Summary
Приток кальция, мера передачи сигналов Т-клеток, является эффективным способом анализа ответов на стимуляцию Т-клеточных рецепторов. Этот протокол мультиплексирования Indo-1 с панелями антител, направленными на молекулы клеточной поверхности, использует преимущества очень гибких возможностей проточной цитометрии полного спектра.
Abstract
Приток кальция в ответ на стимуляцию Т-клеточных рецепторов является общей мерой передачи сигналов Т-клеток. Было разработано несколько индикаторных красителей кальция для оценки передачи сигналов кальция с помощью полосовой проточной цитометрии. Этот протокол предназначен для измерения кальциевых реакций в первичных мышиных Т-клетках с использованием проточной цитометрии полного спектра. Общие спленоциты помечаются ратиометрическим индикаторным красителем кальция Indo-1 вместе с панелью флуорохром-конъюгированных антител к молекулам клеточной поверхности. Использование возможностей проточной цитометрии полного спектра обеспечивает платформу для использования широкого спектра окрашиваний клеточной поверхности в сочетании с Indo-1. Затем клетки анализируются в режиме реального времени при 37 ° C до и после добавления антитела против CD3 для стимуляции Т-клеточного рецептора. После смешивания спектральных сигналов рассчитывается отношение связанного с кальцием и свободного кальция Indo-1, которое может быть визуализировано с течением времени для каждой закрытой популяции спленоцитов. Этот метод может позволить проводить одновременный анализ кальциевых реакций в нескольких клеточных популяциях.
Introduction
Индуцированный Т-клеточным рецептором (TCR) приток кальция является полезной мерой активации Т-клеток и часто используется для определения того, имеет ли популяция Т-клеток нарушенные ответы на проксимальных этапах сигнального путиTCR 1. Измерения притока кальция обычно выполняются путем предварительной маркировки Т-клеток одним или парой флуоресцентных индикаторных красителей кальция, а затем изучения флуоресцентных сигналов с использованием проточной цитометрии в режиме реального времени после сшивания TCR 2,3,4. Индо-1, соотношение-метрический краситель кальция, возбуждается УФ-лазером с пиковым излучением на двух разных длинах волн, зависящих от связываниякальция 5, и является широко используемым индикаторным красителем для анализа проточной цитометрии кальциевых реакций в живых лимфоцитах. Поскольку эмиссионный профиль Indo-1 довольно широк, может быть сложно совместить оценку Indo-1 с одновременным анализом нескольких маркеров клеточной поверхности с помощью полосовой проточной цитометрии. Это ограничение ограничивает использование проточного цитометрического анализа кальциевых ответов для предварительно очищенных популяций Т-клеток или для популяций, идентифицированных ограниченным набором молекул клеточной поверхности.
Чтобы устранить ограничения измерения кальциевых реакций на гетерогенных популяциях первичных лимфоцитов с использованием полосовой проточной цитометрии, был разработан протокол для измерения флуоресценции Indo-1 с использованием проточной цитометрии полного спектра. Этот метод позволяет мультиплексировать Indo-1 с панелями антител, направленными на молекулы клеточной поверхности, используя преимущества очень гибких возможностей проточной цитометрии полного спектра. Преимущество использования проточной цитометрии полного спектра по сравнению с обычной проточной цитометрией заключается в ее способности отличать флуоресцентные сигналы от сильно перекрывающихся красителей, тем самым увеличивая количество поверхностных маркеров, которые могут быть одновременно оценены в каждом образце. Традиционная проточная цитометрия использует полосовые фильтры и ограничена одним флуорохромом на детекторную систему6. Проточная цитометрия полного спектра собирает сигналы по всему спектру флуорохрома с помощью 64 детекторов на пятилазерной спектральной проточной цитометрической системе 7,8. Кроме того, для проточной цитометрии полного спектра используются детекторы APD (лавинные фотодиоды), которые имеют повышенную чувствительность по сравнению с лампочными детекторами фотоумножителя, присутствующими на обычных проточных цитометрах8. Следовательно, этот подход идеально подходит для гетерогенных клеточных популяций, таких как мононуклеарные клетки периферической крови или суспензии вторичных клеток лимфоидных органов у мышей, поскольку он устраняет необходимость выделения специфических популяций Т-клеток перед маркировкой кальциевым красителем. Вместо этого профили экспрессии маркеров клеточной поверхности и стробирование проточной цитометрии после сбора данных могут быть использованы для оценки кальциевых реакций в каждой интересующей популяции. Как показано в этом отчете, Indo-1 можно легко комбинировать с восемью флуорохром-конъюгированными антителами, в результате чего в общей сложности получается 10 уникальных спектральных сигнатур. Кроме того, этот метод может быть легко применен к смесям клеток из конгенно различных линий мышей, что позволяет проводить одновременный анализ кальциевых реакций в Т-клетках дикого типа по сравнению с таковыми из линии мышей, нацеленных на гены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Мыши содержались в медицинском кампусе Университета Колорадо в Аншутце в соответствии с протоколами IACUC. Все мыши были усыплены в соответствии со стандартами AAALAC.
1. Получение иммунных клеток из селезенки мыши
ПРИМЕЧАНИЕ: Усыпляйте наивных мышей с помощью эвтаназии CO2 . Мыши C57BL/6, приобретенные в Jackson Laboratories и выведенные собственными силами, используются для экспериментов в возрасте 6-12 недель. Для экспериментов используются как самцы, так и самки мышей.
- Продезинфицируйте кожу мыши 70% этанолом, чтобы уменьшить вероятность попадания внешних загрязнений в образец.
- Рассекайте селезенку мыши с помощью инструментов для рассечения, хирургических ножниц и щипцов. Соберите селезенку и поместите отделенную селезенку в коническую пробирку объемом 50 мл с ~ 5 мл полной среды RPMI (cRPMI) на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полный RPMI состоит из 10% FBS, 2 мМ L-глютамина и 1% пенициллина/стрептомицина.- Чтобы собрать селезенку мыши, сделайте ножницами 5-сантиметровый надрез на шерсти и коже вдоль левой стороны мыши на полпути между передней и задней лапами. Вскрывают полость тела ~5 см и удаляют селезенку с помощью щипцов. Селезенка имеет цвет фасоли и длиннее и более плоская, чем соседняя почка.
- Вылейте содержимое шага 1.2 на стерильный фильтр 70 мкм, прикрепленный к новой конической пробирке объемом 50 мл. Механически разделите селезенку на одноклеточную суспензию, проталкивая селезенку через фильтр с помощью поршня шприца объемом 5 мл до тех пор, пока на поверхности фильтра не останется пульпа селезенки.
- Гранулируйте спленоциты с помощью центрифуги на столешнице с поворотным ротором при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C.
- Аккуратно сцедите надосадочную жидкость. Гранулированные спленоциты остаются на дне конической пробирки объемом 50 мл.
- Для удаления эритроцитов повторно суспендировать гранулированные спленоциты в 1 мл буфера для лизиса ACK в течение 3 мин в соответствии с инструкциями производителя. Хорошо перемешайте.
- Погасите буфер лизиса ACK 15 мл cRPMI.
- Гранулируйте лимфоциты, как указано на шаге 1.4.
- Повторно суспендировать клеточную суспензию в 5 мл cRPMI в конической пробирке объемом 50 мл. Поместите образцы на лед.
- Чтобы подсчитать клетки, перенесите 10 мкл клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку объемом 0,6 мл и разбавьте в соотношении 1:1 раствором трипанового синего. Затем переведите на гемоцитометр или автоматизированную систему подсчета клеток.
- После подсчета, в зависимости от концентрации клеток в клеточной суспензии, как на этапе 1.9, гранулируют клетки в настольной центрифуге при 500 x g при 4 ° C в течение 5 мин, чтобы подготовиться к добавлению среды cRMPI, содержащей сложноэфирный краситель Indo-1 AM.
- Рассчитайте объем для повторной суспензии клеток, чтобы достичь 10-12 х10,6 клеток/мл. Это 2-кратная концентрация от общего количества клеток.
- Повторно суспендируйте ячейки в объеме cRPMI, рассчитанном на шаге 1.11. Поместите клетки при 37 ° C с 5% CO2 в коническую пробирку объемом 50 мл с вентилируемой крышкой или в пластину для культивирования тканей.
2. Маркировка ратиометрического красителя и флуоресцентных антител Indo-1
- В соответствии с инструкциями производителя добавьте 50 мкл ДМСО во флакон, содержащий 50 мкг Indo-1 AM. Концентрация исходного раствора составляет 1 мкг/мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: ДМСО поставляется в микрофлаконах с набором для предотвращения окисления ДМСО. - Разбавьте исходную аликвоту (1 мкг/мкл) в соответствующем экспериментальном объеме (установленном в 1.11) cRPMI в концентрации 6 мкг/мл, т.е. в 2-кратной концентрации. Не храните Indo-1 в водном растворе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие буферы с добавлением кальция могут быть использованы в зависимости от потребностей клетки. - Отложите весь носитель с Indo-1 в сторону на водяной бане при температуре 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте минимальную концентрацию эфира Indo-1 AM, необходимую для получения адекватного сигнала. Это необходимо титровать для различных типов клеток. Как правило, достаточно концентрации в пределах 3-5 мкМ. Для первичных Т-клеток загрузка клеток Indo-1 в концентрации >5 мкг/мл увеличивает среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) выше log 6 на спектральных проточных цитометрах. Если это произойдет, уменьшите интенсивность УФ-лазера и титруйте Indo-1 до более низкой концентрации. - Разбавьте предварительно подготовленную клеточную суспензию (на шаге 1.12), 1:1 в cRPMI, включая 2x среду Indo-1, изготовленную на шаге 2.2. Убедитесь, что клетки находятся в концентрации от 5-6 x 106 / мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не окрашивайте неокрашенные одиночные пятна или поверхностные маркеры с одиночными пятнами с помощью Indo-1. Добавление Indo-1 к контролю антител с одним окрашиванием создаст многоцветный образец из-за того, что Indo-1 добавлен к одиночным окрашенным клеткам. Включите индо-1 (без кальция) EGTA дополнительный контроль к планшету с образцом, созданному на шаге 2.6. - Добавьте 1 мл клеток/лунки/экспериментального состояния в 12-луночную культуральную пластину.
- Создайте один окрашенный контроль для образца Indo-1 (без кальция), используя ранее загруженные красителем клетки Indo-1, и добавьте EGTA до конечной концентрации 2 мМ. EGTA хелатирует кальций в клеточной суспензии, давая более чистый контрольный образец.
- Создайте положительный контроль Indo-1 (связанный кальцием Indo-1), добавив 50 мкМ иономицина к клеточной суспензии, нагруженной красителем, на проточном цитометре. Иономицин представляет собой мембранопроницаемый ионофор кальция, который связывает ионы кальция и облегчает перенос ионов кальция в клетки.
- Создайте колодец для биологического негативного контроля без флуорофоров или красителя Indo-1.
- Создайте лунку для контроля одного окрашивания для любых дополнительных интересующих популяций клеток (антитела, определяемые пользователем), используя флуорофоры, конъюгированные антителами, в конструкции панели проточной цитометрии. Они не будут включать ратиометрический краситель Indo-1.
- Добавьте антитело, блокирующее Fc-рецептор (~ 2 мкг / 1 x 106 клеток) в соответствии с инструкциями производителя, прежде чем добавлять дополнительные флуорохром-конъюгированные антитела для окрашивания поверхности.
- Инкубируйте пластину в течение 45 минут при 37 °C с 5%CO2.
- Ресуспендируйте клетки в 12-луночную пластину, осторожно постукивая по пластине каждые 15 минут.
- Перемешайте и удалите весь объем ячеек, взвешенных в среде, с 12-луночной пластины. Затем добавьте клеточную суспензию в микроцентрифужные пробирки объемом 1,7 мл.
- Гранулируют клетки в микроцентрифуге при 500 x g в течение 5 мин при комнатной температуре. Сцедите надосадочную жидкость и промойте клетки, добавив 1 мл предварительно подогретого cRPMI. Снова гранулируйте и сцедите надосадочную жидкость.
ПРИМЕЧАНИЕ: Промывание клеток удаляет все оставшиеся антитела, блокирующие FC. - Ресуспендируют клетки в 1 мл cRPMI в микроцентрифужных пробирках объемом 1,7 мл и инкубируют каждую пробирку при 37 ° C в течение дополнительных 30 мин при 5% CO2, оставляя верхнюю часть пробирки слегка открытой, чтобы обеспечить газообмен. Это позволяет полностью деэтерификовать внутриклеточные эфиры AM.
- При необходимости перенесите клетки обратно в 12-луночную тарелку для культивирования тканей. Дополнительные определяемые пользователем титрованные флюорохром-конъюгированные антитела могут быть добавлены в фазе покоя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Маркеры, используемые на панели методов, включают: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 и тетрамер CD1d/α-galcer. Маркеры выбираются для анализа подмножеств Т-клеток.- Создайте основную смесь всех определяемых пользователем флуорохром-конъюгированных антител в соответствии с интересующими типами клеток в предварительно титрованном объеме в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл.
- Добавьте рассчитанную мастер-смесь для 1 мл объема клетки, в зависимости от титруемых антител к покоящимся клеткам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Преимущество окрашивания на шаге 2.15 по сравнению с более поздним этапом 2.18 заключается в том, что окрашивание на шаге 2.15 уменьшит общее время инкубации для эксперимента. Однако окрашивание в общем объеме 1 мл на этапе 2.15 увеличивает использование антител.
- После отдыха гранулируйте клетки в 500 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки в 12-луночной пластине для культивирования тканей могут быть гранулированы в пластине с помощью пластинчатой центрифуги. В противном случае гранулируйте клетки в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл. - Промойте клетки, ресуспендировав гранулы в 1 мл при температуре 4 °C при холодной температуре cRPMI, и снова гранулируйте клетки, как показано на шаге 2.16. Поместите клетки на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если поверхностное окрашивание клеток отдельно, после деэтерификации на этапе 2.18, требуется меньший объем антитела. Поверхностное окрашивание на этом этапе может быть выполнено после фазы покоя в буфере холодного потока (1x DPBS с добавлением 1% FBS) с использованием определяемых пользователем антител на льду в течение 30 минут. Промойте клетки после пятна в cRPMI, как показано на шаге 2.17.- Добавляйте в образцы жизнеспособное пятно Ghost540, разбавленное в соотношении 1:7,500 в DPBS в соответствии с инструкциями производителя. Тепло убивает ячейки при 55 ° C на нагревательном блоке для контроля одиночного окрашивания живого / мертвого цвета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Функциональное окрашивание красителем жизнеспособности для удаления мертвых клеток в проточном цитометрическом анализе проводится без FBS. FBS может взаимодействовать с аминовыми красителями в соответствии с инструкциями производителя.
- Добавляйте в образцы жизнеспособное пятно Ghost540, разбавленное в соотношении 1:7,500 в DPBS в соответствии с инструкциями производителя. Тепло убивает ячейки при 55 ° C на нагревательном блоке для контроля одиночного окрашивания живого / мертвого цвета.
- Повторно суспендировать отдельные образцы в 500 мкл cRPMI (без фенола красного) с помощью проточной трубки из полистирола объемом 5 мл с крышкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки можно оставлять при температуре 4 °C на срок до часа. - Нагревайте каждую пробирку объемом 5 мл, содержащую клетки, индивидуально, до 37 ° C с помощью ванны с шариками в течение 7 минут перед анализом на проточном цитометре, сохраняя время между образцами. Используйте таймер.
3. Трубка для ванны с шариками: поддержание температуры во время анализа потока кальция
- Добавьте шарики для ванны на небольшую водяную баню без добавления воды; прогреть до 37 °C.
- Аккуратно разрежьте лезвием бритвы коническую трубку объемом 50 мл пополам на отметке 25 мл; Выбросьте верхнюю часть трубки.
- Заполните разрезанную пополам трубку на 3/4 пути бусинами для ванны.
- Поместите трубку, созданную на шаге 3.2, в ванну с шариками, созданную на шаге 3.1. Доведите тюбик и бусины до 37 °C.
- Подключите ванну с шариками к электрической розетке рядом с проточным цитометром, чтобы поддерживать температуру при подготовке к анализу образца.
- Добавьте коническую стойку из пенополистирола объемом 50 мл, чтобы удерживать одну пробирку, чтобы расположить пробирку на месте во время работы на проточном цитометре. Это избавит от необходимости вручную удерживать трубку в течение всего времени анализа кривой.
4. Получение кальциевого притока с помощью проточного цитометрического анализа
- Войдите в программное обеспечение проточного цитометра на анализаторе потока.
- Перейдите на вкладку «Библиотека », чтобы добавить флуоресцентные теги Indo-1 (связанный с кальцием) и Indo-1 (без кальция). Выберите «Флуоресцентные метки » в меню программного обеспечения слева. Выберите УФ-лазер в разделе «Группы флуоресцентных тегов» и нажмите «+добавить », чтобы добавить имя флуоресцентной метки (Indo-1 (связанный с кальцием)/Indo-1 (без кальция)) в библиотеку. Выберите длину волны лазерного возбуждения и длину волны излучения, а затем нажмите «Сохранить». Перейдите к экспериментальной установке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Indo-1 возбуждается УФ-лазером на длине волны 355 нм. Длина волны излучения Indo-1 (связанная с кальцием) составляет 372 нм. Длина волны излучения Indo-1 (без кальция) составляет 514 нм. - Перейдите на вкладку «Приобретение». Откройте/создайте новый эксперимент и добавьте в него нужные флуоресцентные метки.
- Создайте референтную группу и новые группы образцов для эксперимента. При необходимости пометьте как образцы, так и референсные группы.
- На вкладке «Приобретения» установите для записи событий максимум: 10 000 000.
- Установите максимальную громкость остановки: 3 000 мкл.
- Установите максимальное время остановки: 36 000 с.
- Приобретите одиночные окрашенные контрольные группы для определенных конъюгированных антител, включенных в многоцветную панель.
- Приобретите одиночный окрашенный контроль для функционального красителя Indo-1.
- Добавьте 50 мкМ иономицина к положительному контролю Indo-1, связанному с кальцием. Вихрь перемешать. Добавьте проточную трубку в порт впрыска образца и нажмите «Запись».
- Добавьте отрицательный контроль Indo-1 без кальция в проточный цитометр и нажмите « Запись». EGTA был добавлен на шаге 2.6.
- Размешивайте одиночные окрашенные элементы управления, нажав кнопку «Разъединить ».
ПРИМЕЧАНИЕ: Все одиночные окрашенные контрольные элементы из всех конъюгированных антител и функциональных красителей должны быть зарегистрированы до смешивания образцов. Чтобы кнопка «Отменить микширование» функционировала, сначала необходимо записать все эталонные элементы управления. Разминирование может быть выполнено до или после отбора пробы.
- После завершения смешивания создайте последовательные графики с помощью несмешанного листа. SSC-A в сравнении с FSC-A, удаляющим мусор из образца, SSC-A в сравнении с SSC-H для удаления дублетов. За этим следуют ворота для очистки жизнеспособности, а также дальнейшее закрытие популяций, представляющих интерес. Чтобы создать ворота, нажмите на Участок. Добавьте график на лист и дважды щелкните внутри ворот, чтобы создать закрытое население, расположенное ниже по течению. Продолжайте до тех пор, пока не будут учтены все интересующие группы населения.
- Теплые одноразовые окрашенные контрольные образцы (от этапов 2.6-2.9 в секции Indo-1 ратиометрическая маркировка красителя и флуоресцентных антител) до 37 °C для последовательного анализа. Настройте программное обеспечение для проточной цитометрии.
- Нанесите деионизированную воду на цитометр в течение 2-3 минут, чтобы обеспечить жидкостную стабильность проточного цитометра.
- Настройте последовательные графики на несмешанном листе, создав ворота с помощью кнопок «Многоугольник», «Прямоугольник» или «Эллипс». Гейт для включения интересующей популяции (т.е. лимфоцитов, использующих SSC-A против FSC-A [различение по размеру/лимфоцитам]). Отрицательные популяции, по-видимому, сгруппированы вокруг нуля, тогда как положительные популяции можно визуализировать, увеличив MFI. Интересующие популяции будут определены пользователем на основе биологического вопроса.
- Дважды щелкните внутри созданного затвора и измените параметры осей Y и X на SSC-A против SSC-H (синглетная дискриминация). Завершите определение параметров оси, щелкнув левой кнопкой мыши по словам на оси.
- Создайте график с сигналом SSC-A в зависимости от жизнеспособности красителя (параметры затвора жизнеспособности). Ворота на живых клетках, которые отрицательны для окрашивания аминовым красителем. Живые клетки, отрицательные для окрашивания живыми мертвецами, будут группироваться на отметке 0 по осям Y и X.
- Дважды щелкните внутренний график, чтобы создать новый график, содержащий только одноклеточные живые лимфоциты. Измените ось Y на Indo-1 (связанный кальций) (V1) и/или Indo-1 (свободный кальций) (V7) в зависимости от времени на оси X для визуализации притока кальция.
- Поместите нагретый биологический образец в аппарат SIT и запустите образцы со скоростью 2,500-3,000 событий / с на среде, чтобы можно было визуализировать приток кальция в популяциях с ограниченным количеством клеток (например, iNKT).
ПРИМЕЧАНИЕ: При ресуспендировании клеток в концентрации 1 x 106 / мл клеточные события, собранные со скоростью потока среды, должны быть равны 2,500-3,000 событий / с. Уменьшите расход при контроле сбора, щелкнув раскрывающееся меню, или разбавьте образец, если суспензия ячейки имеет повышенную концентрацию. Запуск образцов с высокой скоростью потока может увеличить распространение сигнала от одного флуорофора к другим флуорофорам в панели. - Добавьте следующую трубку в ванну с шариками, чтобы она нагрелась до 37 °C.
- В контроле сбора данных нажмите кнопку Запись, чтобы записать исходные данные в течение 30 с, чтобы получить базальный уровень кальциевой сигнализации в образце.
- В окне «Контроль сбора» нажмите «Стоп» и извлеките пробирку из порта впрыска образца (SIP).
- Добавьте 30 мкг неконъюгированного анти-CD3 непосредственно в пробирку для образца, чтобы инициировать приток кальция. Конечная концентрация на пробирку составляет 60 мкг/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: После добавления анти-CD3 этап промывки не производится. - Как можно быстрее поместите трубку обратно в SIP машины и нажмите «Запись» в программном обеспечении.
- Записывайте данные в течение 7 минут, наблюдая за временем, прошедшим под контролем сбора данных в программном обеспечении, чтобы наблюдать за временным ходом притока кальция в выборочных популяциях.
- Через 7 минут нажмите «Стоп» в программном обеспечении и добавьте 1 мкг/мл иономицина. Запись в течение 30 с для получения максимального кальциевого сигнала в интересующих клетках. Чтобы ограничить перенос иономицина в следующий образец, выполните две промывки SIT на приборе между образцами.
- Перейдите к следующему образцу и повторяйте рабочий процесс, пока не будут собраны все образцы.
- Сохраните эксперимент и нажмите на экспортный zip-файл. Несмешанные файлы (.fsc) загружаются во внешнее программное обеспечение для анализа проточной цитометрии.
5. Анализ кальциевой кривой
- Используя аналитическое программное обеспечение6 для проточной цитометрии, преобразуйте флуоресцентные сигналы Indo-1 в соотношение для покадровых измерений кальция. Выведите параметры на вкладке «Инструменты», вставив ссылки Indo-1 (связанный с кальцием)/Indo-1 (свободный кальций) с помощью линейной шкалы. Установите минимум на ноль и максимум в соответствии с соотношением притока кальция, обычно около 10. Максимальное соотношение зависит от типа ячейки и MFI Indo-1.
- Выделите выбранный параметр. В разделе «Инструменты» добавьте кинетический анализ, чтобы выбрать параметр, щелкнув вкладку « Кинетика ». Установите для оси Y значение производное.
- Выберите MFI (средняя интенсивность флуоресценции) на вкладке «Кинетика».
- При желании добавьте гауссово сглаживание. Чтобы добавить гауссово сглаживание, выберите этот параметр в выпадающем меню статистики в программном обеспечении для анализа потока. Гауссово сглаживание может быть добавлено для сглаживания визуализации кривой притока кальция при анализе.
- Создайте несколько диапазонов для статистики по временному ходу потока кальция для биологических сравнений в образцах.
- Перетащите образцы в редактор макетов и добавьте статистику по своему усмотрению. Статистический анализ варьируется в зависимости от биологического вопроса. Для целей публикации множественные реплики анализируются с использованием t-критерия или ANOVA.
- Для анализа времени установите затвор на определенный момент времени вдоль потока кальция. Изучите желаемые поверхностные маркеры и ворота на интересующей популяции; затем оцените двумерный точечный график Indo-1 (без кальция) по сравнению с Indo-1 (связанный с кальцием) для закрытых клеток в этот момент в области времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Экспериментальный рабочий процесс оценки кальциевых реакций в первичных мышиных Т-клетках с использованием ратиометрического красителя Indo-1 с мультиплексирующими поверхностными пятнами показан на рисунке 1. После сбора и обработки спленоцитов мыши в одноклеточную суспензию клетки окрашивают эфиром Indo-1 AM и окрашивают поверхность антителами, связанными с флуорохромом. После завершения загрузки красителя и окрашивания антител образцы лимфоцитов нагревают до биологической температуры (37 °C). Затем образцы анализируют с использованием проточной цитометрии полного спектра для флуоресценции Indo-1 после стробирования отдельных желаемых типов клеток без необходимости сортировки образцов перед анализом. Чтобы использовать детекторы лавинных фотодиодов (APD) в проточном цитометре полного спектра, необходимо преобразовать пиковую длину волны излучения из длины волны полосового фильтра, измеренной в нм, в соответствующий канал на APD. Таблица, показанная на рисунке 2 , дает ориентир, но оптимальные детекторы для двух флуоресцентных сигнатур Indo-1 (связанные с кальцием и без кальция) должны быть определены эмпирически. Это достигается путем подготовки одиночных окрашенных образцов Indo-1 с использованием иономицина для генерации сигнала Indo-1 (связанного с кальцием) и EGTA, хелатирующего агента кальция, для генерации сигнала Indo-1 (без кальция). После анализа с использованием проточной цитометрии полного спектра можно визуализировать канал, отображающий пиковую интенсивность флуоресценции для каждой сигнатуры Indo-1 (рис. 3A). Нормализовав MFI положительных популяций к отрицательным популяциям, можно определить сдвиг флуоресценции Indo-1 от безкальциевой к связанной кальций (рис. 3B). Этот дисплей генерируется в книге (.xls) с использованием эталонных элементов управления как для связанного, так и для свободного Indo-1, рисуя отрицательный и положительный интервальные вентили с четкими положительными и отрицательными вентилями для нормализации MFI, как показано на рисунке 3A. Примерную статистику МФО также можно получить, щелкнув правой кнопкой мыши по таблице статистики. В программном обеспечении определите коэффициент MFI, разделив положительную популяцию на отрицательную популяцию, и наложите два спектра на один дисплей (рис. 3B, справа). Желтая пунктирная стрелка показывает нормализованные спектральные различия между спектральными сигнатурами как связанного, так и свободного Indo-1.
Чтобы оценить реакцию кальция после стимуляции Т-клеточных рецепторов, флуоресценцию Indo-1 оценивают после стробирования на интересующих клеточных популяциях, как показано на рисунке 4. Во-первых, исследуется график зависимости времени от бокового рассеяния (SSC-A) для оценки флюидной стабильности; стабильный согласованный сигнал по оси времени указывает на стабильность (рис. 4А). Затем визуализируется прямое и боковое рассеяние (FSC-A против SSC-A), и популяция лимфоцитов закрывается, как показано на рисунке 4B. После ворот лимфоцитов применяется одноклеточный затвор различения путем создания графика зависимости высоты бокового рассеяния от площади (SSC-H против SSC-A), а синглеты, которые попадают на диагональ, закрываются, как показано на рисунке 4C. Затем синглеты оценивают на жизнеспособность, исследуя окрашивание красителем жизнеспособности и стробирование отрицательной популяции (рис. 4D). Наконец, для анализа Т-клеток применяется дамп В-клеток / внутренний отрицательный контрольный вентиль путем стробирования CD19-отрицательной популяции (рис. 4E). Затем CD19-отрицательную популяцию оценивают на наличие подмножеств Т-клеток с использованием антител к CD4 и CD8 (рис. 4F); в приведенном примере исследуются CD4+ Т-клетки на предмет кальциевых реакций путем визуализации флуоресценции Indo-1 (связанной с кальцием) в зависимости от времени (рис. 4G). После стробирования на временном отрезке также может быть сгенерирован график Индо-1 (без кальция) и Индо-1 (связанный с кальцием) (рис. 4H). Этот анализ позже будет использован для получения коэффициента Indo-1 (см. Методы анализа кривой притока кальция в программном обеспечении для анализа проточной цитометрии).
На этом этапе анализа может быть полезно проанализировать моменты времени в пределах двумерного графика Indo-1 (связанный кальцием) со временем в отдельных интересующих популяциях клеток. Оптимальные временные точки включают исходный уровень кальция, связанный с Indo-1 до стимуляции TCR, пиковую реакцию, временную точку через несколько минут после пиковой реакции при снижении внутриклеточного уровня кальция и, наконец, кальциевую реакцию, вызванную добавлением иономицина (рис. 5A). В исходном образце до добавления антител против CD3 обнаруживается слабый сигнал Indo-1 (связанный с кальцием). Во время пикового ответа клетки демонстрируют сильный сигнал Indo-1 (связанный с кальцием) и сниженную флуоресценцию Indo-1 (без кальция). Через 5 минут после пика флуоресценция Indo-1 почти вернулась к исходному уровню. После добавления иономицина в образец можно визуализировать надежный сигнал Indo-1 (связанный с кальцием), обеспечивая адекватную загрузку клеток красителем. Редкие клеточные популяции (<1 %) могут быть трудными для производного анализа; чтобы преодолеть это ограничение, анализ редких популяций может быть выполнен путем построения графиков Indo-1 (связанный с кальцием) против Indo-1 (свободный от кальция) после стробирования каждой интересующей популяции, такой как клетки CD4+, клетки TCRb+, клетки TCRyg+, клетки CD25+, клетки iNKT и клетки CD19+ (рис. 5B, C). Обратите внимание на легко обнаруживаемый кальциевый ответ в TCRγδ+ Т-клетках и iNKT-клетках (CD1d/α-galcer+). Для сравнения поверхностных белков в смешанной мышиной популяции Т-клеток были созданы двумерные графики, показывающие интересующие подмножества. Ниже показан анализ реакции кальция за весь промежуток времени для каждого подмножества (рис. 5C).
Этот анализ также может быть использован для установления биологических различий в Т-клетках от мышей дикого типа по сравнению с мышами, нацеленными на гены, или в Т-клетках, не обработанных фармакологическими ингибиторами, по сравнению с обработанными фармакологическими ингибиторами. В примере, показанном на рисунке 6, Т-клетки обрабатывали PRN694, низкомолекулярным ингибитором тирозинкиназ Т-клеток, ITK и RLK 9,10. Ингибирование ITK/RLK ослабляет передачу сигналов Т-клеточных рецепторов, что приводит к снижению кальциевого ответа после стимуляции Т-клеточного рецептора11 (рис. 6A). Для количественной оценки эффектов ингибирования ITK/RLK кривые, отображающие отношение флуоресценции Indo-1 (связанная с кальцием) к флуоресценции Indo-1 (без кальция), затем может быть проанализирована для площади под кривой (AUC) или наклона кривой для каждого состояния (рис. 6B, C). Эта количественная оценка выполняется путем разделения временного хода реакции кальция на дискретные сегменты (рис. 6A) и оценки площади под кривой или наклона кривой для каждого сегмента, как показано (рис. 6B, C). В целом, этот протокол демонстрирует, что проточная цитометрия полного спектра может быть использована для измерения притока кальция вместе с несколькими маркерами клеточной поверхности в исследуемых популяциях иммунных клеток. Эти результаты показывают, что клеточные подмножества, представленные более чем на 1% от общей численности населения, могут быть оценены на предмет притока кальция с течением времени. Напротив, менее распространенные подмножества клеток требуют альтернативного анализа с использованием моментов времени.
Статистический анализ данных о кальциевом ответе специфичен для экспериментального вопроса и биологических анализов, которые проводятся. В данных, представленных в рукописи, эксперименты проводились с повторениями для обеспечения экспериментальной точности и надежности методологии; Однако многократные эксперименты на разных биологических образцах в разные дни не проводились. Поэтому было бы нецелесообразно проводить статистический анализ представленных данных.
Рисунок 1: Схема рабочего процесса анализа кальция. Использование индикаторного красителя кальция на основе сложного эфира Indo-1 AM обеспечивает инструмент для визуализации притока кальция в иммунные клетки и их субпопуляции. На этой схеме описан рабочий процесс анализа кальциевых реакций в Т-клетках селезенки мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Преобразование длин волн ФЭУ в каналы APD. Проточный цитометр полного спектра имеет 16 детекторов для обнаружения флуоресцентного излучения после возбуждения УФ-лазером. Технические характеристики каждого извещателя указаны в таблице. Выделены два детектора, используемые для оценки флуоресценции Indo-1, которые были определены эмпирически с использованием одинарного окрашенного контроля. Доступны преобразования в длину волны APD и руководство пользователя для спектрального проточного цитометра11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Визуализация спектральной сигнатуры Индо-1. (A) Вверху: Спектральная сигнатура флуоресценции Indo-1 в CD8+ Т-клетках после введения иономицина для вызова устойчивого притока кальция. Пик Indo-1 (связанный с кальцием) можно визуализировать в UV1. Внизу: Спектральная сигнатура Indo-1 (без кальция), показывающая пик флуоресценции в UV7. Этот контрольный образец был получен путем обработки клеток, нагруженных Indo-1, EGTA12 для хелатирования любого внеклеточного свободного кальция. (B) Комбинированное наложение пяти лазерных спектров сигнатуры Indo-1, показывающее необработанный спектральный MFI слева и нормализованные спектры связанного Indo-1 и свободного Indo-1 справа. Визуализация перехода от Индо-1 (без кальция) оранжевого цвета к Индо-1 (связанного с кальцием) синего цвета может быть легко обнаружена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Стратегия стробирования для визуализации кальциевых реакций. Описан рабочий процесс последовательного стробирования образцов. (A) Жидкостная стабильность исследуется с использованием времени по сравнению с затвором SSC-A. (B) FSC-A по сравнению с SSC-A используется для захвата лимфоцитов, тем самым устраняя клеточный мусор и остаточные эритроциты в образце. (C) Одиночные ячейки закрыты с использованием графика SSC-H и SSC-A. (D). Затем синглетные ворота применяются к сюжету живого мертвеца Ghost540 против SSC-A; стробирование на Ghost540-отрицательных клетках исключает нежизнеспособные клетки из последующего анализа. (E) Живые клетки анализируются на CD19 по сравнению с SSC-A, а CD19-отрицательные клетки (не-В-клетки) закрываются. (F) CD19-отрицательные клетки исследуются на предмет окрашивания CD4 по сравнению с окрашиванием CD8. (G) CD4+ клетки затем закрываются для визуализации времени по сравнению с Indo-1 (связанным с кальцием). (H) Момент времени выбирается для представления инициации реакции притока кальция после добавления антител против CD3 путем визуализации флуоресценции Indo-1 (без кальция) по сравнению с Indo-1 (связанной с кальцием). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Визуализация флуоресценции Indo-1 в закрытых популяциях мышиных тимоцитов в дискретные моменты времени в кальциевом ответе. Общие тимоциты стимулировали антителами против CD3 с последующим иономицином через 6 мин после сбора образца. В четырех дискретных временных точках, как указано в прямоугольных полях, обведенных на двумерных графиках времени по сравнению с Indo-1 (связанным кальцием), различные субпопуляции тимоцитов были исследованы на предмет кальциевых реакций. (A) Двумерные графики, показывающие стробирование для базового сигнала Indo-1, пиковый отклик, 5-минутный постпиковый отклик и ответ на иономицин. Ниже каждого графика показано окрашивание CD4 по сравнению с окрашиванием CD8 (слева) и график Индо-1 (без кальция) по сравнению с Индо-1 (связанный с кальцием) на закрытых одиночных положительных (SP) тимоцитах CD4. (B) Графики Indo-1 (без кальция) по сравнению с Indo-1 (связанные с кальцием) на закрытых подмножествах тимоцитов показаны в каждом из четырех временных моментов с использованием стратегии стробирования, показанной в (A). (C) Были созданы двумерные графики, показывающие окрашивание общих тимоцитов указанными антителами. Конкретные подмножества были закрыты (верхний ряд) и исследованы на предмет реакции кальция в зависимости от времени (нижний). Светло-голубая (SP) популяция CD8+, красная (SP) популяция CD4, которая демонстрирует наибольший приток кальция, оранжевые CD4+CD8+ двойные положительные тимоциты, темно-зеленые iNKT-клетки, светло-зеленые CD25+, фиолетовые TCRγδ+ Т-клетки и черные CD19+ В-клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Ингибирование кальциевого ответа в CD8+ Т-клетках, обработанных низкомолекулярным ингибитором ITK/RLK. Во время загрузки красителем Indo-1 спленоциты обрабатывали двумя дозами PRN694, 100 нМ (темно-серый) и 200 нМ (светло-серый). (A) Соотношение Indo-1 (связанный с кальцием / без кальция) показано в зависимости от времени для необработанных клеток (красный) и клеток, обработанных PRN694. Кривые показывают кальциевую реакцию закрытых CD8+ Т-клеток. Черная линия представляет собой отрицательный контроль спленоцитов, нагруженных Indo-1 и окрашенных на поверхности, но не стимулированных антителами против CD3. (В,В) Данные могут быть проанализированы путем деления оси времени, показанной в (A), на восемь сегментов, визуализированных черными пунктирными линиями, и вычисления площади под кривой (AUC) (B) или наклона каждой кривой (наклона) (C) в каждом временном интервале отклика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе описывается оптимизированный анализ, предназначенный для измерения кальциевых реакций в первичных мышиных Т-клетках, загруженных титрованным индикаторным красителем Indo-1 ratiometric, с использованием проточной цитометрииполного спектра 7,8. Преимуществом проведения анализов потока кальция с использованием проточной цитометрии полного спектра является возможность мультиплексного окрашивания поверхностных клеточных маркеров в сочетании с оценкой флуоресценции Indo-1. Преимущество проточной цитометрия полного спектра заключается в том, что она позволяет использовать сильно перекрывающиеся красители, тем самым увеличивая количество маркеров, которые можно использовать в панели. Это связано с тем, что проточный цитометр полного спектра собирает весь лазерный свет, излучаемый через массив детекторов для каждого анализируемого образца, вместо того, чтобы иметь один детектор, предназначенный для одного флуорохрома. Использование всего спектра каждого фтора обеспечивает более высокую чувствительность анализа и обеспечивает средства для идентификации спектрально уникальных флуорохромов, которые будут иметь перекрывающиеся сигналы при сборе на полосовом проточном цитометре. Это также устраняет необходимость в предварительном выделении исследуемого подмножества клеток.
В этом исследовании панель маркеров клеточной поверхности оценивалась с помощью флуорохром-конъюгированных антител. Эта панель включала αCD4-APC-Cy7, αCD8-FITC, αCD19-PE, αTCRβ-PerCP-Cy5.5, α-TCRδ-PE-Cy5, αCD25-PE-Cy7 и CD1d-αgal-cer тетрамер-APC; кроме того, в состав панели входил живомертвый краситель Ghost540. Оптимальный канал для обнаружения каждого из этих флуорохромов доступен в руководстве пользователя проточного цитометра полного спектра13. Напротив, обнаружение Indo-1 (без кальция) и Indo-1 (связанного с кальцием) было определено эмпирически, хотя приблизительный пиковый канал для обнаружения каждой флуоресцентной сигнатуры был оценен на основе известных пиковых длин волн излучения для двух форм Indo-1. Также можно преобразовывать пиковые длины волн излучения из длин волн полосового фильтра, используемых в обычных проточных цитометрах и измеренных в нм, в соответствующие каналы на лавинных фотодиодных (APD) детекторах, используемых проточным цитометром полного спектра; это также может обеспечить оценку оптимальных каналов для обнаружения Indo-1 (без кальция) и Indo-1 (связанного с кальцием) соответственно. Поскольку одиночные окрашенные элементы управления включены для каждой флуоресцентной метки, процесс разминирования деконволюции флуоресцентных сигнатур, что позволяет визуализировать интенсивность каждого флуорохрома на клетках в каждом образце. Как описано в этом способе, анализ данных может быть выполнен путем стробирования интересующих подмножеств клеток и визуализации соотношения обнаружения Indo-1 (без кальция) и Indo-1 (связанного с кальцием) от времени.
У этого анализа есть ограничения. Например, концентрации Indo-1 ниже 3 мкМ не позволяли успешно визуализировать реакцию притока кальция в Т-клетках. Поскольку этот анализ также включает мультиплексирующие измерения кальциевого ответа с анализом нескольких маркеров клеточной поверхности на гетерогенных популяциях клеток с использованием проточной цитометрии полного спектра, крайне важно тщательно титровать все используемые флуоресцентно меченные антитела, включая те, которые используются для одиночного окрашенного контроля. Это важно для успешной реализации высокочувствительного линейного алгоритмаразмингирования 14. Кроме того, полный временной ход притока кальция не может быть визуализирован для подмножеств клеток, составляющих менее 1% от общей анализируемой популяции. Вместо этого оценка реакции кальция в этих редких подмножествах потребовала альтернативной стратегии анализа с использованием моментоввремени 15. Анализ моментов времени дает снимки флуоресцентных сигналов Indo-1 (без кальция) по сравнению с Indo-1 (связанным с кальцием) на дискретных стадиях кальциевого ответа, а не на протяжении всего времени ответа. Наконец, также важно признать ограничения использования одиночных поверхностных маркеров для определения подмножеств Т-клеток. Например, окрашивание тимоцитов антителом α-CD25 недостаточно, чтобы отличить CD4+ регуляторные Т-клетки от всех других популяций тимоцитов. Это связано с тем, что большинство ранних клеток-предшественников тимоцитов (CD4-CD8-) также экспрессируют CD2516. Это, вероятно, объясняет отсутствие обнаруживаемой реакции притока кальция в закрытых тимоцитах CD4 + CD25 +.
Оптимизация этого протокола потребовала тщательной оценки нескольких переменных, которые были ключом к успеху анализа. К ним относятся оптимизация используемого специфического клона антитела против CD3, титрование оптимальной концентрации этого антитела и необходимость сшивания антител с использованием традиционной системы биотин/стрептавидин. Для мышиных Т-клеток было обнаружено, что концентрация 30 мкг / образец для 6 x 106 клеток в объеме 500 мкл является минимальным количеством антител, необходимым для оптимального кальциевого ответа. Интересно, что устойчивые кальциевые ответы наблюдались с клоном антител против CD3 17A2, но не с клоном 145-2C11; кроме того, при использовании клона 17A2 добавление вторичного сшивающего реагента было ненужным17. Тесты с использованием биотинилированного анти-CD3-клона 17A2 со стрептавидином или без него не показали усиления кальциевого ответа в присутствии сшивания стрептавидина. Возможно, что это антитело включало агрегаты, и что эти агрегаты объясняли стимулирующую эффективность антитела в отсутствие явного сшивания. Однако, поскольку эти эксперименты проводились в течение многих месяцев с различными флаконами этого антитела против CD3, полученные результаты были высоко воспроизводимыми; следовательно, способность этого антитела стимулировать Т-клетки вряд ли будет варьироваться у разных пользователей.
Устойчивые кальциевые реакции в первичных Т-клетках требуют поддержания биологической температуры клеток 37 ° C на протяжении всего сбора образца; напротив, первичные В-клетки проявляют кальциевый ответ на антитела против IgM при комнатной температуре. Основываясь на чувствительности реакции Т-клеток кальция на температуру, очень важно убедиться, что каждый образец обрабатывается одинаково; например, каждый образец должен быть подогрет до 37°С с использованием одного и того же метода и в течение одного и того же периода времени. При отсутствии этой согласованности могут наблюдаться изменения в кальциевых реакциях, но они могут не указывать на биологически значимые различия между образцами.
Таким образом, этот протокол описывает детали выполнения анализов потока кальция на основе оценки флуоресценции Indo-1 с использованием проточной цитометрии полного спектра в сочетании с мультиплексным окрашиванием маркеров поверхностных клеток. Метод позволяет исследователям избежать необходимости выделения или сортировки конкретных клеточных популяций перед маркировкой кальциевым красителем. Кроме того, в этом протоколе изложена дополнительная методология анализа, используемая для визуализации кальциевых реакций в дискретные моменты времени в различных клеточных субпопуляциях. Анализ моментов времени может быть успешно применен к редким (<1% от общего числа) клеточным популяциям, которые в противном случае не обнаруживаются при оценке всей кривой кальциевого ответа. В будущем этот анализ может быть расширен за счет использования дополнительных флуорохром-конъюгированных антител, используя широкие возможности проточного цитометра полного спектра.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конкурирующих интересов, о которых можно было бы заявить.
Acknowledgments
R01AI132419, CU | Общий ресурс AMC ImmunoMicro Flow Cytometry, RRID:SCR_021321, Большое спасибо нашим коллегам из Cytek за постоянные обсуждения полного спектрального цитометрического анализа в программном обеспечении Aurora и SpectroFlo. Фигуры были созданы с помощью BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well TC treated plates | Cell Treat | 229111 | |
| 50 mL conical | Greiner Bio1 | 41-12-17-03 | 50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap |
| 5mL polysterene flow tubes | Corning | 352052 | |
| 5mL syringe | BD syringe | 309646 | plunger only is used sheith is discarded |
| 70uM filter | Greiner bio1 | 542070 | |
| aCD3 (17A2) | Biolegend | 100202 | |
| AKC lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Aurora Spectral Flowcytometer | https://cytekbio.com/pages/aurora | ||
| Bath Beads | coleparmer | Item # UX-06274-52 | |
| CD19 PE | Tonbo | 50-0193-U100 | |
| CD1d Tetramer APC | NIH | ||
| CD25 PECy7 | ebioscience | 15-0251 | |
| CD4 APC Cy7 | Tonbo | 25-0042-U100 | |
| CD8a FITC | ebioscience | 11-0081-85 | |
| Cell Incubator | Formal Scientific | ||
| Dissection Tools forceps | McKesson | #487593 | Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth |
| Dissection Tools Scissors | McKesson | #970135 | Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip |
| DPBS 1x | Gibco | 14190-136 | DPBS |
| EGTA | Fisher | NC1280093 | |
| FBS | Hyclond | SH30071.03 | lot AE29165301 |
| FlowJo Software | https://www.flowjo.com/ | ||
| Indo1-AM Ester Dye | ebioscience | 65-085-39 | Calcium Loading Dye |
| ionomycin | Millipore | 407951-1mg | |
| Live/Dead Ghost 540 | Tonbo | 13-0879-T100 | |
| Microcentrifuge tubes 1.7mL | Light Labs | A-7001 | |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
| PRN694 | Med Chem Express | Hy-12688 | |
| Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2) | Tonbo | 70-0161-M001 | FC Block |
| RPMI | Gibco | 1875093 | + phenol red |
| RPMI phenol free | Gibco | 11835030 | -phenol red |
| Table top centrifuge | Beckman Coulter | Allegra612 | |
| TCRβ PerCP Cy5.5 | ebioscience | 45-5961-82 | |
| TCRγ/δ Pe Cy5 | ebioscience | 15-5961-82 | |
| Vi-Cell Blu Reagent Pack | Product No: C06019 | Includes Tripan | |
| Vi-Cell Blu | Beckman Coulter | ||
| Waterbath | Fisher Brand Dry bath |
References
- Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).
- Huang, G. N. Cell calcium mobilization study (flow cytometry). Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).
- June, C. H., Moore, J. S. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , Chapter 5, Unit 5.5 (2004).
- Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- McKinnon, K. M.
- Nolan, J. P., Condello, D.
- Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).
- Zhong, Y., et al. Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694. The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).
- Gallagher, M. P., et al. Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).
- Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287 (2010).
- Nakamura, Y. EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels. Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26 (2019).
- Cytek Aurora Users Guide. Cytek. , Available from: https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf (2022).
- SpctroFlo Software. Cytek. , Available from: https://cytekbio.com/pages/spectro-flo (2022).
- FlowJo Software. Becton-Dickinson. , Available from: https://www.flowjo.com/solutions/flowjo (2022).
- Godfrey, D. I., Zlotnik, A. Control points in early T-cell development. Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).
- Vossen, A. C., et al. Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects. European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).
