Summary
Der Kalziumeinstrom, ein Maß für die T-Zell-Signalübertragung, ist ein effektiver Weg, um Reaktionen auf die Stimulation von T-Zell-Rezeptoren zu analysieren. Dieses Protokoll zum Multiplexen von Indo-1 mit Antikörpern, die auf Zelloberflächenmoleküle gerichtet sind, nutzt die hochflexiblen Möglichkeiten der Vollspektrum-Durchflusszytometrie.
Abstract
Der Kalziumeinstrom als Reaktion auf die Stimulation durch T-Zell-Rezeptoren ist ein gängiges Maß für die T-Zell-Signalübertragung. Es wurden mehrere Calcium-Indikatorfarbstoffe entwickelt, um die Calcium-Signalübertragung mittels Bandpass-Durchflusszytometrie zu untersuchen. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Kalziumantworten in primären murinen T-Zellen mittels Vollspektrum-Durchflusszytometrie zu messen. Die gesamten Splenozyten werden mit dem ratiometrischen Calciumindikatorfarbstoff Indo-1 markiert, zusammen mit einer Reihe von Fluorochrom-konjugierten Antikörpern gegen Zelloberflächenmoleküle. Die Nutzung der Möglichkeiten der Vollspektrum-Durchflusszytometrie bietet eine Plattform für die Verwendung einer breiten Palette von Zelloberflächenfärbungen in Kombination mit Indo-1. Die Zellen werden dann in Echtzeit bei 37 °C vor und nach der Zugabe eines Anti-CD3-Antikörpers zur Stimulation des T-Zell-Rezeptors analysiert. Nach der Entmischung der spektralen Signale wird das Verhältnis von calciumgebundenem zu calciumfreiem Indo-1 berechnet und kann über die Zeit für jede Gated Population von Splenozyten visualisiert werden. Diese Technik kann die gleichzeitige Analyse von Kalziumantworten in mehreren Zellpopulationen ermöglichen.
Introduction
Der durch den T-Zell-Rezeptor (TCR) induzierte Kalziumeinstrom ist ein nützliches Maß für die T-Zell-Aktivierung und wird häufig verwendet, um festzustellen, ob eine Population von T-Zellen eine beeinträchtigte Reaktion in den proximalen Schritten des TCR-Signalwegsaufweist 1. Messungen des Kalziumeinstroms werden in der Regel durchgeführt, indem die T-Zellen mit einem oder zwei fluoreszierenden Kalziumindikatorfarbstoffen vormarkiert und dann die Fluoreszenzsignale mittels Durchflusszytometrie in Echtzeit nach TCR-Vernetzung untersuchtwerden 2,3,4. Indo-1, ein ratiometrischer Calciumfarbstoff, wird durch den UV-Laser mit Spitzenemissionen bei zwei verschiedenen Wellenlängen angeregt, die von der Calciumbindung5 abhängen, und ist ein häufig verwendeter Indikatorfarbstoff für die durchflusszytometrische Analyse von Calciumantworten in lebenden Lymphozyten. Da das Emissionsprofil von Indo-1 recht breit gefächert ist, kann es schwierig sein, die Indo-1-Bewertung mit der gleichzeitigen Analyse mehrerer Zelloberflächenmarker mittels Bandpass-Durchflusszytometrie zu kombinieren. Diese Einschränkung schränkt die Verwendung der durchflusszytometrischen Analyse von Kalziumantworten auf vorgereinigte Populationen von T-Zellen oder auf Populationen ein, die durch einen begrenzten Satz von Zelloberflächenmolekülen identifiziert wurden.
Um die Einschränkungen der Messung von Kalziumantworten auf heterogene Populationen primärer Lymphozyten mittels Bandpass-Durchflusszytometrie zu beheben, wurde ein Protokoll zur Messung der Indo-1-Fluoreszenz mittels Vollspektrum-Durchflusszytometrie entwickelt. Diese Methode ermöglicht das Multiplexing von Indo-1 mit Antikörpern, die auf Zelloberflächenmoleküle gerichtet sind, und nutzt so die hochflexiblen Möglichkeiten der Vollspektrum-Durchflusszytometrie. Der Vorteil der Vollspektrum-Durchflusszytometrie gegenüber der konventionellen Durchflusszytometrie besteht darin, dass sie die Fluoreszenzsignale von stark überlappenden Farbstoffen unterscheiden kann, wodurch die Anzahl der Oberflächenmarker erhöht wird, die gleichzeitig in jeder Probe bewertet werden können. Die konventionelle Durchflusszytometrie verwendet Bandpassfilter und ist auf ein Fluorochrom pro Detektorsystembeschränkt 6. Bei der Vollspektrum-Durchflusszytometrie werden Signale über das gesamte Spektrum des Fluorochroms mit 64 Detektoren auf einem spektralen Durchflusszytometriesystem mit fünf Lasernerfasst 7,8. Darüber hinaus nutzt die Vollspektrum-Durchflusszytometrie die Vorteile von APD-Detektoren (Avalanche Photo Diode), die eine höhere Empfindlichkeit im Vergleich zu Photomultiplier-Röhrendetektoren aufweisen, die auf herkömmlichen Durchflusszytometern vorhanden sind8. Folglich ist dieser Ansatz ideal für die heterogenen Zellpopulationen, wie z.B. mononukleäre Zellen des peripheren Blutes oder sekundäre lymphatische Organzellsuspensionen der Maus, da er die Isolierung spezifischer T-Zellpopulationen vor der Markierung des Kalziumfarbstoffs überflüssig macht. Stattdessen können Expressionsprofile von Zelloberflächenmarkern und durchflusszytometrisches Gating nach der Datenerfassung verwendet werden, um die Kalziumreaktionen in jeder interessierenden Population zu bewerten. Wie in diesem Bericht gezeigt wird, kann Indo-1 problemlos mit acht fluorochrom-konjugierten Antikörpern kombiniert werden, was zu insgesamt 10 einzigartigen spektralen Signaturen führt. Darüber hinaus kann diese Methode leicht auf Mischungen von Zellen aus kongen unterschiedlichen Mauslinien angewendet werden, was die gleichzeitige Analyse der Kalziumantworten in Wildtyp-T-Zellen im Vergleich zu denen einer genspezifischen Mauslinie ermöglicht.
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Protocol
Die Mäuse wurden auf dem medizinischen Campus der University of Colorado Anschutz in Übereinstimmung mit den IACUC-Protokollen gehalten. Alle Mäuse wurden nach AAALAC-Standards eingeschläfert.
1. Präparation von Immunzellen aus der Milz der Maus
HINWEIS: Naive Mäuse mit CO2 -Euthanasie einschläfern. C57BL/6-Mäuse, die von Jackson Laboratories gekauft und im eigenen Haus gezüchtet wurden, werden für Experimente im Alter von 6-12 Wochen verwendet. Für Experimente werden sowohl männliche als auch weibliche Mäuse verwendet.
- Desinfizieren Sie die Mäusehaut mit 70%igem Ethanol, um die Möglichkeit zu verringern, dass externe Verunreinigungen in die Probe gelangen.
- Präpariere die Milz der Maus mit Sezierwerkzeugen, einer chirurgischen Schere und einer Pinzette. Entnehmen Sie die Milz und legen Sie die abgelöste Milz in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit ~5 ml vollständigem RPMI-Medium (cRPMI) auf Eis.
HINWEIS: Das komplette RPMI besteht aus 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin und 1 % Penicillin/Streptomycin.- Um die Milz der Maus zu entnehmen, machen Sie mit einer Schere einen 5 cm langen Schnitt in das Fell und die Haut entlang der linken Seite der Maus auf halbem Weg zwischen Vorder- und Hinterbeinen. Öffnen Sie die Körperhöhle ~5 cm und entfernen Sie die Milz mit einer Pinzette. Die Milz hat die Farbe einer Kidneybohne und ist länger und flacher als die Nachbarniere.
- Gießen Sie den Inhalt von Schritt 1.2 auf einen sterilen 70-μm-Filter, der an einem neuen konischen 50-ml-Röhrchen befestigt ist. Trennen Sie die Milz mechanisch in eine einzellige Suspension, indem Sie die Milz mit einem 5-ml-Spritzenkolben durch den Filter drücken, bis keine Milzpulpa mehr auf der Filteroberfläche verbleibt.
- Die Splenozyten werden mit einer Ausschwingrotor-Arbeitsplattenzentrifuge bei 500 x g für 5 min bei 4 °C pelletiert.
- Den Überstand vorsichtig umfüllen. Die pelletierten Splenozyten verbleiben am Boden des konischen 50-ml-Röhrchens.
- Um rote Blutkörperchen zu entfernen, suspendieren Sie die pelletierten Splenozyten in 1 ml ACK-Lysepuffer für 3 Minuten gemäß den Anweisungen des Herstellers. Gut mischen.
- Der ACK-Lysepuffer wird mit 15 ml cRPMI abgeschreckt.
- Die Lymphozyten werden wie in Schritt 1.4 beschrieben pelletiert.
- Resuspendieren Sie die Zellsuspension in 5 ml cRPMI in einem konischen 50-ml-Röhrchen. Legen Sie die Proben auf Eis.
- Um die Zellen zu zählen, werden 10 μl der Zellsuspension in ein 0,6-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und im Verhältnis 1:1 mit Trypanblaulösung verdünnt. Anschließend in ein Hämozytometer oder ein automatisiertes Zellzählsystem überführen.
- Nach der Zählung werden die Zellen in Abhängigkeit von der Zellkonzentration in der Zellsuspension wie in Schritt 1.9 in einer Tischzentrifuge bei 500 x g bei 4 °C für 5 min pelletiert, um die Zugabe von cRMPI-Medien vorzubereiten, die Indo-1 AM-Esterfarbstoff enthalten.
- Berechnen Sie das Volumen für die Resuspension der Zellen, um 10-12 x 106 Zellen/ml zu erreichen. Dies ist eine 2-fache Konzentration der erforderlichen Gesamtzellzahl.
- Suspendieren Sie die Zellen erneut in dem in Schritt 1.11 berechneten cRPMI-Volumen. Platzieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO2 entweder in einem konischen 50-ml-Röhrchen mit belüftetem Deckel oder einer Gewebekulturplatte.
2. Markierung von ratiometrischem Indo-1-Farbstoff und fluoreszierenden Antikörpern
- Geben Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers 50 μl DMSO in eine Durchstechflasche mit 50 μg Indo-1 AM. Die Konzentration der Stammlösung beträgt 1 μg/μl.
Anmerkungen: DMSO wird in Mikrofläschchen mit dem Kit geliefert, um eine Oxidation von DMSO zu verhindern. - Das Stammaliquot (1 μg/μl) wird in das entsprechende Versuchsvolumen (gemäß Abschnitt 1.11) cRPMI in einer Konzentration von 6 μg/ml, einer 2-fachen Konzentration, verdünnt. Lagern Sie Indo-1 nicht in einer wässrigen Lösung.
Anmerkungen: Je nach Bedarf der Zelle können auch andere Puffer mit zugesetztem Kalzium verwendet werden. - Komplette Medien mit Indo-1 in einem Wasserbad bei 37 °C beiseite stellen.
Anmerkungen: Verwenden Sie die Mindestkonzentration an Indo-1 AM-Ester, die erforderlich ist, um ein angemessenes Signal zu erhalten. Dies muss für verschiedene Zelltypen titriert werden. Typischerweise ist eine Konzentration zwischen 3-5 μM ausreichend. Bei primären T-Zellen erhöht das Laden von Zellen mit Indo-1 in einer Konzentration von >5 μg/ml die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) über einen Logarithmus von 6 auf spektralen Durchflusszytometern. Verringern Sie in diesem Fall die Intensität des UV-Lasers und titrieren Sie das Indo-1 auf eine niedrigere Konzentration. - Die zuvor hergestellte Zellsuspension (in Schritt 1.12) wird 1:1 in cRPMI verdünnt, einschließlich der 2x Indo-1-Medien, die in Schritt 2.2 hergestellt wurden. Stellen Sie sicher, dass die Zellen eine Konzentration zwischen 5-6 x 106/ml aufweisen.
Anmerkungen: Färben Sie keine ungefärbten Einzelfleckenkontrollen oder Oberflächenmarker-Einzelfleckenzellenkontrollen mit Indo-1. Durch die Zugabe von Indo-1 zu Einzelfärbungs-Antikörperkontrollen wird aufgrund des Indo-1, das einzelnen gefärbten Zellen zugesetzt wird, eine mehrfarbige Probe erzeugt. Fügen Sie der in Schritt 2.6 erstellten Probenplatte Indo-1 (kalziumfreies) EGTA zusätzliche Kontrolle hinzu. - Geben Sie 1 ml Zellen/Well/Versuchsbedingung in eine 12-Well-Gewebekulturplatte.
- Erstellen Sie eine einzelne gefärbte Kontrolle für Indo-1 (kalziumfreie) Probe unter Verwendung von zuvor mit Indo-1 beladenen Farbstoffzellen und fügen Sie EGTA bis zu einer Endkonzentration von 2 mM hinzu. EGTA chelatisiert Kalzium in der Zellsuspension, wodurch eine sauberere Kontrollprobe entsteht.
- Erstellen Sie eine Indo-1-Positivkontrolle (Indo-1-Kalziumbindung), indem Sie der farbstoffbeladenen Zellsuspension am Durchflusszytometer 50 μM Ionomycin hinzufügen. Ionomycin ist ein membrandurchlässiger Calcium-Ionophor, der Calcium-Ionen bindet und den Transfer von Calcium-Ionen in die Zellen erleichtert.
- Erstellen Sie eine Vertiefung für die biologische Negativkontrolle ohne Fluorophore oder Indo-1-Farbstoffe.
- Erstellen Sie eine Vertiefung für die Kontrolle einzelner Färbungen für zusätzliche Zellpopulationen von Interesse (benutzerdefinierte Antikörper) unter Verwendung von Antikörper-konjugierten Fluorophoren in einem Durchflusszytometrie-Panel-Design. Diese enthalten nicht den ratiometrischen Farbstoff Indo-1.
- Fügen Sie den Fc-Rezeptor-blockierenden Antikörper (~2 μg/1 x 106 Zellen) gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu, bevor Sie zusätzliche Fluorochrom-konjugierte Antikörper für die Oberflächenfärbung hinzufügen.
- Die Platte wird 45 min bei 37 °C mit 5 % CO 2 inkubiert.
- Resuspendieren Sie die Zellen in einer 12-Well-Platte, indem Sie alle 15 Minuten vorsichtig auf die Platte klopfen.
- Mischen und entfernen Sie das gesamte Volumen der im Medium suspendierten Zellen von der 12-Well-Platte. Anschließend wird die Zellsuspension in 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben.
- Die Zellen werden in einer Mikrozentrifuge bei 500 x g für 5 min bei Raumtemperatur pelletiert. Dekantieren Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen, indem Sie 1 ml vorgewärmtes cRPMI hinzufügen. Erneut pelletieren und den Überstand umfüllen.
HINWEIS: Durch das Waschen der Zellen werden alle verbleibenden FC-blockierenden Antikörper entfernt. - Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml cRPMI in 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie jedes Röhrchen bei 37 °C für weitere 30 Minuten bei 5 % CO2, wobei die Oberseite des Röhrchens leicht geöffnet bleibt, um einen Gasaustausch zu ermöglichen. Dies ermöglicht eine vollständige Entesterung der intrazellulären AM-Ester.
- Übertragen Sie die Zellen bei Bedarf zurück in eine 12-Well-Gewebekulturplatte. Zusätzliche benutzerdefinierte titrierte Fluorochrom-konjugierte Antikörper können in einer Ruhephase hinzugefügt werden.
HINWEIS: Zu den Markern, die im Methodenbereich verwendet werden, gehören: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 und CD1d/α-Galcer-Tetramer. Marker werden ausgewählt, um T-Zell-Untergruppen zu analysieren.- Erstellen Sie einen Mastermix aller benutzerdefinierten Fluorochrom-konjugierten Antikörper entsprechend den interessierenden Zelltypen in einem zuvor titrierten Volumen in einem 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Fügen Sie eine berechnete Mastermischung für 1 ml des Zellvolumens hinzu, abhängig von titrierten Antikörpern für ruhende Zellen.
ANMERKUNG: Der Vorteil der Färbung in Schritt 2.15 gegenüber dem späteren Schritt 2.18 besteht darin, dass die Färbung in Schritt 2.15 die Gesamtinkubationszeit für das Experiment verkürzt. Die Färbung in einem Gesamtvolumen von 1 ml in Schritt 2.15 erhöht jedoch den Antikörperverbrauch.
- Nach der Ruhezeit pelletieren Sie die Zellen bei 500 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Zellen in einer 12-Well-Gewebekulturplatte können mit einem Plattenzentrifugenzubehör in der Platte pelletiert werden. Andernfalls pelletieren Sie die Zellen in einem 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. - Waschen Sie die Zellen, indem Sie das Pellet in 1 ml 4 °C kaltem cRPMI resuspendieren, und pelletieren Sie die Zellen erneut wie in Schritt 2.16. Legen Sie die Zellen auf Eis.
Anmerkungen: Wenn Oberflächenzellen separat gefärbt werden, wird nach der Entesterung in Schritt 2.18 weniger Antikörpervolumen benötigt. Die Oberflächenfärbung in diesem Schritt kann nach der Ruhephase in Cold-Flow-Puffer (1x DPBS mit 1% FBS) unter Verwendung von benutzerdefinierten Antikörpern auf Eis für 30 min durchgeführt werden. Waschen Sie die Zellen nach dem Fleck in cRPMI wie in Schritt 2.17.- Fügen Sie den Proben den Viabilitätsfleck Ghost540 verdünnt 1:7.500 in DPBS gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu. Hitzeabtötung der Zellen bei 55 °C auf einem Erwärmungsblock für eine einzelne gefärbte Lebend-/Totkontrolle.
HINWEIS: Die Färbung von Viabilitätsfarbstoffen zur Eliminierung abgestorbener Zellen in der durchflusszytometrischen Analyse wird ohne FBS durchgeführt. FBS kann gemäß den Anweisungen des Herstellers mit Aminfarbstoffen interagieren.
- Fügen Sie den Proben den Viabilitätsfleck Ghost540 verdünnt 1:7.500 in DPBS gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu. Hitzeabtötung der Zellen bei 55 °C auf einem Erwärmungsblock für eine einzelne gefärbte Lebend-/Totkontrolle.
- Resuspendieren Sie einzelne Proben in 500 μl cRPMI (phenolrotfrei) unter Verwendung eines 5-ml-Polystyrol-Durchflussrohrs mit Kappe.
Anmerkungen: Die Zellen können bis zu einer Stunde bei 4 °C belassen werden. - Erwärmen Sie jedes 5-ml-Röhrchen mit den einzelnen Zellen vor der Analyse auf dem Durchflusszytometer 7 Minuten lang mit einem Perlenbad auf 37 °C, wobei die Zeit zwischen den Proben konstant bleibt. Verwenden Sie einen Timer.
3. Perlenbadrohr: Aufrechterhaltung der Temperatur während der Kalziumflussanalyse
- Geben Sie Badeperlen in ein kleines Wasserbad, ohne dass Wasser hinzugefügt wird. auf 37 °C erwärmen.
- Schneiden Sie vorsichtig ein konisches 50-ml-Röhrchen an der 25-ml-Marke mit einer Rasierklinge in zwei Hälften. Entsorgen Sie die Oberseite des Röhrchens.
- Füllen Sie das halbierte Röhrchen zu 3/4 mit Badeperlen.
- Legen Sie das in Schritt 3.2 erstellte Rohr in das in Schritt 3.1 erstellte Perlenbad. Röhrchen und Perlen auf 37 °C erhitzen.
- Stecken Sie das Perlenbad in eine Steckdose neben dem Durchflusszytometer, um die Temperatur in Vorbereitung auf die Probenanalyse aufrechtzuerhalten.
- Fügen Sie ein konisches 50-ml-Styroporgestell hinzu, das für ein Röhrchen zugeschnitten ist, um das Röhrchen an Ort und Stelle zu positionieren, während es auf dem Durchflusszytometer läuft. Dadurch entfällt die Notwendigkeit, das Rohr für die Dauer der Kurvenanalyse manuell zu halten.
4. Erfassung des Calciumeinstroms mittels durchflusszytometrischer Analyse
- Melden Sie sich bei der Durchflusszytometer-Software auf einem Durchflussanalysator an.
- Klicken Sie auf die Registerkarte Bibliothek, um Indo-1 (kalziumgebunden) und Indo-1 (kalziumfrei) fluoreszierende Tags hinzuzufügen. Wählen Sie Fluoreszierende Tags im Softwaremenü auf der linken Seite. Wählen Sie UV-Laser unter fluoreszierende Tag-Gruppen aus und klicken Sie auf +hinzufügen, um der Bibliothek einen fluoreszierenden Tag-Namen (Indo-1 (kalziumgebunden)/Indo-1 (kalziumfrei)) hinzuzufügen. Wählen Sie die Wellenlänge der Laseranregung und die Emissionswellenlänge aus und klicken Sie dann auf Speichern. Fahren Sie mit dem Versuchsaufbau fort.
HINWEIS: Indo-1 wird durch den UV-Laser bei einer Wellenlänge von 355 nm angeregt. Die Emissionswellenlänge von Indo-1 (calciumgebunden) beträgt 372 nm. Die Emissionswellenlänge von Indo-1 (calciumfrei) beträgt 514 nm. - Klicken Sie auf die Registerkarte Akquise. Öffnen/erstellen Sie ein neues Experiment und fügen Sie dem Experiment die gewünschten fluoreszierenden Tags hinzu.
- Erstellen Sie eine Referenzgruppe und eine neue Stichprobengruppe(n) für das Experiment. Beschriften Sie sowohl die Proben als auch die Referenzgruppen nach Bedarf.
- Legen Sie auf der Registerkarte " Akquisitionen" die maximal aufzuzeichnenden Ereignisse fest: 10.000.000.
- Stellen Sie das Stoppvolumen auf das maximale Volumen ein: 3.000 μL.
- Stellen Sie die Stoppzeit auf die maximale Zeit ein: 36.000 s.
- Erfassen Sie einzelne gefärbte Kontrollen für definierte konjugierte Antikörper, die im Multicolor-Panel enthalten sind.
- Erwerben Sie einfach gefärbte Kontrollen für den funktionellen Farbstoff Indo-1.
- Fügen Sie 50 μM Ionomycin zur Calcium-gebundenen Indo-1-Positivkontrolle hinzu. Wirbel zum Mischen. Fügen Sie das Durchflussrohr zum Probeninjektionsanschluss hinzu und klicken Sie auf Aufzeichnen.
- Fügen Sie dem Durchflusszytometer die kalziumfreie Indo-1-Negativkontrolle hinzu und klicken Sie auf Aufzeichnen. EGTA wurde in Schritt 2.6 hinzugefügt.
- Entmischen Sie die einzelnen Stained-Regler, indem Sie auf die Schaltfläche Unmix klicken.
HINWEIS: Alle einzelgefärbten Kontrollen aller konjugierten Antikörper und funktionellen Farbstoffe müssen vor dem Entmischen der Proben aufgezeichnet werden. Damit die Unmix-Taste funktioniert, müssen zuerst alle Referenzregler aufgezeichnet werden. Die Entmischung kann vor oder nach der Probenentnahme erfolgen.
- Sobald die Entmischung abgeschlossen ist, erstellen Sie sequenzielle Diagramme mit dem ungemischten Arbeitsblatt. SSC-A im Vergleich zu FSC-A zum Entfernen von Schmutz aus der Probe, SSC-A im Vergleich zu SSC-H zum Entfernen von Dubletten. Darauf folgt ein Rentabilitäts-Clean-up-Gate zusammen mit einem weiteren Gating für Populationen von Interesse. Um Tore zu erstellen, klicken Sie auf Plotten. Fügen Sie dem Arbeitsblatt ein Diagramm hinzu, und doppelklicken Sie in das Tor, um eine nachgelagerte geschlossene Population zu erstellen. Fahren Sie fort, bis alle interessierenden Populationen berücksichtigt sind.
- Erwärmen Sie einfach gefärbte Kontrollproben (aus den Schritten 2.6-2.9 im Abschnitt Indo-1 ratiometrische Farbstoff- und Fluoreszenzantikörpermarkierung) auf 37 °C für die sequenzielle Analyse. Richten Sie die Durchflusszytometrie-Software ein.
- Lassen Sie DI-Wasser 2-3 Minuten lang auf dem Zytometer laufen, um die fluidische Stabilität des Durchflusszytometers zu gewährleisten.
- Richten Sie sequenzielle Diagramme auf dem ungemischten Arbeitsblatt ein, indem Sie mit den Schaltflächen Polygon, Rechteck oder Ellipsentor Tore erstellen. Gate, um die interessierende Population einzubeziehen (d. h. Lymphozyten, die SSC-A vs. FSC-A verwenden [Größen-/Lymphozytenunterscheidung]). Negative Populationen erscheinen um Null geclustert, während positive Populationen durch Erhöhung des MFI visualisiert werden können. Die interessierenden Populationen werden auf der Grundlage der biologischen Fragestellung benutzerdefiniert.
- Doppelklicken Sie in das erstellte Tor und ändern Sie die Parameter für die Y-Achse und die X-Achse in SSC-A statt SSC-H (Singulett-Unterscheidung). Schließen Sie die Definition der Achsenparameter ab, indem Sie mit der linken Maustaste auf die Wörter auf der Achse klicken.
- Erstellen Sie ein Diagramm mit SSC-A im Vergleich zum Viabilitätsfarbstoffsignal (Viability-Gate-Parameter). Gate auf lebenden Zellen, die negativ für die Aminfarbstofffärbung sind. Lebende Zellen, die negativ für die Färbung lebender Tote sind, gruppieren sich sowohl auf der Y- als auch auf der X-Achse an der 0-Markierung.
- Doppelklicken Sie auf das innere Diagramm, um ein neues Diagramm zu erstellen, das nur einzellige lebende Lymphozyten enthält. Ändern Sie die Y-Achse auf Indo-1 (gebundenes Kalzium) (V1) und/oder Indo-1 (freies Kalzium) (V7) über die Zeit auf der X-Achse, um den Kalziumeinstrom zu visualisieren.
- Legen Sie die erwärmte biologische Probe auf die Maschine SIT und lassen Sie die Proben mit 2.500-3.000 Ereignissen/s auf Medium laufen, um die Visualisierung des Kalziumeinstroms in Populationen mit begrenzter Zellzahl (z. B. iNKT) zu ermöglichen.
Anmerkungen: Durch die Resuspendierung der Zellen in einer Konzentration von 1 x 106/ml sollten die bei mittlerer Flussrate erfassten Zellereignisse 2.500-3.000 Ereignisse/s betragen. Verringern Sie die Durchflussrate unter Erfassungskontrolle, indem Sie auf das Dropdown-Menü klicken, oder verdünnen Sie die Probe, wenn die Zellsuspension eine erhöhte Konzentration aufweist. Wenn die Proben mit einer hohen Flussrate betrieben werden, kann die Ausbreitung des Signals von einem Fluorophor zu anderen Fluorophoren im Panel erhöht werden. - Geben Sie das nächste Röhrchen in das Perlenbad, um es auf 37 °C zu erwärmen.
- Drücken Sie in der Erfassungssteuerung die Aufnahmetaste , um die Anfangsdaten für 30 s aufzuzeichnen und einen basalen Gehalt an Kalziumsignalen in der Probe zu erhalten.
- Klicken Sie in der Erfassungssteuerung auf Stopp und entfernen Sie das Röhrchen vom Probeninjektionsanschluss (SIP).
- Geben Sie 30 μg unkonjugiertes Anti-CD3 direkt in das Probenröhrchen, um den Kalziumeinstrom zu initiieren. Die Endkonzentration pro Röhrchen beträgt 60 μg/ml.
Anmerkungen: Nach der Zugabe von Anti-CD3 findet kein Waschschritt statt. - Legen Sie den Schlauch so schnell wie möglich wieder auf das SIP der Maschine und drücken Sie in der Software auf Aufnahme .
- Zeichnen Sie die Daten 7 Minuten lang auf und beobachten Sie die Zeit, die unter den Erfassungskontrollen in der Software verstrichen ist, um den zeitlichen Verlauf des Kalziumeinstroms innerhalb der Probenpopulationen zu beobachten.
- Drücken Sie nach 7 Minuten in der Software auf Stopp und fügen Sie 1 μg/ml Ionomycin hinzu. Zeichnen Sie 30 s lang auf, um das maximale Kalziumsignal in den interessierenden Zellen zu erhalten. Um die Verschleppung von Ionomycin in die nächste Probe zu begrenzen, führen Sie zwischen den Proben zwei SIT-Spülungen auf dem Gerät durch.
- Fahren Sie mit der nächsten Probe fort und wiederholen Sie den Arbeitsablauf, bis alle Proben gesammelt wurden.
- Speichern Sie das Experiment und klicken Sie auf die Export-Zip-Datei. Ungemischte Dateien (.fsc) werden in eine externe Durchflusszytometrie-Analysesoftware hochgeladen.
5. Analyse der Kalziumkurve
- Wandeln Sie mit einer Analysesoftware6 für die Durchflusszytometrie Indo-1-Fluoreszenzsignale in ein Verhältnis für Zeitraffer-Kalziummessungen um. Leiten Sie Parameter auf der Registerkarte Werkzeuge ab, indem Sie die Referenzen Indo-1 (kalziumgebunden)/Indo-1 (freies Kalzium) mit einer linearen Skala einfügen. Setzen Sie das Minimum auf Null und das Maximum entsprechend dem Kalziumzuflussverhältnis, normalerweise um 10. Das maximale Verhältnis variiert je nach Zelltyp und MFI von Indo-1.
- Markieren Sie den ausgewählten Parameter. Fügen Sie unter Werkzeuge kinetische Analyse hinzu, um den Parameter auszuwählen, indem Sie auf die Registerkarte Kinetik klicken. Legen Sie die Y-Achse auf abgeleitet fest.
- Wählen Sie MFI (mittlere Fluoreszenzintensität) auf der Registerkarte Kinetik aus.
- Fügen Sie bei Bedarf eine Gaußsche Glättung hinzu. Um die Gaußsche Glättung hinzuzufügen, wählen Sie die Option im Pulldown-Statistikmenü in der Strömungsanalysesoftware aus. Gaußsche Glättung kann hinzugefügt werden, um die Visualisierung der Kalziumzuflusskurve der Analyse zu glätten.
- Erstellen Sie mehrere Bereiche für Statistiken entlang des Zeitverlaufs des Kalziumflusses für biologische Vergleiche innerhalb der Proben.
- Ziehen Sie die Samples in den Layout-Editor und fügen Sie die Statistiken wie gewünscht hinzu. Die statistische Auswertung variiert je nach biologischer Fragestellung. Zu Publikationszwecken werden mehrere Replikationen mittels t-Test oder ANOVA analysiert.
- Für eine Moment-of-Time-Analyse stellen Sie das Gate auf einen bestimmten Zeitpunkt entlang des Kalziumflusses ein. Untersuchen Sie die gewünschten Oberflächenmarkierungen und das Tor auf die Population von Interesse. Bewerten Sie dann ein zweidimensionales Punktdiagramm von Indo-1 (kalziumfrei) im Vergleich zu Indo-1 (kalziumgebunden) für Gated Cells innerhalb dieses Zeitpunkts in der Zeitregion.
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Representative Results
Der experimentelle Arbeitsablauf zur Beurteilung der Kalziumantworten in primären murinen T-Zellen unter Verwendung eines ratiometrischen Indo-1-Farbstoffs mit Multiplex-Oberflächenfärbungen ist in Abbildung 1 dargestellt. Nach der Ernte und Aufbereitung der Maus-Splenozyten zu einer Einzelzellsuspension werden die Zellen mit einem Indo-1 AM-Ester gefärbt und mit Fluorochrom-verknüpften Antikörpern oberflächengefärbt. Nach Abschluss der Farbstoffbeladung und der Antikörperfärbung werden die Lymphozytenproben auf eine biologische Temperatur (37 °C) erwärmt. Die Proben werden dann mittels Vollspektrum-Durchflusszytometrie auf Indo-1-Fluoreszenz nach dem Gating an den einzelnen gewünschten Zelltypen analysiert, ohne dass die Proben vor der Analyse sortiert werden müssen. Um Avalanche Photo Diode (APD)-Detektoren innerhalb des Vollspektrum-Durchflusszytometers verwenden zu können, ist es notwendig, die maximale Emissionswellenlänge von einer in nm gemessenen Bandpassfilterwellenlänge in den entsprechenden Kanal auf dem APD umzuwandeln. Die Tabelle in Abbildung 2 dient als Richtwert, allerdings müssen die optimalen Detektoren für die beiden Fluoreszenzsignaturen von Indo-1 (calciumgebunden versus calciumfrei) empirisch bestimmt werden. Dies wird erreicht, indem einzelne gefärbte Indo-1-Proben unter Verwendung von Ionomycin zur Erzeugung des Indo-1-Signals (Calcium-gebunden) und EGTA, einem Calcium-Chelatbildner, zur Erzeugung des Indo-1-Signals (Calcium-frei) verwendet werden. Nach der Analyse mittels Vollspektrum-Durchflusszytometrie kann der Kanal, der die maximale Fluoreszenzintensität für jede Indo-1-Signatur anzeigt, visualisiert werden (Abbildung 3A). Durch Normalisierung des MFI der positiven Populationen auf den der negativen Populationen kann die Verschiebung der Indo-1-Fluoreszenz von kalziumfrei zu kalziumgebunden bestimmt werden (Abbildung 3B). Diese Anzeige wird in einer Arbeitsmappe (.xls) unter Verwendung von Referenzsteuerungen sowohl für gebundenes als auch für freies Indo-1 generiert, wobei ein negatives und positives Intervallgatter mit eindeutigen positiven und negativen Gattern für die MFI-Normalisierung gezeichnet wird, wie in Abbildung 3A gezeigt. Beispiel-MFI-Statistiken können auch durch Rechtsklick auf die Statistiktabelle abgerufen werden. Bestimmen Sie in der Software das MFI-Verhältnis, indem Sie die positive Grundgesamtheit durch die negative Grundgesamtheit dividieren und die beiden Spektren auf einem einzigen Display überlagern (Abbildung 3B, rechts). Der gelb gestrichelte Pfeil zeigt die normierten spektralen Unterschiede zwischen den spektralen Signaturen von gebundenem und freiem Indo-1.
Um die Kalziumantworten nach T-Zell-Rezeptor-Stimulation zu bewerten, wird die Indo-1-Fluoreszenz nach dem Gating an den interessierenden Zellpopulationen bewertet, wie in Abbildung 4 dargestellt. Zunächst wird ein Diagramm der Zeit-Seitenstreuung (SSC-A) untersucht, um die fluidische Stabilität zu beurteilen. Ein stabiles, konsistentes Signal über die Zeitachse zeigt Stabilität an (Abbildung 4A). Als nächstes wird die Vorwärts- und Seitenstreuung (FSC-A vs. SSC-A) visualisiert und die Lymphozytenpopulation wie in Abbildung 4B gezeigt gesteuert. Nach dem Lymphozyten-Gate wird ein Einzelzell-Diskriminations-Gate angewendet, indem ein Diagramm der seitlichen Streuhöhe über der Fläche (SSC-H vs. SSC-A) erzeugt wird, und die Singuletts, die auf die Diagonale fallen, werden wie in Abbildung 4C gezeigt. Die Singlelets werden dann auf ihre Lebensfähigkeit untersucht, indem die Färbung mit dem Viabilitätsfarbstoff und das Gating an der negativen Population untersucht werden (Abbildung 4D). Um schließlich T-Zellen zu analysieren, wird ein B-Zell-Dump/internes Negativkontroll-Gate durch Gating auf die CD19-negative Population angewendet (Abbildung 4E). Die CD19-negative Population wird dann mit Hilfe von Antikörpern gegen CD4 und CD8 auf T-Zell-Subpopulationen untersucht (Abbildung 4F). Das gezeigte Beispiel untersucht CD4+ T-Zellen auf Kalziumantworten durch Visualisierung der Indo-1 (Kalzium-gebundenen) Fluoreszenz über die Zeit (Abbildung 4G). Nach dem Gating auf einem Zeitsegment kann auch das Indo-1 (kalziumfrei) versus Indo-1 (kalziumgebunden) Diagramm erstellt werden (Abbildung 4H). Aus dieser Analyse wird später das Indo-1-Verhältnis abgeleitet (siehe Methoden zur Analyse der Kalziumeinstromkurve in der Durchflusszytometrie-Analysesoftware).
An diesem Punkt der Analyse kann es nützlich sein, die Zeitpunkte innerhalb des zweidimensionalen Diagramms von Indo-1 (kalziumgebunden) im Vergleich zur Zeit in einzelnen Zellpopulationen von Interesse zu analysieren. Zu den optimalen Zeitpunkten gehören das an Indo-1 gebundene Basiskalzium vor der TCR-Stimulation, die Spitzenreaktion, ein Zeitpunkt einige Minuten nach der Spitzenreaktion, wenn der intrazelluläre Kalziumspiegel sinkt, und schließlich die Kalziumreaktion, die durch die Zugabe von Ionomycin ausgelöst wird (Abbildung 5A). In der Ausgangsprobe vor der Zugabe von Anti-CD3-Antikörpern wird ein schwaches Indo-1 (Calcium-gebundenes) Signal detektiert. Während der Peakantwort zeigen die Zellen ein starkes Indo-1(Calcium-gebundenes) Signal und eine reduzierte Fluoreszenz von Indo-1 (Calcium-frei). 5 Minuten nach dem Höhepunkt kehrte die Indo-1-Fluoreszenz fast zum Ausgangswert zurück. Nach der Zugabe von Ionomycin zur Probe kann ein robustes Signal von Indo-1 (calciumgebunden) sichtbar gemacht werden, das eine ausreichende Farbbeladung der Zellen gewährleistet. Seltene Zellpopulationen (<1 %) können für die abgeleitete Analyse schwierig sein; Um diese Einschränkung zu überwinden, kann die Analyse der seltenen Populationen durchgeführt werden, indem Indo-1 (kalziumgebunden) versus Indo-1 (kalziumfrei) nach dem Gating auf jede interessierende Population aufgetragen wird, wie z. B. CD4+-Zellen, TCRb+-Zellen, TCRyg+-Zellen, CD25+-Zellen, iNKT-Zellen und CD19+-Zellen (Abbildung 5B, C). Man beachte die leicht nachweisbare Kalziumantwort in TCRγδ+ T-Zellen und iNKT-Zellen (CD1d/α-galcer+). Für den Vergleich von Oberflächenproteinen innerhalb einer gemischten murinen T-Zell-Population wurden zweidimensionale Diagramme erstellt, die interessante Teilmengen zeigen. Unten ist die Analyse der Kalziumantwort über den gesamten Zeitverlauf für jede Teilmenge dargestellt (Abbildung 5C).
Dieser Assay kann auch verwendet werden, um biologische Unterschiede in T-Zellen von Wildtyp- und Gen-Zielmäusen oder in T-Zellen, die nicht behandelt und mit pharmakologischen Inhibitoren behandelt wurden, festzustellen. In dem in Abbildung 6 gezeigten Beispiel wurden T-Zellen mit PRN694 behandelt, einem niedermolekularen Inhibitor der T-Zell-Tyrosinkinasen ITK und RLK 9,10. Die Hemmung von ITK/RLK dämpft die Signalübertragung des T-Zell-Rezeptors, was zu einer reduzierten Kalziumantwort nach T-Zell-Rezeptor-Stimulation führt11 (Abbildung 6A). Um die Auswirkungen der ITK/RLK-Hemmung zu quantifizieren, können die Kurven, die das Verhältnis von Indo-1 (calciumgebunden) zu Indo-1 (calciumfrei) Fluoreszenz zeigen, für die Fläche unter der Kurve (AUC) oder die Steigung der Kurve für jede Bedingung analysiert werden (Abbildung 6B, C). Diese Quantifizierung wird durchgeführt, indem der zeitliche Verlauf der Kalziumantwort in diskrete Segmente unterteilt wird (Abbildung 6A) und die Fläche unter der Kurve oder die Steigung der Kurve für jedes Segment bewertet wird, wie gezeigt (Abbildung 6B, C). Insgesamt zeigt dieses Protokoll, dass die Vollspektrum-Durchflusszytometrie verwendet werden kann, um den Kalziumeinstrom zusammen mit mehreren Zelloberflächenmarkern in den untersuchten Immunzellpopulationen zu messen. Diese Ergebnisse zeigen, dass Zelluntergruppen, die mehr als 1% der Gesamtpopulation ausmachen, auf Kalziumeinstrom im Laufe der Zeit untersucht werden können. Im Gegensatz dazu erfordern weniger häufig vorkommende Zelluntergruppen eine alternative Analyse unter Verwendung von Zeitmomenten.
Die statistische Analyse der Calcium-Response-Daten ist spezifisch für die experimentelle Fragestellung und die biologischen Assays, die durchgeführt werden. In den im Manuskript präsentierten Daten wurden Experimente mit Wiederholungen durchgeführt, um die experimentelle Genauigkeit und die Robustheit der Methodik zu gewährleisten. Mehrere Experimente an verschiedenen biologischen Proben an verschiedenen Tagen wurden jedoch nicht durchgeführt. Daher wäre es nicht angebracht, statistische Analysen der vorgelegten Daten durchzuführen.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Calcium-Assay-Arbeitsablaufs. Die Verwendung des Indo-1 AM-Ester-Calcium-Indikatorfarbstoffs bietet ein Werkzeug zur Visualisierung des Einstroms von Calcium in Immunzellen und deren Subpopulationen. Dieses Schema skizziert den Arbeitsablauf für die Analyse von Kalziumantworten in murinen Milz-T-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Umrechnung von PMT-Wellenlängen in APD-Kanäle. Das Vollspektrum-Durchflusszytometer verfügt über 16 Detektoren zur Detektion von Fluoreszenzemissionen nach Anregung durch den UV-Laser. Die Spezifikationen der einzelnen Melder sind in der Tabelle angegeben. Hervorzuheben sind die beiden Detektoren, die für die Beurteilung der Indo-1-Fluoreszenz verwendet wurden, wie sie empirisch mit einfach gefärbten Kontrollen bestimmt wurden. Umrechnungen in APD-Wellenlänge und Benutzerhandbuch für spektrale Durchflusszytometer sind verfügbar11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Visualisierung der spektralen Signatur von Indo-1. (A) Oben: Spektrale Signatur der Indo-1-Fluoreszenz in CD8+ T-Zellen nach Ionomycin-Eintragung, um einen robusten Einstrom von Calcium auszulösen. Der Peak von Indo-1 (kalziumgebunden) kann in UV1 visualisiert werden. Unten: Spektrale Signatur von Indo-1 (calciumfrei) mit der maximalen Fluoreszenz in UV7. Diese Kontrollprobe wurde durch die Behandlung von Indo-1-beladenen Zellen mit EGTA12 erzeugt, um extrazelluläres freies Kalzium zu chelatisieren. (B) Kombinierte Überlagerung der Indo-1-Signatur mit fünf Laserspektren, die links die rohe spektrale MFI und rechts die normalisierten Spektren von Indo-1-gebundenem und freiem Indo-1 zeigt. Die Visualisierung der Verschiebung von Indo-1 (kalziumfrei) in orange zu Indo-1 (kalziumgebunden) in blau ist leicht zu erkennen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Gating-Strategie zur Visualisierung von Kalziumantworten. Der Arbeitsablauf für das sequenzielle Gating der Proben wird skizziert. (A) Die fluidische Stabilität wird mit Hilfe eines Zeit-gegen-SSC-A-Gatters untersucht. (B) FSC-A im Vergleich zu SSC-A wird verwendet, um Lymphozyten anzulocken und dadurch Zelltrümmer und verbleibende rote Blutkörperchen in der Probe zu eliminieren. (C) Einzelne Zellen werden unter Verwendung eines SSC-H- und SSC-A-Diagramms gesteuert. (D). Das Singulett-Gatter wird dann auf ein Diagramm von lebend-totem Ghost540 gegen SSC-A angewendet; Das Gating auf Ghost540-negativen Zellen eliminiert nicht lebensfähige Zellen aus der nachfolgenden Analyse. (E) Lebende Zellen werden auf CD19 im Vergleich zu SSC-A analysiert, und CD19-negative Zellen (Nicht-B-Zellen) werden angesteuert. (F) Die CD19-negativen Zellen werden auf CD4- und CD8-Färbung untersucht. (G) CD4+ -Zellen werden dann angesteuert, um die Zeit im Vergleich zu Indo-1 (kalziumgebunden) zu visualisieren. (H) Ein Zeitpunkt wird ausgewählt, um die Initiierung der Kalziumeinstromantwort nach der Zugabe von Anti-CD3-Antikörpern darzustellen, indem die Fluoreszenz von Indo-1 (kalziumfrei) im Vergleich zu Indo-1 (kalziumgebunden) visualisiert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Visualisierung der Indo-1-Fluoreszenz in Gated Populations von murinen Thymozyten zu diskreten Zeitpunkten in der Kalziumantwort. Die Gesamtthymozyten wurden mit Anti-CD3-Antikörpern stimuliert, gefolgt von Ionomycin nach 6 min der Probenentnahme. Zu vier diskreten Zeitpunkten, wie in den rechteckigen Kästchen in den zweidimensionalen Zeitdiagrammen im Vergleich zu Indo-1 (kalziumgebunden) angegeben, wurden verschiedene Subpopulationen von Thymozyten auf Kalziumantworten untersucht. (A) Zweidimensionale Diagramme, die das Gating für das Indo-1-Basissignal, die Peak-Antwort, die 5-Minuten-Post-Peak-Antwort und die Reaktion auf Ionomycin zeigen. Unten ist die CD4- versus CD8-Färbung (links) und die Darstellung von Indo-1 (calciumfrei) versus Indo-1 (calciumgebunden) auf einzelnen CD4-Thymozyten mit Gated gezeigt. (B) Diagramme von Indo-1 (kalziumfrei) versus Indo-1 (kalziumgebunden) auf gated Untergruppen von Thymozyten sind zu jedem der vier Zeitpunkte unter Verwendung der in (A) gezeigten Gating-Strategie dargestellt. (C) Es wurden zweidimensionale Diagramme erstellt, die die Färbung der Gesamtthymozyten mit den angegebenen Antikörpern zeigen. Spezifische Subpopulationen wurden eingeschaltet (obere Reihe) und auf Kalziumreaktionen über die Zeit (unten) untersucht. Hellblaue (SP) CD8+-Population, rote (SP) CD4-Population, die den größten Zustrom von Kalzium aufweist, orangefarbene CD4+CD8+-Doppel-positive Thymozyten, dunkelgrüne iNKT-Zellen, hellgrüne CD25+, violette TCRγδ+ T-Zellen und schwarze CD19+ B-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Hemmung der Calciumantwort in CD8+ T-Zellen, die mit einem niedermolekularen Inhibitor von ITK/RLK behandelt wurden. Während der Indo-1-Farbstoffbeladung wurden die Splenozyten mit zwei Dosen PRN694, 100 nM (dunkelgrau) und 200 nM (hellgrau), behandelt. (A) Das Indo-1-Verhältnis (kalziumgebunden/kalziumfrei) wird für unbehandelte Zellen (rot) und Zellen, die mit PRN694 behandelt wurden, über der Zeit dargestellt. Die Kurven zeigen die Kalziumantwort von kontrollierten CD8+ T-Zellen. Die schwarze Linie stellt die Negativkontrolle von Splenozyten dar, die mit Indo-1 beladen und oberflächengefärbt, aber nicht mit Anti-CD3-Antikörpern stimuliert wurden. (B,C) Die Daten können analysiert werden, indem die in (A) gezeigte Zeitachse in acht Segmente unterteilt wird, die mit schwarzen gepunkteten Linien visualisiert werden, und die Fläche unter der Kurve (AUC) (B) oder die Steigung jeder Kurve (Steigung) (C) in jedem Zeitintervall der Antwortvariablen berechnet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt einen optimierten Assay zur Messung von Kalziumantworten in primären murinen T-Zellen, die mit titriertem Indo-1-ratiometrischem Indikatorfarbstoff unter Verwendung der Vollspektrum-Durchflusszytometrie beladen sind 7,8. Der Vorteil der Durchführung von Calciumfluss-Assays mit Vollspektrum-Durchflusszytometrie ist die Möglichkeit, die Färbung von Oberflächenzellmarkern in Kombination mit der Beurteilung der Indo-1-Fluoreszenz zu multiplexen. Die Vollspektrum-Durchflusszytometrie hat den Vorteil, dass sie die Verwendung stark überlappender Farbstoffe ermöglicht, wodurch die Anzahl der Marker erhöht wird, die in einem Panel verwendet werden können. Dies liegt daran, dass das Vollspektrum-Durchflusszytometer das gesamte Laserlicht, das über eine Reihe von Detektoren emittiert wird, für jede analysierte Probe sammelt, anstatt einen Detektor für ein Fluorochrom zu haben. Die Verwendung des gesamten Spektrums jedes Fluores ermöglicht eine höhere Empfindlichkeit des Assays und bietet die Möglichkeit, spektral einzigartige Fluorochrome zu identifizieren, die überlappende Signale aufweisen würden, wenn sie mit einem Bandpass-Durchflusszytometer erfasst würden. Dadurch entfällt auch die Notwendigkeit einer Vorisolierung einer zu untersuchenden Zelluntergruppe.
In dieser Studie wurde eine Reihe von Zelloberflächenmarkern mit Fluorochrom-konjugierten Antikörpern untersucht. Dieses Panel umfasste αCD4-APC-Cy7, αCD8-FITC, αCD19-PE, αTCRβ-PerCP-Cy5.5, α-TCRδ-PE-Cy5, αCD25-PE-Cy7 und CD1d-αgal-cer-Tetramer-APC; Darüber hinaus enthielt das Panel den lebend toten Farbstoff Ghost540. Der optimale Kanal zum Nachweis jedes dieser Fluorochrome ist in der Bedienungsanleitung des Vollspektrum-Durchflusszytometers13 enthalten. Im Gegensatz dazu wurde die Detektion von Indo-1 (calciumfrei) und Indo-1 (calciumgebunden) empirisch bestimmt, wobei ein ungefährer Peakkanal für die Detektion jeder Fluoreszenzsignatur auf der Grundlage der bekannten Peak-Emissionswellenlängen für die beiden Formen von Indo-1 geschätzt wurde. Es ist auch möglich, die Spitzenemissionswellenlängen von Bandpassfilterwellenlängen, die auf herkömmlichen Durchflusszytometern verwendet und in nm gemessen werden, in ihre jeweiligen Kanäle auf den Avalanche-Photodioden-Detektoren (APD) umzuwandeln, die vom Vollspektrum-Durchflusszytometer verwendet werden. Dies kann auch eine Abschätzung der optimalen Kanäle zum Nachweis von Indo-1 (kalziumfrei) bzw. Indo-1 (kalziumgebunden) liefern. Da für jede Fluoreszenzmarkierung einzelne gefärbte Kontrollen enthalten sind, werden die Fluoreszenzsignaturen durch den Entmischungsprozess entwirrt, was die Visualisierung der Intensität jedes Fluorochroms auf den Zellen in jeder Probe ermöglicht. Wie in dieser Methode beschrieben, kann die Datenanalyse durchgeführt werden, indem die interessierenden Zelluntergruppen angehängt und das Verhältnis von Indo-1 (kalziumfrei) und Indo-1 (kalziumgebunden) über die Zeit visualisiert wird.
Es gibt Einschränkungen dieses Assays. So erlaubten beispielsweise Konzentrationen von Indo-1 unter 3 μM keine erfolgreiche Visualisierung der Kalziumeinstromantwort in T-Zellen. Da dieser Assay auch Multiplexing-Messungen der Kalziumantwort mit der Analyse mehrerer Zelloberflächenmarker an heterogenen Zellpopulationen unter Verwendung der Vollspektrum-Durchflusszytometrie ermöglicht, ist es zwingend erforderlich, alle verwendeten fluoreszenzmarkierten Antikörper, einschließlich derjenigen, die für die einzelgefärbten Kontrollen verwendet wurden, sorgfältig zu titrieren. Dies ist wichtig für die erfolgreiche Implementierung des hochempfindlichen linearen Entmischungsalgorithmus14. Darüber hinaus konnte kein vollständiger zeitlicher Verlauf des Kalziumeinstroms für Zellsubpopulationen visualisiert werden, die weniger als 1% der untersuchten Gesamtpopulation ausmachen. Stattdessen erforderte eine Bewertung der Kalziumantwort in diesen seltenen Untergruppen eine alternative Analysestrategie unter Verwendung von Zeitpunkten15. Die Moment-in-Time-Analyse liefert Momentaufnahmen der Fluoreszenzsignale von Indo-1 (kalziumfrei) im Vergleich zu Indo-1 (kalziumgebunden) in diskreten Stadien der Kalziumantwort und nicht den gesamten zeitlichen Verlauf der Antwort. Schließlich ist es auch wichtig, die Grenzen der Verwendung von Einzeloberflächenmarkern zur Definition von Teilmengen von T-Zellen zu erkennen. Zum Beispiel reicht die Färbung von Thymozyten mit α-CD25-Antikörpern nicht aus, um CD4+-regulatorische T-Zellen von allen anderen Thymozytenpopulationen zu unterscheiden. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Mehrzahl der frühen Thymozyten-Vorläuferzellen (CD4-CD8-) auch CD2516 exprimiert. Dies ist wahrscheinlich der Grund für das Fehlen einer nachweisbaren Kalziumeinstromantwort in kontrollierten CD4+CD25+-Thymozyten.
Die Optimierung dieses Protokolls erforderte eine sorgfältige Bewertung mehrerer Variablen, die für den Erfolg der Assays entscheidend waren. Dazu gehören die Optimierung des spezifischen Klons des verwendeten Anti-CD3-Antikörpers, die Titration der optimalen Konzentration dieses Antikörpers und die Notwendigkeit einer Antikörpervernetzung mit dem traditionellen Biotin/Streptavidin-System. Für murine T-Zellen wurde festgestellt, dass die Konzentration von 30 μg/Probe für 6 x 106 Zellen in einem Volumen von 500 μl die minimale Menge an Antikörpern ist, die für eine optimale Kalziumantwort erforderlich ist. Interessanterweise wurden robuste Kalziumantworten mit dem Anti-CD3-Antikörper-Klon 17A2 beobachtet, nicht jedoch mit dem Klon 145-2C11; ferner war bei Verwendung des Klons 17A2 die Zugabe eines sekundären Vernetzungsreagenzes17 nicht erforderlich. Tests mit dem biotinylierten Anti-CD3-Klon 17A2 mit oder ohne Streptavidin zeigten keine Verstärkung der Calciumantwort in Gegenwart von Streptavidin-Vernetzung. Es ist möglich, dass dieser Antikörper Aggregate enthielt und dass diese Aggregate für die Stimulationswirkung des Antikörpers in Abwesenheit einer offensichtlichen Quervernetzung verantwortlich waren. Da diese Experimente jedoch über viele Monate hinweg mit verschiedenen Fläschchen dieses Anti-CD3-Antikörpers durchgeführt wurden, waren die erzielten Ergebnisse sehr gut reproduzierbar; Daher ist es unwahrscheinlich, dass die Fähigkeit dieses Antikörpers, T-Zellen zu stimulieren, zwischen den Anwendern variiert.
Robuste Kalziumantworten in primären T-Zellen erfordern es, die Zellen während der gesamten Probenaufnahme auf der biologischen Temperatur von 37 °C zu halten. Im Gegensatz dazu zeigen primäre B-Zellen bei Raumtemperatur eine Kalziumantwort auf Anti-IgM-Antikörper. Aufgrund der Empfindlichkeit der T-Zell-Kalziumreaktion auf die Temperatur ist es wichtig, sicherzustellen, dass jede Probe gleich behandelt wird. So muss jede Probe mit der gleichen Methode und für die gleiche Zeit auf 37 °C erwärmt werden. In Ermangelung dieser Konsistenz können Variationen in den Kalziumreaktionen beobachtet werden, die jedoch möglicherweise nicht auf biologisch relevante Unterschiede zwischen den Proben hinweisen.
Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll die Details der Durchführung von Calciumfluss-Assays basierend auf der Bewertung der Indo-1-Fluoreszenz mittels Vollspektrum-Durchflusszytometrie in Kombination mit Multiplex-Oberflächenzellmarkerfärbung. Die Methode ermöglicht es den Forschern, die Notwendigkeit der Isolierung oder Sortierung bestimmter Zellpopulationen vor der Markierung von Kalziumfarbstoffen zu vermeiden. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll eine zusätzliche Analysemethodik, die zur Visualisierung von Kalziumantworten zu diskreten Zeitpunkten innerhalb verschiedener Zellsubpopulationen verwendet wird. Die Moment-in-Time-Analyse kann erfolgreich auf seltene (<1 % der Gesamtzellpopulationen) angewendet werden, die sonst bei der Beurteilung der Gesamtheit der Kalziumantwortkurve nicht nachweisbar sind. In Zukunft könnte dieser Assay auf die Verwendung weiterer Fluorochrom-konjugierter Antikörper ausgeweitet werden, wobei die umfangreichen Möglichkeiten des Vollspektrum-Durchflusszytometers genutzt werden können.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Vielen Dank an unsere Kollegen bei Cytek für die kontinuierlichen Diskussionen über die vollständige spektralzytometrische Analyse mit der Aurora- und SpectroFlo-Software. Figuren wurden mit BioRender.com erstellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well TC treated plates | Cell Treat | 229111 | |
| 50 mL conical | Greiner Bio1 | 41-12-17-03 | 50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap |
| 5mL polysterene flow tubes | Corning | 352052 | |
| 5mL syringe | BD syringe | 309646 | plunger only is used sheith is discarded |
| 70uM filter | Greiner bio1 | 542070 | |
| aCD3 (17A2) | Biolegend | 100202 | |
| AKC lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Aurora Spectral Flowcytometer | https://cytekbio.com/pages/aurora | ||
| Bath Beads | coleparmer | Item # UX-06274-52 | |
| CD19 PE | Tonbo | 50-0193-U100 | |
| CD1d Tetramer APC | NIH | ||
| CD25 PECy7 | ebioscience | 15-0251 | |
| CD4 APC Cy7 | Tonbo | 25-0042-U100 | |
| CD8a FITC | ebioscience | 11-0081-85 | |
| Cell Incubator | Formal Scientific | ||
| Dissection Tools forceps | McKesson | #487593 | Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth |
| Dissection Tools Scissors | McKesson | #970135 | Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip |
| DPBS 1x | Gibco | 14190-136 | DPBS |
| EGTA | Fisher | NC1280093 | |
| FBS | Hyclond | SH30071.03 | lot AE29165301 |
| FlowJo Software | https://www.flowjo.com/ | ||
| Indo1-AM Ester Dye | ebioscience | 65-085-39 | Calcium Loading Dye |
| ionomycin | Millipore | 407951-1mg | |
| Live/Dead Ghost 540 | Tonbo | 13-0879-T100 | |
| Microcentrifuge tubes 1.7mL | Light Labs | A-7001 | |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
| PRN694 | Med Chem Express | Hy-12688 | |
| Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2) | Tonbo | 70-0161-M001 | FC Block |
| RPMI | Gibco | 1875093 | + phenol red |
| RPMI phenol free | Gibco | 11835030 | -phenol red |
| Table top centrifuge | Beckman Coulter | Allegra612 | |
| TCRβ PerCP Cy5.5 | ebioscience | 45-5961-82 | |
| TCRγ/δ Pe Cy5 | ebioscience | 15-5961-82 | |
| Vi-Cell Blu Reagent Pack | Product No: C06019 | Includes Tripan | |
| Vi-Cell Blu | Beckman Coulter | ||
| Waterbath | Fisher Brand Dry bath |
References
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