Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

איתור העברת גנים אופקית בתיווך פלסמידים מצומדים טבעיים באי-קולי

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64523
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2, 1, 2
1School of Biological Sciences, University of California Irvine, 2Department of Microbiology & Environmental Toxicology, University of California Santa Cruz

Summary

הצמידות מתווכת העברת גנים אופקית על ידי גיוס DNA פלסמיד על פני שני תאים שונים, מה שמקל על התפשטות גנים מועילים. עבודה זו מתארת שיטה נפוצה לזיהוי יעיל של העברת פלסמיד מצומד, המבוססת על שימוש בסמנים דיפרנציאליים בפלסמיד המצומד, התורם והמקבל כדי לזהות טרנסקוניוגציה.

Abstract

הצמידות מייצגת את אחד המנגנונים העיקריים המאפשרים העברת גנים אופקית בחיידקים גראם-שליליים. עבודה זו מתארת שיטות לחקר הגיוס של פלסמידים מצומדים טבעיים, תוך שימוש בשני פלסמידים טבעיים כדוגמה. פרוטוקולים אלה מסתמכים על נוכחות דיפרנציאלית של סמנים הניתנים לבחירה בפלסמיד תורם, מקבל ומצומד. באופן ספציפי, השיטות המתוארות כוללות 1) זיהוי פלסמידים מצומדים טבעיים, 2) כימות שיעורי הצמידות בתרבית מוצקה, ו -3) זיהוי אבחון של גנים עמידים לאנטיביוטיקה וסוגי רפליקון פלסמיד במקבלי טרנס-מצומדים על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR). הפרוטוקולים המתוארים כאן פותחו בהקשר של חקר האקולוגיה האבולוציונית של העברת גנים אופקית, כדי לסנן נוכחות של פלסמידים מצומדים הנושאים גנים של עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים הנמצאים בסביבה. ההעברה היעילה של פלסמידים מצומדים שנצפתה בניסויים אלה בתרבית מדגישה את הרלוונטיות הביולוגית של הצמידות כמנגנון המקדם העברת גנים אופקית בכלל והתפשטות עמידות לאנטיביוטיקה בפרט.

Introduction

בשנת 1946, לדרברג וטייטום1 תיארו תהליך מיני ב- Escherichia coli K-12 הידוע כיום בשם צימוד. צימוד חיידקים הוא תהליך שבו תא חיידק (התורם) מעביר באופן חד-כיווני חומר גנטי לתא אחר (המקבל) על ידי מגע ישיר בין תאים. הצמידות מופצת באופן נרחב בחיידקים2,3, אם כי החלק של תאי התורם המבטאים את מנגנון הצמידות הוא בדרך כלל קטן מאוד4.

פלסמידים הם רכיבי DNA חוץ-כרומוזומליים המשכפלים באופן אוטונומי. בנוסף לגנים המעורבים בשכפול פלסמיד ותחזוקתו, פלסמידים נושאים לעיתים קרובות מטען של גנים המעורבים בהסתגלות לאתגרים סביבתיים, כגון מתכות כבדות או חשיפה לאנטיביוטיקה5. פלסמידים מצומדים הם סוג של פלסמידים עם קבוצה של גנים מיוחדים המאפשרים את העברתם לתאים המקבלים ותומכים בהתמדה שלהם לאחר ההעברה6. פלסמידים מצומדים משתנים בגודלם בין 21.8 קילובייט ל -1.35 מגה בייט בחיידקים בפילום Pseudomonadota (שם נרדף לפרוטאובקטריה), כאשר החציון סביב 100 kb 5,7. הם גם בדרך כלל יש מספר עותקים נמוך, אולי כדי לשמור על הנטל המטבולי על המארח נמוך 8,9.

מנגנון הצמידות הטיפוסי מורכב מארבעה מרכיבים: מקור העברה (oriT), relaxase, חלבון צימוד מסוג IV, ומערכת הפרשה מסוג IV (מבנה דמוי צינור הנקרא pilus המאפשר לתורמים ליצור קשר עם מושתלים)6. רק חלק קטן מאוד מהתאים הנושאים פלסמידים מצומדים מבטאים את מנגנון הצמידות4, אך אם הפלסמידים מספקים יתרון כושר, הטרנס-מצומדים יכולים להתרחב במהירות באוכלוסייה. בין 35% ליותר מ-80% ממבודדי E. coli שנאספו מבתי גידול שונים הם בעלי פלסמידים מצומדים עם גנים המקנים עמידות לאנטיביוטיקה אחת לפחות10,11; לכן, העברת גנים אופקית בתיווך פלסמידים מצומדים היא מנגנון מרכזי המניע את ההתפשטות העולמית של גנים עמידים לאנטיביוטיקה12.

ניסויי הזדווגות שנערכו בתרביות מעבדה הראו כי תדירות הצמידות מושפעת מגורמים רבים, כולל אופי התאים המקבלים, שלב הגדילה, צפיפות התא, יחס תורם-מקבל, האם הצמידות מתבצעת במדיה נוזלית או מוצקה, פחמן, חמצן, מלחי מרה, ריכוזי מתכות, נוכחות תאי יונקים, טמפרטורה, pH וזמן הזדווגות13,14, 15.

עבודה זו מתארת פרוטוקולים לזיהוי נוכחותם של פלסמידים מצומדים בזן מארח נתון, לכימות קצבי הצמידות בתרבית מוצקה ולבדיקה כפולה של העברתם לתאים מקבלים. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש כצעד ראשון לזיהוי פלסמידים מצומדים טבעיים המתאימים למחקר. הם משתמשים במספר מינימלי של צעדים פשוטים מכיוון שהם נועדו לסנן את נוכחותם של פלסמידים מצומדים בחיידקים המתקבלים ממקורות מרובים (סביבתיים, קומנסליים ופתוגנים) בקנה מידה גדול (עשרות עד מאות תורמים).

בנוסף, מוצגות בדיקות לזיהוי האם הניוד של פלסמיד מצומד נתון אינו תלוי באנטיביוטיקה המשמשת לגילוי (כלומר, הרלוונטיות של גן העמידות לאנטיביוטיקה הברירה) ולהשוואת שיעורי הצמידות של שני פלסמידים מצומדים הנמצאים במבודדים סביבתיים שונים.

בהתבסס על ההרכב הגנטי של פלסמידים מצומדים רלוונטיים (פלסמיד רפליקון והרכב גנים של עמידות לאנטיביוטיקה), ניתן לשנות כל שלב בפרוטוקול כדי לחקור את ההשפעה של מגוון גורמים שעשויים להשפיע על קצב הצמידה.

תכנון ניסויי כללי:
המרכיבים החיוניים הדרושים להקמת ניסוי הזדווגות הם תאי תורם, זן מושתל ומדיה מוצקה לבחירת תורמים (אנטיביוטיקה A), מושתלים (אנטיביוטיקה B) וטרנס-מצומדים (אנטיביוטיקה A ו-B). Transconjugants הם תאים מקבלים השומרים ביציבות על פלסמיד הצמידות של התורם.

תאי התורם עמידים לאנטיביוטיקה (אנטיביוטיקה A) ורגישים לסמן או לסמנים המשמשים לבחירת תאים מקבלים (אנטיביוטיקה B). המיקום הגנומי של גן העמידות לאנטיביוטיקה (כלומר, האם הוא ממוקם בכרומוזום או בפלסמיד של תא התורם) אינו חייב להיות ידוע מראש, מכיוון שניוד סמני עמידות לאנטיביוטיקה למקבל (לאחר מגע ישיר בין תורם לנתרם) מרמז על כך שהסמנים שסופקו על ידי התורם היו בפלסמיד.

זן מושתל (הידוע כלוקח פלסמידים מצומדים) צריך להיות בעל סמן יציב לבחירה שאינו נוכח אצל התורם; סמן ברירה זה עמיד בדרך כלל לאנטיביוטיקה או ביוסיד הממוקם בכרומוזום. בחירת הנמען שישמש בניסויי הזדווגות היא קריטית, מכיוון שחלק מזני E. coli שונים זה מזה ביכולתם לקחת פלסמידים מצומדים16.

לאחר שהרכיבים האלה נוצרו, כל מושבה שגדלה על מדיה עם אנטיביוטיקה (A ו-B) לאחר מגע בין זוג תורם-מקבל היא טרנס-מצומדת משוערת (איור 1). זאת בהנחה שתורמים יכולים לגדול במדיה עם אנטיביוטיקה A אך אינם יכולים לגדול במדיה עם אנטיביוטיקה B, וכי מושתלים מסוגלים לגדול במדיה עם אנטיביוטיקה B, אך לא מסוגלים לגדול עם אנטיביוטיקה A. ניתן לאשר את ההעברה באמצעות שתי בדיקות אבחון. הבדיקה הראשונה כוללת זיהוי (על ידי תגובת שרשרת פולימראז [PCR] הגברה של גנים, או שיטות אחרות) של גנים הנמצאים בפלסמיד המצומד במושבות טרנס-מצומדות. הבדיקה השנייה כוללת שימוש בסמני צבע דיפרנציאליים המבוססים על מטבוליזם לקטוז. צבע המושבה הדיפרנציאלי מתגלה על ידי שימוש באגר MacConkey; הלקטוז שבאגר יכול לשמש כמקור תסיסה על ידי מיקרואורגניזמים מתסיסים לקטוז (LAC+). מיקרואורגניזמים אלה מייצרים חומצות אורגניות, במיוחד חומצה לקטית, אשר מורידות את ה- pH. אדום נייטרלי הוא מחוון pH הכלול במדיה שהופך מאוף-ווייט לאדום/ורוד בוהק כאשר ה- pH יורד מתחת ל-6.817. לפיכך, זנים חיוביים ללקטוז E. coli מייצרים מושבות ורודות גדולות יותר על אגר MacConkey, בעוד זנים שליליים ללקטוז מייצרים מושבות צהובות חיוורות ומושבות קטנות יותר על אגר MacConkey.

Figure 1
איור 1: תכנון ניסויי המשמש לזיהוי נוכחות של פלסמידים מצומדים בזנים תורמים. בדוגמה זו, התורם נושא פלסמיד מצומד עם גן עמידות לאנטיביוטיקה המקנה עמידות לאנטיביוטיקה A, אך הוא רגיש לאנטיביוטיקה B. לעומת זאת, למקבל יש קובע עמידות כרומוזומלית המקנה הגנה מפני אנטיביוטיקה B, אך הוא רגיש לאנטיביוטיקה A. Transconjugants עמידים לשתי האנטיביוטיקות (A ו- B), מכיוון שיש להם את פלסמיד הצמידות של התורם המקנה עמידות לאנטיביוטיקה A ואת הכרומוזום של המקבל המקנה הגנה מפני אנטיביוטיקה B. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתן לחשב את שיעור הצמידות של זוג תורם-מקבל (בתנאי ניסוי נתונים) על ידי חלוקת מספר הטרנסקונוטים במספר התורמים או במספר המקבלים; השיעור הראשון מציין את החלק של תאי התורם המציגים ביטוי פונקציונלי של מנגנון הצמידות על ידי התורם16,18, ואילו השיעור השני מציין את יכולתו של המקבל לקחת פלסמידים מצומדים 19,20. במחקר זה, אלא אם צוין אחרת, שיעור הצמידות מייצג את החלק של התאים המקבלים שהופכים לטרנס-מצומדים (כלומר, שיעור לכל מקבל).

כאן מדווחים על שני ניסויי הזדווגות עצמאיים, בהם מעורב מושתל E. coli אחד ושני תורמי E. coli. בנוסף, נעשה שימוש באנטיביוטיקה שונה לבחירת טרנס-מצומדים עבור אחד התורמים כדי לאשר שניתן לבחור פלסמיד יחיד עמיד לתרופות מרובות עם כל אחד מהגנים לעמידות לאנטיביוטיקה הנמצאים בפלסמיד המצומד.

זני התורם והמקבל המשמשים בעבודה זו רוצפו במלואם כדי להבין את כל המרכיבים של מערכת ניסויית זו; עם זאת, פרוטוקולים אלה תוכננו לסנן נוכחות של פלסמידים מצומדים במארחים של רצף לא ידוע, וניתן להשתמש בהם גם בהקשר ניסיוני זה; עם זאת, במקרה זה, הגנים הרלוונטיים הם ריצוף הראשון.

זני התורם והמקבל המשמשים בפרוטוקול הם:

תורם 1. אי קולי SW4955 נאסף באגם בבאטון רוז' (לוס אנג'לס, ארה"ב). יש לו פלסמיד מצומד 134,797 bp (p134797) עם IncFIC(FII) ו IncFIB (AP001918) replicons. פלסמיד מצומד זה מכיל גנים המקנים עמידות לצפלוספורינים מהדור השלישי (blaCTX-M-55), אמינוגליקוזידים (aac(3)-IIa ו-aadA1), פניקולים (catA2), טטרציקלינים (tet(A)), trimethoprim (dfrA14) וסולפונאמידים (sul3). למפה המלאה של עמ' 134797, ראו איור 2A. אי קולי SW4955 הוא חיובי ללקטוז, ומייצר מושבות ורודות על אגר MacConkey.

תורם 2. אי קולי SW7037 נאסף באגם אירי (מחוז אוטווה, אוהיו, ארה"ב). הוא נושא פלסמיד מצומד של 101,718 bp (p101718) עם רפליקון IncI1-I (אלפא). לפלסמיד המצומד הזה יש גן המקנה עמידות לבטא-לקטמים (blaCMY-2). למפה המלאה של עמ' 101718, ראו איור 2B. אי קולי SW7037 הוא גם חיובי ללקטוז, ומייצר מושבות ורודות על אגר MacConkey.

Figure 2
איור 2: מפה גנטית של פלסמידים מצומדים ששימשו במחקר זה . (A) פלסמיד p134797, פלסמיד המצומד שנמצא בזן E. coli SW4955. (B) פלסמיד p101718, פלסמיד מצומד שנמצא בזן E. coli SW7037. גנים של עמידות לאנטיביוטיקה מסומנים בכחול, וגנים השייכים למנגנון הצמידות מסומנים באדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

נמען. אי קולי LMB100 משמש כנמען. זהו זן פלסמיד ללא עמידות לריפמפין (100 מ"ג/ליטר) ולסטרפטומיצין (100 מ"ג/ליטר). עמידות לשתי אנטיביוטיקות מפחיתה את האפשרות להיווצרות מוטציות עמידות אצל התורם שיפריעו לפרשנות התוצאות. בנוסף, E. coli LMB100 הוא שלילי ללקטוז, וניתן להבדיל אותו משני הזנים התורמים מכיוון שהוא מייצר מושבות צהובות חיוורות ומושבות קטנות (בניגוד למושבות גדולות וורודות יותר) על אגר MacConkey.

כאשר התורם שלילי ללקטוז, אנו ממליצים להשתמש במושתל חיובי ללקטוז (למשל, E. coli J53). הזנים LMB100 ו-J53 זמינים לשימוש במעבדות אחרות. אנא שלח בקשה לד"ר חררדו קורטס-קורטס יחד עם כתובת ומספר FedEx.

המדיה המוצקה הדרושה לבחירה ולספירה של תורמים, מושתלים וטרנס-מצומדים היא אגר מקונקי בצלחות פטרי בקוטר 100 מ"מ. יש צורך בתוספת של האנטיביוטיקות הבאות: (i) מדיה A: carbenicillin (100 מ"ג / ליטר) כדי לספור תורמים ולהבטיח כי מושתלים לא יכולים לגדול עם אנטיביוטיקה זו. (ii) מדיה B: ריפמפין (100 מ"ג/ליטר) + סטרפטומיצין (100 מ"ג/ליטר) כדי לספור את המושתלים ולהבטיח שהתורמים לא יוכלו לגדול בשתי האנטיביוטיקות האלה. (iii) מדיה AB: carbenicillin (100 מ"ג / ליטר) + rifampin (100 מ"ג / ליטר) + סטרפטומיצין (100 מ"ג / ליטר) כדי להשיג ולספור transconjugants. (iv) מדיה C: אין אנטיביוטיקה כדי לפזר את כל המבודדים שנחקרו.

שיעורי הצמידות של פלסמידים מצומדים מ E. coli SW4955 ו E. coli SW7037 ל E. coli LMB100 מושווים. בנוסף, במקרה של פלסמיד מצומד p134797 (זן SW4955), האנטיביוטיקה קרבניצלין (100 מ"ג / ליטר) מוחלפת על ידי גנטמיצין (2 מ"ג / ליטר), כלוראמפניקול (25 מ"ג / ליטר), טטרציקלין (10 מ"ג / ליטר), trimethoprim (20 מ"ג / ליטר), או sulfamethoxazole (100 מ"ג / ליטר) בניסויים הבאים כדי לקבוע אם סמן עמידות לאנטיביוטיקה המשמש לבחירה יש השפעה כלשהי על התוצאות.

Protocol

1. שיטה 1: צימוד

  1. יום 1: פסחו על התורמים והנתרמים. יש לפזר בנפרד ממלאי הגליצרול על מדיה C (אגר מקונקי ללא אנטיביוטיקה), ולדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C.
    הערה: שלב זה נחוץ כדי להבטיח שהניסוי מתבצע עם מבודדים טהורים ולאשר את פנוטיפ הלקטוז לפי צבע המושבות.
  2. יום 2: תייגו צינור תרבית בנפח 14.0 מ"ל לכל תורם ומקבל. בחר מושבה אחת של כל תורם ומקבל, וגדל אותם במשך הלילה (18 שעות) בצינורות תרבית נפרדים של 14.0 מ"ל המכילים 2 מ"ל מרק מולר הינטון ב 37 ° C ורעד ב 200 סל"ד.
    הערה: בזנים המשמשים, השלב הנייח מגיע לאחר תרבית לילה של 18 שעות.
  3. יום 3: מדוד את הצפיפות האופטית ב- 600 ננומטר (OD600) של תרבית הלילה של כל תורם ומקבל (ללא מערבולות) באמצעות דילול 1:10 של 900 מיקרוליטר של תמיסת מלח ו- 100 מיקרוליטר של תרבית הלילה.
  4. התאם את הצפיפות האופטית של כל תורם ומקבל ל- 2.0 (OD600 = 2.0) עם תמיסת מלח מעוקרת (0.85% NaCl במים).
    הערה: תרבית לילה של E. coli עם OD600 = 2.0 יש 1.6 x 109 CFU/mL.
  5. תייגו צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל "צינור הזדווגות", המציין את הזנים של התורם והמקבל. העבר 500 μL של המתלה המותאם (OD600 = 2.0) של כל תורם ומקבל, ומקם אותם בצינור ההזדווגות (צינור הזדווגות זה יהיה 0.8 x 109 CFU/mL של כל תורם ומקבל). מערבבים בעדינות את צינור ההזדווגות על ידי היפוך.
  6. צנטריפוגה את צינור ההזדווגות למשך 10 דקות ב 500 x גרם בטמפרטורת החדר.
  7. מבלי להפריע לכדור, פיפטה החוצה 800 μL של צינור הצמידה. צריך להישאר 200 μL בצינור הצמידה.
    הערה: יש להשליך את הסופרנאטנט למיכל אקונומיקה של 10% כדי להשבית חיידקים בתרחיף.
  8. לדגור על צינור ההזדווגות במשך 18 שעות (לילה) ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור. ההזדווגות מתרחשת בזמן הדגירה.
    הערה: שלב זה חייב להיעשות ללא טלטול על מנת לא לשבור את pili ההתייחדות.
  9. כבקרה שלילית, פסחו את תרבית הלילה של תורמים במדיה B ומקבלי מדיה A. דגרו על הצלחות למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C
  10. יום 4: הוסיפו 800 מיקרוליטר של תמיסת מלח לצינור ההזדווגות ולמערבולת כדי להשהות מחדש (זה יוצר מחדש את תערובת ההזדווגות ל-1 מ"ל).
    הערה: מערבולות מפרקת את חיידקי ההזדווגות ויוצרת הומוגניות בתרבית כדי לכמת את CFU/mL.
  11. מכינים דילולים 1:10 (מ 1 x 100 ל 1 x 10-7) של תערובת ההזדווגות. צלחת 100 μL של דילולים 10-5 עד 10-7 על מדיה A ומדיה B, וכל דילולים על מדיה AB.
    הערה: Dlution 100 מתייחס לצינור המסודר.
  12. מניחים לצלחות להתייבש לפני שמניחים אותן באינקובטור הפוך. לדגור את הצלחות במשך 18 שעות (לילה) ב 37 ° C.
  13. יום 5: בדוק את הבקרות השליליות כדי לוודא שהפסים של תרביות לילה טהורות של תורמים לא גדלו במדיה ב', ותרבות הלילה הטהורה של המקבלים לא גדלה במדיה א'.
  14. רשום את מספר המושבות והדילולים שניתן לספור:
    1. לספור את המושבות במדיה א'; אלה התורמים. המושבות צריכות להיות ורודות (איור 3A,B).
    2. לספור את המושבות במדיה ב'; אלה הם הנמענים והטרנס-צימודים. המושבות צריכות להיות בצבע צהוב בהיר (איור 3C).
    3. לספור את המושבות במדיה AB; אלה הם transconjugants. המושבות צריכות להיות צהובות חיוורות.
      הערה: בחר צלחת ניתנת לספירה. לוח ספירה מכיל בין 30 ל-300 מושבות (יהיה קשה לספור יותר מ-300 מושבות, ופחות מ-30 מושבות נחשבות לגודל מדגם קטן מכדי להציג ייצוג מדויק של המדגם המקורי).
  15. חישוב תדירות הצמידות לכל תורם או לכל מקבל
    תדירות הצמידות לתורם = (CFU/mL של הטרנס-צימוד [מדיה AB])/ (CFU/מ"ל של תורמים [מדיה A]) x 100
    תדירות הצמידות לכל נמען = (CFU/mL של הטרנס-צימוד [מדיה AB])/ (CFU/מ"ל של הנמענים והטרנס-מצומדים [מדיה B]) x 100
    הערה: תדירות הצמידות עבור פרוטוקול זה חושבה כטרנס-צימודים חלקי מספר הנמען, כפול 100. על פי הספרות, כמות הצמידות המתקבלת יכולה להיקרא תדירות exconjugant, תדירות העברת גנים, תדירות הצמידה, תפוקה רקומביננטית, יעילות העברת פלסמיד, תדירות הצמידות בהתבסס על ספירת החיידקים הכוללת, שיעור transconjugants, שבר של transconjugants באוכלוסיית המקבלים, תדירות transconjugant, תדירות הצמידה, הלוגריתם של קצב הצמידה, קבוע קצב ההעברה, קצב הצמידות לכל זוג הזדווגות, מקדם הצמדה, או יעילות הצמידות20. פרוטוקול זה מתייחס למונח יעילות צימוד.
  16. אחסנו את הטרנס-מצומדים במאגרי גליצרול בטמפרטורה של -80°C. בצע את שלבי המשנה להכנת מניות גליצרול.
    1. בחר מושבה אחת של transconjugants ולגדל אותם לילה (18 שעות) בצינורות תרבית 5.0 מ"ל המכילים 2 מ"ל של מרק מולר הינטון בתוספת carbenicillin (100 מ"ג / ליטר), ב 37 ° C ורעד ב 200 סל"ד.
    2. תווית בקבוקונים קריוגניים, המציין את שם transconjugant, כדלקמן: Tc + שם התורם + אנטיביוטיקה של בחירה במדיה A (כפי שהם transconjugants, ידוע כי הרקע שלהם הוא זן הנמען, אשר כבר עמיד סטרפטומיצין ו rifampin אבל בנוסף מכיל את פלסמיד הנושא גן עמידות בטא לקטם); לדוגמה, TcU1Carb. הוסף מספרים רציפים במקרה שיש צורך לאחסן יותר מטרנס-צימוד אחד מאותו תורם (לדוגמה, TcU1Carb1, TcU1Carb2 וכו').
    3. מעבירים 1 מ"ל של תרבית לילה ל-1 מ"ל של 50% גליצרול (v/v; ריכוז הגליצרול הסופי צריך להיות 25%) ומערבבים בעדינות בהיפוך. הניחו את הבקבוקונים הקריוגניים על קרח יבש למשך 15 דקות ואחסנו את הבקבוקונים בטמפרטורה של -80°C לניסויים עתידיים.
  17. עבור מיצוי DNA, לפזר את trasnconjugants ממלאי גליצרול על אגר מולר הינטון בתוספת carbenicillin (100 מ"ג / ליטר), ולדגור לילה ב 37 ° C; לאחר מכן, בצע את ההמלצות משלב 2.1.

2. שיטה 2: תגובת שרשרת פולימראז (PCR) להגברת גנים של עמידות לאנטיביוטיקה ורפליקונים פלסמידים בטרנסקוניוגנטים של E. coli

הערה: תגובת שרשרת פולימראז (PCR) פותחה על ידי ד"ר קארי מוליס בשנת 1983. ה-PCR תלוי בפריימרים ספציפיים (פיסת דנ"א קצרה משלימה לרצף דנ"א נתון הפועל כנקודה שבה השכפול יכול להתקדם, בדרך כלל באורך 20-40 נוקלאוטידים ובאופן אידיאלי עם תכולת גואנין-ציטוזין של 40%-60%), המחושלים לגדילים מנוגדים של תבנית DNA דו-גדילית מפורקת ומורחבים באמצעות DNA פולימראז תרמו-יציב, ובכך ליצור תבנית נוספת למחזור הבא של התגובות, מה שמוביל להגברה מעריכית של תבנית21 המקורית. בפרוטוקול זה, הרפליקונים וגני ההתנגדות הנמצאים בפלסמידים המצומדים הוגברו כדי לאשר את ההעברה בתאים מקבלים טרנס-מצומדים.

  1. מיצוי DNA
    1. כדי לזהות העברה של גני התנגדות הנישאים על ידי פלסמידים מצומדים, השתמש ב- DNA transconjugant כתבנית. השתמשו במיצוי פשוט להכנת רתיחה כדי ללטש את דפנות תאי החיידקים.
      הערה: מיצוי פשוט להכנת רתיחה הוא גישה פשוטה לליזה של דפנות תאי החיידקים. מיצוי זה מכיל DNA פלסמיד מעורבב עם DNA גנומי, אך מכיוון שפריימרים מתוכננים על פי רצפי DNA ספציפיים בעלי עניין, תבנית זו שימושית גם עבור PCR. פלסמידים יכולים גם להיות מטוהרים במיוחד, אם כי התשואות נוטות לרדת עם הגדלת גודל פלסמיד22. זוהי נקודת עצירה נוחה. DNA יכול להיות מאוחסן במשך מספר חודשים ב -20 ° C.
  2. PCR
    1. בהתחשב בכך שלניסוי יש שליטה שלילית וחיובית, כדאי להקים מאגר לכל התגובות בצינור של 1.5 מ"ל. תייגו צינורית של 1.5 מ"ל כ"בריכה" ואת צינורות ה-PCR הנדרשים עם שם הגן והדגימה (למשל, OXA-U1).
    2. פיפטה של ריאגנטי PCR בסדר הבא לתוך צינור 1.5 מ"ל: מים סטריליים, 2x מאסטר מיקס, פריימרים ופולימראז (למעט DNA התבנית) (ראה טבלה 1). מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים. שמור על קרח כל הזמן.
      הערה: יש ללבוש כפפות כדי למנוע זיהום של תערובת התגובה או ריאגנטים. נסו להימנע מפתיחה וערבוב ריאגנטים וטיפול בדגימות באותו אזור כדי למנוע זיהום מגיבים. הכניסו את הריאגנטים לדלי הקרח כדי לדכא פעילות נוקלאז ופריימינג לא ספציפי. תן להם להפשיר לחלוטין לפני הגדרת תגובה. שמור את הריאגנטים על קרח לאורך כל הניסוי. Taq פולימראז מתווסף בסוף כי הוא רגיש לשינויים pH; זה צריך להיות חוצץ כדי למנוע השפלה או קיפול שגוי. רצף הפריימרים מופיע בטבלה 2 - גנים לעמידות לאנטיביוטיקה - ובטבלה 3 - replicons 23,24,25,26,27,28.
    3. הוסף את ה- DNA של התבנית לצינור המתאים. הימנע מהחדרת בועות ומכסים מאובטחים על צינורות ה- PCR.
    4. הכניסו את צינורות ה-PCR למחזור התרמי.
    5. הפעל את התוכנית. עיין בהגדרות התוכנית המפורטות עבור כל גן בטבלה 2 (גני התנגדות) ובטבלה 3 (רפליקונים).
      הערה: הגדר תוכניות PCR להחזיק את הדגימות ב- 4 ° C לאחר ההפעלה.
      1. תנאי PCR עבור replicons: מחזור אחד של denaturation ב 94 ° C במשך 5 דקות, ואחריו 30 מחזורים של denaturation ב 94 ° C במשך 1 דקה, חישול ב 60 ° C במשך 30 שניות, התארכות ב 72 ° C במשך 1 דקות, והארכה סופית של מחזור אחד ב 72 ° C במשך 5 דקות.
        הערה: אלה הם התנאים המתוקננים על ידי Carattoli et al.29.
    6. כאשר התוכנית מסתיימת, לאחסן את צינורות PCR ב 4 ° C.
      הערה: זוהי נקודת עצירה נוחה. מוצרי PCR ניתן לאחסן במשך מספר חודשים ב -20 °C
    7. הכינו ג'ל אגרוז 1% במשקל 0.6 גרם אגרוז בבקבוק של 250 מ"ל והוספת 60 מ"ל של חיץ Tris-אצטט-EDTA (TAE) 1x (התאימו ריאגנטים אם יש צורך בגודל ג'ל שונה). המיסו את האגרוז בזהירות ובאיטיות במיקרוגל כדי למנוע שפיכת אגרוז על הצלוחית, ותנו לו להתקרר לכ-55 מעלות צלזיוס (10-15 דקות).
      1. הכינו את כל הריאגנטים באמצעות מים דה-יוניים אולטרה-טהורים וריאגנטים ברמה אנליטית:
      2. TAE 50x Buffer (בסיס טריס, חומצה אצטית ו-EDTA) (1 ליטר): יש לערבב 121.1 גרם בסיס Tris + 372.24 גרם EDTA ולהוסיף 500 מ"ל מים מזוקקים. מתמוססים עם מערבל מגנטי. מוסיפים 57.1 מ"ל חומצה אצטית, ומוסיפים מים מזוקקים לנפח כולל של 1,000 מ"ל.
      3. Autoclave ב 15 psi, 121 ° C במשך 15 דקות, ולשמור בטמפרטורת החדר עד מוכן עד 6 חודשים.
      4. TAE 1x Buffer (1 L): ערבבו 20 מ"ל של מאגר TAE 50x עם 980 מ"ל מים מזוקקים וערבבו.
    8. מתחת למכסה האדים, הוסיפו 6 מיקרוליטר של SYBR Green לאגרוז המומס, ערבבו ושפכו החוצה למגש (ולמסרק), שהיה אטום בעבר בסרט הדבקה כדי למנוע שפיכה. מניחים לג'ל להתייצב למשך 15-25 דקות עד להופעת עכירות.
      הערה: צבעים חלופיים אחרים זמינים גם 30,31,32,33.
    9. הסר את סרט ההדבקה והכנס את הג'ל לתא האלקטרופורזה, תוך הוספת חיץ 1x TAE מספיק כדי לכסות את הג'ל.
    10. יש לערבב 5 μL של 6x צבע טעינת ג'ל DNA עם 25 μL של כל תגובה. מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים.
      הערה: לא כל מוצר ה-PCR צריך להיות מוטען לתוך הג'ל כדי לדמיין את המוצר הצפוי (להתאים את כמות הצבע לפי הצורך). ניתן לשמור את דגימת ה-PCR הנותרת ולאחסן אותה בטמפרטורה של -20°C למשך מספר חודשים.
    11. טוענים את התערובת לבארות (הימנעו מהחדרת בועות) ומניחים את מכסה התא למטה.
      הערה: טען את הדגימה הראשונה לבאר השנייה (שמור את הראשונה לסולם), החל מהבקרה השלילית.
    12. טען 4 μL של סולם DNA 1 kb לתוך הבאר הראשונה.
    13. הפעל את האלקטרופורזה ב- 120 וולט, 400 מיליאמפר ו- 60 דקות.
    14. דמיינו את הג'ל תחת אור UV (עם תאורת UV) והקליטו את התמונה.
      הערה: אם קיים מוצר PCR, ניתן לזהות פסי DNA מוכתמים באמצעות טרנסילטור UV סטנדרטי, טרנסילמייטור אור נראה או סורק מבוסס לייזר.
מגיב פתרון מלאי נפח נוסף לתגובה של 50 μL (1x) הסופי דוגמה: עוצמת קול דוגמה: עוצמת קול דוגמה: נפח נוסף לכל צינור כרך סופי 50 μL נפח נוסף לשליטה חיובית נפח נוסף לשליטה שלילית
ריכוז נוסף ל- 1x נוסף ל-3x (בריכה)
מים סטריליים - 21.5 μL (q.s. עד 50 μL) - 21.5 μL 64.5 מיקרוליטר 49 מיקרוליטר/צינור 49 מיקרוליטר/צינור 49 מיקרוליטר/צינור
מאסטר מיקס פי 2 25 מיקרוליטר 1x 25 מיקרוליטר 75 מיקרוליטר
פריימר קדמי 25 מיקרומטר 1 μL 0.5 מיקרומטר 1 μL 3 מיקרוליטר
פריימר הפוך 25 מיקרומטר 1 μL 0.5 מיקרומטר 1 μL 3 מיקרוליטר
DNA של תבנית משתנה (100–200 ננוגרם/מיקרוליטר) משתנה (1 מיקרוליטר) משתנה 0.5 מיקרוליטר 1.5 מיקרוליטר
פולימראז 5 יחידות/μL 0.5 מיקרוליטר 2.5 יחידות - - 1 μL (transconjugant) 1 μL (תורם) 1 μL (מושתל)
הערה: q.s. הוא קיצור לטיני של satis קוונטי שמשמעותו הכמות הדרושה.

טבלה 1: ריאגנטים PCR ומאגר לשלוש תגובות (דוגמה). 

פריימרים (הרצף מופיע בכיוון 5' - 3') תוכנית PCR גודל צפוי
(כב) מספר נכס
blaCTX-M קבוצה 1 94 oC 7 דקות (864) 23
CTX-M: GGTTAAAAAATCACTGCGYC 94 oC 50 שניות (35 מחזורים)
CTX-M: TTGGTGACGATTTTTCCGC 50 oC 40 שניות
68 oC 1 דקות
68 oC 5 דקות
בלהCMY-2 95 oC 3 דקות (1855) 24
CMY-2-F: GATTCCTTGGACTCTTCAG 95 oC 30 שניות (30 מחזורים)
CMY-2-R: TAAAACCAGGTTCCCAGATAGC 53 oC 30 שניות
72 oC 30 שניות
72 oC 3 דקות
AAC(3')-II 94 oC 5 דקות (237) 25
AAC(3')-II-F: ACTGTGATGGGATACGCGTC 94 oC 30 שניות (32 מחזורים)
AAC(3')-II-R: CTCCGTCAGCGTTTCAGCTA 60 oC 45 שניות
72 oC 2 דקות
72 oC 8 דקות
dani_1977 94 oC 5 דקות (283) 26
aadA1: GCAGCGCAATGACATTCTTG 94 oC 1 דקות (35 מחזורים)
aadA2: ATCCTTCGGCGCGATTTTG 60 oC 1 דקות
72 oC 1 דקות
72 oC 8 דקות
סול-3 94 oC 5 דקות (799) 27
sul-3-F: GAGCAAGATTTTTGGAATCG 94 oC 1 דקות (30 מחזורים)
sul-3-R: CATCTGCAGCTAACCTAGGGCTTTGGA 51 oC 1 דקות
72 oC 1 דקות
72 oC 5 דקות
tet(A) 95 oC 5 דקות (957) 28
TETA-1: GTAATTCTGAGCACTGTCGC 95 oC 30 שניות (23 מחזורים)
TETA-2: CTGCCTGGACAACATTGCTT 62 oC 30 שניות
72 oC 45 שניות
72 oC 7 דקות
DFR A 95 oC 5 דקות (302) עבודה זו
DFRA-F: CATACCCTGGTCCGCGAAAG 95 oC 1 דקות (30 מחזורים)
55 oC 1 דקות
DFRA-R: CGATGTCGATCGTCGATAAGTG 72 oC 1 דקות
72 oC 7 דקות
catA2 95 oC 5 דקות
catA2-F: GACCCGGTCTTTCTCTCTTTC 95 oC 1 דקות (25 מחזורים) (225) עבודה זו
catA2-R: TCCGGTGATATTCAGATTAAAT 60 oC 1 דקות
72 oC 1 דקות
72 oC 7 דקות

טבלה 2: פריימרים ותוכניות PCR המשמשים להגברת גנים של עמידות לאבחון. 

רפליקון פריימר (הרצף מופיע בכיוון 5' - 3') יעד תוכנית PCR גודל צפוי (bp)
IncFIB F: TCTGTTTATTCTTTTACTGTCCAC repA 94 oC 5 דקות 683
R: CTCCCGTCGCTTCAGGGCATT 94 oC 1 דקות (30 מחזורים)
60 oC 30 שניות
IncFIC F: GTGAACTGGCAGATGAGGAAGG repA2 72 oC 1 דקות 262
R: TTCTCCTCGTCGCCAAACTAGAT 72 oC 5 דקות
IncI1 F: CGAAAGCCGGACGGCAGAA רנ"א 139
R: TCGTCGTTCCGCCAAGTTCGT

טבלה 3: פריימרים ותוכנית PCR המשמשים לסיווג פלסמידים p134797 ו- p101718 לפי הקלדת רפליקון מבוסס PCR29. 

Representative Results

בהתחשב בכך שהתורמים SW4955 ו- SW7037 רוצפו, שני זני תורמים אלה צפויים להיות בעלי פנוטיפים עמידים המתאימים לפרופיל גן ההתנגדות שזוהו ברצף הגנומי שלהם. פלסמיד p134797 (מ-SW4955) מכיל גנים המקנים עמידות לצפלוספורינים מהדור השלישי (blaCTX-M-55), ועמידות לאמינוגליקוזידים (aac(3)-IIa ו-aadA1), פניקולים (catA2), טטרציקלינים (tet(A)), טרימטופריים (dfrA14) וסולפונאמידים (sul3); לא נמצאו גנים של עמידות לאנטיביוטיקה בכרומוזום SW4955. פלסמיד p101718 (מ-SW7037) נושא רק גן עמידות אנטיביוטי אחד (bla CMY-2), שצפוי להעניק עמידות לצפלוספורינים מהדור השלישי (blaCTX-M-55). שוב, לא נמצאו גנים של עמידות לאנטיביוטיקה בכרומוזום SW7037.

לאחר ההזדווגות היה צפוי גילוי של העברת שני פלסמידים מצומדים הנושאים את כל גני ההתנגדות שהוזכרו לעיל. זיהוי צימוד חיובי מרמז על כך שהנמענים שזוהו כטרנס-מצומדים היו צריכים לרכוש את פלסמידים מצומדים. נוכחותם של גני ההתנגדות האבחנתית לפלסמידים המצומדים בטרנסקונדואגנטים (כפי שזוהו על ידי PCR) הייתה צפויה גם היא.

כדי להמחיש את השיטות המתוארות כאן, נבדקה יכולתם של שני מבודדים סביבתיים E. coli להעביר DNA פלסמיד על ידי צימוד. ייצוג סכמטי של סביבת הניסוי מוצג באיור 1. שני תורמים (E. coli SW4955 ו-SW7037) ומושתל אחד (E. coli LMB100) הזדווגו באופן עצמאי. מפת הגנים של פלסמידים מצומדים שנמצאת ב-E. coli SW4955 (p134797) וב-SW7037 (p101718) מוצגת באיור 2.

פלסמידים מצומדים נבחרו עם קרבניצלין ונבחרו נגדית באמצעות ריפמפין וסטרפטומיצין, שגורמי ההתנגדות שלהם נמצאים בכרומוזום של הנמען. אגר מקונקי שימש כדי להבדיל בין תורמים חיוביים ללקטוז (שמייצרים מושבות גדולות וורודות) לבין המקבל והטרנס-מצומדים (שהם שליליים ללקטוז ומייצרים מושבות קטנות יותר בצבע צהוב בהיר) (איור 3).

Figure 3
איור 3: איור של סמני הצבע הדיפרנציאליים עבור מושבות תורמים ומקבלים על אגר MacConkey. המושבות המקבילות לתורמים ורודות על אגר מקונקי מכיוון שהן חיוביות ללקטוז. זה מבדיל בין מושבות תורם למושבות מקבלות, שהן צהובות חיוורות וקטנות יותר (לקטוז שלילי). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

זוהתה הניוד של פלסמיד הצמידות p134797, כאשר כל אחת מחמש האנטיביוטיקות מתאימה לחמש קבוצות שונות של גני עמידות שנמצאו בפלסמיד.

דוגמה כיצד לחשב את יעילות הצמידות (CE) עבור מתח SW4955 מוצג. מן הבדיקה עם זן SW4955, 172 CFU של transconjugants נספרו בצלחת מ דילול 10-2; ספירת הנמען מהדילול המתאים (10-2) הייתה 10,300,000 CFU/מ"ל (טבלה 4).

CE מחושב כדלקמן:

CE = (174 CFU/מ"ל)/(10,300,000 CFU/מ"ל)

CE= 1.67 x 10-5 טרנס-צימודים/נמען

LMB100 Transconjugants מזן SW4955 נבחר עם Carbelicillin יעילות הצמידות
דילול CFU (צלחת ניתנת לספירה) כ- CFU/מ"ל CFU (צלחת ניתנת לספירה)
100 קונפלואנט 1.03E+09
10-1 קונפלואנט 1.03E+08
10-2 קונפלואנט 10300000 172 1.67 x 10-5 טרנסקונצ'וגנטים/נמען
10-3 קונפלואנט 1030000
10-4 קונפלואנט 103000
10-5 קונפלואנט 10300
10-6 קונפלואנט 1030
10-7 103 103
ערכים המשמשים לחישוב CE מודגשים בגופן מודגש.

טבלה 4: דוגמה לחישוב יעילות הצמידות (CE) עבור זן SW4955.

התוצאות מוצגות בטבלה 5, המתבטאת ביעילות הצמידות לכל מקבל. חמש יעילות הצמידות שהושגו באמצעות זן SW4955 כתורם היו כולן באותו סדר גודל. תוצאות אלה מצביעות על כך שניתן לזהות את גיוס פלסמיד הצמידות ללא קשר לבחירה המשמשת לזיהוי טרנס-מצומד.

באמצעות שימוש בזן SW7037 כתורם, יעילות הצמידות שהתקבלה הייתה נמוכה בשלושה סדרי גודל; תוצאות אלה מאפשרות השוואה של יעילות הצמידות של תורמים שונים וסוגי פלסמיד שונים עם אותם מושתלים.

יעילות הצמידות
זן קרבניצלין (100 מ"ג/ליטר) גנטמיצין (2 מ"ג/ליטר) כלוראמפניקול (25 מ"ג/ליטר) טטרציקלין (10 מ"ג/ליטר) טרימטופריים (20 מ"ג/ליטר)
SW4955 1.67 x 10-5 5.67 x 10-5 2.17 x 10-5 7.62 x 10-5 1.36 x 10-5
SW7037 2.14 x 10-6

טבלה 5: יעילות הצמידות של זני תורם E. coli SW4955 ו- SW7037 בהתאם לאנטיביוטיקה המשמשת לבחירה.

בטרנס-צימודים, נוכחות של רפליקונים וכל גני ההתנגדות המקודדים בשני פלסמידים מצומדים שנבדקו, והרפליקונים המתאימים להם, נבדקה על ידי PCR. התנאים המשמשים לתגובות PCR אבחוניות אלה מוצגים בטבלה 3.

ג'ל האבחון מוצג באיור 4. ג'לים אלה מאשרים את נוכחותם של הרפליקונים הצפויים בטרנס-צימודים (IncFIC ו-IncFIB ב-p1347975, ו-IncI1 ב-p101718). הם גם מאשרים את נוכחותם של הגנים הצפויים לעמידות לאנטיביוטיקה, כלומר קבוצת bla CTX-M-55 (בטא-לקטם), aac(3)-II ו-aadA (אמינוגליקוזיד), catA2 (פניקול), tet(A) (טטרציקלין), dfrA14 (טרימטופריים) וסול3 (סולפונאמיד) עבור p1347975 , ו-blaCMY-2 עבור p101718 (איור 4).

Figure 4
איור 4: ג'ל אלקטרופורזה אבחנתי. אלקטרופורזה בג'ל של מוצרי PCR של גנים עמידים לאנטיביוטיקה ורפליקונים פלסמידים הנמצאים בפלסמידים מצומדים p134797 ו- p101718 בתאי התורם (זנים SW4955 ו- SW7037, בהתאמה) ובטרנסקונדואגנטים המתאימים LMB100. Carbenicillin שימש לבחירת פלסמיד. קיצורים. -: בקרה שלילית (DNA של זן LMB100 שימש כבקרה שלילית); D: תורם; T: transconjugant. גדלי אמפליקון צפויים: blaCTX-M-55: 864 pb; AAC(3)-IIa: 237 bp; aadA1: 283 bp; catA2 : 225 bp; tet(A): 957 bp; dfrA14: 302 bp; סול3: 799 BP; IncFIC(FII): 262 bp; IncFIB: 683 bp; BLACMY-2: 1,855 bp; IncI1-I: 139 bp. הג'ל מכיל 1% אגרוז. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

פלסמידים מצומדים מספקים גישה למאגר משותף של גנים בסביבה סביבתית מסוימת באמצעות רקומבינציה והעברת גנים אופקית34. לפיכך, פלסמידים מצומדים הם ישויות אבולוציוניות המסוגלות לרכוש ולהעניק פונקציות המאפשרות לחיידקים להסתגל לתנאים מרובים (כולל עמידות לאנטיביוטיקה, עמידות למתכות, רכישת מתכות, היווצרות ביופילם וגנים פתוגניים, בין היתר) בטווח זמן של שעות.

עבודה זו מציגה פרוטוקול לזיהוי פלסמידים מצומדים בחיידקים. כדי שהפרוטוקול יעבוד, הסמנים שבהם נעשה שימוש צריכים להבדיל בין זני התורם למקבל, כפי שמוצג על ידי הפקדים במדיה A ו- B. הם גם צריכים לבחור ביעילות תאים הנושאים את הפלסמיד. תגובת ההזדווגות היא קריטית. בתגובה זו, התורמים והמקבלים צריכים ליצור קשר ממושך (באמצעות פילי) כדי שהצמידות תתרחש. כל דבר שיכול להפריע למגע בין תאים, כגון זמן דגירה לא מספיק או טלטול או ערבוב התרבית, ובכך מקטין את יעילות ההצמדה. בחירת הנמען היא גם קריטית, שכן חלק מזני המקבל עמידים לצמידות35,36. LMB100 מוצע כנמען הבחירה, מכיוון שהוא מסוגל לקחת פלסמידים ממספר סוגי אי-תאימות.

קצב הצמידות הוא ספציפי לכל זוג כרומוזומים של תורם פלסמיד, מקבל ומצב סביבתי. הצמידות של פלסמידים ספציפיים נמצאה רגישה למספר רב של משתנים, כולל שלב הגדילה, צפיפות התא, יחס תורם-מקבל, האם הצמידות מתבצעת במדיה נוזלית או מוצקה, פחמן, חמצן, מלחי מרה, ריכוזי מתכות, נוכחות תאי יונקים, טמפרטורה, pH וזמן הזדווגות13,14,15 . המחקר של אינטראקציות אלה תלוי בזיהוי הראשוני של פלסמיד מצומד להיחקר לעומק. לפיכך, ניתן לשנות את הפרוטוקול המתואר כאן גם כדי לחקור את ההשפעה של משתני ניסוי שונים, אם כי זה בא במחיר של הגבלת מספר התורמים שנבדקו. הוא יכול גם לזהות פלסמידים הניתנים לניידות בפונדקאים שיש להם פלסמידים מסייעים (כלומר, פלסמידים המאפשרים צימוד על ידי מתן פונקציות חסרות בפלסמידים הניידים בטרנס6).

ידיעת רצף הפלסמיד המצומד מומלצת (אך אין צורך לזהות הצמדה, כפי שנדון לעיל). כאשר התורמים הם שליליים ללקטוז (מייצרים מושבות צהובות על אגר MacConkey), ניתן להשתמש במושתל חיובי ללקטוז (המייצר מושבות ורודות על אגר MacConkey) כדי להבחין בין טרנס-מצומדים אמיתיים לבין תאי תורם המסוגלים לגדול על המדיה כדי לבחור טרנס-צימודים. הפרוטוקול המתואר כאן נועד לזהות פלסמידים מצומדים מבני הסביבה, הקומנסל והפתוגניים של המשפחה Enterobacteriaceae; עם זאת, ניתן להשתמש בו עם כל זן חיידקים עם תורם, מקבל, אנטיביוטיקה וסמני צבע מתאימים. זיהוי המרכיבים הקריטיים הללו בחיידקים אחרים דורש מחקרים שיטתיים באמצעות מספר תורמים, מושתלים וסמנים (אנטיביוטיקה וצבעים). פרוטוקול זה לא נבדק בחיידקים גראם-חיוביים.

מספר גרסאות של השיטה המוצגת כאן דווחו בספרות, שנסקרו לאחרונה20. ניתן להתייחס לתוצאה האיכותית גם בדרכים שונות (למשל, תדירות הצמדה ותדירות העברת גנים), וניתן להשתמש ביחידות חסרות ממד כדי לדווח על יעילות הצמידות (mL/CFU x h)20.

הפרוטוקול המתואר כאן פותר מספר מגבלות שלא טופלו בעבר בשיטותהקיימות 16,18,19,20. ראשית, אותר נמען מתאים. שנית, השימוש בשתי אנטיביוטיקות (ריפמפין וסטרפטומיצין) לבחירת טרנסקוניוגנטים אמיתיים ממזער את האפשרות שהתורמים יפתחו עמידות לאחת האנטיביוטיקות המשמשות לבחירת טרנס-מצומדים באמצעות מוטגנזה ספונטנית. טרנס-צימודים כוזבים יכולים גם לנבוע מהגנה של צופה מהצד על ידי הידרוליזה של אנטיביוטיקה המשמשת לבחירת טרנס-מצמדים על ידי אנזימים (למשל, בטא-לקטמזות) המיוצרים בכמויות גדולות על ידי התורם. שלישית, מספר בקרות ניסיוניות כלולות כדי להבטיח שתוצר ההזדווגות הוא טרנס-מצומד אמיתי (כלומר, תא מקבל ששילב ביציבות את פלסמיד הצמידות של התורם). כאן, הצגנו שתי שיטות עצמאיות לבדיקת האותנטיות של הטרנס-מצומדים, כלומר סמן קולורימטרי באגר MacConkey, וזיהוי PCR של הגנים הרפליקונים והעמידות לאנטיביוטיקה של פלסמיד הצמידות אצל הנמען. כמו כן, הפרוטוקול המתואר כאן נועד לבודד ולאפיין פלסמידים מצומדים מבני המשפחה Enterobacteriaceae (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Salmonella, Shigella, ומינים אחרים).

כדי להבין את המכניקה של הצמידה, מודלים של תצפיות ניסיוניות באמצעות סימולציות מחשב. מודלים לחיזוי אלה מעריכים את תדירות העברת הפלסמיד עבור צפיפות גדילה נתונה של תורמים, מושתלים וטרנס-מצומדים. מודל המכונה מודל נקודת הקצה מצא ספים שמעליהם קצב העברת הפלסמיד בתרבית נוזלית, והגיע למסקנה כי קצב ההעברה אינו מושפע מצפיפות התא, יחס תורם:מקבל וזמן הזדווגות19. הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) שימשה כשיטה חלופית לזיהוי פלסמיד טרנס-מצומד. FISH מאפשר הדמיה פלסמידית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות הכלאה של בדיקת DNA ו- DNA מטרה. לפיכך, FISH מאפשר זיהוי חזותי של זרימות פלסמיד על פני אוכלוסיות תאים שונות37, אם כי אין לו את אותה רמת רגישות כמו השיטה המוצגת כאן אם transconjugants מזוהים על ידי סינון חזותי בניגוד לבחירה.

יש צורך עצום להבין את הביולוגיה של פלסמידים מצומדים המפזרים גנים של עמידות לאנטיביוטיקה דרך מרכיבים שונים של המערכת האקולוגית (מרפאה, חקלאות, ביוב, חיות בר, חיות בית, קרקעות, נהרות ואגמים). לסיכום, תנאי הניסוי הפשוטים המוצגים בפרוטוקולים המתוארים כאן מאפשרים סינון של תורמים בקנה מידה גדול, ובכך מהווים כלי מרכזי לחקר העברת גנים אופקית שמקורה בפלסמידים מצומדים ממגוון מקורות. ניתן להשתמש בהם כדי לחקור את השכיחות של גנים עמידים לאנטיביוטיקה או גנים רלוונטיים קליניים אחרים בפלסמידים מצומדים ממקורות וחיידקים מרובים. הם יכולים גם להיות מותאמים לחקר הצמידות in vivo (למשל, במעיים של בעלי חוליות) וללמוד את התנאים המווסתים את יעילות הצמידה. כל המחקרים הללו יוסיפו רבות להבנה כיצד הגיוס של פלסמידים מצומדים עמידים לתרופות מרובות תורם להתפשטות עמידות לתרופות מרובות.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

LM-B, IMG, AT ו- IS נתמכו על ידי מענק NIH GM055246 שהוענק ל- LM-B. GC-C זכתה במלגת UC MEXUS-CONACYT לפוסט-דוקטורט במשך שנתיים רצופות: AY 2017-18 ו-2018-19. אנו מודים מאוד לסטודנטים סייג' צ'אבס ופפר סנט קלייר מתוכנית החונכות של רשת ההשראה האקדמית (GAIN) בחסות קרן Genentech על תמיכתם הטכנית בניסויים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tube racks Thermo Fisher Scientific 22-313630 It can be replaced for another brand
2.0 mL Cryogenic vials Corning 430659 It can be replaced for another brand
14 mL conical tubes FALCON 149597 It can be replaced for another brand
14 mL tube racks Thermo Fisher Scientific 8850 It can be replaced for another brand
1 kb DNA ladder New England Biolabs N0552G 
250 mL sterile flasks  PYREX 5320 It can be replaced for another permanent marker brand
Acetic acid Fisher Scientific A38SI-212 It can be replaced for another brand
Agarose (molecular biology grade, multipurpose) Fisher Scientific BP160-500 It can be replaced for another brand
Carbenicillin GOLD BIOTECHNOLOGY C-103-50 It can be replaced for another brand
Disposable inoculating loops: 1 µL Fisherbrand 22-363-595 It can be replaced for another brand
DNA gel loading dye 6x  New England Biolabs B7024S It can be replaced for another brand
EDTA Fisher Scientific BP119-500 It can be replaced for another brand
Electronic digital scale Denver Instrument APX-2001 It can be replaced for another brand
Eppendorf conical tubes: 1.5 mL Eppendorf 14-282-302 It can be replaced for another brand
Equipment for agarose gel electrophoresis Fisher Scientific FP300 It can be replaced for another brand
Ethanol-resistant markers Sharpie 37001; 37002; 37003 It can be replaced for another brand
Gel documentation systems (UVP GelSolo) Analytakjena SP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01 It can be replaced for another brand
Gloves X-GEN 44-100M Any nitrile gloves brand works
Ice bucket Thermo Fisher Scientific 432128 It can be replaced for another brand
MacConkey agar  BD DIFCO 212123
Master Mix  BioLabs M0496S  It can be replaced for another brand
Methanol Fisher Scientific A452-4 It can be replaced for another brand
Microcentrifuge tubes: 2.0 mL Fisherbrand 05-408-138 It can be replaced for another brand
Mueller Hinton agar BD DIFCO DF0479-17-3
Mueller Hinton broth BD DIFCO 275730
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA Takara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL 740588. 250
PCR tube racks AXYGEN   R96PCRFSP It can be replaced for another brand
PCR tubes (0.2 mL) AXYGEN  PCR-02-C It can be replaced for another brand
Rifampicin Fisher Scientific 50-164-7517
Set of micropipettes that dispense between 1 - 10 μL (P10), 2–20 μL (P20), 20–200 μL (P200) and 200–1000 μL (P1000) RAININ 17008648; 17008650; 17008652; 17008653 Micropipettes should be calibrated; can be replaced for another brand
Sodium chloride Fisher Scientific S671-3 It can be replaced for another brand
Spectrophotometer Thermo Scientific 335905P It can be replaced for another brand
Sterilized tips for 10 μL, 200 μL and 1000 μL  Eclipse 1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9 It can be replaced for another brand
Streptomycin Fisher Scientific BP910-50
SYBR Safe DNA gel stain  Thermo Fisher Scientific S33102
Taq DNA Polymerase BioLabs M0273S
Thermal cycler C1000 Touch  Bio-Rad 1851196 It can be replaced for another brand
Tris  Fisher Scientific BP153-500 It can be replaced for another brand

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lederberg, J., Tatum, E. Gene recombination in Escherichia coli. Nature. 158 (4016), 558 (1946).
  2. de la Cruz, F., Frost, L. S., Meyer, R. J., Zechner, E. L. Conjugative DNA metabolism in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (1), 18-40 (2010).
  3. Grohmann, E., Muth, G., Espinosa, M. Conjugative plasmid transfer in gram-positive bacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (2), 277-301 (2003).
  4. Koraimann, G., Wagner, M. A. Social behavior and decision making in bacterial conjugation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 54 (2014).
  5. Dziewit, L., et al. Diversity and role of plasmids in adaptation of bacteria inhabiting the Lubin copper mine in Poland, an environment rich in heavy metals. Frontiers in Microbiology. 6, 152 (2015).
  6. Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (3), 434-452 (2010).
  7. Balbuena-Alonso, M. G., et al. Genomic analysis of plasmid content in food isolates of E. coli strongly supports its role as a reservoir for the horizontal transfer of virulence and antibiotic resistance genes. Plasmid. 123-124, 102650 (2022).
  8. San Millan, A., MacLean, R. C. Fitness costs of plasmids: A limit to plasmid transmission. Microbiol Spectrum. 5 (5), (2017).
  9. Coluzzi, C., Garcillán-Barcia, M. P., de la Cruz, F., Rocha, E. P. C. Evolution of plasmid mobility: Origin and fate of conjugative and nonconjugative plasmids. Molecular Biology and Evolution. 39 (6), 1-23 (2022).
  10. Bevan, E. R., et al. Molecular characterization of plasmids encoding blaCTX-M from faecal Escherichia coli in travellers returning to the UK from South Asia. The Journal of Hospital Infection. 114, 134-143 (2021).
  11. Minja, C. A., Shirima, G., Mshana, S. E. Conjugative plasmids disseminating CTX-M-15 among human, animals and the environment in Mwanza Tanzania: a need to intensify one health approach. Antibiotics. 10 (7), 836 (2021).
  12. Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. International Journal of Medical Microbiology. 303 (6-7), 298-304 (2013).
  13. Sengupta, M., Austin, S. Prevalence and significance of plasmid maintenance functions in the virulence plasmids of pathogenic bacteria. Infection and Immunity. 79 (7), 2502-2509 (2011).
  14. Alderliesten, J. B., et al. Effect of donor-recipient relatedness on the plasmid conjugation frequency: a meta-analysis. BMC Microbiology. 20 (1), 135 (2020).
  15. Neil, K., Allard, N., Rodrigue, S. Molecular mechanisms influencing bacterial conjugation in the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 12, 673260 (2021).
  16. Liu, G., Bogaj, K., Bortolaia, V., Olsen, J. E., Thomsen, L. E. Antibiotic-induced, increased conjugative transfer is common to diverse naturally occurring ESBL plasmids in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 10, 2119 (2019).
  17. Suchman, E. Polymerase chain reaction protocol. American Society for Microbiology. , 1-14 (2011).
  18. Watanabe, T. Infective heredity of multiple drug resistance in bacteria. Bacteriological Reviews. 27 (1), 87-115 (1963).
  19. Simonsen, L., Gordon, D. M., Stewart, F. M., Levin, B. R. Estimating the rate of plasmid transfer: an end-point method. Journal of General Microbiology. 136 (11), 2319-2325 (1990).
  20. Huisman, J. S., et al. Estimating plasmid conjugation rates: A new computational tool and a critical comparison of methods. Plasmid. 121, 102627 (2022).
  21. Jung, B., Hoilat, G. J. MacConkey medium. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2022).
  22. NucleoSpin Plasmid DNA purification. , Available from: https://www.mn-net.com/media/pdf/45/51/02/Instruction-NucleoSpin-Plasmid.pdf (2022).
  23. Jiang, X., et al. Detection of extended-spectrum beta-lactamases in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (9), 2990-2995 (2006).
  24. Stapleton, P. D., Shannon, K. P., French, G. L. Carbapenem resistance in Escherichia coli associated with plasmid-determined CMY-4 beta-lactamase production and loss of an outer membrane protein. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (5), 1206-1210 (1999).
  25. Ben Yahia, H., et al. Detection of CTX-M-15 harboring Escherichia coli isolated from wild birds in Tunisia. BMC Microbiology. 18 (1), 26 (2018).
  26. Madsen, L., Aarestrup, F. M., Olsen, J. E. Characterisation of streptomycin resistance determinants in Danish isolates of Salmonella Typhimurium. Veterinary Microbiology. 75 (1), 73-82 (2000).
  27. Perreten, V., Boerlin, P. A new sulfonamide resistance gene (sul3) in Escherichia coli is widespread in the pig population of Switzerland. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (3), 1169-1172 (2003).
  28. Guardabassi, L., Dijkshoorn, L., Collard, J. M., Olsen, J. E., Dalsgaard, A. Distribution and in-vitro transfer of tetracycline resistance determinants in clinical and aquatic Acinetobacter strains. Journal of Medical Microbiology. 49 (10), 929-936 (2000).
  29. Carattoli, A., et al. Identification of plasmids by PCR-based replicon typing. Journal of Microbiological Methods. 63 (3), 219-228 (2005).
  30. Green, M. R., Sambrook, J. Agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor protocols. 2019 (1), (2019).
  31. Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutation Research. 439 (1), 37-47 (1999).
  32. Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold nucleic acid gel stain: a dye optimized for use with 300-nm ultraviolet transilluminators. Analytical Biochemistry. 268 (2), 278-288 (1999).
  33. Oatey, P. Imaging fluorescently stained DNA with CCD technology How to increase sensitivity and reduce integration times. Biotechniques. 42 (3), 376-377 (2007).
  34. Norman, A., Hansen, L. H., Sørensen, S. J. Conjugative plasmids: vessels of the communal gene pool. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 364 (1527), 2275-2289 (2009).
  35. Du, L., Liu, R. H., Ying, L., Zhao, G. R. An efficient intergeneric conjugation of DNA from Escherichia coli to mycelia of the lincomycin-producer Streptomyces lincolnensis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (4), 4797-4806 (2012).
  36. Kirk, J. A., Fagan, R. P. Heat shock increases conjugation efficiency in Clostridium difficile. Anaerobe. 42, 1-5 (2016).
  37. Esteves, G. M., Pereira, J. A., Azevedo, N. F., Azevedo, A. S., Mendes, L. Friends with benefits: An inside look of periodontal microbes' interactions using fluorescence in situ hybridization-Scoping review. Microorganisms. 9 (7), 1504 (2021).

Tags

גנטיקה גיליון 193 אבולוציה ניסויית העברת גנים אופקית פלסמידים מצומדים עמידות לאנטיביוטיקה Escherichia coli
איתור העברת גנים אופקית בתיווך פלסמידים מצומדים טבעיים <em>באי-קולי</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mota-Bravo, L., Camps, M.,… More

Mota-Bravo, L., Camps, M., Muñoz-Gutiérrez, I., Tatarenkov, A., Warner, C., Suarez, I., Cortés-Cortés, G. Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli. J. Vis. Exp. (193), e64523, doi:10.3791/64523 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter