교세포와 뉴런은 동일한 다분화능 줄기세포로부터 유래한다는 가설을 세운다. 이러한 이유로, 계보 추적 연구는 성인 포유동물 뇌에서 뉴런과 신경교세포를 보충하고 재생하는 데 기여하는 다양한 줄기 세포 유형의 역할을 이해하는 데 필수적이었다 (50에서 검토).
성인 뇌 가소성에 대한 연구의 경우, 최적의 나이는 뮤린 뇌가 발달을 완료 한 12 주령입니다51. 독시사이클린 펄스의 길이와 후속 추격을 계획할 때, 관심 있는 과정에 대한 이해가 중요하므로 펄스-체이스 타이밍은 관심 있는 과정이 발생할 수 있을 만큼 충분히 길다. 예를 들어, V-SVZ에서 성체 신경 줄기 세포 (ANSCs)로부터 후각 전구에 신생아 뉴런의 생성은 이전의 계보 추적 연구52에 의해 결정된 바와 같이 대략 4 주이다. 따라서 V-SVZ에서 ANSC를 라벨링하는 펄스 체이스 연구는 V-SVZ의 ANSC가 분열 할 수 있도록하고, 이러한 ANSC가 중간 세포 유형으로 분화하고, 이러한 중간 세포 유형이 후각 전구로 이동하여 성인 태생 뉴런으로 분화 할 수 있도록하기 위해 그 기간 내에 있어야합니다. 추격의 길이는 표지 된 세포와 그 자손이 이동 및 분화를 계속해야하는 시간을 결정할 것이지만, 이러한 과정은 맥박 중에도 발생할 것입니다. 종합하면, 각 계보 추적 실험의 타임 라인이 적절한 프로세스가 발생할 수 있도록해야하기 때문에 관련된 프로세스를 이해하는 것이 중요합니다.
이 원고는 Tet-On 시스템을 자세히 설명하지만, 활용 될 수있는 다른 계보 추적 전이유전자가 존재합니다. CreERT2 전이유전자는 타목시펜 유도체인 타목시펜 또는 4-OHT의 존재 하에서만 활성인 Cre 재조합효소의 발현을 허용한다. 이러한 Cre가 관심있는 프로모터에 의해 조절될 때, 4-OHT 또는 타목시펜 투여는 단지 그 프로모터를 발현하는 세포에서 Cre 재조합을 생성할 것이다. Rosa-LSL-GFP 또는 Rosa-mTmG와 같은 리포터 유전자와 짝을 이룬다면, Cre-lox 재조합은 타목시펜 투여 동안 Cre를 발현하는 세포를 불가분하게 표시한다. 이 시스템의 한 가지 단점은 태아 및 성인 두뇌 모두에서 신경 발생에 오래 지속되는 부작용이있는 타목시펜의 사용입니다17. 이러한 이유로 CreERT2 라인을 사용한 계보 추적 연구는 관련된 주의 사항을 고려해야 합니다.
성체 뇌에서의 혈통 추적 연구는 종종 네스틴과 같은 줄기 세포의 마커 또는 NG253,54를 포함한 신경교 전구체 세포의 마커로 수행됩니다. 결과 데이터는 신생아 성숙 세포 유형으로의 이러한 세포의 회전율 및 분화를 나타내는 반면, 성인 뇌에서 다양한 다른 세포 유형에 의한 이러한 마커의 발현은 혼란 스러울 수 있습니다. 예를 들어, 유사분열55에 관여하는 중간 필라멘트 단백질인 네스틴은 성숙한 뉴런(56) 및 수막세포 유형(57)에 의해서도 발현된다. 다른 줄기 세포 마커는 신경교세포 세동 산성 단백질(GFAP)58,59, 및 글루타메이트 아스파르테이트 수송체 1(GLAST)60을 포함하며, 이는 성인 뇌 전반에 걸쳐 성상세포에 의해 발현되는 61일 뿐만 아니라. 이러한 이유로 추가 마커가있는 계보 추적 연구가 필요합니다. 우리가 뇌에서 성인 가소성의 광범위한 영향에 대해 더 많이 알게되면서, 이러한 과정과 그 자손에서 역할을하는 세포의 특성화와 분석은 신경 퇴행성 건강 등에 관련된 신경 인성 및 교세포 형성 경로에 대한 우리의 이해에 매우 중요합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 다이애나 칼론 박사 (보스턴 아동 병원, 하버드 의과 대학)와 매튜 린스 박사 (조슬린 당뇨병 센터; 메인 메디컬 센터 연구소) mTert-rtTA 동물을 활용한 안내를 위한 연구.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody diluent | Agilent | S080983-2 | |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent | S2367 | |
| anti-GFP antibody | Invitrogen | A2311 | Use at 1:500-1:000 |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | |
| B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J | The Jackson Laboratory | JAX:006234 | |
| B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX:007676 | |
| Blocking Solution (IHC) | Millipore Sigma | 20773 | |
| Blunt needle | BSTEAN | X0012SYHIV | |
| Coronal brain block | Braintree | BS-2000C | |
| Cover slip | Corning | 2850-22 | |
| Cryostat | Leica | CM1900 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D564 | |
| Dibenzyl ether | Millipore Sigma | 33630 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Doxycycline Hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0718 | |
| Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative | Amresco | H120 | This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265) |
| Hydrogen Peroxide Solution | Sigma-Aldrich | 516813 | |
| IHC Select TBS Rinse Buffer | Millipore Sigma | 20845 | |
| Ketamine | Westward | 0143-95095-10 | This product requires a DEA license for storage and use. |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Milipore Block | Millipore | 20773 | |
| Mounting medium | Millipore Sigma | 5013 | |
| Optimal Cutting Temperature Solution | Sakura | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS Solution (10X) | Teknova | P0496 | |
| Sagittal brain block | Braintree | RBM-2000S | |
| Saline | Braun | S8004-5264 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Sudan (Typogen) Black | Millipore Sigma | 199664 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 186562 | |
| Tissue cartridge | Simport | M512 | |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween-20 | Millipore Sigma | 655205 | |
| Xylazine | AnaSed | sc-362950Rx |
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