Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Rilevazione del trasferimento genico orizzontale mediato da plasmidi coniugativi naturali in E. coli

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64523
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2, 1, 2
1School of Biological Sciences, University of California Irvine, 2Department of Microbiology & Environmental Toxicology, University of California Santa Cruz

Summary

La coniugazione media il trasferimento genico orizzontale mobilitando il DNA plasmidico attraverso due cellule diverse, facilitando la diffusione di geni benefici. Questo lavoro descrive un metodo ampiamente utilizzato per la rilevazione efficiente del trasferimento plasmidico coniugativo, basato sull'uso di marcatori differenziali nel plasmide coniugativo, nel donatore e nel ricevente per rilevare la transconiugazione.

Abstract

La coniugazione rappresenta uno dei principali meccanismi che facilitano il trasferimento genico orizzontale nei batteri Gram-negativi. Questo lavoro descrive i metodi per lo studio della mobilizzazione dei plasmidi coniugativi presenti in natura, usando due plasmidi presenti in natura come esempio. Questi protocolli si basano sulla presenza differenziale di marcatori selezionabili nel plasmide donatore, ricevente e coniugativo. In particolare, i metodi descritti includono 1) l'identificazione di plasmidi coniugativi naturali, 2) la quantificazione dei tassi di coniugazione in colture solide e 3) la rilevazione diagnostica dei geni di resistenza agli antibiotici e dei tipi di replicon plasmidico nei riceventi transconiuganti mediante reazione a catena della polimerasi (PCR). I protocolli qui descritti sono stati sviluppati nel contesto dello studio dell'ecologia evolutiva del trasferimento genico orizzontale, per lo screening della presenza di plasmidi coniugativi portatori di geni di resistenza agli antibiotici nei batteri presenti nell'ambiente. L'efficiente trasferimento di plasmidi coniugativi osservato in questi esperimenti in coltura evidenzia la rilevanza biologica della coniugazione come meccanismo che promuove il trasferimento genico orizzontale in generale e la diffusione della resistenza agli antibiotici in particolare.

Introduction

Nel 1946, Lederberg e Tatum1 descrissero un processo sessuale in Escherichia coli K-12 che ora è noto come coniugazione. La coniugazione batterica è il processo mediante il quale una cellula batterica (il donatore) trasferisce materiale genetico unidirezionale ad un'altra cellula (il ricevente) mediante contatto diretto cellula-cellula. La coniugazione è ampiamente distribuita nei batteri2,3, sebbene la frazione di cellule donatrici che esprimono il meccanismo di coniugazione sia tipicamente molto piccola4.

I plasmidi sono elementi del DNA extracromosomico a replicazione autonoma. Oltre ai geni coinvolti nella replicazione e nel mantenimento dei plasmidi, i plasmidi trasportano spesso un carico di geni coinvolti nell'adattamento alle sfide ambientali, come i metalli pesanti o l'esposizione agli antibiotici5. I plasmidi coniugativi sono una classe di plasmidi con un insieme di geni specializzati che consentono il loro trasferimento alle cellule riceventi e supportano la loro persistenza dopo il trasferimento6. I plasmidi coniugativi variano in dimensioni da 21,8 kb a 1,35 Mb nei batteri nel phylum Pseudomonadota (sinonimo di Proteobacteria), con la mediana intorno a 100 kb 5,7. Inoltre hanno generalmente un basso numero di copie, probabilmente per mantenere basso il carico metabolico sull'ospite 8,9.

Il tipico apparato coniugativo è costituito da quattro componenti: un'origine di trasferimento (oriT), una relaxasi, una proteina di accoppiamento di tipo IV e un sistema di secrezione di tipo IV (una struttura simile a un tubo chiamata pilus che consente ai donatori di contattare i riceventi)6. Solo una frazione molto piccola di cellule portatrici di plasmidi coniugativi esprime il meccanismo di coniugazione4, ma se i plasmidi forniscono un vantaggio di fitness, i transconiuganti possono espandersi rapidamente nella popolazione. Tra il 35% e oltre l'80% degli isolati di E. coli raccolti da habitat diversi hanno plasmidi coniugativi con geni che conferiscono resistenza ad almeno un antibiotico10,11; Pertanto, il trasferimento genico orizzontale mediato dai plasmidi coniugativi è un meccanismo importante che guida la diffusione globale dei geni di resistenza agli antibiotici12.

Gli esperimenti di accoppiamento condotti in coltura di laboratorio hanno dimostrato che la frequenza di coniugazione è influenzata da molteplici fattori, tra cui la natura delle cellule riceventi, la fase di crescita, la densità cellulare, il rapporto donatore-ricevente, se la coniugazione è condotta in mezzi liquidi o solidi, carbonio, ossigeno, sali biliari, concentrazioni di metalli, presenza di cellule di mammifero, temperatura, pH e tempo di accoppiamento13,14, 15.

Questo lavoro descrive protocolli per rilevare la presenza di plasmidi coniugativi in un dato ceppo ospite, per quantificare i tassi di coniugazione in coltura solida e per ricontrollare il loro trasferimento alle cellule riceventi. Questi protocolli possono essere utilizzati come primo passo per l'identificazione di plasmidi coniugativi naturali adatti alla ricerca. Usano un numero minimo di passaggi semplificati perché sono progettati per schermare la presenza di plasmidi coniugativi in batteri ottenuti da più fonti (ambientali, commensali e patogene) su larga scala (da decine a centinaia di donatori).

Inoltre, vengono mostrati test per rilevare se la mobilizzazione di un dato plasmide coniugativo è indipendente dall'antibiotico utilizzato per il rilevamento (cioè la rilevanza del gene di resistenza agli antibiotici in selezione) e per confrontare i tassi di coniugazione di due plasmidi coniugativi trovati in diversi isolati ambientali.

Sulla base della composizione genetica dei plasmidi coniugativi rilevanti (replicon plasmidico e composizione genica della resistenza agli antibiotici), ogni fase del protocollo può essere modificata per studiare l'impatto di una varietà di fattori che possono influenzare il tasso di coniugazione.

Disegno sperimentale generale:
I componenti essenziali necessari per impostare un esperimento di accoppiamento sono cellule donatrici, un ceppo ricevente e terreni solidi per selezionare donatori (antibiotico A), riceventi (antibiotico B) e transconiuganti (antibiotico A e B). I transconiuganti sono cellule riceventi che mantengono stabilmente il plasmide coniugativo del donatore.

Le cellule donatrici sono resistenti a un antibiotico (antibiotico A) e sono sensibili al marcatore o ai marcatori utilizzati per selezionare le cellule riceventi (antibiotico B). La posizione genomica del gene di resistenza agli antibiotici (cioè, se si trova nel cromosoma o in un plasmide della cellula donatrice) non deve essere nota a priori, perché la mobilizzazione dei marcatori di resistenza agli antibiotici al ricevente (dopo un contatto diretto donatore-ricevente) implica che i marcatori forniti dal donatore fossero in un plasmide.

Un ceppo ricevente (noto per assumere plasmidi coniugativi) deve avere un marcatore stabile selezionabile non presente nel donatore; Questo marcatore selezionabile è generalmente resistente a un antibiotico o biocida situato nel cromosoma. La selezione del ricevente da utilizzare negli esperimenti di accoppiamento è fondamentale, perché alcuni ceppi di E. coli variano nella loro capacità di assumere plasmidi coniugativi16.

Una volta che questi componenti sono stati stabiliti, qualsiasi colonia che cresce su terreni con entrambi gli antibiotici (A e B) dopo un contatto di coppia donatore-ricevente è un transconiugante putativo (Figura 1). Ciò presuppone che i donatori possano crescere nei terreni con l'antibiotico A ma non possano crescere nei terreni con l'antibiotico B, e che i riceventi siano in grado di crescere nei terreni con l'antibiotico B, ma non in grado di crescere con l'antibiotico A. La transconiugazione può essere confermata utilizzando due test diagnostici. Il primo test consiste nella rilevazione (mediante amplificazione di geni mediante reazione a catena della polimerasi [PCR] o altri metodi) di geni presenti nel plasmide coniugativo in colonie transconiuganti. Il secondo test prevede l'uso di marcatori di colore differenziale delle colonie basati sul metabolismo del lattosio. Il colore differenziale della colonia è rivelato dall'uso dell'agar MacConkey; Il lattosio nell'agar può essere utilizzato come fonte di fermentazione da microrganismi fermentanti del lattosio (lac+). Questi microrganismi producono acidi organici, in particolare acido lattico, che abbassano il pH. Il rosso neutro è un indicatore di pH incluso nel mezzo che passa dal bianco sporco al rosso brillante / rosa quando il pH scende al di sotto di 6,817. Pertanto, i ceppi positivi al lattosio di E. coli producono colonie rosa più grandi sull'agar MacConkey, mentre i ceppi negativi al lattosio producono colonie giallo pallido e colonie più piccole sull'agar MacConkey.

Figure 1
Figura 1: Disegno sperimentale utilizzato per rilevare la presenza di plasmidi coniugativi nei ceppi donatori. In questo esempio, il donatore porta un plasmide coniugativo con un gene di resistenza agli antibiotici che conferisce resistenza all'antibiotico A, ma sono sensibili all'antibiotico B. Al contrario, il ricevente ha un determinante di resistenza cromosomica che conferisce protezione dall'antibiotico B, ma è suscettibile all'antibiotico A. I transconiuganti sono resistenti a entrambi gli antibiotici (A e B), perché hanno il plasmide coniugativo del donatore che conferisce resistenza all'antibiotico A e il cromosoma del ricevente che conferisce protezione dall'antibiotico B. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il tasso di coniugazione per una coppia donatore-ricevente (in determinate condizioni sperimentali) può essere calcolato dividendo il numero di transconiuganti per il numero di donatori o per il numero di riceventi; Il primo tasso indica la frazione di cellule donatrici che mostrano espressione funzionale del meccanismo di coniugazione da parte del donatore16,18, mentre il secondo tasso indica la capacità del ricevente di assumere plasmidi coniugativi 19,20. In questo studio, salvo diversa indicazione, il tasso di coniugazione rappresenta la frazione di cellule riceventi che diventano transconiuganti (cioè tasso per ricevente).

Qui, vengono riportati due esperimenti di accoppiamento indipendenti, che coinvolgono un ricevente di E. coli e due donatori di E. coli. Inoltre, sono stati utilizzati diversi antibiotici per selezionare i coniuganti per uno dei donatori per confermare che un singolo plasmide multiresistente può essere selezionato con uno qualsiasi dei geni di resistenza agli antibiotici presenti nel plasmide coniugativo.

I ceppi donatori e riceventi utilizzati in questo lavoro sono stati completamente sequenziati per comprendere tutte le componenti di questo sistema sperimentale; Tuttavia, questi protocolli sono stati progettati per lo screening della presenza di plasmidi coniugativi in ospiti di sequenza sconosciuta, e possono essere utilizzati anche in questo contesto sperimentale; Tuttavia, in questo caso, i geni rilevanti vengono sequenziati per primi.

I ceppi donatori e riceventi utilizzati nel protocollo sono i seguenti:

Donatore 1. Coli SW4955 è stato raccolto in un lago a Baton Rouge (LA, USA). Ha un plasmide coniugativo di 134.797 bp (p134797) con risposte IncFIC (FII) e IncFIB (AP001918). Questo plasmide coniugativo ha geni che conferiscono resistenza alle cefalosporine di terza generazione (blaCTX-M-55), aminoglicosidi (aac(3)-IIa e aadA1), fenicoli (catA2), tetracicline (tet(A)), trimetoprim (dfrA14) e sulfonamidi (sul3). Per una mappa completa di p134797, vedere la Figura 2A. Coli SW4955 è positivo al lattosio e produce colonie rosa sull'agar MacConkey.

Donatore 2. Coli SW7037 è stato raccolto nel lago Erie (Ottawa County, OH, USA). Porta un plasmide coniugativo di 101.718 bp (p101718) con un replica IncI1-I(Alpha). Questo plasmide coniugativo ha un gene che conferisce resistenza ai beta-lattamici (blaCMY-2). Per una mappa completa di p101718, vedere la Figura 2B. Coli SW7037 è anche positivo al lattosio, producendo colonie rosa su agar MacConkey.

Figure 2
Figura 2: Mappa genetica dei plasmidi coniugativi utilizzati in questo studio . (A) Plasmide p134797, il plasmide coniugativo trovato nel ceppo SW4955 di E. coli. (B) Plasmide p101718, il plasmide coniugativo trovato nel ceppo SW7037 di E. coli. I geni di resistenza agli antibiotici sono evidenziati in blu e i geni appartenenti all'apparato coniugativo sono evidenziati in rosso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Destinatario. Coli LMB100 viene utilizzato come destinatario. Questo è un ceppo senza plasmide resistente alla rifampicina (100 mg / L) e alla streptomicina (100 mg / L). Avere resistenza a due antibiotici riduce la possibilità che si verifichino mutazioni di resistenza nel donatore che interferirebbero con l'interpretazione dei risultati. Inoltre, E. coli LMB100 è negativo al lattosio e può essere distinto dai due ceppi donatori perché produce colonie giallo pallido e piccole (al contrario di colonie rosa più grandi) su agar MacConkey.

Quando il donatore è negativo al lattosio, si consiglia di utilizzare un ricevente positivo al lattosio (ad esempio, E. coli J53). I ceppi LMB100 e J53 sono disponibili per altri laboratori per l'uso. Si prega di inviare una richiesta al Dr. Gerardo Cortés-Cortés insieme a un indirizzo e un numero FedEx.

Il terreno solido necessario per selezionare e contare donatori, riceventi e transconiuganti è l'agar MacConkey in piastre di Petri di 100 mm di diametro. È necessaria l'aggiunta dei seguenti antibiotici: (i) Media A: carbenicillina (100 mg/L) per contare i donatori e per garantire che i riceventi non possano crescere con questo antibiotico. (ii) Media B: rifampicina (100 mg/L) + streptomicina (100 mg/L) per contare i riceventi e garantire che i donatori non possano crescere in questi due antibiotici. iii) Media AB: carbenicillina (100 mg/L) + rifampicina (100 mg/L) + streptomicina (100 mg/L) per ottenere e contare i coniuganti. (iv) Media C: nessun antibiotico per strisciare tutti gli isolati studiati.

Vengono confrontati i tassi di coniugazione dei plasmidi coniugativi da E. coli SW4955 ed E. coli SW7037 a E. coli LMB100. Inoltre, nel caso del plasmide coniugativo p134797 (ceppo SW4955), l'antibiotico carbenicillina (100 mg/L) viene sostituito da gentamicina (2 mg/L), cloramfenicolo (25 mg/L), tetraciclina (10 mg/L), trimetoprim (20 mg/L) o sulfametossazolo (100 mg/L) in esperimenti successivi per stabilire se il marcatore di resistenza agli antibiotici utilizzato per la selezione abbia un impatto sui risultati.

Protocol

1. Metodo 1: Coniugazione

  1. Giorno 1: Striscia i donatori e il ricevente. Strisciare separatamente dalle scorte di glicerolo sul supporto C (agar MacConkey senza antibiotici) e incubare per una notte a 37 °C.
    NOTA: Questo passaggio è necessario per garantire che l'esperimento sia condotto con isolati puri e per confermare il fenotipo del lattosio dal colore delle colonie.
  2. Giorno 2: Etichettare una provetta di coltura da 14,0 ml per ciascun donatore e ricevente. Selezionare una singola colonia di ciascun donatore e ricevente e coltivarle per una notte (18 ore) in provette di coltura separate da 14,0 ml contenenti 2 ml di brodo Mueller Hinton a 37 °C e agitando a 200 giri/min.
    NOTA: Nei ceppi utilizzati, la fase stazionaria viene raggiunta dopo una coltura notturna di 18 ore.
  3. Giorno 3: Misurare la densità ottica a 600 nm (OD600) della coltura notturna di ciascun donatore e ricevente (senza vortice) utilizzando una diluizione 1:10 di 900 μL di soluzione salina e 100 μL di coltura notturna.
  4. Regolare la densità ottica di ciascun donatore e ricevente a 2,0 (OD600 = 2,0) con soluzione salina sterilizzata (0,85% NaCl in acqua).
    NOTA: Una coltura notturna di E. coli con un OD600 = 2.0 ha 1.6 x 109 CFU / mL.
  5. Etichettare una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL "tubo di accoppiamento", indicando i ceppi donatori e riceventi. Trasferire 500 μL della sospensione aggiustata (OD600 = 2,0) di ciascun donatore e ricevente e metterli nel tubo di accoppiamento (questo tubo di accoppiamento avrebbe 0,8 x 109 CFU / ml di ciascun donatore e ricevente). Mescolare delicatamente il tubo di accoppiamento per inversione.
  6. Centrifugare il tubo di accoppiamento per 10 minuti a 500 x g a temperatura ambiente.
  7. Senza disturbare il pellet, pipettare 800 μL del tubo di coniugazione. Dovrebbero rimanere 200 μL nel tubo di coniugazione.
    NOTA: Scartare il surnatante in un contenitore di candeggina al 10% per inattivare i batteri nella sospensione.
  8. Incubare il tubo di accoppiamento per 18 ore (durante la notte) a 37 °C in un'incubatrice. L'accoppiamento avviene durante il periodo di incubazione.
    NOTA: Questo passaggio deve essere fatto senza agitare per non rompere il pili coniugativo.
  9. Come controllo negativo, striare la coltura notturna dei donatori sul terreno B e dei riceventi sul terreno A. Incubare le piastre durante la notte a 37 °C
  10. Giorno 4: Aggiungere 800 μL di soluzione salina al tubo di accoppiamento e vortice per risospendere (questo ricostituisce la miscela di accoppiamento a 1 ml).
    NOTA: Il vortice rompe i batteri di accoppiamento e omogeneizza la coltura per quantificare il CFU / ml.
  11. Preparare diluizioni 1:10 (da 1 x 100 a 1 x 10-7) della miscela di accoppiamento. Piastra 100 μL di diluizioni da 10-5 a 10-7 su supporti A e supporti B e tutte le diluizioni su supporti AB.
    NOTA: Dlution 100 si riferisce al tubo pulito.
  12. Lasciare asciugare le piastre prima di metterle nell'incubatrice capovolte. Incubare le piastre per 18 ore (durante la notte) a 37 °C.
  13. Giorno 5: Ispezionare i controlli negativi per assicurarsi che le strisce di colture notturne pure dei donatori non siano cresciute sul mezzo B e la cultura pura durante la notte dei riceventi non sia cresciuta sul mezzo A.
  14. Registra il numero di colonie e diluizioni che possono essere contate:
    1. Contare le colonie nella media A; Questi sono i donatori. Le colonie dovrebbero essere rosa (Figura 3A,B).
    2. Contare le colonie nella media B; Questi sono i destinatari e i transconiuganti. Le colonie dovrebbero essere giallo pallido (Figura 3C).
    3. Contare le colonie in media AB; Questi sono i transconiuganti. Le colonie dovrebbero essere giallo pallido.
      NOTA: selezionare una lastra numerabile. Una lastra numerabile ha tra 30 e 300 colonie (più di 300 colonie sarebbero difficili da contare, e meno di 30 colonie sono considerate una dimensione del campione troppo piccola per presentare una rappresentazione accurata del campione originale).
  15. Calcolare la frequenza di coniugazione per donatore o per ricevente
    Frequenza di coniugazione per donatore = (CFU/mL del coniugante [media AB])/ (CFU/mL dei donatori [media A]) x 100
    Frequenza di coniugazione per ricevente = (CFU/mL del transconiugante [media AB])/ (CFU/mL dei riceventi e dei transconiuganti [media B]) x 100
    NOTA: La frequenza di coniugazione per questo protocollo è stata calcolata come transconiuganti divisa per il numero del destinatario, moltiplicato per 100. Secondo la letteratura, la quantità risultante di coniugazione potrebbe essere denominata come frequenza di exconiugante, frequenza di trasferimento genico, frequenza di coniugazione, resa ricombinante, efficienza di trasferimento del plasmide, frequenza di coniugazione basata sulla conta batterica totale, proporzione di transconiuganti, frazione di transconiuganti nella popolazione ricevente, frequenza di transconiugante, frequenza di coniugazione, logaritmo della velocità di coniugazione, costante della velocità di trasferimento, velocità di coniugazione per coppia di accoppiamento, coefficiente di coniugazione, o efficienza di coniugazione20. Questo protocollo si riferisce al termine efficienza di coniugazione.
  16. Conservare i coniuganti nelle scorte di glicerolo a -80 °C. Seguire i passaggi secondari per la preparazione delle scorte di glicerolo.
    1. Selezionare una singola colonia di transconiuganti e coltivarli per una notte (18 ore) in provette di coltura da 5,0 mL contenenti 2 mL di brodo Mueller Hinton integrato con carbenicillina (100 mg/L), a 37 °C e agitando a 200 giri/min.
    2. Etichetta flaconcini criogenici, indicando il nome del transconiugante, come segue: Tc + nome del donatore + antibiotico di selezione nel mezzo A (poiché sono transconiuganti, è noto che il loro background è il ceppo ricevente, che è già resistente alla streptomicina e alla rifampicina, ma ospita anche il plasmide che trasporta un gene di resistenza ai beta-lattamici); ad esempio, TcU1Carb. Aggiungere numeri continui nel caso in cui sia necessario conservare più di un transconiugante dello stesso donatore (ad esempio, TcU1Carb1, TcU1Carb2, ecc.).
    3. Trasferire 1 mL di coltura overnight a 1 mL di glicerolo al 50% (v/v; la concentrazione finale di glicerolo deve essere del 25%) e mescolare delicatamente per inversione. Mettere i flaconcini criogenici su ghiaccio secco per 15 minuti e conservare i crioviali a -80 °C per esperimenti futuri.
  17. Per l'estrazione del DNA, striare i trasnconiuganti dalle scorte di glicerolo sull'agar Mueller Hinton integrato con carbenicillina (100 mg/L) e incubare per una notte a 37 °C; Quindi, seguire i consigli del passaggio 2.1.

2. Metodo 2: reazione a catena della polimerasi (PCR) per amplificare i geni di resistenza agli antibiotici e i repliconi plasmidi nei coniuganti di E. coli

NOTA: La reazione a catena della polimerasi (PCR) è stata sviluppata dal Dr. Kary Mullis nel 1983. La PCR dipende da primer specifici (un breve pezzo di DNA complementare a una data sequenza di DNA che agisce come un punto in cui può procedere la replicazione, generalmente lunghi 20-40 nucleotidi e idealmente con un contenuto di guanina-citosina del 40%-60%), che vengono ricotti a filamenti opposti di un modello di DNA a doppio filamento denaturato ed estesi attraverso una DNA polimerasi termostabile, generando così un modello aggiuntivo per il prossimo ciclo di reazioni, portando all'amplificazione esponenziale del modello originale21. In questo protocollo, i replicons e i geni di resistenza presenti nei plasmidi coniugativi sono stati amplificati per confermare il trasferimento nelle cellule riceventi transconiuganti.

  1. Estrazione del DNA
    1. Per rilevare il trasferimento di geni di resistenza trasportati dai plasmidi coniugativi, utilizzare il DNA transconiugante come modello. Utilizzare una semplice estrazione di preparazione dell'ebollizione per lisare le pareti cellulari batteriche.
      NOTA: La semplice estrazione con ebollizione è un approccio semplice per lisare le pareti cellulari batteriche. Questa estrazione contiene DNA plasmidico mescolato con DNA genomico, ma poiché i primer sono progettati in base a specifiche sequenze di DNA di interesse, questo modello è utile anche per la PCR. I plasmidi possono anche essere purificati in modo specifico, sebbene le rese tendano a diminuire con l'aumentare della dimensione del plasmide22. Questo è un comodo punto di sosta. Il DNA può essere conservato per diversi mesi a -20 °C.
  2. PCR
    1. Dato che l'esperimento ha un controllo negativo e uno positivo, è utile creare un pool per tutte le reazioni in un tubo da 1,5 ml. Etichettare un tubo da 1,5 ml come "pool" e le provette PCR richieste con il nome del gene e del campione (ad esempio, OXA-U1).
    2. Pipettare i reagenti PCR nel seguente ordine in una provetta da 1,5 ml: acqua sterile, 2x Master Mix, primer e polimerasi (eccetto il DNA modello) (vedere Tabella 1). Mescolare delicatamente pipettando su e giù almeno 10 volte. Tenere in ghiaccio per tutto il tempo.
      NOTA: Indossare guanti per evitare di contaminare la miscela di reazione o i reagenti. Cerca di evitare di aprire e mescolare i reagenti e di manipolare i campioni nella stessa area per prevenire la contaminazione dei reagenti. Posizionare i reagenti nel secchiello del ghiaccio per sopprimere l'attività di nucleasi e l'adescamento non specifico. Lasciali scongelare completamente prima di impostare una reazione. Mantenere i reagenti sul ghiaccio per tutta la durata dell'esperimento. La Taq Polimerasi viene aggiunta alla fine perché è sensibile alle variazioni di pH; Deve essere tamponato per evitare il degrado o il ripiegamento errato. La sequenza dei primer è elencata nella Tabella 2 - geni di resistenza agli antibiotici - e nella Tabella 3 - replicons 23,24,25,26,27,28.
    3. Aggiungi il DNA modello al tubo corrispondente. Evitare di introdurre bolle e tappi di fissaggio sui tubi PCR.
    4. Posizionare i tubi PCR nel termociclatore.
    5. Avviare il programma. Fare riferimento alle impostazioni del programma elencate per ciascun gene nella Tabella 2 (geni di resistenza) e nella Tabella 3 (replicon).
      NOTA: impostare i programmi PCR in modo da mantenere i campioni a 4 °C dopo l'esecuzione.
      1. Condizioni PCR per i replicon: un ciclo di denaturazione a 94 °C per 5 minuti, seguito da 30 cicli di denaturazione a 94 °C per 1 minuto, ricottura a 60 °C per 30 s, allungamento a 72 °C per 1 minuto e estensione finale di un ciclo a 72 °C per 5 minuti.
        NOTA: Queste sono le condizioni standardizzate da Carattoli et al.29.
    6. Al termine del programma, conservare le provette PCR a 4 °C.
      NOTA: questo è un comodo punto di sosta. I prodotti PCR possono essere conservati per diversi mesi a -20 °C
    7. Preparare un gel di agarosio all'1% pesando 0,6 g di agarosio in un matraccio da 250 mL e aggiungendo 60 mL di tampone 1x Tris-acetato-EDTA (TAE) (regolare i reagenti se è necessaria una dimensione del gel diversa). Sciogliere l'agarosio con cura e lentamente in un microonde per evitare che l'agarosio si rovesci sul pallone e lasciarlo raffreddare a circa 55 °C (10-15 min).
      1. Preparare tutti i reagenti utilizzando acqua deionizzata ultrapura e reagenti di grado analitico:
      2. TAE 50x Buffer (Tris base, acido acetico ed EDTA) (1 L): Mescolare 121,1 g di Tris base + 372,24 g di EDTA e aggiungere 500 mL di acqua distillata. Sciogliere con un agitatore magnetico. Aggiungere 57,1 ml di acido acetico e aggiungere acqua distillata per un volume totale di 1.000 ml.
      3. Autoclave a 15 psi, 121 °C per 15 minuti, e conservare a temperatura ambiente fino a 6 mesi.
      4. TAE 1x tampone (1 L): Combinare 20 mL di tampone TAE 50x con 980 mL di acqua distillata e miscelare.
    8. Sotto una cappa aspirante, aggiungere 6 μL di SYBR Green all'agarosio fuso, mescolare e versare nel vassoio (e nel pettine), precedentemente sigillato con nastro adesivo per evitare fuoriuscite. Lasciare riposare il gel per 15-25 minuti fino a quando non appare la torbidità.
      NOTA: Altri coloranti alternativi sono disponibili anche30,31,32,33.
    9. Rimuovere il nastro adesivo e posizionare il gel nella camera di elettroforesi, aggiungendo abbastanza tampone TAE 1x per coprire il gel.
    10. Mescolare 5 μL di 6x colorante caricante gel DNA con 25 μL di ogni reazione. Mescolare delicatamente pipettando su e giù almeno 10 volte.
      NOTA: Non tutto il prodotto PCR deve essere caricato nel gel per visualizzare il prodotto previsto (regolare la quantità di colorante in base alla corrispondenza). Il campione PCR rimanente potrebbe essere salvato e conservato a -20 °C per diversi mesi.
    11. Caricare la miscela nei pozzetti (evitare di introdurre bolle) e abbassare il coperchio della camera.
      NOTA: caricare il primo campione nel secondo pozzetto (riservare il primo alla scala), iniziando con il controllo negativo.
    12. Caricare 4 μL di scala del DNA da 1 kb nel primo pozzetto.
    13. Eseguire l'elettroforesi a 120 V, 400 mA e 60 min.
    14. Visualizza il gel sotto la luce UV (con un illuminatore UV) e registra l'immagine.
      NOTA: Se è presente un prodotto PCR, le bande di DNA colorate possono essere rilevate utilizzando un transilluminatore UV standard, un transilluminatore a luce visibile o uno scanner laser.
Reagente Soluzione Stock Volume aggiunto alla reazione a 50 μL (1x) Finale Esempio: volume Esempio: volume Esempio: volume aggiunto ad ogni tubo Vol. finale 50 μL Volume aggiunto al controllo positivo Volume aggiunto al controllo negativo
Concentrazione aggiunto a 1x aggiunto a 3x (pool)
Acqua sterile - 21,5 μL (da q.s. a 50 μL) - 21,5 μL 64,5 μL 49 μL/tubo 49 μL/tubo 49 μL/tubo
Master Mix 2x 25 μL 1x 25 μL 75 μL
Primer in avanti 25 μM 1 μL 0,5 μM 1 μL 3 μL
Primer inverso 25 μM 1 μL 0,5 μM 1 μL 3 μL
Modello DNA Variabile (100–200 ng/μL) Variabile (1 μL) Variabile 0,5 μL 1,5 μL
Polimerasi 5 unità/μL 0,5 μL 2.5 Unità - - 1 μL (transconiugante) 1 μL (donatore) 1 μL (ricevente)
NOTA: q.s. è un'abbreviazione latina per quantum satis che significa la quantità necessaria.

Tabella 1: reagenti PCR e pool per tre reazioni (un esempio). 

Primer (sequenza elencata nell'orientamento 5' - 3') Programma PCR Dimensioni previste
(bp) Ref.
blaCTX-M gruppo 1 94 oC 7 min (864) 23
CTX-M: GGTTAAAAAATCACTGCGYC 94 oC 50 s (35 cicli)
CTX-M: TTGGTGACGATTTTAGCCGC 50 oC 40 s
68 oC 1 min
68 oC 5 min
blaCMY-2 95 oC 3 min (1855) 24
CMY-2-F: GATTCCTTGGACTCTTCAG 95 oC 30 s (30 cicli)
CMY-2-R: TAAAACCAGGTTCCCAGATAGC 53 oC 30 s
72 oC 30 s
72 oC 3 min
aac(3')-II 94 oC 5 min (237) 25
aac(3')-II-F: ACTGTGATGGGATACGCGTC 94 oC 30 s (32 cicli)
aac(3')-II-R: CTCCGTCAGCGTTTCAGCTA 60 oC 45 s
72 oC 2 min
72 oC 8 min
aadA 94 oC 5 min (283) 26
aadA1: GCAGCGCAATGACATTCTTG 94 oC 1 min (35 cicli)
aadA2: ATCCTTCGGCGCGATTTTG 60 oC 1 min
72 oC 1 min
72 oC 8 min
SUL-3 94 oC 5 min (799) 27
sul-3-F: GAGCAAGATTTTTGGAATCG 94 oC 1 min (30 cicli)
sul-3-R: CATCTGCAGCTAACCTAGGGCTTTGGA 51 oC 1 min
72 oC 1 min
72 oC 5 min
tet(A) 95 oC 5 min (957) 28
TETA-1: GTAATTCTGAGCACTGTCGC 95 oC 30 s (23 cicli)
TETA-2: CTGCCTGGACAACATTGCTT 62 oC 30 s
72 oC 45 s
72 oC 7 min
DFR Un 95 oC 5 min (302) Questo lavoro
DFRA-F: CATACCCTGGTCCGCGAAAG 95 oC 1 min (30 cicli)
55 oC 1 min
DFRA-R: CGATGTCGATCGTCGATAAGTG 72 oC 1 min
72 oC 7 min
catA2 95 oC 5 min
catA2-F: GACCCGGTCTTTACTGTCTTTC 95 oC 1 min (25 cicli) (225) Questo lavoro
catA2-R: TCCGGTGATATTCAGATTAAAT 60 oC 1 min
72 oC 1 min
72 oC 7 min

Tabella 2: Primer e programmi PCR utilizzati per amplificare i geni di resistenza diagnostica. 

Replica Primer (sequenza elencata nell'orientamento 5' - 3') Bersaglio Programma PCR Dimensioni previste (bp)
IncFIB F: TCTGTTTATTCTTACTGTCCAC repA 94 oC 5 min 683
R: CTCCCGTCGCTTCAGGGCATT 94 oC 1 min (30 cicli)
60 oC 30 s
IncFIC F: GTGAACTGGCAGATGAGGAAGG repA2 72 oC 1 min 262
R: TTCTCCTCGTCGCCAAACTAGAT 72 oC 5 min
IncI1 F: CGAAAGCCGGACGGCAGAA RNAI 139
R: TCGTCGTTCCGCCAAGTTCGT

Tabella 3: Primer e programma PCR utilizzati per classificare i plasmidi p134797 e p101718 mediante replicon basato su PCR29. 

Representative Results

Dato che i donatori SW4955 e SW7037 sono stati sequenziati, ci si aspetta che questi due ceppi donatori abbiano i fenotipi di resistenza corrispondenti al profilo genico di resistenza identificato nella loro sequenza genomica. Il plasmide p134797 (da SW4955) ha geni che conferiscono resistenza alle cefalosporine di terza generazione (blaCTX-M-55) e resistenza agli aminoglicosidi (aac(3)-IIa e aadA1), fenicoli (catA2), tetracicline (tet(A)), trimetoprim (dfrA14) e sulfonamidi (sul3); non sono stati trovati geni di resistenza agli antibiotici nel cromosoma SW4955. Il plasmide p101718 (da SW7037) porta solo un gene di resistenza agli antibiotici (bla CMY-2), che dovrebbe conferire resistenza alle cefalosporine di terza generazione (blaCTX-M-55). Ancora una volta non sono stati trovati geni di resistenza agli antibiotici nel cromosoma SW7037.

Dopo l'accoppiamento, era prevista la rilevazione del trasferimento dei due plasmidi coniugativi portatori di tutti i geni di resistenza sopra menzionati. Il rilevamento positivo della coniugazione implica che i riceventi identificati come transconiuganti dovrebbero aver acquisito i plasmidi coniugativi. Era prevista anche la presenza dei geni di resistenza diagnostica per i plasmidi coniugativi nei transconiuganti (come rilevato dalla PCR).

Per illustrare i metodi qui descritti, è stata testata la capacità di due isolati ambientali di E. coli di trasferire DNA plasmidico per coniugazione. Una rappresentazione schematica dell'impostazione sperimentale è mostrata nella Figura 1. Due donatori (E. coli SW4955 e SW7037) e un ricevente (E. coli LMB100) sono stati accoppiati indipendentemente. La mappa genica dei plasmidi coniugativi trovati in E. coli SW4955 (p134797) e SW7037 (p101718) è mostrata nella Figura 2.

I plasmidi coniugativi sono stati selezionati con carbenicillina e controselezionati utilizzando rifampicina e streptomicina, i cui determinanti di resistenza sono nel cromosoma del ricevente. L'agar MacConkey è stato utilizzato per distinguere i donatori positivi al lattosio (che producono grandi colonie rosa) dal ricevente e dai transconiuganti (che sono negativi al lattosio e producono colonie più piccole e giallo pallido) (Figura 3).

Figure 3
Figura 3: Illustrazione dei marcatori di colore differenziale per le colonie donatrici e riceventi sull'agar MacConkey. Le colonie corrispondenti ai donatori sono rosa su agar MacConkey perché sono positive al lattosio. Questo distingue le colonie donatrici da quelle riceventi, che sono giallo pallido e più piccole (lattosio negativo). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

È stata rilevata la mobilizzazione del plasmide coniugativo p134797, con ciascuno dei cinque antibiotici corrispondenti alle cinque diverse classi di geni di resistenza presenti nel plasmide.

Viene presentato un esempio di come calcolare l'efficienza di coniugazione (CE) per il ceppo SW4955. Dal saggio con ceppo SW4955, 172 CFU di transconiuganti sono stati contati nella piastra dalla diluizione 10-2; il conteggio del ricevente dalla diluizione corrispondente (10-2) è stato di 10.300.000 CFU/mL (Tabella 4).

Il CE è calcolato come segue:

CE = (174 CFU/mL)/(10.300.000 CFU/mL)

CE= 1,67 x 10-5 coniuganti/ricevente

LMB100 Transconiuganti del ceppo SW4955 selezionati con carbelicillina Efficienza di coniugazione
Diluizione CFU (piastra numerabile) circa CFU/mL CFU (piastra numerabile)
100 confluente 1,03E+09
10-1 confluente 1,03E+08
10-2 confluente 10300000 172 1,67 x 10-5 transconiuganti/ricevente
10-3 confluente 1030000
10-4 confluente 103000
10-5 confluente 10300
10-6 confluente 1030
10-7 103 103
I valori utilizzati per calcolare il CE sono evidenziati in grassetto.

Tabella 4: Un esempio di come calcolare l'efficienza di coniugazione (CE) per il ceppo SW4955.

I risultati sono mostrati nella Tabella 5, espressa come efficienza di coniugazione per destinatario. Le cinque efficienze di coniugazione ottenute utilizzando il ceppo SW4955 come donatore erano tutte all'interno dello stesso ordine di grandezza. Questi risultati indicano che la mobilizzazione del plasmide coniugativo può essere rilevata indipendentemente dalla selezione utilizzata per l'identificazione transconiugante.

Utilizzando il ceppo SW7037 come donatore, l'efficienza di coniugazione ottenuta era inferiore di tre ordini di grandezza; Questi risultati consentono il confronto delle efficienze di coniugazione di diversi donatori e tipi di plasmidi con gli stessi riceventi.

Efficienza di coniugazione
Sforzo Carbenicillina (100 mg/L) Gentamicina (2 mg/L) Cloramfenicolo (25 mg/L) Tetraciclina (10 mg/L) Trimetoprim (20 mg/L)
SW4955 1,67 x 10-5 5,67 x 10-5 2,17 x 10-5 7,62 x 10-5 1,36 x 10-5
SW7037 2,14 x 10-6

Tabella 5: Efficienze di coniugazione dei ceppi donatori di E. coli SW4955 e SW7037 a seconda dell'antibiotico utilizzato per la selezione.

Nei transconiuganti, la presenza di replicons e di tutti i geni di resistenza codificati in due plasmidi coniugativi testati, e i loro corrispondenti replicon, è stata controllata mediante PCR. Le condizioni utilizzate per queste reazioni diagnostiche alla PCR sono mostrate nella Tabella 3.

I gel diagnostici sono mostrati nella Figura 4. Questi gel confermano la presenza dei replicons attesi nei transconiuganti (IncFIC e IncFIB in p1347975 e IncI1 in p101718). Confermano anche la presenza dei geni di resistenza agli antibiotici attesi, vale a dire il gruppo bla CTX-M-55 (beta-lattamici), aac(3)-II e aadA (aminoglicoside), catA2 (fenicolo), tet(A) (tetraciclina), dfrA14 (trimetoprim) e sul3 (sulfonamide) per p1347975 e blaCMY-2 per p101718 (Figura 4).

Figure 4
Figura 4: Gel per elettroforesi diagnostica. Elettroforesi su gel di prodotti PCR di geni di resistenza agli antibiotici e replicons plasmidi trovati nei plasmidi coniugativi p134797 e p101718 nelle cellule donatrici (ceppi SW4955 e SW7037, rispettivamente) e nei corrispondenti transconiuganti LMB100. La carbenicillina è stata utilizzata per la selezione del plasmide. Abbreviazioni. -: controllo negativo (il DNA del ceppo LMB100 è stato utilizzato come controllo negativo); D: donatore; T: transconiugante. Dimensioni ampliconi previste: blaCTX-M-55: 864 pb; aac(3)-IIa: 237 pb; aadA1: 283 pb; catA2 : 225 pb; tet(A): 957 pb; dfrA14: 302 pb; sul3: 799 pb; IncFIC(FII): 262 pb; IncFIB: 683 pb; blaCMY-2: 1.855 pb; IncI1-I: 139 pb. Il gel ha l'1% di agarosio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussion

I plasmidi coniugativi forniscono l'accesso a un pool comune di geni all'interno di un particolare ambiente ambientale attraverso la ricombinazione e il trasferimento genico orizzontale34. Pertanto, i plasmidi coniugativi sono entità evolutive in grado di acquisire e conferire funzioni che consentono ai batteri di adattarsi a molteplici condizioni (tra cui resistenza agli antibiotici, resistenza ai metalli, acquisizione di metalli, formazione di biofilm e geni patogeni, tra gli altri) entro una scala temporale di ore.

Questo lavoro presenta un protocollo per l'identificazione di plasmidi coniugativi nei batteri. Affinché il protocollo funzioni, i marcatori utilizzati devono differenziare i ceppi del donatore e del ricevente, come mostrato dai controlli nei mezzi A e B. Hanno anche bisogno di selezionare efficacemente le cellule che trasportano il plasmide. La reazione di accoppiamento è fondamentale. In questa reazione, donatori e riceventi devono stabilire un contatto prolungato (attraverso pili) affinché avvenga la coniugazione. Tutto ciò che può interrompere il contatto cellula-cellula, come un tempo di incubazione insufficiente o agitare o mescolare la coltura, diminuisce quindi l'efficienza della coniugazione. Anche la scelta del ricevente è critica, poiché alcuni ceppi riceventi sono refrattari alla coniugazione35,36. LMB100 si propone come destinatario di scelta, in quanto è in grado di prendere plasmidi di più tipi di incompatibilità.

Il tasso di coniugazione è specifico per ogni coppia cromosomica plasmide-donatore, ricevente e condizione ambientale. La coniugazione di plasmidi specifici è risultata sensibile a un gran numero di variabili, tra cui la fase di crescita, la densità cellulare, il rapporto donatore-ricevente, se la coniugazione è condotta in mezzi liquidi o solidi, carbonio, ossigeno, sali biliari, concentrazioni di metalli, presenza di cellule di mammifero, temperatura, pH e tempo di accoppiamento13,14,15 . Lo studio di queste interazioni dipende dalla rilevazione iniziale di un plasmide coniugativo da studiare in profondità. Pertanto, il protocollo qui descritto può anche essere modificato per esplorare l'impatto di diverse variabili sperimentali, sebbene ciò avvenga al costo di limitare il numero di donatori sottoposti a screening. Può anche identificare plasmidi mobilizzabili in ospiti che hanno plasmidi helper (cioè plasmidi che consentono la coniugazione fornendo funzioni mancanti dai plasmidi mobilizzabili in trans6).

Si raccomanda di conoscere la sequenza del plasmide coniugativo (ma non è necessario per rilevare la coniugazione, come discusso sopra). Quando i donatori sono negativi al lattosio (producono colonie gialle su agar MacConkey), un ricevente positivo al lattosio (che produce colonie rosa su agar MacConkey) può essere utilizzato per distinguere i veri transconiuganti dalle cellule donatrici che sono in grado di crescere sul terreno per selezionare i transconiuganti. Il protocollo qui descritto è progettato per rilevare plasmidi coniugativi da membri ambientali, commensali e patogeni della famiglia delle Enterobacteriaceae; Tuttavia, può essere utilizzato con qualsiasi specie batterica con un donatore, un ricevente, uno o più antibiotici e marcatori colorati adatti. L'identificazione di questi componenti critici in altri batteri richiede studi sistematici utilizzando più donatori, riceventi e marcatori (antibiotici e coloranti). Questo protocollo non è stato testato nei batteri Gram-positivi.

Diverse varianti del metodo qui presentato sono state riportate in letteratura, recentemente recensite20. Il risultato qualitativo può anche essere indicato in modi diversi (ad esempio, frequenza dell'exconiugante e frequenza di trasferimento genico), e le unità adimensionali possono essere utilizzate per riportare l'efficienza di coniugazione (mL / CFU x h) 20.

Il protocollo qui descritto risolve diverse limitazioni precedentemente non affrontate dai metodi esistenti16,18,19,20. In primo luogo, è stato identificato un destinatario adatto. In secondo luogo, l'uso di due antibiotici (rifampicina e streptomicina) per selezionare i veri coniuganti riduce al minimo la possibilità che i donatori sviluppino resistenza a uno degli antibiotici usati per selezionare i transconiuganti attraverso la mutagenesi spontanea. I falsi transconiuganti possono anche derivare dalla protezione degli astanti mediante idrolisi dell'antibiotico utilizzato per selezionare i transconiuganti da parte di enzimi (ad esempio, beta-lattamasi) prodotti in grandi quantità dal donatore. In terzo luogo, sono inclusi diversi controlli sperimentali per garantire che il prodotto dell'accoppiamento sia un vero transconiugante (cioè una cellula ricevente che ha incorporato stabilmente il plasmide coniugativo del donatore). Qui, abbiamo presentato due metodi indipendenti per testare l'autenticità dei transconiuganti, vale a dire un marcatore colorimetrico in agar MacConkey e il rilevamento PCR dei geni replicons e di resistenza agli antibiotici del plasmide coniugativo nel ricevente. Inoltre, il protocollo qui descritto è progettato per isolare e caratterizzare plasmidi coniugativi da membri ambientali, commensali e patogeni della famiglia Enterobacteriaceae (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Salmonella, Shigella e altre specie).

Per comprendere la meccanica della coniugazione, le osservazioni sperimentali sono state modellate utilizzando simulazioni al computer. Questi modelli predittivi stimano la frequenza del trasferimento del plasmide per determinate densità di crescita di donatori, riceventi e transconiuganti. Un modello noto come modello endpoint ha trovato soglie al di sopra delle quali il tasso di trasferimento del plasmide in coltura liquida e ha concluso che la velocità di trasferimento non è influenzata dalla densità cellulare, dal rapporto donatore/ricevente e dal tempo di accoppiamento19. L'ibridazione fluorescenza in situ (FISH) è stata utilizzata come metodo alternativo di rilevamento plasmidico transconiugante. FISH consente la visualizzazione del plasmide utilizzando la microscopia a fluorescenza attraverso l'ibridazione di una sonda di DNA e di un DNA bersaglio. Pertanto, la FISH consente la rilevazione visiva dei flussi plasmidici attraverso diverse popolazioni cellulari37, sebbene non abbia lo stesso livello di sensibilità del metodo qui presentato se i transconiuganti vengono rilevati mediante screening visivo anziché selezione.

C'è un enorme bisogno di comprendere la biologia dei plasmidi coniugativi che stanno disperdendo i geni di resistenza agli antibiotici attraverso diversi componenti dell'ecosistema (clinica, agricoltura, fognature, fauna selvatica, animali domestici, suoli, fiumi e laghi). In sintesi, le condizioni sperimentali semplificate presentate nei protocolli qui descritti facilitano lo screening dei donatori su larga scala, e rappresentano quindi uno strumento chiave per lo studio del trasferimento genico orizzontale originato nei plasmidi coniugativi da una varietà di fonti. Possono essere utilizzati per studiare la prevalenza di geni di resistenza agli antibiotici o altri geni clinicamente rilevanti nei plasmidi coniugativi provenienti da più fonti e batteri. Possono anche essere adattati per lo studio della coniugazione in vivo (ad esempio, nell'intestino dei vertebrati) e per studiare le condizioni che modulano l'efficienza della coniugazione. Tutti questi studi contribuiranno notevolmente alla comprensione di come la mobilizzazione dei plasmidi coniugativi multiresistenti contribuisca alla diffusione della resistenza multifarmaco.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

LM-B, IMG, AT e IS sono stati supportati dalla sovvenzione NIH GM055246 assegnata a LM-B. GC-C ha ricevuto la borsa di studio post-dottorato UC MEXUS-CONACYT per due anni consecutivi: AA 2017-18 e 2018-19. Ringraziamo vivamente gli studenti Sage Chavez e Pepper St. Clair del programma di mentoring Academic Inspiration Network (GAIN) sponsorizzato dalla Genentech-Foundation per il loro supporto tecnico negli esperimenti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tube racks Thermo Fisher Scientific 22-313630 It can be replaced for another brand
2.0 mL Cryogenic vials Corning 430659 It can be replaced for another brand
14 mL conical tubes FALCON 149597 It can be replaced for another brand
14 mL tube racks Thermo Fisher Scientific 8850 It can be replaced for another brand
1 kb DNA ladder New England Biolabs N0552G 
250 mL sterile flasks  PYREX 5320 It can be replaced for another permanent marker brand
Acetic acid Fisher Scientific A38SI-212 It can be replaced for another brand
Agarose (molecular biology grade, multipurpose) Fisher Scientific BP160-500 It can be replaced for another brand
Carbenicillin GOLD BIOTECHNOLOGY C-103-50 It can be replaced for another brand
Disposable inoculating loops: 1 µL Fisherbrand 22-363-595 It can be replaced for another brand
DNA gel loading dye 6x  New England Biolabs B7024S It can be replaced for another brand
EDTA Fisher Scientific BP119-500 It can be replaced for another brand
Electronic digital scale Denver Instrument APX-2001 It can be replaced for another brand
Eppendorf conical tubes: 1.5 mL Eppendorf 14-282-302 It can be replaced for another brand
Equipment for agarose gel electrophoresis Fisher Scientific FP300 It can be replaced for another brand
Ethanol-resistant markers Sharpie 37001; 37002; 37003 It can be replaced for another brand
Gel documentation systems (UVP GelSolo) Analytakjena SP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01 It can be replaced for another brand
Gloves X-GEN 44-100M Any nitrile gloves brand works
Ice bucket Thermo Fisher Scientific 432128 It can be replaced for another brand
MacConkey agar  BD DIFCO 212123
Master Mix  BioLabs M0496S  It can be replaced for another brand
Methanol Fisher Scientific A452-4 It can be replaced for another brand
Microcentrifuge tubes: 2.0 mL Fisherbrand 05-408-138 It can be replaced for another brand
Mueller Hinton agar BD DIFCO DF0479-17-3
Mueller Hinton broth BD DIFCO 275730
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA Takara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL 740588. 250
PCR tube racks AXYGEN   R96PCRFSP It can be replaced for another brand
PCR tubes (0.2 mL) AXYGEN  PCR-02-C It can be replaced for another brand
Rifampicin Fisher Scientific 50-164-7517
Set of micropipettes that dispense between 1 - 10 μL (P10), 2–20 μL (P20), 20–200 μL (P200) and 200–1000 μL (P1000) RAININ 17008648; 17008650; 17008652; 17008653 Micropipettes should be calibrated; can be replaced for another brand
Sodium chloride Fisher Scientific S671-3 It can be replaced for another brand
Spectrophotometer Thermo Scientific 335905P It can be replaced for another brand
Sterilized tips for 10 μL, 200 μL and 1000 μL  Eclipse 1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9 It can be replaced for another brand
Streptomycin Fisher Scientific BP910-50
SYBR Safe DNA gel stain  Thermo Fisher Scientific S33102
Taq DNA Polymerase BioLabs M0273S
Thermal cycler C1000 Touch  Bio-Rad 1851196 It can be replaced for another brand
Tris  Fisher Scientific BP153-500 It can be replaced for another brand

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lederberg, J., Tatum, E. Gene recombination in Escherichia coli. Nature. 158 (4016), 558 (1946).
  2. de la Cruz, F., Frost, L. S., Meyer, R. J., Zechner, E. L. Conjugative DNA metabolism in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (1), 18-40 (2010).
  3. Grohmann, E., Muth, G., Espinosa, M. Conjugative plasmid transfer in gram-positive bacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (2), 277-301 (2003).
  4. Koraimann, G., Wagner, M. A. Social behavior and decision making in bacterial conjugation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 54 (2014).
  5. Dziewit, L., et al. Diversity and role of plasmids in adaptation of bacteria inhabiting the Lubin copper mine in Poland, an environment rich in heavy metals. Frontiers in Microbiology. 6, 152 (2015).
  6. Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (3), 434-452 (2010).
  7. Balbuena-Alonso, M. G., et al. Genomic analysis of plasmid content in food isolates of E. coli strongly supports its role as a reservoir for the horizontal transfer of virulence and antibiotic resistance genes. Plasmid. 123-124, 102650 (2022).
  8. San Millan, A., MacLean, R. C. Fitness costs of plasmids: A limit to plasmid transmission. Microbiol Spectrum. 5 (5), (2017).
  9. Coluzzi, C., Garcillán-Barcia, M. P., de la Cruz, F., Rocha, E. P. C. Evolution of plasmid mobility: Origin and fate of conjugative and nonconjugative plasmids. Molecular Biology and Evolution. 39 (6), 1-23 (2022).
  10. Bevan, E. R., et al. Molecular characterization of plasmids encoding blaCTX-M from faecal Escherichia coli in travellers returning to the UK from South Asia. The Journal of Hospital Infection. 114, 134-143 (2021).
  11. Minja, C. A., Shirima, G., Mshana, S. E. Conjugative plasmids disseminating CTX-M-15 among human, animals and the environment in Mwanza Tanzania: a need to intensify one health approach. Antibiotics. 10 (7), 836 (2021).
  12. Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. International Journal of Medical Microbiology. 303 (6-7), 298-304 (2013).
  13. Sengupta, M., Austin, S. Prevalence and significance of plasmid maintenance functions in the virulence plasmids of pathogenic bacteria. Infection and Immunity. 79 (7), 2502-2509 (2011).
  14. Alderliesten, J. B., et al. Effect of donor-recipient relatedness on the plasmid conjugation frequency: a meta-analysis. BMC Microbiology. 20 (1), 135 (2020).
  15. Neil, K., Allard, N., Rodrigue, S. Molecular mechanisms influencing bacterial conjugation in the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 12, 673260 (2021).
  16. Liu, G., Bogaj, K., Bortolaia, V., Olsen, J. E., Thomsen, L. E. Antibiotic-induced, increased conjugative transfer is common to diverse naturally occurring ESBL plasmids in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 10, 2119 (2019).
  17. Suchman, E. Polymerase chain reaction protocol. American Society for Microbiology. , 1-14 (2011).
  18. Watanabe, T. Infective heredity of multiple drug resistance in bacteria. Bacteriological Reviews. 27 (1), 87-115 (1963).
  19. Simonsen, L., Gordon, D. M., Stewart, F. M., Levin, B. R. Estimating the rate of plasmid transfer: an end-point method. Journal of General Microbiology. 136 (11), 2319-2325 (1990).
  20. Huisman, J. S., et al. Estimating plasmid conjugation rates: A new computational tool and a critical comparison of methods. Plasmid. 121, 102627 (2022).
  21. Jung, B., Hoilat, G. J. MacConkey medium. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2022).
  22. NucleoSpin Plasmid DNA purification. , Available from: https://www.mn-net.com/media/pdf/45/51/02/Instruction-NucleoSpin-Plasmid.pdf (2022).
  23. Jiang, X., et al. Detection of extended-spectrum beta-lactamases in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (9), 2990-2995 (2006).
  24. Stapleton, P. D., Shannon, K. P., French, G. L. Carbapenem resistance in Escherichia coli associated with plasmid-determined CMY-4 beta-lactamase production and loss of an outer membrane protein. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (5), 1206-1210 (1999).
  25. Ben Yahia, H., et al. Detection of CTX-M-15 harboring Escherichia coli isolated from wild birds in Tunisia. BMC Microbiology. 18 (1), 26 (2018).
  26. Madsen, L., Aarestrup, F. M., Olsen, J. E. Characterisation of streptomycin resistance determinants in Danish isolates of Salmonella Typhimurium. Veterinary Microbiology. 75 (1), 73-82 (2000).
  27. Perreten, V., Boerlin, P. A new sulfonamide resistance gene (sul3) in Escherichia coli is widespread in the pig population of Switzerland. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (3), 1169-1172 (2003).
  28. Guardabassi, L., Dijkshoorn, L., Collard, J. M., Olsen, J. E., Dalsgaard, A. Distribution and in-vitro transfer of tetracycline resistance determinants in clinical and aquatic Acinetobacter strains. Journal of Medical Microbiology. 49 (10), 929-936 (2000).
  29. Carattoli, A., et al. Identification of plasmids by PCR-based replicon typing. Journal of Microbiological Methods. 63 (3), 219-228 (2005).
  30. Green, M. R., Sambrook, J. Agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor protocols. 2019 (1), (2019).
  31. Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutation Research. 439 (1), 37-47 (1999).
  32. Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold nucleic acid gel stain: a dye optimized for use with 300-nm ultraviolet transilluminators. Analytical Biochemistry. 268 (2), 278-288 (1999).
  33. Oatey, P. Imaging fluorescently stained DNA with CCD technology How to increase sensitivity and reduce integration times. Biotechniques. 42 (3), 376-377 (2007).
  34. Norman, A., Hansen, L. H., Sørensen, S. J. Conjugative plasmids: vessels of the communal gene pool. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 364 (1527), 2275-2289 (2009).
  35. Du, L., Liu, R. H., Ying, L., Zhao, G. R. An efficient intergeneric conjugation of DNA from Escherichia coli to mycelia of the lincomycin-producer Streptomyces lincolnensis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (4), 4797-4806 (2012).
  36. Kirk, J. A., Fagan, R. P. Heat shock increases conjugation efficiency in Clostridium difficile. Anaerobe. 42, 1-5 (2016).
  37. Esteves, G. M., Pereira, J. A., Azevedo, N. F., Azevedo, A. S., Mendes, L. Friends with benefits: An inside look of periodontal microbes' interactions using fluorescence in situ hybridization-Scoping review. Microorganisms. 9 (7), 1504 (2021).

Tags

Genetica Numero 193 Evoluzione sperimentale trasferimento genico orizzontale plasmidi coniugativi antibiotico-resistenza Escherichia coli
Rilevazione del trasferimento genico orizzontale mediato da plasmidi coniugativi naturali in <em>E. coli</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mota-Bravo, L., Camps, M.,… More

Mota-Bravo, L., Camps, M., Muñoz-Gutiérrez, I., Tatarenkov, A., Warner, C., Suarez, I., Cortés-Cortés, G. Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli. J. Vis. Exp. (193), e64523, doi:10.3791/64523 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter