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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Analyse de l’afflux de calcium induit par le récepteur des lymphocytes T dans les lymphocytes T murins primaires par cytométrie en flux à spectre complet

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64526
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado-Anschutz School of Medicine

Summary

L’afflux de calcium, une mesure de la signalisation des lymphocytes T, est un moyen efficace d’analyser les réponses à la stimulation des récepteurs des lymphocytes T. Ce protocole de multiplexage d’Indo-1 avec des panels d’anticorps dirigés contre les molécules de surface cellulaire tire parti des capacités très flexibles de la cytométrie en flux à spectre complet.

Abstract

L’afflux de calcium en réponse à la stimulation des récepteurs des lymphocytes T est une mesure courante de la signalisation des lymphocytes T. Plusieurs colorants indicateurs de calcium ont été développés pour évaluer la signalisation du calcium par cytométrie en flux passe-bande. Ce protocole est conçu pour mesurer les réponses calciques dans les cellules T murines primaires en utilisant la cytométrie en flux à spectre complet. Les splénocytes totaux sont marqués avec le colorant indicateur de calcium ratiométrique Indo-1, ainsi qu’un panel d’anticorps conjugués au fluorochrome contre les molécules de surface cellulaire. L’exploitation des capacités de la cytométrie en flux à spectre complet fournit une plate-forme pour utiliser un large éventail de colorations de surface cellulaire en combinaison avec Indo-1. Les cellules sont ensuite analysées en temps réel à 37 °C avant et après l’ajout d’un anticorps anti-CD3 pour stimuler le récepteur des lymphocytes T. Après avoir démélangé les signaux spectraux, le rapport de l’Indo-1 lié au calcium et de l’Indo-1 sans calcium est calculé et peut être visualisé au fil du temps pour chaque population fermée de splénocytes. Cette technique peut permettre l’analyse simultanée des réponses calciques dans plusieurs populations cellulaires.

Introduction

L’afflux de calcium induit par le récepteur des lymphocytes T (TCR) est une mesure utile de l’activation des lymphocytes T et est fréquemment utilisé pour déterminer si une population de lymphocytes T a des réponses altérées dans les étapes proximales de la voie de signalisation TCR1. Les mesures de l’afflux de calcium sont généralement effectuées en pré-marquant les lymphocytes T avec un ou une paire de colorants indicateurs de calcium fluorescents, puis en examinant les signaux fluorescents en utilisant la cytométrie de flux en temps réel après réticulation TCR 2,3,4. Indo-1, un colorant calcique proportionnel, est excité par le laser UV avec des émissions de pointe à deux longueurs d’onde différentes en fonction de la liaison au calcium5, et est un colorant indicateur couramment utilisé pour l’analyse par cytométrie en flux des réponses calciques dans les lymphocytes vivants. Comme le profil d’émission d’Indo-1 est assez large, il peut être difficile de combiner l’évaluation de l’Indo-1 avec l’analyse simultanée de plusieurs marqueurs de surface cellulaire par cytométrie en flux passe-bande. Cette limitation limite l’utilisation de l’analyse par cytométrie en flux des réponses calciques aux populations pré-purifiées de lymphocytes T ou aux populations identifiées par un ensemble limité de molécules de surface cellulaire.

Pour remédier aux limites de la mesure des réponses calciques sur des populations hétérogènes de lymphocytes primaires à l’aide de la cytométrie en flux passe-bande, un protocole a été développé pour mesurer la fluorescence Indo-1 à l’aide de la cytométrie en flux à spectre complet. Cette méthode permet de multiplexer Indo-1 avec des panels d’anticorps dirigés contre les molécules de surface cellulaire, en tirant parti des capacités très flexibles de la cytométrie en flux à spectre complet. L’avantage de l’utilisation de la cytométrie en flux à spectre complet par rapport à la cytométrie en flux conventionnelle est sa capacité à distinguer les signaux fluorescents des colorants qui se chevauchent fortement, augmentant ainsi le nombre de marqueurs de surface qui peuvent être évalués simultanément dans chaque échantillon. La cytométrie de flux conventionnelle utilise des filtres passe-bande et est limitée à un fluorochrome par système de détection6. La cytométrie en flux à spectre complet recueille des signaux sur tout le spectre du fluorochrome à l’aide de 64 détecteurs sur un système de cytométrie spectrale en fluxà cinq lasers 7,8. De plus, la cytométrie en flux à spectre complet tire parti des détecteurs APD (Avalanche Photo Diode) qui ont une sensibilité accrue par rapport aux détecteurs à tube photomultiplicateur présents sur les cytomètres en flux conventionnels8. Par conséquent, cette approche est idéale pour les populations cellulaires hétérogènes, telles que les cellules mononucléées du sang périphérique ou les suspensions de cellules d’organes lymphoïdes secondaires murins, car elle élimine le besoin d’isoler des populations spécifiques de lymphocytes T avant le marquage du colorant calcique. Au lieu de cela, les profils d’expression des marqueurs de surface cellulaire et la cytométrie en flux après la collecte de données peuvent être utilisés pour évaluer les réponses au calcium dans chaque population d’intérêt. Comme le montre ce rapport, Indo-1 peut facilement être combiné avec huit anticorps conjugués au fluorochrome, ce qui donne un total de 10 signatures spectrales uniques. En outre, cette méthode peut être facilement appliquée à des mélanges de cellules de lignées de souris congéniquement distinctes, permettant l’analyse simultanée des réponses calciques dans les cellules T de type sauvage par rapport à celles d’une lignée de souris ciblant un gène.

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Protocol

Les souris ont été maintenues sur le campus médical Anschutz de l’Université du Colorado conformément aux protocoles de l’IACUC. Toutes les souris ont été euthanasiées selon les normes AAALAC.

1. Préparation des cellules immunitaires de la rate de souris

NOTE: Euthanasier les souris naïves avec l’euthanasie au CO2 . Les souris C57BL / 6 achetées aux laboratoires Jackson et élevées en interne sont utilisées pour des expériences à l’âge de 6 à 12 semaines. Les souris mâles et femelles sont utilisées pour des expériences.

  1. Désinfectez la peau de souris avec de l’éthanol à 70% afin de réduire la possibilité que des contaminants externes pénètrent dans l’échantillon.
  2. Disséquez la rate de la souris à l’aide d’outils de dissection, de ciseaux chirurgicaux et de forceps. Prélever la rate et placer la rate détachée dans un tube conique de 50 ml avec ~5 mL de milieu RPMI complet (cRPMI) sur de la glace.
    REMARQUE : L’IMRP complète est composée de 10 % de FBS, de 2 mM de L-glutamine et de 1 % de pénicilline/streptomycine.
    1. Pour récolter la rate de la souris, faites une incision de 5 cm dans la fourrure et la peau le long du côté gauche de la souris à mi-chemin entre les pattes avant et arrière avec des ciseaux. Ouvrez la cavité corporelle ~5 cm et retirez la rate à l’aide d’une pince. La rate a la couleur d’un haricot et est plus longue et plus plate que le rein voisin.
  3. Verser le contenu de l’étape 1.2 sur un filtre stérile de 70 μm fixé à un nouveau tube conique de 50 mL. Séparer mécaniquement la rate en une suspension unicellulaire en poussant la rate à travers le filtre à l’aide d’un piston de seringue de 5 ml jusqu’à ce qu’il ne reste plus de pulpe de rate sur la surface du filtre.
  4. Enduire les splénocytes à l’aide d’une centrifugeuse à rotor pivotant à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
  5. Décanter soigneusement le surnageant. Les splénocytes granulés restent au fond du tube conique de 50 mL.
  6. Pour éliminer les globules rouges, remettre en suspension les splénocytes granulés dans 1 mL de tampon de lyse ACK pendant 3 minutes selon les instructions du fabricant. Bien mélanger.
  7. Éteignez le tampon de lyse ACK avec 15 ml de cRPMI.
  8. Enduire les lymphocytes comme indiqué à l’étape 1.4.
  9. Resuspendre la suspension cellulaire dans 5 mL de cRPMI dans un tube conique de 50 mL. Placez les échantillons sur de la glace.
    1. Pour compter les cellules, transférer 10 μL de la suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge de 0,6 mL et diluer à un rapport de 1:1 avec une solution de bleu de trypan. Ensuite, transférez-le vers un hémocytomètre ou un système automatisé de comptage cellulaire.
  10. Après comptage, en fonction de la concentration de la cellule dans la suspension cellulaire comme à l’étape 1.9, enduire les cellules dans une centrifugeuse de table à 500 x g à 4 °C pendant 5 minutes pour préparer l’ajout de milieu cRMPI contenant un colorant ester Indo-1 AM.
  11. Calculer le volume de remise en suspension des cellules pour atteindre 10-12 x 106 cellules/mL. Il s’agit d’une concentration de 2x du nombre total de cellules requis.
  12. Re-suspendre les cellules dans le volume de cRPMI calculé à l’étape 1.11. Placer les cellules à 37 °C contenant 5 % de CO2 dans un tube conique de 50 mL dont le couvercle est ventilé ou dans une plaque de culture tissulaire.

2. Colorant ratiométrique Indo-1 et marquage des anticorps fluorescents

  1. Selon les instructions du fabricant, ajouter 50 μL de DMSO dans un flacon contenant 50 μg d’Indo-1 AM. La concentration de la solution mère est de 1 μg/μL.
    REMARQUE: Le DMSO est fourni en micro-flacons avec le kit pour éviter toute oxydation du DMSO.
  2. Diluer l’aliquote mère (1 μg/μL) dans le volume expérimental approprié (établi au point 1.11) de cRPMI à une concentration de 6 μg/mL, soit une concentration de 2x. Ne conservez pas Indo-1 dans une solution aqueuse.
    REMARQUE: D’autres tampons contenant du calcium ajouté peuvent être utilisés en fonction des besoins cellulaires.
  3. Mettre de côté le média complet avec Indo-1 au bain-marie à 37 °C.
    REMARQUE: Utilisez la concentration minimale d’ester Indo-1 AM nécessaire pour obtenir un signal adéquat. Cela doit être titré pour différents types de cellules. En règle générale, une concentration comprise entre 3 et 5 μM est suffisante. Pour les lymphocytes T primaires, charger des cellules avec de l’Indo-1 à une concentration de >5 μg/mL augmente l’intensité fluorescente moyenne (ICM) au-dessus d’un log de 6 sur les cytomètres de flux spectral. Si cela se produit, diminuez l’intensité du laser UV et titrez l’Indo-1 à une concentration plus faible.
  4. Diluer la suspension cellulaire préalablement préparée (à l’étape 1.12), 1:1 dans cRPMI, y compris les 2x milieux Indo-1 fabriqués à l’étape 2.2. Assurez-vous que les cellules sont à une concentration comprise entre 5-6 x 106/mL.
    REMARQUE: Ne chargez pas de colorant les contrôles de contrôle de tache unique non colorés ou de cellules de coloration simples de marqueur de surface avec Indo-1. L’ajout d’Indo-1 à des contrôles d’anticorps à coloration unique créera un échantillon multicolore en raison de l’Indo-1 ajouté aux cellules colorées uniques. Inclure indo-1 (sans calcium) EGTA contrôle ajouté à la plaque d’échantillonnage créée à l’étape 2.6.
  5. Ajouter 1 mL de cellules/puits/état expérimental dans une plaque de culture tissulaire de 12 puits.
  6. Créer un seul témoin coloré pour l’échantillon d’Indo-1 (sans calcium) en utilisant des cellules précédemment chargées de colorant Indo-1 et ajouter de l’EGTA à une concentration finale de 2 mM. L’EGTA chélate le calcium dans la suspension cellulaire, ce qui donne un échantillon témoin plus propre.
    1. Créer un témoin positif Indo-1 (Indo-1 lié au calcium) en ajoutant 50 μM d’ionomycine à la suspension cellulaire chargée de colorant au cytomètre en flux. L’ionomycine est un ionophore de calcium perméable à la membrane qui lie les ions calcium et facilite le transfert des ions calcium dans les cellules.
  7. Créer un puits pour le contrôle biologique négatif sans fluorophores ni colorant Indo-1.
  8. Créer un puits pour les contrôles de coloration unique pour toute population cellulaire supplémentaire d’intérêt (anticorps définis par l’utilisateur) en utilisant des fluorophores conjugués d’anticorps dans une conception de panel de cytométrie en flux. Ceux-ci n’incluront pas le colorant ratiométrique Indo-1.
  9. Ajouter l’anticorps bloquant le récepteur Fc (~2 μg/1 x 106 cellules), conformément aux instructions du fabricant, avant d’ajouter des anticorps conjugués au fluorochrome supplémentaires pour la coloration de surface.
  10. Incuber la plaque pendant 45 min à 37 °C avec 5% de CO2.
  11. Remettez les cellules en suspension dans une plaque de 12 puits en tapotant doucement la plaque toutes les 15 minutes.
  12. Mélanger et retirer tout le volume de cellules en suspension dans le média de la plaque à 12 puits. Ajoutez ensuite la suspension cellulaire à des tubes microcentrifugés de 1,7 mL.
  13. Enduire les cellules dans une microcentrifugeuse à 500 x g pendant 5 min à température ambiante. Décanter le surnageant et laver les cellules en ajoutant 1 mL de cRPMI préchauffé. Pelleter à nouveau et décanter le surnageant.
    REMARQUE: Le lavage des cellules élimine tout anticorps bloquant le FC restant.
  14. Resuspendre les cellules dans 1 mL de cRPMI dans des tubes microcentrifugeuses de 1,7 mL et incuber chaque tube à 37 °C pendant 30 minutes supplémentaires à 5 % de CO2, en laissant le haut du tube légèrement ouvert pour permettre l’échange gazeux. Cela permet une estérification complète des esters AM intracellulaires.
  15. Transférez les cellules dans une plaque de culture tissulaire à 12 puits, si nécessaire. D’autres anticorps conjugués fluorochromes titrés définis par l’utilisateur peuvent être ajoutés lors d’une phase de repos.
    REMARQUE : Les marqueurs utilisés dans le panneau des méthodes sont les suivants : Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 et CD1d/α-galcer tetramer. Les marqueurs sont choisis pour analyser les sous-ensembles de lymphocytes T.
    1. Créer un mélange principal de tous les anticorps conjugués au fluorochrome définis par l’utilisateur en fonction des types de cellules d’intérêt à un volume précédemment titré dans un tube microcentrifuge de 1,7 mL.
    2. Ajouter un mélange maître calculé pour 1 mL du volume cellulaire, en fonction des anticorps titrés dirigés contre les cellules au repos.
      NOTE: L’avantage de la coloration à l’étape 2.15 au lieu de l’étape 2.18 ultérieure est que la coloration à l’étape 2.15 réduira le temps d’incubation global de l’expérience. Cependant, la coloration dans un volume total de 1 mL à l’étape 2.15 augmente l’utilisation d’anticorps.
  16. Après repos, pelleter les cellules à 500 x g pendant 5 min à température ambiante.
    REMARQUE: Les cellules d’une plaque de culture tissulaire à 12 puits peuvent être granulées dans la plaque avec un accessoire de centrifugeuse à plaque. Sinon, enfouissez les cellules dans un tube microcentrifuge de 1,7 mL.
  17. Laver les cellules en remettant la pastille en suspension dans 1 mL de cRPMI froid à 4 °C et granuler à nouveau les cellules comme à l’étape 2.16. Placez les cellules sur de la glace.
    REMARQUE: Si les cellules de coloration de surface séparément, post-deestérification à l’étape 2.18, moins de volume d’anticorps est nécessaire. La coloration de surface à cette étape peut être effectuée après la phase de repos dans un tampon d’écoulement à froid (1x DPBS avec ajout de 1% FBS), en utilisant des anticorps définis par l’utilisateur, sur glace pendant 30 min. Lavez les cellules après la coloration dans cRPMI comme à l’étape 2.17.
    1. Ajouter la coloration de viabilité Ghost540 diluée 1:7,500 dans DPBS aux échantillons conformément aux instructions du fabricant. La chaleur tue les cellules à 55 °C sur un bloc chauffant pour un contrôle vivant / mort non coloré.
      REMARQUE: La coloration fonctionnelle de viabilité pour éliminer les cellules mortes dans l’analyse cytométrique en flux est effectuée sans FBS. FBS peut interagir avec les colorants amines selon les instructions du fabricant.
  18. Resuspendre les échantillons individuels dans 500 μL de cRPMI (phénol rouge) à l’aide d’un tube d’écoulement en polystyrène de 5 mL muni d’un bouchon.
    REMARQUE: Les cellules peuvent être laissées à 4 ° C jusqu’à une heure.
  19. Réchauffer chaque tube de 5 mL contenant des cellules, individuellement, à 37 °C à l’aide d’un bain de billes pendant 7 minutes avant l’analyse sur le cytomètre en flux en maintenant un temps constant entre les échantillons. Utilisez une minuterie.

3. Tube de bain de perles: maintien de la température pendant l’analyse du flux de calcium

  1. Ajouter des perles de bain à un petit bain-marie, sans ajouter d’eau; chauffer à 37 °C.
  2. Couper soigneusement un tube conique de 50 ml en deux, à la marque de 25 ml, avec une lame de rasoir; Jetez le haut du tube.
  3. Remplissez le tube coupé en deux aux 3/4 du chemin avec des perles de bain.
  4. Placez le tube créé à l’étape 3.2 dans le bain de billes créé à l’étape 3.1. Porter le tube et les perles à 37 °C.
  5. Branchez le bain de billes dans une prise électrique à côté du cytomètre en flux afin de maintenir la température en préparation de l’analyse de l’échantillon.
  6. Ajouter une grille conique en polystyrène coupé de 50 ml pour maintenir un tube afin de positionner le tube en place pendant qu’il fonctionne sur le cytomètre en flux. Cela éliminera le besoin de maintenir manuellement le tube pendant toute la durée de l’analyse de la courbe.

4. Acquisition de l’afflux de calcium par analyse cytométrique en flux

  1. Connectez-vous au logiciel de cytomètre en flux sur un analyseur de flux.
  2. Cliquez sur l’onglet Bibliothèque pour ajouter des étiquettes fluorescentes Indo-1 (liées au calcium) et Indo-1 (sans calcium). Sélectionnez Étiquettes fluorescentes dans le menu du logiciel à gauche. Sélectionnez Laser UV sous les groupes de balises fluorescentes et cliquez sur +ajouter pour ajouter un nom d’étiquette fluorescente (Indo-1 (lié au calcium)/Indo-1 (sans calcium)) à la bibliothèque. Choisissez la longueur d’onde d’excitation laser et la longueur d’onde d’émission, puis cliquez sur Enregistrer. Passez à la configuration expérimentale.
    REMARQUE: Indo-1 est excité par le laser UV à une longueur d’onde de 355 nm. La longueur d’onde d’émission d’Indo-1 (liée au calcium) est de 372 nm. La longueur d’onde d’émission d’Indo-1 (sans calcium) est de 514 nm.
  3. Cliquez sur l’onglet Acquisition. Ouvrir/créer une nouvelle expérience et ajouter les étiquettes fluorescentes souhaitées à l’expérience.
  4. Créez un groupe de référence et un ou plusieurs nouveaux groupes d’échantillons pour l’expérience. Étiquetez à la fois les échantillons et les groupes de référence au besoin.
  5. Sous l’onglet Acquisitions , définissez les événements à enregistrer au maximum : 10 000 000.
  6. Réglez le volume d’arrêt au volume maximal : 3 000 μL.
  7. Réglez le temps d’arrêt sur le temps maximum : 36 000 s.
  8. Acquérir des contrôles à coloration unique pour des anticorps conjugués définis inclus dans le panneau multicolore.
  9. Acquérir des commandes colorées simples pour le colorant fonctionnel Indo-1.
    1. Ajouter 50 μM d’ionomycine au témoin positif Indo-1 lié au calcium. Vortex à mélanger. Ajoutez le tube d’écoulement au port d’injection de l’échantillon et cliquez sur Enregistrer.
    2. Ajoutez le contrôle négatif Indo-1 sans calcium au cytomètre en flux et cliquez sur Enregistrer. EGTA a été ajouté à l’étape 2.6.
    3. Démélangez les commandes colorées simples en cliquant sur le bouton Unmix .
      REMARQUE : Tous les témoins colorés de tous les anticorps conjugués et colorants fonctionnels doivent être enregistrés avant le démélange des échantillons. Pour que le bouton Dissocier fonctionne, tous les contrôles de référence doivent d’abord être enregistrés. Le démélange peut être effectué avant ou après le prélèvement de l’échantillon.
  10. Une fois le démixage terminé, créez des tracés séquentiels à l’aide de la feuille de calcul non mélangée. SSC-A versus FSC-A enlevant les débris de l’échantillon, SSC-A versus SSC-H pour enlever les doublets. Cette étape est suivie d’une barrière de nettoyage de la viabilité ainsi que d’autres points de contrôle sur les populations d’intérêt. Pour créer des portes, cliquez sur Plot. Ajoutez un graphique à la feuille de calcul et double-cliquez à l’intérieur de la porte pour créer une population fermée en aval. Continuez jusqu’à ce que toutes les populations d’intérêt soient prises en compte.
  11. Échantillons témoins chauds à coloration unique (des étapes 2.6-2.9 de la section Colorant ratiométrique indo-1 et marquage des anticorps fluorescents) à 37 °C pour analyse séquentielle. Configurez le logiciel de cytométrie en flux.
  12. Faites couler de l’eau DI sur le cytomètre pendant 2-3 minutes pour assurer la stabilité fluidique du cytomètre en flux.
  13. Configurez des tracés séquentiels sur la feuille de calcul non mélangée en créant des portes à l’aide des boutons de porte Polygone, Rectangle ou Ellipse. Point de contrôle pour inclure la population d’intérêt (c.-à-d. lymphocytes utilisant SSC-A vs FSC-A [discrimination de taille/lymphocytes ]). Les populations négatives apparaissent regroupées autour de zéro alors que les populations positives peuvent être visualisées en augmentant l’IMF. Les populations d’intérêt seront définies par l’utilisateur en fonction de la question biologique.
  14. Double-cliquez à l’intérieur de la porte créée et remplacez les paramètres de l’axe Y et de l’axe X par SSC-A par rapport à SSC-H (discrimination singulet). Terminez la définition des paramètres de l’axe en cliquant avec le bouton gauche de la souris sur les mots de l’axe.
  15. Créez un tracé avec le signal SSC-A par rapport au colorant de viabilité (paramètres de la porte de viabilité). Porte sur les cellules vivantes, qui sont négatives pour la coloration au colorant amine. Les cellules vivantes, négatives pour la coloration vivante morte, se regrouperont à la marque 0 sur les axes Y et X.
  16. Double-cliquez sur le graphique intérieur pour créer un nouveau graphique contenant uniquement des lymphocytes vivants unicellulaires. Changez l’axe des Y en Indo-1 (calcium-lié) (V1) et/ou Indo-1 (calcium libre) (V7) en fonction du temps sur l’axe des X pour visualiser l’afflux de calcium.
  17. Placer l’échantillon biologique chauffé sur le SIT de la machine et exécuter les échantillons à 2 500-3 000 événements/s sur un milieu pour permettre la visualisation de l’afflux de calcium dans des populations à nombre limité de cellules (par exemple, iNKT).
    REMARQUE : En remettant les cellules en suspension à une concentration de 1 x 106/mL, les événements cellulaires recueillis à un débit moyen devraient être égaux à 2 500-3 000 événements/s. Réduisez le débit sous contrôle d’acquisition en cliquant sur le menu déroulant ou diluez l’échantillon si la suspension cellulaire a une concentration accrue. L’exécution des échantillons à un débit élevé peut augmenter la propagation du signal d’un fluorophore à d’autres fluorophores dans le panneau.
  18. Ajouter le tube suivant au bain de perles pour le réchauffer à 37 °C.
  19. Dans le contrôle d’acquisition, appuyez sur Enregistrer pour enregistrer les données initiales pendant 30 s afin d’obtenir un niveau basal de signalisation calcique dans l’échantillon.
  20. Dans le contrôle d’acquisition, cliquez sur Arrêter et retirez le tube du port d’injection d’échantillon (SIP).
  21. Ajouter 30 μg d’anti-CD3 non conjugué directement dans le tube à échantillon pour initier l’afflux de calcium. La concentration finale par tube est de 60 μg/mL.
    REMARQUE: Il n’y a pas d’étape de lavage après l’ajout d’anti-CD3.
  22. Replacez le tube sur la machine SIP le plus rapidement possible et appuyez sur Enregistrer dans le logiciel.
  23. Enregistrer les données pendant 7 min, en observant le temps écoulé sous les contrôles d’acquisition dans le logiciel, pour observer l’évolution temporelle de l’afflux de calcium dans les populations échantillons.
  24. Après 7 min, appuyez sur Arrêter dans le logiciel et ajoutez 1 μg/mL d’ionomycine. Enregistrer pendant 30 s pour obtenir le signal maximum de calcium dans les cellules d’intérêt. Pour limiter le transfert de l’ionomycine dans l’échantillon suivant, effectuez deux rinçages SIT sur l’instrument entre les échantillons.
  25. Passez à l’échantillon suivant et répétez le workflow jusqu’à ce que tous les échantillons aient été collectés.
  26. Enregistrez l’expérience et cliquez sur le fichier zip d’exportation . Les fichiers non mélangés (.fsc) sont téléchargés vers un logiciel externe d’analyse de cytométrie en flux.

5. Analyse de la courbe calcique

  1. À l’aide d’un logiciel d’analyse6 pour la cytométrie en flux, convertissez les signaux fluorescents Indo-1 en un rapport pour les mesures de calcium en accéléré. Dérivez des paramètres sous l’onglet Outils en insérant les références Indo-1 (lié au calcium)/Indo-1 (calcium libre) à l’aide d’une échelle linéaire. Réglez le minimum à zéro et le maximum en fonction du rapport d’afflux de calcium, généralement autour de 10. Le rapport maximum varie selon le type de cellule et l’IMF d’Indo-1.
  2. Mettez en surbrillance le paramètre sélectionné. Sous outils, ajoutez l’analyse cinétique pour choisir le paramètre en cliquant sur l’onglet Cinétique . Définissez l’axe Y sur dérivé.
  3. Sélectionnez MFI (intensité fluorescente moyenne) dans l’onglet Cinétique.
  4. Ajoutez un lissage gaussien, si vous le souhaitez. Pour ajouter un lissage gaussien, sélectionnez l’option dans le menu déroulant des statistiques du logiciel d’analyse de flux. Un lissage gaussien peut être ajouté pour lisser la visualisation de la courbe d’afflux de calcium de l’analyse.
  5. Créer plusieurs plages pour les statistiques le long du flux de calcium pour les comparaisons biologiques dans les échantillons.
  6. Faites glisser les exemples dans l’éditeur de mise en page et ajoutez les statistiques comme vous le souhaitez. L’analyse statistique varie en fonction de la question biologique. À des fins de publication, plusieurs répétitions sont analysées à l’aide du test t ou de l’ANOVA.
  7. Pour une analyse de moment de temps, placez la porte sur un moment précis dans le temps le long du flux de calcium. Examiner les marqueurs de surface souhaités et la porte sur la population d’intérêt; Ensuite, évaluez un diagramme de points bidimensionnel d’Indo-1 (sans calcium) par rapport à Indo-1 (lié au calcium) pour les cellules fermées à ce moment dans la région temporelle.

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Representative Results

Le flux de travail expérimental pour évaluer les réponses au calcium dans les cellules T murines primaires à l’aide d’un colorant ratiométrique Indo-1 avec des taches de surface multiplexantes est illustré à la figure 1. Après avoir récolté et traité les splénocytes de souris en une seule suspension cellulaire, les cellules sont colorées avec un ester Indo-1 AM et colorées en surface avec des anticorps liés au fluorochrome. Une fois la charge du colorant et la coloration des anticorps terminées, les échantillons de lymphocytes sont réchauffés à une température biologique (37 °C). Les échantillons sont ensuite analysés à l’aide de la cytométrie en flux à spectre complet pour la fluorescence Indo-1 après avoir vérifié les types de cellules individuels souhaités, sans qu’il soit nécessaire de trier les échantillons avant l’analyse. Afin d’utiliser des détecteurs de photodiodes d’avalanche (APD) dans le cytomètre en flux à spectre complet, il est nécessaire de convertir la longueur d’onde d’émission de crête d’une longueur d’onde de filtre passe-bande mesurée en nm à son canal respectif sur l’APD. Le tableau illustré à la figure 2 fournit une ligne directrice, mais les détecteurs optimaux pour les deux signatures de fluorescence de l’Indo-1 (lié au calcium ou sans calcium) doivent être déterminés empiriquement. Ceci est accompli en préparant des échantillons d’Indo-1 colorés uniques en utilisant de l’ionomycine pour générer le signal Indo-1 (lié au calcium) et de l’EGTA, un agent chélatant du calcium, pour générer le signal Indo-1 (sans calcium). Après analyse à l’aide de la cytométrie en flux à spectre complet, le canal affichant l’intensité de fluorescence maximale pour chaque signature Indo-1 peut être visualisé (Figure 3A). En normalisant l’IMF des populations positives à celle des populations négatives, le passage de la fluorescence Indo-1 de l’Indo-1 de l’absence de calcium à la fluorescence liée au calcium peut être déterminé (Figure 3B). Cet affichage est généré dans un classeur (.xls) à l’aide de contrôles de référence pour Indo-1 lié et libre, dessinant une porte d’intervalle négative et positive avec des portes positives et négatives claires pour la normalisation MFI comme indiqué dans (Figure 3A). Des exemples de statistiques d’IMF peuvent également être obtenus en cliquant avec le bouton droit de la souris sur le tableau des statistiques. Dans le logiciel, déterminez le ratio MFI en divisant la population positive par la population négative et superposez les deux spectres sur un seul écran (Figure 3B, à droite). La flèche pointillée jaune montre les différences spectrales normalisées entre les signatures spectrales de l’Indo-1 lié et libre.

Pour évaluer les réponses calciques après la stimulation des récepteurs des lymphocytes T, la fluorescence Indo-1 est évaluée après validation sur les populations cellulaires d’intérêt, comme le montre la figure 4. Tout d’abord, un diagramme de diffusion temporelle par rapport à la diffusion latérale (SSC-A) est examiné pour évaluer la stabilité fluidique; un signal stable et cohérent sur l’axe temporel indique la stabilité (figure 4A). Ensuite, la diffusion vers l’avant par rapport à la diffusion latérale (FSC-A par rapport à la SSC-A) est visualisée, et la population lymphocytaire est fermée comme indiqué dans (Figure 4B). Après la porte des lymphocytes, une porte de discrimination unicellulaire est appliquée en générant un graphique de la hauteur de la diffusion latérale en fonction de la surface (SSC-H vs SSC-A), et les singlets, qui tombent sur la diagonale, sont fermés comme le montre la figure 4C. La viabilité des singlets est ensuite évaluée en examinant la coloration avec le colorant de viabilité et en évaluant la population négative (figure 4D). Enfin, pour analyser les lymphocytes T, une décharge de cellules B/porte de contrôle négatif interne est appliquée en gating sur la population CD19 négative (figure 4E). La population CD19 négative est ensuite évaluée pour les sous-ensembles de lymphocytes T à l’aide d’anticorps dirigés contre CD4 et CD8 (figure 4F); l’exemple présenté examine les réponses au calcium des lymphocytes T CD4+ en visualisant la fluorescence Indo-1 (liée au calcium) en fonction du temps (figure 4G). Après avoir été établi sur un segment temporel, le diagramme Indo-1 (sans calcium) par rapport à Indo-1 (lié au calcium) peut également être généré (Figure 4H). Cette analyse sera ensuite utilisée pour dériver le rapport Indo-1 (voir méthodes d’analyse de la courbe d’afflux de calcium dans le logiciel d’analyse de cytométrie en flux).

À ce stade de l’analyse, il peut être utile d’analyser les moments dans le temps dans le diagramme bidimensionnel d’Indo-1 (lié au calcium) en fonction du temps dans les populations cellulaires individuelles d’intérêt. Les points temporels optimaux comprennent le calcium de base lié à Indo-1 avant la stimulation TCR, la réponse maximale, un point temporel plusieurs minutes après la réponse maximale lorsque les niveaux de calcium intracellulaire diminuent, et enfin la réponse calcique provoquée par l’ajout d’ionomycine (Figure 5A). Dans l’échantillon de base avant l’ajout d’anticorps anti-CD3, un faible signal Indo-1 (lié au calcium) est détecté. Pendant la réponse maximale, les cellules montrent un fort signal Indo-1 (lié au calcium) et une fluorescence réduite d’Indo-1 (sans calcium). À 5 minutes après le pic, la fluorescence Indo-1 est presque revenue à la ligne de base. Une fois l’ionomycine ajoutée à l’échantillon, un signal robuste d’Indo-1 (lié au calcium) peut être visualisé, assurant une charge de colorant adéquate des cellules. Les populations de cellules rares (<1 %) peuvent être difficiles pour l’analyse dérivée; Pour surmonter cette limitation, l’analyse des populations rares peut être effectuée en traçant Indo-1 (lié au calcium) par rapport à Indo-1 (sans calcium) après avoir été contrôlé sur chaque population d’intérêt, comme les cellules CD4+, les cellules TCRb+, les cellules TCRyg+, les cellules CD25+, les cellules iNKT et les cellules CD19+ (Figure 5B,C). Notez la réponse calcique facilement détectable dans les cellules T TCRγδ+ et les cellules iNKT (CD1d/α-galcer+). Pour la comparaison des protéines de surface au sein d’une population mixte de lymphocytes T murins, des diagrammes bidimensionnels ont été créés montrant des sous-ensembles d’intérêt. Ci-dessous, l’analyse de la réponse calcique sur l’ensemble du parcours temporel pour chaque sous-ensemble est présentée (Figure 5C).

Ce test peut également être utilisé pour établir les différences biologiques entre les lymphocytes T de souris de type sauvage et de souris ciblant des gènes ou entre les lymphocytes T non traités et traités avec des inhibiteurs pharmacologiques. Dans l’exemple de la figure 6, les lymphocytes T ont été traités avec PRN694, une petite molécule inhibitrice des tyrosine kinases des lymphocytes T, ITK et RLK 9,10. L’inhibition de l’ITK/RLK atténue la signalisation des récepteurs des lymphocytes T, entraînant une réduction de la réponse calcique suite à la stimulation des récepteurs des lymphocytes T11 (Figure 6A). Pour quantifier les effets de l’inhibition ITK/RLK, les courbes affichant le rapport de fluorescence Indo-1 (liée au calcium) et Indo-1 (sans calcium) peuvent ensuite être analysées pour l’aire sous la courbe (ASC) ou la pente de la courbe pour chaque condition (Figure 6B,C). Cette quantification est effectuée en sectionnant le parcours temporel de la réponse calcique en segments discrets (figure 6A) et en évaluant l’aire sous la courbe ou la pente de la courbe pour chaque segment, comme indiqué (figure 6B,C). Dans l’ensemble, ce protocole démontre que la cytométrie en flux à spectre complet peut être utilisée pour mesurer l’afflux de calcium ainsi que plusieurs marqueurs de surface cellulaire dans les populations de cellules immunitaires à l’étude. Ces résultats montrent que des sous-ensembles cellulaires représentés à plus de 1% de la population totale peuvent être évalués pour l’afflux de calcium au fil du temps. En revanche, les sous-ensembles cellulaires moins abondants nécessitent une analyse alternative utilisant des moments de temps.

L’analyse statistique des données de réponse au calcium est spécifique à la question expérimentale et aux essais biologiques effectués. Dans les données présentées dans le manuscrit, des expériences ont été réalisées avec des répétitions pour assurer la précision expérimentale et la robustesse de la méthodologie; Cependant, de multiples expériences sur différents échantillons biologiques sur différents jours n’ont pas été effectuées. Par conséquent, il ne serait pas approprié d’effectuer des analyses statistiques sur les données présentées.

Figure 1
Figure 1 : Schéma du flux de travail de l’analyse du calcium. L’utilisation du colorant indicateur de calcium ester Indo-1 AM fournit un outil pour visualiser l’afflux de calcium dans les cellules immunitaires et leurs sous-populations. Ce schéma décrit le flux de travail pour l’analyse des réponses calciques dans les lymphocytes T spléniques murins. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Conversion des longueurs d’onde PMT en canaux APD. Le cytomètre en flux à spectre complet dispose de 16 détecteurs pour détecter les émissions fluorescentes suite à l’excitation par le laser UV. Les spécifications de chaque détecteur sont indiquées dans le tableau. Les deux détecteurs utilisés pour l’évaluation de la fluorescence indo-1 sont mis en évidence, tels qu’ils ont été déterminés empiriquement à l’aide de témoins à coloration unique. Les conversions en longueur d’onde APD et le manuel d’utilisation pour le cytomètre spectral en flux sont disponibles11. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Visualisation de la signature spectrale Indo-1. (A) En haut : Signature spectrale de la fluorescence Indo-1 dans les lymphocytes T CD8+ après l’introduction de l’ionomycine pour provoquer un afflux robuste de calcium. Le pic d’Indo-1 (lié au calcium) peut être visualisé dans UV1. En bas : Signature spectrale de l’Indo-1 (sans calcium) montrant le pic de fluorescence dans UV7. Cet échantillon de contrôle a été généré en traitant des cellules chargées d’Indo-1 avec EGTA12 pour chélater tout calcium libre extracellulaire. (B) Combinaison de cinq couches de spectre laser de la signature Indo-1, montrant l’IMF spectrale brute à gauche et les spectres normalisés d’Indo-1 lié à Indo-1 par rapport à Indo-1 libre à droite. La visualisation du passage de l’Indo-1 (sans calcium) en orange à l’Indo-1 (lié au calcium) en bleu peut être facilement détectée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Stratégie de contrôle pour la visualisation des réponses au calcium. Le flux de travail pour le contrôle séquentiel des échantillons est décrit. (A) La stabilité fluidique est examinée à l’aide d’une porte temporelle par rapport à la porte SSC-A. (B) FSC-A versus SSC-A est utilisé pour filtrer les lymphocytes, éliminant ainsi les débris cellulaires et les globules rouges résiduels dans l’échantillon. (C) Les cellules individuelles sont fermées à l’aide d’un graphique SSC-H par rapport à SSC-A. (D). La porte singulet est ensuite appliquée à une parcelle de Ghost540 mort-vivant par rapport à SSC-A; Les cellules Ghost540 négatives éliminent les cellules non viables de l’analyse ultérieure. (E) Les cellules vivantes sont analysées pour le CD19 par rapport au CSS-A, et les cellules CD19 négatives (cellules non B) sont fermées. (F) Les cellules CD19 négatives sont examinées pour la coloration CD4 par rapport à CD8. (G) Les cellules CD4+ sont ensuite fermées pour visualiser le temps par rapport à Indo-1 (lié au calcium). (H) Un moment dans le temps est choisi pour représenter le début de la réponse d’afflux de calcium après l’ajout d’anticorps anti-CD3 en visualisant la fluorescence Indo-1 (sans calcium) par rapport à Indo-1 (liée au calcium). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Visualisation de la fluorescence Indo-1 dans des populations fermées de thymocytes murins à des points temporels discrets de la réponse calcique. Les thymocytes totaux ont été stimulés avec des anticorps anti-CD3 suivis d’ionomycine après 6 minutes de prélèvement d’échantillons. À quatre points temporels distincts, comme l’indiquent les cases rectangulaires décrites sur les diagrammes bidimensionnels du temps par rapport à Indo-1 (lié au calcium), différentes sous-populations de thymocytes ont été examinées pour les réponses au calcium. (A) Graphiques bidimensionnels montrant le point de départ du signal Indo-1 de base, la réponse de pointe, la réponse post-pic 5 minutes et la réponse à l’ionomycine. Sous chaque graphique, la coloration CD4 versus CD8 (à gauche) et la parcelle d’Indo-1 (sans calcium) versus Indo-1 (liée au calcium) sur les thymocytes CD4 simples positifs (SP) fermés est montrée. (B) Les graphiques d’Indo-1 (sans calcium) par rapport à Indo-1 (lié au calcium) sur des sous-ensembles fermés de thymocytes sont présentés à chacun des quatre points temporels, en utilisant la stratégie de déclenchement illustrée en (A). (C) Des diagrammes bidimensionnels ont été créés montrant la coloration des thymocytes totaux avec les anticorps indiqués. Des sous-ensembles spécifiques ont été examinés (rangée du haut) et examinés pour les réponses au calcium en fonction du temps (en bas). Population CD8+ bleu clair (SP), population CD4 rouge (SP), qui présente le plus grand afflux de calcium, thymocytes CD4+CD8+ doublement positifs orange, cellules iNKT vert foncé, CD25+ vert clair, cellules T TCRγδ+ violettes et cellules B CD19+ noires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Inhibition de la réponse calcique dans les lymphocytes T CD8+ traités avec une petite molécule inhibitrice de l’ITK/RLK. Au cours de la charge de colorant Indo-1, les splénocytes ont été traités avec deux doses de PRN694, 100 nM (gris foncé) et 200 nM (gris clair). (A) Le rapport indo-1 (lié au calcium/sans calcium) est indiqué en fonction du temps pour les cellules non traitées (rouge) et les cellules traitées avec PRN694. Les courbes montrent la réponse calcique des lymphocytes T CD8+ fermés. La ligne noire représente le contrôle négatif des splénocytes chargés d’Indo-1 et colorés en surface, mais non stimulés par des anticorps anti-CD3. (B,C) Les données peuvent être analysées en divisant l’axe temporel représenté en (A) en huit segments, visualisés avec des lignes pointillées noires, et en calculant l’aire sous la courbe (ASC) (B), ou la pente de chaque courbe (pente) (C) à chaque intervalle de temps de la réponse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Ce protocole décrit un dosage optimisé conçu pour mesurer les réponses calciques dans les lymphocytes T murins primaires chargés de colorant indicateur ratiométrique Indo-1 titré en utilisant la cytométrie en fluxà spectre complet 7,8. L’avantage d’effectuer des tests de flux de calcium à l’aide de la cytométrie en flux à spectre complet est la capacité de multiplexer la coloration des marqueurs cellulaires de surface en combinaison avec l’évaluation de la fluorescence Indo-1. La cytométrie en flux à spectre complet a l’avantage de permettre l’utilisation de colorants à fort chevauchement, augmentant ainsi le nombre de marqueurs pouvant être utilisés dans un panel. Cela est dû au fait que le cytomètre en flux à spectre complet recueille toute la lumière laser émise à travers un réseau de détecteurs pour chaque échantillon analysé, plutôt que d’avoir un détecteur dédié à un fluorochrome. L’utilisation de l’ensemble du spectre de chaque fluor permet une plus grande sensibilité du test et fournit un moyen d’identifier des fluorochromes spectralement uniques qui auraient des signaux qui se chevaucheraient s’ils étaient collectés sur un cytomètre en flux passe-bande. Cela élimine également le besoin de pré-isolement d’un sous-ensemble de cellules à l’étude.

Dans cette étude, un panel de marqueurs de surface cellulaire a été évalué avec des anticorps conjugués au fluorochrome. Ce panel comprenait αCD4-APC-Cy7, αCD8-FITC, αCD19-PE, αTCRβ-PerCP-Cy5.5, α-TCRδ-PE-Cy5, αCD25-PE-Cy7 et CD1d-αgal-cer tétramère-APC; en outre, le panneau comprenait le colorant Ghost540 mort vivant. Le canal optimal pour détecter chacun de ces fluorochromes est disponible dans le manuel d’utilisation du cytomètre en flux à spectre complet13. En revanche, la détection d’Indo-1 (sans calcium) et d’Indo-1 (lié au calcium) a été déterminée empiriquement, bien qu’un canal de crête approximatif pour la détection de chaque signature fluorescente ait été estimé en fonction des longueurs d’onde d’émission de crête connues pour les deux formes d’Indo-1. Il est également possible de convertir les longueurs d’onde d’émission de crête des longueurs d’onde des filtres passe-bande utilisées sur les cytomètres en flux conventionnels et mesurées en nm en leurs canaux respectifs sur les détecteurs de photodiodes d’avalanche (APD) utilisés par le cytomètre en flux à spectre complet; cela peut également fournir une estimation des canaux optimaux pour détecter Indo-1 (sans calcium) et Indo-1 (lié au calcium), respectivement. Étant donné que des témoins à coloration unique sont inclus pour chaque marqueur fluorescent, le processus de démélange déconvolue les signatures fluorescentes, ce qui permet de visualiser l’intensité de chaque fluorochrome sur les cellules de chaque échantillon. Comme décrit dans cette méthode, l’analyse des données peut être effectuée en vérifiant des sous-ensembles cellulaires d’intérêt et en visualisant le rapport entre détecter Indo-1 (sans calcium) et Indo-1 (lié au calcium) en fonction du temps.

Il y a des limites à ce test. Par exemple, les concentrations d’Indo-1 inférieures à 3 μM n’ont pas permis de visualiser avec succès la réponse à l’afflux de calcium dans les cellules T. Comme ce test permet également des mesures de multiplexage de la réponse calcique avec l’analyse de marqueurs de surface cellulaire multiples sur des populations hétérogènes de cellules utilisant la cytométrie en flux à spectre complet, il est impératif de titrer soigneusement tous les anticorps marqués par fluorescence utilisés, y compris ceux utilisés pour les témoins à coloration unique. Ceci est important pour la mise en œuvre réussie de l’algorithme de démélange linéaire hautement sensible14. De plus, il n’a pas été possible de visualiser une évolution temporelle complète de l’afflux de calcium pour des sous-ensembles cellulaires représentant moins de 1 % de la population totale analysée. Au lieu de cela, une évaluation de la réponse calcique dans ces sous-ensembles rares a nécessité une stratégie d’analyse alternative utilisant des moments dans le temps15. L’analyse des moments dans le temps fournit des instantanés des signaux fluorescents de l’Indo-1 (sans calcium) par rapport à l’Indo-1 (lié au calcium) à des stades discrets de la réponse calcique, plutôt que l’ensemble du cours temporel de la réponse. Enfin, il est également important de reconnaître les limites de l’utilisation de marqueurs de surface uniques pour définir des sous-ensembles de lymphocytes T. Par exemple, la coloration des thymocytes avec des anticorps α-CD25 n’est pas suffisante pour distinguer les lymphocytes T régulateurs CD4+ de toutes les autres populations de thymocytes. Cela est dû au fait que la majorité des cellules progénitrices précoces des thymocytes (CD4-CD8-) expriment également CD2516. Ceci est susceptible d’expliquer l’absence d’une réponse détectable à l’afflux de calcium dans les thymocytes CD4+CD25+ fermés.

L’optimisation de ce protocole a nécessité une évaluation minutieuse de plusieurs variables qui ont été essentielles au succès du test. Il s’agit notamment de l’optimisation du clone spécifique de l’anticorps anti-CD3 utilisé, du titrage de la concentration optimale de cet anticorps et de la nécessité d’une réticulation des anticorps à l’aide du système traditionnel biotine/streptavidine. Pour les lymphocytes T murins, la concentration de 30 μg/échantillon pour 6 x 106 cellules dans un volume de 500 μL s’est avérée être la quantité minimale d’anticorps nécessaire pour des réponses optimales en calcium. Fait intéressant, des réponses calciques robustes ont été observées avec le clone d’anticorps anti-CD3 17A2, mais pas avec le clone 145-2C11; de plus, lors de l’utilisation du clone 17A2, l’ajout d’un réactif de réticulation secondaire était inutile17. Les tests utilisant le clone 17A2 anti-CD3 biotinylé avec ou sans streptavidine n’ont montré aucune amélioration de la réponse calcique en présence de réticulation de la streptavidine. Il est possible que cet anticorps comprenne des agrégats, et que ces agrégats expliquent l’efficacité de stimulation de l’anticorps en l’absence de réticulation manifeste. Cependant, comme ces expériences ont été réalisées au cours de plusieurs mois avec différents flacons de cet anticorps anti-CD3, les résultats obtenus étaient hautement reproductibles; par conséquent, la capacité de cet anticorps à stimuler les lymphocytes T n’est pas susceptible de varier d’un utilisateur à l’autre.

Des réponses robustes en calcium dans les lymphocytes T primaires nécessitent de maintenir les cellules à la température biologique de 37 °C tout au long de l’acquisition de l’échantillon; en revanche, les cellules B primaires montreront une réponse calcique aux anticorps anti-IgM à température ambiante. Compte tenu de la sensibilité de la réponse calcique des lymphocytes T à la température, il est essentiel de s’assurer que chaque échantillon est traité de la même manière; par exemple, chaque échantillon doit être chauffé à 37 °C selon la même méthode et pendant la même durée. En l’absence de cette consistance, des variations des réponses calciques peuvent être observées, mais peuvent ne pas indiquer des différences biologiquement pertinentes entre les échantillons.

En résumé, ce protocole décrit les détails de la réalisation de tests de flux de calcium basés sur l’évaluation de la fluorescence Indo-1 en utilisant la cytométrie en flux à spectre complet en combinaison avec la coloration multiplex des marqueurs cellulaires de surface. La méthode permet aux chercheurs d’éviter la nécessité d’isoler ou de trier des populations cellulaires spécifiques avant le marquage du colorant calcique. De plus, ce protocole décrit une méthodologie d’analyse supplémentaire utilisée pour visualiser les réponses au calcium à des moments discrets dans le temps au sein de sous-populations cellulaires distinctes. L’analyse des moments dans le temps peut être appliquée avec succès à des populations cellulaires rares (<1% du total), qui sont autrement indétectables lors de l’évaluation de l’intégralité de la courbe de réponse calcique. À l’avenir, ce test pourrait être étendu à l’utilisation d’anticorps conjugués au fluorochrome supplémentaires, en tirant parti des capacités étendues du cytomètre en flux à spectre complet.

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Disclosures

Les auteurs n’ont pas d’intérêts concurrents à déclarer.

Acknowledgments

R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Un grand merci à nos collègues de Cytek pour les discussions continues sur l’analyse cytométrique spectrale complète sur les logiciels Aurora et SpectroFlo. Les figurines ont été créées avec BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 well TC treated plates Cell Treat 229111
50 mL conical Greiner Bio1 41-12-17-03 50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap
5mL polysterene flow tubes Corning 352052
5mL syringe BD syringe 309646 plunger only is used sheith is discarded
70uM filter Greiner bio1 542070
aCD3 (17A2) Biolegend 100202
AKC lysis Buffer Gibco A1049201
Aurora Spectral Flowcytometer https://cytekbio.com/pages/aurora
Bath Beads coleparmer Item # UX-06274-52
CD19 PE Tonbo 50-0193-U100
CD1d Tetramer APC NIH
CD25 PECy7 ebioscience 15-0251
CD4 APC Cy7 Tonbo 25-0042-U100
CD8a FITC ebioscience 11-0081-85
Cell Incubator Formal Scientific
Dissection Tools forceps McKesson #487593 Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth
Dissection Tools Scissors McKesson #970135 Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip
DPBS 1x Gibco 14190-136 DPBS 
EGTA Fisher NC1280093
FBS Hyclond SH30071.03 lot AE29165301
FlowJo Software https://www.flowjo.com/
Indo1-AM Ester Dye ebioscience 65-085-39 Calcium Loading Dye 
ionomycin Millipore 407951-1mg
Live/Dead Ghost 540 Tonbo 13-0879-T100
Microcentrifuge tubes 1.7mL Light Labs A-7001
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine Gibco 10378-016
PRN694 Med Chem Express Hy-12688
Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2) Tonbo 70-0161-M001 FC Block
RPMI Gibco 1875093  + phenol red
RPMI phenol free Gibco 11835030  -phenol red
Table top centrifuge Beckman Coulter Allegra612
TCRβ PerCP Cy5.5 ebioscience 45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5 ebioscience 15-5961-82
Vi-Cell Blu Reagent Pack Product No: C06019 Includes Tripan
Vi-Cell Blu Beckman Coulter
Waterbath Fisher Brand Dry bath

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References

  1. Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).
  2. Huang, G. N. Cell calcium mobilization study (flow cytometry). Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).
  3. June, C. H., Moore, J. S. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , Chapter 5, Unit 5.5 (2004).
  4. Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).
  5. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  6. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
  7. Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit1.27 (2013).
  8. Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).
  9. Zhong, Y., et al. Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694. The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).
  10. Gallagher, M. P., et al. Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).
  11. Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287 (2010).
  12. Nakamura, Y. EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels. Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26 (2019).
  13. Cytek Aurora Users Guide. Cytek. , Available from: https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf (2022).
  14. SpctroFlo Software. Cytek. , Available from: https://cytekbio.com/pages/spectro-flo (2022).
  15. FlowJo Software. Becton-Dickinson. , Available from: https://www.flowjo.com/solutions/flowjo (2022).
  16. Godfrey, D. I., Zlotnik, A. Control points in early T-cell development. Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).
  17. Vossen, A. C., et al. Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects. European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).

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Immunologie et infection numéro 190
Analyse de l’afflux de calcium induit par le récepteur des lymphocytes T dans les lymphocytes T murins primaires par cytométrie en flux à spectre complet
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Perrenoud, L., Conley, J., Berg, L.… More

Perrenoud, L., Conley, J., Berg, L. J. Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (190), e64526, doi:10.3791/64526 (2022).

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