Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ثقافة طويلة الأجل ومراقبة Caenorhabditis elegans المعزولة على الوسائط الصلبة في الأجهزة متعددة الآبار

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64681
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, 2Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Pennsylvania

Summary

يظهر هنا بروتوكول محسن لزراعة الديدان الخيطية الفردية المعزولة على وسائط صلبة في أجهزة متعددة الآبار دقيقة الصنع. يسمح هذا النهج بمراقبة الحيوانات الفردية طوال حياتها لمجموعة متنوعة من الأنماط الظاهرية المتعلقة بالشيخوخة والصحة ، بما في ذلك النشاط وحجم الجسم وشكله وهندسة الحركة والبقاء على قيد الحياة.

Abstract

تعد الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans من بين أكثر الأنظمة النموذجية شيوعا المستخدمة في أبحاث الشيخوخة نظرا لتقنيات الاستزراع البسيطة وغير المكلفة ، ودورة التكاثر السريع (~ 3 أيام) ، والعمر القصير (~ 3 أسابيع) ، والعديد من الأدوات المتاحة للتلاعب الجيني والتحليل الجزيئي. النهج الأكثر شيوعا لإجراء دراسات الشيخوخة في C. elegans ، بما في ذلك تحليل البقاء على قيد الحياة ، ينطوي على زراعة مجموعات من عشرات إلى مئات الحيوانات معا على وسائط نمو الديدان الخيطية الصلبة (NGM) في لوحات بتري. بينما يجمع هذا النهج بيانات عن مجموعة من الحيوانات ، فإن معظم البروتوكولات لا تتعقب الحيوانات الفردية بمرور الوقت. يظهر هنا بروتوكول محسن للاستزراع طويل الأجل للحيوانات الفردية على أجهزة بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS) المصنعة تسمى WorMotels. يسمح كل جهاز باستزراع ما يصل إلى 240 حيوانا في آبار صغيرة تحتوي على NGM ، مع عزل كل بئر بواسطة خندق يحتوي على كبريتات النحاس يمنع الحيوانات من الفرار. بناء على وصف WorMotel الأصلي ، توفر هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لقولبة كل جهاز وإعداده وتعبئته ، مع وصف للمضاعفات الفنية الشائعة ونصائح لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. ضمن هذا البروتوكول ، توجد تقنيات للتحميل المتسق ل NGM صغير الحجم ، والتجفيف المتسق لكل من NGM والأغذية البكتيرية ، وخيارات لتقديم التدخلات الدوائية ، والتعليمات والقيود العملية لإعادة استخدام أجهزة PDMS ، ونصائح لتقليل الجفاف ، حتى في البيئات منخفضة الرطوبة. تسمح هذه التقنية بالمراقبة الطولية لمختلف المعلمات الفسيولوجية ، بما في ذلك النشاط المحفز ، والنشاط غير المحفز ، وحجم الجسم ، وهندسة الحركة ، والعمر الصحي ، والبقاء على قيد الحياة ، في بيئة مشابهة للتقنية القياسية للثقافة الجماعية على الوسائط الصلبة في ألواح بتري. تتوافق هذه الطريقة مع جمع البيانات عالية الإنتاجية عند استخدامها جنبا إلى جنب مع برامج الفحص المجهري والتحليل الآلي. أخيرا ، تمت مناقشة قيود هذه التقنية ، بالإضافة إلى مقارنة هذا النهج بطريقة تم تطويرها مؤخرا تستخدم الصواني الدقيقة لاستزراع الديدان الخيطية المعزولة على الوسائط الصلبة.

Introduction

يشيع استخدام Caenorhabditis elegans في دراسات الشيخوخة بسبب وقت جيلها القصير (حوالي 3 أيام) ، وقصر عمرها (حوالي 3 أسابيع) ، وسهولة الزراعة في المختبر ، ودرجة عالية من الحفظ التطوري للعمليات الجزيئية والمسارات مع الثدييات ، والتوافر الواسع لتقنيات التلاعب الجيني. في سياق دراسات الشيخوخة ، تسمح C. elegans بالتوليد السريع لبيانات طول العمر والسكان المسنين لتحليل الأنماط الظاهرية المتأخرة في الحيوانات الحية. يتضمن النهج النموذجي لإجراء دراسات شيخوخة الديدان القياس اليدوي لعمر مجموعة من الديدان المحفوظة في مجموعات من 20 إلى 70 حيوانا على وسائط نمو نيماتودا أجار صلبة (NGM) في ألواح بتري 6 سم1. يسمح استخدام المجموعات المتزامنة مع العمر بقياس العمر أو الأنماط الظاهرية المستعرضة في الحيوانات الفردية عبر السكان ، ولكن هذه الطريقة تمنع مراقبة خصائص الحيوانات الفردية بمرور الوقت. هذا النهج هو أيضا كثيفة العمالة ، وبالتالي تقييد حجم السكان الذين يمكن اختبارهم.

هناك عدد محدود من طرق الاستزراع التي تسمح بالمراقبة الطولية ل C. elegans الفردية طوال حياتها ، ولكل منها مجموعة مميزة من المزايا والعيوب. تسمح أجهزة الموائع الدقيقة ، بما في ذلك WormFarm2 و NemaLife3 وشريحة "السلوك"4 ، من بين أجهزة أخرى5،6،7 ، بمراقبة الحيوانات الفردية بمرور الوقت. وبالمثل ، فإن استزراع الديدان في الاستزراع السائل باستخدام ألواح متعددة الآبار يسمح بمراقبة الحيوانات الفردية أو مجموعات صغيرة من C. elegans بمرور الوقت 8,9. تمثل البيئة السائلة سياقا بيئيا متميزا عن بيئة الثقافة الشائعة على الوسائط الصلبة في ألواح بتري ، والتي يمكن أن تغير جوانب فسيولوجيا الحيوان ذات الصلة بالشيخوخة ، بما في ذلك محتوى الدهون والتعبير عن جينات الاستجابة للإجهاد10،11. القدرة على مقارنة هذه الدراسات مباشرة بغالبية البيانات التي تم جمعها عن الشيخوخة C. elegans محدودة بسبب الاختلافات في المتغيرات البيئية المهمة المحتملة. Worm Corral12 هو أحد الأساليب التي تم تطويرها لإيواء الحيوانات الفردية في بيئة تكرر بشكل أوثق ثقافة الوسائط الصلبة النموذجية. يحتوي Worm Corral على غرفة محكمة الغلق لكل على شريحة مجهرية باستخدام هيدروجيل ، مما يسمح بالمراقبة الطولية للحيوانات المعزولة. تستخدم هذه الطريقة التصوير القياسي برايت فيلد لتسجيل البيانات المورفولوجية ، مثل حجم الجسم ونشاطه. ومع ذلك ، يتم وضع الحيوانات في بيئة هيدروجيل كأجنة ، حيث تظل دون إزعاج طوال حياتها. وهذا يتطلب استخدام خلفيات وراثية متحولة أو محورة وراثيا معقمة مشروطا ، مما يحد من القدرة على الفحص الجيني ، حيث يجب عبور كل طفرة جديدة أو جين تحوير إلى خلفية ذات عقم مشروط ، والقدرة على فحص الأدوية ، حيث لا يمكن تطبيق العلاجات إلا مرة واحدة على الحيوانات كأجنة.

تسمح طريقة بديلة طورها مختبر Fang-Yen بزراعة الديدان على الوسائط الصلبة في الآبار الفردية لجهاز polydimethylsiloxane (PDMS) الدقيق يسمى WorMotel13,14. يتم وضع كل جهاز في صينية بئر واحدة (أي بنفس أبعاد لوحة 96 بئرا) ويحتوي على 240 بئرا مفصولة بخندق مملوء بمحلول مكروه لمنع الديدان من الانتقال بين الآبار. يمكن لكل بئر إيواء دودة واحدة طوال فترة حياتها. الجهاز محاط بكريات جل بولي أكريلاميد الممتصة للماء (يشار إليها باسم "بلورات الماء") ، ويتم إغلاق الدرج بفيلم مختبر Parafilm للحفاظ على الرطوبة وتقليل جفاف الوسائط. يسمح هذا النظام بجمع بيانات الصحة والعمر للحيوانات الفردية ، في حين أن استخدام الوسائط الصلبة يلخص بشكل أفضل البيئة التي تعاني منها الحيوانات في الغالبية العظمى من دراسات عمر C. elegans المنشورة ، مما يسمح بمزيد من المقارنات المباشرة. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير تقنية مماثلة باستخدام صواني البوليسترين الدقيقة التي كانت تستخدم في الأصل لمقايسات السمية المجهرية15 بدلا من جهاز PDMS16. تسمح طريقة microtray بجمع البيانات الفردية للديدان المستزرعة على وسائط صلبة وقد حسنت القدرة على احتواء الديدان في ظل ظروف من شأنها أن تسبب عادة الفرار (على سبيل المثال ، الضغوطات أو القيود الغذائية) ، مع المفاضلة هي أن كل microtray يمكن أن تحتوي فقط على 96 حيوانا16 ، في حين أن الجهاز متعدد الآبار المستخدم هنا يمكن أن يحتوي على ما يصل إلى 240 حيوانا.

يظهر هنا بروتوكول مفصل لإعداد الأجهزة متعددة الآبار التي تم تحسينها من أجل الاتساق من لوحة إلى أخرى وإعداد أجهزة متعددة بالتوازي. تم تكييف هذا البروتوكول من البروتوكول الأصلي من مختبر Fang-Yen13. على وجه التحديد ، هناك أوصاف لتقنيات لتقليل التلوث ، وتحسين التجفيف المتسق لكل من الوسائط الصلبة ومصدر الغذاء البكتيري ، وتقديم RNAi والأدوية. يمكن استخدام هذا النظام لتتبع الصحة الفردية والعمر والأنماط الظاهرية الأخرى ، مثل حجم الجسم وشكله. تتوافق هذه الأجهزة متعددة الآبار مع الأنظمة عالية الإنتاجية الحالية لقياس العمر الافتراضي ، والتي يمكن أن تزيل الكثير من العمل اليدوي المتضمن في تجارب العمر التقليدية وتوفر الفرصة لقياس طول العمر الآلي والمباشر وتتبع الصحة في C. elegans الفردية على نطاق واسع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد حلول الأسهم والوسائط

ملاحظة: قبل البدء في إعداد الأجهزة متعددة الآبار ، قم بإعداد حلول ووسائط المخزون التالية.

  1. حلول المخزون لوسائط نمو الديدان الخيطية (NGM) و NGM منخفضة الذوبان (lmNGM):
    1. تحضير 1 M K 2 HPO4: أضف 174.18 جم من K2HPO4 إلى زجاجة سعة 1 لتر ، واملأها حتى 1 لتر بالماء منزوع الأيونات المعقم. الأوتوكلاف (121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة) لمدة 30 دقيقة ، ويخزن في درجة حرارة الغرفة (RT).
    2. تحضير 1 M KPi ، درجة الحموضة 6.0: أضف 136.09 جم من KH2HPO4 إلى زجاجة سعة 1 لتر ، واملأها حتى 1 لتر بالماء منزوع الأيونات المعقم. قم بالمعايرة باستخدام 1 M K2HPO4 إلى pH 6.0. الأوتوكلاف (121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة) لمدة 30 دقيقة ، ويخزن في RT.
    3. تحضير 1 م CaCl 2: أضف 73.5 جم من CaCl2 إلى زجاجة سعة 500 مل ، واملأها حتى 500 مل بالماء منزوع الأيونات المعقم. الأوتوكلاف (121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة) لمدة 30 دقيقة ، ويخزن في RT.
    4. تحضير 1 M MgSO 4: أضف 123.25 جم من MgSO4 إلى زجاجة سعة 500 مل ، واملأها حتى 500 مل بالماء منزوع الأيونات المعقم. الأوتوكلاف (121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة) لمدة 30 دقيقة ، ويخزن في RT.
    5. تحضير 5 ملغ / مل من الكوليسترول: الجمع بين 2.5 غرام من الكوليسترول ، 275 مل من الإيثانول 100 ٪ ، و 25 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم في زجاجة 500 مل العنبر. متجر في RT.
    6. تحضير 50 mM floxuridine: الجمع بين 0.1231 غرام من floxuridine و 10 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم في أنبوب مخروطي 15 مل. قم بتعقيمه بفلتر 0.22 ميكرومتر باستخدام حقنة سعة 10 مل. القسمة 1 مل لكل منها في 10 أنابيب طرد مركزي دقيقة ، وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    7. تحضير 50 مجم / مل كاربينيسيلين: في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، امزج 500 مجم من الكربينيسيلين مع 10 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم. قم بتعقيمه بفلتر 0.22 ميكرومتر باستخدام حقنة سعة 10 مل. القسمة 1 مل لكل منها في 10 أنابيب طرد مركزي دقيقة ، وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    8. تحضير 1 mM isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG): في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، ادمج 2.38 جم من IPTG مع 10 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم. قم بتعقيمه بفلتر 0.22 ميكرومتر باستخدام حقنة سعة 10 مل. القسمة 1 مل لكل منها في 10 أنابيب طرد مركزي دقيقة ، وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    9. تحضير 100 مجم / مل أمبيسلين: في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، امزج 1 جم من الأمبيسلين مع 10 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم. قم بتعقيمه بفلتر 0.22 ميكرومتر باستخدام حقنة سعة 10 مل. القسمة 1 مل لكل منها في 10 أنابيب طرد مركزي دقيقة ، وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  2. تحضير وسائط نمو الديدان الخيطية (NGM) للصيانة العامة ل C. elegans
    1. لصنع 50 طبقا ، في دورق سعة 1 لتر ، امزج 10 جم من أجار باكتو ، و 1.5 جم من كلوريد الصوديوم ، و 1.25 جم من ببتون باكتو ، و 486 مل من الماء عالي النقاء. الأوتوكلاف على دورة سائلة (121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة) لمدة 30 دقيقة على الأقل للتعقيم.
    2. بعد الأوتوكلاف ، بعد أن تبرد الوسائط إلى 55 درجة مئوية ، أضف 12.5 مل من 1 M KPi ، و 500 ميكرولتر من 1 M MgSO4 ، و 500 ميكرولتر من 1 M CaCl2 ، و 500 ميكرولتر من 5 مجم / مل كوليسترول.
    3. باستخدام تقنية معقمة ، صب 10 مل من الوسائط في كل لوحة 60 مم (إجمالي 50). بعد أن تصلب الوسائط (بعد 30 دقيقة على الأقل من الصب) ، ماصة 300 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية (المحضرة وفقا للخطوة 4 والخطوة 10) التي نمت بين عشية وضحاها في وسط اللوحة. اترك اللوحة على المقعد ، مما يسمح للثقافة البكتيرية أن تجف وتنمو أكثر سمكا (1-2 أيام). قم بتخزين الأطباق على حرارة 4 درجات مئوية.
  3. تحضير الخليط المسبق لوسائط نمو الديدان الخيطية منخفضة الذوبان (lmNGM):
    1. في دورق سعة 500 مل ، امزج 4 جم من الأغاروز منخفض الذوبان ، و 0.5 جم من باكتو ببتون ، و 195 مل من الماء عالي النقاء. الأوتوكلاف على دورة سائلة (121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة) لمدة 30 دقيقة على الأقل للتعقيم.
    2. بينما لا تزال الوسائط منصهرة ، قم بتوزيع 10 مل من القسمة في أنابيب اختبار زجاجية معقمة. أغلق كل أنبوب اختبار باستخدام Parafilm متبوعا بغطاء أنبوب اختبار للحفاظ على الخليط المسبق lmNGM ومنع الجفاف. سوف تصلب الوسائط ويمكن تخزينها لمدة ~ 2 أسابيع في RT قبل الاستخدام.
  4. تحضير 142.8 mM كلوريد الصوديوم: في زجاجة 250 مل ، امزج 0.8345 جم من كلوريد الصوديوم و 100 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم. الأوتوكلاف (121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة) لمدة 30 دقيقة ، ويخزن في RT.
  5. تحضير محلول المنظفات: في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، امزج 3 مل من Tween 20 و 7 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم. امزج جيدا ، وقم بتعقيمه بالفلتر باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر باستخدام حقنة سعة 10 مل ، وقم بتخزينه في RT.
  6. تحضير محلول كبريتات النحاس: في زجاجة معقمة سعة 50 مل ، امزج 20 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم ، و 0.5 جم من CuSO4 ، و 100 ميكرولتر من محلول المنظف (محضر في الخطوة 1.5). امزج حتى يذوب CuSO4 . متجر في RT.
  7. تحضير بلورات بولي أكريلاميد الممتصة للماء: في زجاجة ضغط آمنة للأوتوكلاف ، امزج 150 مل من الماء منزوع الأيونات و 1 جم من البوليمر فائق الامتصاص من النوع S. تخلط بلطف عن طريق قلب الزجاجة عدة مرات. الأوتوكلاف على دورة سائلة (121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة) لمدة 20 دقيقة على الأقل ، ويخزن في RT.
  8. تحضير مرق الليزوجيني (LB): في دورق سعة 1 لتر أو أكبر ، امزج 20 جم من مسحوق LB مع 1 لتر من الماء منزوع الأيونات. القسمة إلى كأسين زجاجية سعة 500 mL. الأوتوكلاف (121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة) لمدة 30 دقيقة ، ويخزن في RT
  9. تحضير لوحات أجار مرق ليسوجيني (LB):
    1. في دورق سعة 1 لتر ، امزج 10 جم من مسحوق LB و 7.5 جم من Bacto Agar و 500 مل من الماء منزوع الأيونات. الأوتوكلاف على دورة سائلة (121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة) لمدة 30 دقيقة.
    2. إذا رغبت في ذلك، يجب إضافة المضادات الحيوية الاختيارية (بعد الأوتوكلاف، بعد تبريد الوسائط إلى 55 درجة مئوية): 500 ميكرولتر من الأمبيسلين 100 ملغ/مل. باستخدام تقنية معقمة، صب 20 مل من الوسائط في كل لوحة 100 مم (إجمالي 25)، واحفظها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.

2. طباعة قالب جهاز متعدد الآبار 3D

ملاحظة: يتم تشكيل كل جهاز من PDMS باستخدام قالب مخصص مطبوع 3D. يمكن أن ينتج قالب واحد العديد من الأجهزة حسب الحاجة ؛ ومع ذلك ، في حالة محاولة إعداد أجهزة متعددة في نفس الوقت ، يلزم وجود قالب واحد مطبوع 3D لكل جهاز ليتم تصنيعه بالتوازي.

  1. قم بتنزيل ملف المحكمة الخاصة بلبنان (انظر الملف التكميلي 1).
  2. طباعة القالب مع طابعة 3D عالية الدقة.
    ملاحظة: يجب أن تكون دقة الطابعة عالية بما يكفي للسماح بأحجام ثابتة للبئر والخندق. دقة الطابعة المقترحة هي دقة XY لا تقل عن ~ 40 ميكرومتر ودقة طبقة تبلغ 28 ميكرومتر. المواد المستخدمة من قبل طابعة 3D لها نفس القدر من الأهمية ، حيث أن العديد من أنواع المواد ستمنع PDMS من المعالجة. من التجربة ، تعمل القوالب التي تنتجها طابعات PolyJet عالية الدقة (الدقة: المحور X = 600 نقطة في البوصة ، المحور Y = 600 نقطة في البوصة ، المحور Z = 1600 نقطة في البوصة) باستخدام مواد الطباعة Vero Black باستمرار. تم الاستعانة بمصادر خارجية للطباعة ثلاثية الأبعاد للقوالب المستخدمة في هذه الدراسة (يمكن العثور على تفاصيل الطباعة في جدول المواد).

3. إعداد جهاز متعدد الآبار

ملاحظة: يصف هذا القسم كيفية استخدام القالب المطبوع 3D لإنشاء جهاز PDMS متعدد الآبار.

  1. اضبطي فرن المعالجة على 55 درجة مئوية للسماح بالتسخين المسبق.
  2. حدد عدد الأجهزة المراد إعدادها دفعة واحدة. لكل جهاز ، امزج 60 جم من قاعدة PDMS و 6 جم من عامل المعالجة في وعاء وزن كبير يمكن التخلص منه (أو حاوية مماثلة يمكن التخلص منها) باستخدام ملعقة يمكن التخلص منها.
  3. ضع خليط PDMS في غرفة مفرغة لمدة 30 دقيقة عند −0.08 ميجا باسكال لإزالة الفقاعات.
  4. صب خليط PDMS في كل قالب مطبوع 3D. املأ القالب بالكامل ، مع امتداد خليط PDMS قليلا فوق الجزء العلوي من القالب. احتفظ بخليط PDMS الزائد لإعادة ملء القالب في حالة الانسكابات.
  5. ضع القالب المملوء وأي خليط PDMS إضافي في غرفة التفريغ لمدة 25 دقيقة عند −0.08 ميجا باسكال لإزالة أي فقاعات تم إنشاؤها أثناء عملية الصب.
  6. قم بإزالة القالب المملوء من غرفة التفريغ ، وقم بفرقعة أي فقاعات متبقية باستخدام ملعقة يمكن التخلص منها. استخدم الملعقة لتنظيف أي حطام مرئي أو فقاعات متبقية على حافة القالب بعيدا عن الآبار. يمكن أن تتداخل أي حطام أو فقاعات متبقية مع التصوير في الخطوات اللاحقة.
  7. تأكد من ملء القالب بالكامل بخليط PDMS ؛ من الشائع أن ينسكب جزء صغير من الخليط أثناء وجوده في غرفة التفريغ أو أثناء النقل. أعد التعبئة باستخدام خليط PDMS الإضافي الذي تم تفريغه في الخطوة 3.5. لا ينبغي أن يؤدي ذلك إلى إنشاء فقاعات ، ولكن إذا كان أي شكل ، فيمكن تنظيفها برفق إلى جانب القالب باستخدام الملعقة.
  8. ضع لوح أكريليك مسطح أعلى القالب المملوء ب PDMS عن طريق وضع حافة واحدة أولا وخفض الأخرى ببطء حتى يستقر الأكريليك بشكل مسطح فوق القالب ، مما يؤدي إلى إزاحة أي خليط PDMS يمتد فوق الحافة. إذا تشكلت فقاعات أثناء وضع لوح الأكريليك ، فقم بإزالة الأكريليك ببطء ، وأعد ملء القالب بخليط PDMS إذا لزم الأمر ، وأعد تشغيل موضع الأكريليك. ستشكل لوح الأكريليك قاعا مسطحا للجهاز المصبوب ويضمن أن جميع الآبار في نفس المستوى بالنسبة للقاعدة.
  9. ضع وزن 2.5 رطل فوق الأكريليك. يمكن تكديس قوالب متعددة ، لكل منها لوح أكريليك منفصل. ضعي القوالب المرجحة في الفرن واتركيها تلتئم على حرارة 55 درجة مئوية طوال الليل.
  10. في اليوم التالي ، قم بإزالة الأوزان والقوالب من الفرن.
  11. اعمل بعناية شفرة حلاقة بين الأكريليك و PDMS المعالج لكسر الختم. قم بإزالة الأكريليك بعناية من أعلى القالب. سيتم تعيين PDMS عند هذه النقطة ، ويمكن أن تستغرق إزالة الأكريليك بعض القوة.
  12. باستخدام ماكينة حلاقة أو ملعقة معدنية ، قم بفك جوانب PDMS المعالجة بعناية من القالب. من السهل تمزيق PDMS في هذه المرحلة ؛ اعمل ببطء ورفق حول الحافة لإزالة جهاز PDMS سليما.
    ملاحظة: القوالب المطبوعة حديثا لزجة بشكل خاص للاستخدامات الثلاثة الأولى ، وغالبا ما يتمزق PDMS أثناء محاولة إزالة الجهاز. مع المزيد من الاستخدامات ، يصبح من الأسهل إزالة PDMS المعالج من القالب.
  13. لف الجهاز بورق الألمنيوم ، وأغلقه بشريط الأوتوكلاف. الأوتوكلاف في دورة جافة لمدة 15 دقيقة على الأقل عند 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة للتعقيم. بعد التعقيم ، قم بتخزين الأجهزة المغلفة على المقعد ، واستخدمها حسب الحاجة.

4. خطوط البكتيريا

ملاحظة: ابدأ في تحضير البكتيريا التي سيتم استخدامها كمصدر غذاء للديدان أثناء وجودها على الجهاز متعدد الآبار. البكتيريا الأكثر شيوعا هي سلالة الإشريكية القولونية OP50 (أو سلالة HT115 لتجارب RNAi). أكمل هذه الخطوة قبل 2 أيام على الأقل من إضافة الديدان إلى الجهاز.

  1. ضع البكتيريا على طبق LB جديد. تأكد من تضمين أي إضافات انتقائية خاصة بالسلالة (على سبيل المثال ، الأمبيسلين لاختيار البلازميد الذي يمنح مقاومة الأمبيسلين للبكتيريا) في ألواح LB.
  2. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية طوال الليل (~ 18 ساعة) للسماح للمستعمرات بالنمو.

5. إعداد الجهاز متعدد الآبار لتحميل الوسائط

ملاحظة: سطح مادة PDMS المصنوعة من السيليكون التي يتكون منها الجهاز كاره للماء ، مما يمنع ملء الآبار الصغيرة الحجم والخنادق المكروهة ب NGM وكبريتات النحاس ، على التوالي. للتحايل على هذه المشكلة ، يتم استخدام بلازما الأكسجين لتعديل خصائص سطح الجهاز مؤقتا ليكون محبا للماء ، مما يسمح بملء الآبار والخندق في غضون فترة زمنية محدودة (تصل إلى ~ 2 ساعة). يوضح هذا القسم خطوات إكمال عملية تنظيف البلازما. أكمل هذه الخطوة على الأقل 1 يوم قبل اكتشاف آبار الجهاز بالبكتيريا ، حيث يمكن أن تتداخل الآثار المتبقية لتنظيف البلازما مع اكتشافها. بالنظر إلى توقيت الأقسام 5-7 ، فإن الحد العملي لهذه الخطوات لكل فني هو ثلاثة أجهزة بالتوازي.

  1. سخني حاضنة حمام حبة جافة إلى 90 درجة مئوية استعدادا للقسم 6.
  2. نظرا لأن إجمالي حجم الوسائط اللازم لملء آبار جهاز متعدد الآبار صغير مقارنة بألواح بتري ، قم بإعداد دفعة كبيرة من NGM ، وقم بقسمها في أنابيب اختبار (انظر الخطوة 1.3).
    ملاحظة: يمكن القيام بذلك في وقت مبكر ، حيث يمكن تخزين أنابيب الوسائط على مقاعد البدلاء لمدة ~ 2 أسابيع. إذا تم تحضير الوسائط ونقلها إلى أنابيب ، فانتقل إلى الخطوة 5.3.
  3. أثناء ارتداء القفازات ، قم بفك غلاف جهاز متعدد الآبار معقم ؛ تجنب لمس أي من الآبار. قم بقص شق صغير في الزاوية العلوية اليمنى من الجهاز للإشارة إلى عدد المرات التي تم فيها استخدامه / إعادة استخدامه (انظر القسم 15 أدناه للحصول على إرشادات وتوصيات لتنظيف وإعادة استخدام كل جهاز).
  4. ضع ما يصل إلى ثلاثة أجهزة غير مغلفة في منظف البلازما مع توجيه الآبار لأعلى. قم بتشغيل منظف البلازما.
    ملاحظة: التعليمات التفصيلية التالية خاصة بمنظف البلازما Plasma Etch PE-50. يجب تكييف الخطوات والإعدادات المحددة وربما إعادة تحسينها لمنظفات البلازما الأخرى.
    1. تأكد من ضبط مستوى طاقة منظف البلازما على 75٪.
    2. تأكد من أن صمامات التهوية والعزل كلاهما في وضع إيقاف التشغيل .
    3. افتح الصمام الرئيسي على خزان الأكسجين. انتظر حتى ينخفض ضغط المنظم إلى ما بين 15 رطل لكل بوصة مربعة و 20 رطل لكل بوصة مربعة ، ثم أدر صمام العزل إلى وضع التشغيل .
    4. قم بتشغيل مضخة التفريغ ومنظف البلازما.
    5. أدخل الإعدادات التالية على منظف البلازما (الاستخدام الأول)، أو تحقق من صحة الإعدادات المبرمجة مسبقا:
      وقت البلازما: 3:00 دقيقة
      نقطة ضبط الفراغ: 149.5 mTorr
      تنفيس الغلاف الجوي: 45 ثانية
      تنفيس التطهير: 5 ثوان
      استقرار الغاز: 15 ثانية
      إنذار الفراغ: 3:00 دقيقة
      إيقاف تشغيل الدورة تلقائيا: تشغيل
    6. اضغط على Enter للانتقال إلى قائمة الأوامر. استخدم مفتاح السهم لليمين لتحديد قائمة الإعداد، ثم اضغط على مفتاح الإدخال Enter. قم بالتمرير خلال جميع الإعدادات بالضغط على Enter لتأكيد كل إعداد حالي ثم السهم الأيمن للانتقال إلى الإعداد التالي.
    7. ارجع إلى قائمة الأوامر بالضغط على السهم لأعلى ثم السهم الأيسر.
    8. في شاشة قائمة الأوامر ، اضغط على مفتاح الإدخال Enter. حدد أوامر PLASMA بالضغط على Enter. سيتنقل النظام عبر المراحل التالية:
      ضخ البلازما
      استقرار الغاز: خلال هذه المرحلة ، اضبط مقبض Gas 1 على منظف البلازما حتى يصل مقياس التدفق إلى 10 سم مكعب / دقيقة.
      وقت البلازما
      تطهير الضخ
      دورة البلازما كاملة
      تنفيس الغرفة
      ملاحظة: يجب أن تستغرق هذه العملية حوالي 5-10 دقائق حتى تكتمل. عند اكتمال جميع المراحل ، يتم عرض قائمة الأوامر على الشاشة مرة أخرى. إذا لم ينخفض الضغط بدرجة كافية أثناء مرحلة ضخ البلازما ، فلن ينتقل منظف البلازما إلى المرحلة التالية ، وستعرض الشاشة رسالة خطأ. إذا حدث هذا ، تحقق من زيت مضخة التفريغ. إذا كانت مستويات الزيت منخفضة أو كان الزيت غائما / متسخا ، فإن تغيير الزيت يمكن أن يسمح لضغط الفراغ بالوصول إلى المستوى المطلوب.
    9. قم بإيقاف تشغيل الصمام الرئيسي على خزان الأكسجين.
    10. ببطء شديد ، أدر صمام التهوية إلى وضع التشغيل ، واسمح لضغط المنظم لخزان الأكسجين بالعودة إلى الصفر.
    11. أدر صمام العزل إلى وضع إيقاف التشغيل .
    12. قم بإيقاف تشغيل مضخة التفريغ ومنظف البلازما.
      ملاحظة: تعديل السطح المحب للماء للجهاز متعدد الآبار بواسطة منظف البلازما مؤقت ويصبح أقل فعالية تدريجيا بمرور الوقت (حتى حوالي 2 ساعة). تابع القسم 6 والقسم 7 في أسرع وقت ممكن.

6. ملء الآبار ب lmNGM

ملاحظة: يجب تشغيل حاضنة حمام الخرزة الجافة وتسخينها مسبقا من الخطوة 5.1. تأكد من وصول الحمام إلى 90 درجة مئوية.

  1. قم بتعقيم صينية بوليسترين واحدة ذات بئر واحد لكل جهاز عن طريق رش الجزء الداخلي من الدرج بإيثانول بنسبة 70٪ ومسحه جافا بمسح المهام.
  2. أخرج كل جهاز من منظف البلازما بيد قفاز ، وضعه في صينية نظيفة.
  3. ضع حوض ماصة سعة 25 مل يمكن التخلص منه في حاضنة حمام الخرز بعد تسخينه إلى 90 درجة مئوية.
  4. اجمع أنبوبا واحدا من الخليط المسبق lmNGM المتصلب لكل جهاز ليتم ملؤه (انظر الخطوة 1.3).
  5. ضع أنابيب اختبار lmNGM قبل الخليط في دورق زجاجي سعة 200 مل ، وقم بإزالة الأغطية و Parafilm. الميكروويف لمدة ~ 20 ثانية حتى تذوب الوسائط بدرجة كافية لتصب (وجود بعض الوسائط الصلبة جيد في هذه المرحلة).
  6. امزج الخليط المسبق lmNGM المنصهر من أنابيب اختبار متعددة في دورق آخر معقم سعة 200 مل. استمر في الميكروويف لمدة 20 ثانية إضافية لتصل إلى إجمالي 40 ثانية. إذا بدأ الخليط المسبق lmNGM في الغليان ، أوقف الميكروويف ، واترك الخليط المسبق lmNGM يستقر قبل المتابعة.
  7. قم بإزالة الخليط المنصهر lmNGM مسبقا من الميكروويف ، واتركه يبرد إلى ~ 60 درجة مئوية.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، سوف تبرد الوسائط وتعيد صلابتها بعد ~ 5 دقائق. انتقل فورا إلى الخطوة 6.8 والخطوة 6.9.
  8. لكل 10 مل من الخليط المسبق lmNGM ، أضف ما يلي (بالترتيب): 250 ميكرولتر من 1 M KPi ، 10 ميكرولتر من 1 M MgSO4 ، 10 ميكرولتر من 1 M CaCl2 ، و 10 ميكرولتر من 5 ملغ / مل كوليسترول.
    1. لمنع تفقيس البيض عند مراقبة البالغين على الجهاز ، أضف 10 ميكرولتر من 50 mM floxuridine.
    2. لاختيار بلازميد RNAi وللحث على التعبير عن الحمض النووي الريبي ، أضف 5 ميكرولتر من 50 مجم / مل كاربينيسيلين و 12 ميكرولتر من 1 mM IPTG.
      ملاحظة: يمكن تغيير المضادات الحيوية أو المواد المضافة الأخرى اعتمادا على تصميم التجربة. يمكن أيضا إضافة مركبات الاختبار / الأدوية إلى الوسائط في هذه المرحلة.
  9. صب lmNGM المنصهر في حوض 25 مل في حمام الخرز.
  10. املأ آبار الجهاز باستخدام lmNGM باستخدام ماصة مكرر متعدد القنوات سعة 200 ميكرولتر.
    1. اضبط المكرر لتوزيع حصص 14 ميكرولتر (يمكن الاستغناء عن 14 ميكرولتر حتى 14 مرة في حالة استخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر).
    2. قم بتركيب خمسة أطراف ماصة. آبار الجهاز لها نفس التباعد مثل لوحة 384 بئر. يتم تباعد الماصات القياسية متعددة القنوات بحيث يمكن للمستخدم ماصة في كل بئر أخرى في صف / عمود.
    3. قم بتحميل النصائح باستخدام lmNGM المنصهر. قم بتوزيع أول 14 ميكرولتر مرة أخرى في الحوض المحتوي على lmNGM.
    4. التحرك بسرعة ولكن بعناية ، قم بتوزيع 14 ميكرولتر في الآبار الداخلية (بيضاء في الشكل 1 ب) ، بدءا من تلك المميزة بعلامة "x" في الشكل 1B والانتقال عبر اللوحة إلى اليمين ثم لأسفل ، والاستغناء عن ما مجموعه 12 مرة (60 بئرا).
    5. قم بتوزيع lmNGM المتبقي مرة أخرى في الحوض ، حيث أن القسمة النهائية عادة ما تكون أقل من 14 ميكرولتر.
    6. كرر الخطوات 6.10.3-6.10.5 حتى يتم ملء جميع الآبار الداخلية.
    7. بعد ذلك ، اضبط المكرر على توزيع حصص 15 ميكرولتر. كرر الخطوات 6.10.3-6.10.5 ، ولكن بدلا من الآبار الداخلية ، املأ الحلقة الخارجية للآبار (رمادي في الشكل 1 ب) ، بدءا من الآبار المميزة بعلامة "+" في الشكل 1 ب والتحرك حول الحافة الخارجية للوحة.
      ملاحظة: اعمل بسرعة حتى لا تتجمد الوسائط في أطراف الماصة. تجنب انسكاب أي lmNGM في الخندق. تميل الآبار الخارجية إلى الجفاف بسرعة أكبر. يسمح 1 ميكرولتر إضافي من lmNGM للبئر المجفف النهائي أن يكون له سطح مستو في نفس وقت التجفيف مثل الآبار الداخلية.
  11. كخطوة لمراقبة الجودة ، افحص كل بئر لتحديد تلك التي بها عيوب قد تتداخل مع التصوير ، بما في ذلك الآبار غير المملوءة (سطح lmNGM غارق أسفل حافة البئر) ، مملوء بشكل مفرط (سطح lmNGM له قمة مقببة) ، وتحتوي على فقاعات أو حطام.
  12. قم بإزالة lmNGM المتصلب من الآبار غير المرضية باستخدام معول قصير من أسلاك البلاتين أو شفاط فراغ. أعد ملء الآبار الفارغة ب lmNGM المنصهر الطازج. أيضا ، قم بإزالة أي وسائط تفيض في الخندق باستخدام معول سلك بلاتيني قصير أو شفاط فراغ.

7. إضافة كبريتات النحاس إلى الخندق

ملاحظة: آبار هذا الجهاز محاطة بخندق مستمر. هنا ، يمتلئ الخندق بكبريتات النحاس ، التي تعمل كطارد وتردع الديدان عن الفرار من آبارها.

  1. باستخدام ماصة 200 ميكرولتر ، قم بتوزيع 200 ميكرولتر من محلول كبريتات النحاس (انظر الخطوة 1.6) في خندق الجهاز في كل زاوية ، 2x لكل زاوية. يجب أن يكون هذا حجما كبيرا بما يكفي لتدفق كبريتات النحاس عبر الخندق بأكمله. احرص على عدم ملء الخندق في أي وقت ؛ يجب ألا تلمس كبريتات النحاس السطح العلوي للآبار.
  2. إذا لم تتدفق كبريتات النحاس بسهولة عبر الخندق بأكمله ، فاستخدم معول سلك بلاتيني قصير للمساعدة في كسر التوتر وسحب كبريتات النحاس عبر الخندق.
  3. بعد أن تتدفق كبريتات النحاس عبر الخندق بأكمله ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من كبريتات النحاس من الخندق باستخدام ماصة 200 ميكرولتر أو شفط مع فراغ. ستكون البقايا المتبقية كافية لردع الديدان عن مغادرة آبارها. إن ترك الخندق مليئا بمحلول كبريتات النحاس يخاطر بتسرب كبريتات النحاس إلى الآبار ، مما قد يتسبب في فرار الديدان.

8. إضافة بلورات الماء المعقمة

ملاحظة: للحفاظ على الرطوبة داخل اللوحة ومنع جفاف lmNGM ، كل جهاز محاط ببلورات بولي أكريلاميد مشبعة تمتص الماء.

  1. تحضير بلورات الماء (انظر الخطوة 1.7).
  2. باستخدام زجاجة ضغط ، أضف بلورات الماء في الفراغات بين الجهاز وجدران الدرج. أغلق غطاء الدرج ، ولف الجوانب الأربعة بقطعة من Parafilm. أضف قطعتين إضافيتين من Parafilm لإغلاق اللوحة تماما.
    ملاحظة: يمكن تحضير بلورات الماء في دورق وغرفها في الدرج باستخدام ملعقة معقمة. ومع ذلك ، فإن هذا يضيف وقتا إلى الإجراء ويزيد من الوقت الذي يكون فيه كل درج مفتوحا ومعرضا للملوثات المحتملة.
  3. اترك الجهاز المختوم على المقعد حتى اليوم التالي عندما تكون البكتيريا جاهزة للرصد. تأكد من تخزين الأجهزة بحيث تكون الآبار متجهة لأعلى بعد إضافة lmNGM.

9. إعداد مجموعة متزامنة مع العمر من الديدان

ملاحظة: تنتج الخطوات التالية مجموعة متزامنة من الديدان الجاهزة للإضافة إلى الجهاز متعدد الآبار في المرحلة اليرقية الرابعة (L4). ومع ذلك ، يمكن أيضا إضافة الديدان في مراحل مختلفة من التطور. يجب إكمال هذه الخطوة قبل يومين من إضافة الديدان إلى الجهاز إذا كانت L4s مطلوبة. ضبط توقيت التزامن لمرحلة الحياة المطلوبة.

  1. لدراسات الشيخوخة المتسقة ، حافظ على C. elegans على ألواح NGM القياسية (انظر الخطوة 1.2 عند 20 درجة مئوية في ظل ظروف التغذية الجيدة).
  2. احصل على مجموعة متزامنة من الحيوانات من صفيحة مخزون عبر الطرق القياسية ، على سبيل المثال ، تبييض17 أو وضع البيضالموقوت 1.
  3. أضف البيض المعزول إلى طبق NGM المرقط بالبكتيريا. سوف يفقس البيض على هذه اللوحة ، وسوف تصل الديدان إلى مرحلة اليرقات L4 في 2 أيام للحيوانات البرية.

10. تلقيح الثقافة البكتيرية

ملاحظة: تستخدم البكتيريا كمصدر غذائي أساسي لسلالات C. elegans ، وأكثرها شيوعا سلالات الإشريكية القولونية OP50 أو HT115. تتركز البكتيريا 10 أضعاف ، والتي ينبغي حسابها في حجم الثقافة المعدة. قم بإعداد مزرعة بكتيرية في اليوم السابق لاكتشاف الجهاز.

  1. من لوحة LB المحضرة في الخطوة 4 ، اختر مستعمرة واحدة ، وقم بتلقيح 12 مل من LB المعقم لكل جهاز ليتم رصده. قم بتضمين عوامل انتقائية إذا لزم الأمر لسلالة البكتيريا المستخدمة.
  2. تنمو الثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها (~ 18 ساعة) في حاضنة 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند ~ 250 دورة في الدقيقة.

11. اكتشاف الآبار بالبكتيريا المركزة

ملاحظة: تتم إضافة كمية صغيرة من البكتيريا المركزة إلى كل بئر ، وهو ما يكفي لتغذية الديدان طوال عمرها على الجهاز. يجب تجفيف الثقافة البكتيرية قبل إضافة الديدان إلى الآبار. نظرا لأن حجم الوسائط في كل بئر صغير (14-15 ميكرولتر) بالنسبة لحجم البكتيريا المضافة (5 ميكرولتر) ، يمكن أن يؤثر المحتوى الكيميائي للوسائط البكتيرية على البيئة الكيميائية للبئر. لتفسير ذلك ، يتم تركيز البكتيريا وإعادة تعليقها في الماء المالح لإزالة LB المستنفد مع تجنب الإجهاد الناقص التناضح. لا يوجد ملح مضاف إلى وصفة lmNGM (انظر الخطوات 1.3-1.4) حيث يتم إضافته في هذه المرحلة.

  1. بعد زراعة البكتيريا بين عشية وضحاها كما هو موضح في القسم 10 ، ركز الثقافة البكتيرية 10x. قم بإذابة البكتيريا عن طريق الطرد المركزي عند ~ 3,400 × جم لمدة 20 دقيقة ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 1/10 من حجم الاستزراع الأصلي البالغ 142.8 mM NaCl (انظر الخطوة 1.4). على سبيل المثال ، لاكتشاف جهاز واحد يحتوي على 240 بئرا ، قم بتدوير 12 مل من المزرعة وإعادة التعليق في 1.2 مل من 142.8 مللي مول كلوريد الصوديوم.
    ملاحظة: يمكن إضافة مركبات الاختبار / الأدوية إلى الثقافة البكتيرية المعاد تعليقها قبل اكتشافها.
  2. باستخدام ماصة متكررة ، اكتشف كل بئر مع 5 ميكرولتر من البكتيريا المركزة. تجنب الاتصال المباشر بسطح lmNGM ، حيث يمكن لطرف الماصة أن يخترق lmNGM ويسمح للدودة بالحفر تحت سطح البئر. احرص على عدم ترك البكتيريا تتسرب إلى الخندق لأن الديدان ستنجذب إليه وتهرب إلى الخندق.
  3. جفف البكتيريا المرقطة مع إزالة أغطية الدرج. هذه الخطوة مهمة لسلامة بيئة البئر على المدى الطويل ، وهناك مجموعة متنوعة من الطرق لتجفيف الأجهزة المرقطة. مهما كانت الطريقة المستخدمة ، تأكد من بقاء الجهاز في بيئة معقمة ، حيث يحتاج إلى الجلوس مكشوفا أثناء جفاف البكتيريا. زيادة تدفق الهواء يقلل بشكل كبير من وقت التجفيف. يمكن إجراء التجفيف كما هو موضح في الخطوات أدناه:
    1. اترك الجهاز مكشوفا في حاوية نظيفة ومحكمة الغلق ، مثل صندوق بلاستيكي تم تنظيفه باستخدام مبيض بنسبة 10٪ ، متبوعا بنسبة 70٪ من الإيثانول. قد تستغرق طريقة التجفيف هذه عدة ساعات.
    2. ضع الأجهزة مكشوفة في غطاء تدفق رقائقي معقم (على غرار الطريقة المفضلة أدناه).
    3. قم بتجفيف الأجهزة باستخدام "صندوق تجفيف" مصمم خصيصا (الطريقة المثلى المتبعة في هذه الدراسة) ، والذي يمكن بناؤه بأقل تكلفة باستخدام مراوح علبة الكمبيوتر ومرشحات HEPA (انظر الملف التكميلي 1).
      ملاحظة: بغض النظر عن الطريقة المستخدمة ، يجب تحسين خطوة التجفيف للبيئة المحلية. راقب بشكل متكرر مدى سرعة جفاف الآبار حتى يتم تحديد وقت التجفيف النموذجي. في بيئة منخفضة الرطوبة ، يؤدي استخدام صندوق التجفيف إلى وقت تجفيف ~ 30-40 دقيقة. لا تدع الألواح تجف كثيرا ، لأن الوسائط الموجودة في الآبار سوف تتقلص وتغرق. من الأفضل إزالة الجهاز من الجفاف بينما لا تزال بعض الآبار رطبة بدلا من تركه يجف لفترة أطول وربما يفرط في تجفيف عدد كبير من الآبار.
  4. تحقق من بلورات الماء. إذا جفت غالبية بلورات الماء في الدرج وفقدت حجمها أثناء عملية التجفيف ، أضف المزيد إلى الدرج.
  5. بعد أن تجف البكتيريا ، أضف الديدان على الفور (القسم 12) أو أغلق الدرج لاستخدامه لاحقا. لإغلاق ، أغلق غطاء الدرج ، ولف الجوانب الأربعة بقطعة واحدة من Parafilm. كرر مرتين لما مجموعه ثلاث طبقات بارافيلم. بعد لف الدرج بالكامل ، يمكن ترك الجهاز على المقعد في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 4 أيام قبل إضافة الديدان (القسم 12).

12. إضافة الديدان إلى الجهاز متعدد الآبار

  1. أضف يدويا دودة واحدة لكل بئر إلى كل بئر باستخدام معول بلاتيني لنقل الحيوانات من ألواح الديدان المعدة في القسم 9. اختر فقط الديدان التي هي في مرحلة الحياة والعمر المطلوبين.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي أخذ أكثر من 1 ساعة لإضافة الديدان إلى الجهاز إلى جفاف lmNGM ، لذلك يجب إضافة الديدان في أسرع وقت ممكن. يمكن أن يساعد اختيار العديد من الديدان (20+) في وقت واحد قبل إضافتها إلى آبار الجهاز في زيادة السرعة.

13. الانتهاء من إعداد الجهاز للاستخدام على المدى الطويل

ملاحظة: تضمن هذه الخطوات بقاء آبار الجهاز رطبة طوال مدة التجربة.

  1. افحص بلورات الماء. تأكد من أن بلورات الماء مستوية مع الجزء العلوي من الجهاز ولكن لا تفيض عليه. أضف بلورات ماء إضافية إلى الدرج إذا لزم الأمر.
  2. أضف قطرة من محلول المنظف المحضر (انظر الخطوة 1.5) إلى داخل غطاء الدرج ، وافركه بمسح المهمة حتى يجف محلول المنظف. هذا يمنع الضباب على الغطاء بعد إغلاق الجهاز داخل الدرج بحيث تكون الديدان مرئية بوضوح.
  3. لف الصينية بثلاث قطع من Parafilm باستخدام تقنية محددة تعزز سلامة ختم Parafilm على المدى الطويل.
    1. قم بتمديد قطعة من Parafilm قليلا بحيث تغطي جانبين فقط من الدرج. كرر هذا مع قطعة ثانية من Parafilm لتغطية الجانبين الآخرين.
    2. ضع طبقات فوق الطبقة الأولى من Parafilm ، خذ قطعة أخيرة من Parafilm ، وقم بتمديدها بالكامل ، ولف الجوانب الأربعة. إذا تم إغلاقها بشكل صحيح ، يجب أن تظل آبار الجهاز رطبة لمدة ~ 2 أشهر.
      ملاحظة: يجب مراقبة سلامة Parafilm كل 1-2 أسابيع ، ويجب استبدال Parafilm في حالة كسره.
  4. قم بإزالة أي بصمات أصابع من أعلى الدرج باستخدام مسح مهمة مبلل بنسبة 70٪ من الإيثانول.

14. جمع البيانات

ملاحظة: الغرض من هذه الدراسة هو وصف منهجية الثقافة. بمجرد ملئها ، تتوافق الأجهزة متعددة الآبار مع المراقبة الطولية لمجموعة متنوعة من الأنماط الظاهرية. هنا ، يتم توفير إرشادات أساسية لقياس العديد من المعلمات الأكثر شيوعا.

  1. عمر: راقب العمر الافتراضي عن طريق النقر على اللوحة أو تعريض الديدان لضوء أزرق ساطع كل 1-3 أيام. سجل على أنه ميت إذا لم يتم ملاحظة أي حركة. تتوافق هذه الأجهزة متعددة الآبار أيضا مع خطوط أنابيب التصوير والتحليل الآلي لتقدير العمرالافتراضي 13,18.
  2. النشاط: راقب نشاط الحيوانات الفردية طوال الحياة عن طريق التقاط صور أو مقاطع فيديو ثابتة للحيوانات في آبار الجهاز وتقييم المسافة المقطوعة أو السرعة أو مقاييس الحركة الأخرى. تتوافق الأجهزة أيضا مع خطوط أنابيب التصوير والتحليل الآلي لتقدير النشاط13,18.
  3. حجم الجسم وشكله: مراقبة التغيرات في حجم الجسم وشكله عن طريق التقاط صور ثابتة للحيوانات في آبار الجهاز وتحديد المعلمات البصرية باستخدام تقنيات التصوير القياسية. من حيث المبدأ ، يجب أن تكون طريقة الاستزراع هذه متوافقة مع البرامج الحالية لإجراء تقييم أكثر تطورا لشكل جسم الدودة19،20،21.

15. إعادة استخدام الأجهزة

ملاحظة: بعد اكتمال التجربة ، يمكن تنظيف الأجهزة متعددة الآبار وإعادة استخدامها حتى ثلاث مرات. تبدأ إعادة الاستخدام الإضافية في التأثير على الأنماط الظاهرية للدودة ، والتي ربما تكون ناجمة عن مواد كيميائية من الوسائط أو البكتيريا المتراكمة في جدران مادة PDMS.

  1. تخلص من Parafilm ، وقم بإزالة الجهاز من الدرج. تحقق من الشقوق الموجودة في الزاوية العلوية اليمنى من الجهاز ، والتي تشير إلى عدد مرات استخدامه. إذا تم استخدامه ثلاث مرات ، فتخلص من الجهاز. إذا تم استخدامه أقل من ثلاث مرات ، فقم بتنظيفه وإعادة استخدامه.
    ملاحظة: الصواني مصنوعة من البوليسترين وليست ملامسة مباشرة ل lmNGM أو البكتيريا أو أي إضافات للوسائط. يمكن إعادة استخدامها عدة مرات طالما ظلت واضحة بصريا.
  2. اشطف أي بلورات ماء متبقية من الصينية. رش الجزء الداخلي من الدرج بمحلول تبييض بنسبة 10٪ ، واتركه لمدة 10 دقائق. اشطفه بالماء منزوع الأيونات وجففه على الفور لتجنب بقع الماء.
  3. أمسك الجهاز تحت الماء الجاري لبدء تنظيف الوسائط من الآبار. قم بثني الجهاز ولفه برفق تحت الماء للمساعدة في فك الوسائط من الآبار ، لكن لا تنحني حتى يتمزق الجهاز. اختر أي وسائط متبقية عالقة في الآبار بطرف ماصة سعة 200 ميكرولتر.
  4. املأ دورق سعة 2 لتر بقضيب تقليب ~ 3/4 ممتلئ بالماء منزوع الأيونات ، واتركه حتى يغلي على طبق ساخن.
  5. أضف جهازا أو جهازين متعددي الآبار وشريط تحريك إلى الماء المغلي. قم بتشغيل التحريك المغناطيسي إلى سرعة منخفضة (~ 200 دورة في الدقيقة) لتحريك الأجهزة في الماء برفق. اترك الأجهزة تغلي لمدة 10 دقائق.
  6. قم بإزالة الأجهزة من الماء باستخدام ملاقط معدنية ، وضعها بشكل جيد لأسفل على مناشف ورقية لتصريفها. اترك الأجهزة تجف على الأقل بين عشية وضحاها.
  7. عندما تجف الأجهزة تماما ، لفها بورق ، وختمها بشريط الأوتوكلاف. اكتب على شريط الأوتوكلاف عدد المرات التي تم فيها استخدام الجهاز. الأوتوكلاف في دورة جافة لمدة 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية للتعقيم. الأجهزة جاهزة الآن لإعادة الاستخدام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يمكن استخدام نظام ثقافة WorMotel لجمع مجموعة متنوعة من البيانات ، بما في ذلك ما يتعلق بالعمر الافتراضي والعمر الصحي والنشاط. استخدمت الدراسات المنشورة أجهزة متعددة الآبار لدراسة العمر والصحة 13،14 ، والسكون والنوم 22،23،24 ، والسلوك 25. يمكن تسجيل العمر يدويا أو من خلال مجموعة من الصور وتحليل التصوير النهائي. في النهج السابق ، يمكن ملاحظة الديدان يدويا بعد التحفيز (على سبيل المثال ، النقر على اللوحة أو التعرض للضوء الأزرق) كل 1-3 أيام وتسجيلها على أنها ميتة إذا لم يتم ملاحظة أي حركة ، على غرار الطرق القياسية على لوحات بتري1. النهج الأخير مشابه ، باستثناء أنه يمكن تحديد حركة الدودة من خلال مقارنة الاختلافات من إطار إلى إطار بين الصور التي تم التقاطها بعد تطبيق التحفيز. يوفر هذا فائدة إضافية في أن الحركة توفر معلومات عن مستوى نشاط الحيوانات الفردية في تلك النقطة الزمنية وتوفر مقياسا يمكن من خلاله تحديد العمر (على سبيل المثال ، وقف الحركة) والعمر الصحي (تم اقتراح تعريفات متعددة). يمكن استخدام الصور أيضا لاستخراج معلمات فسيولوجية إضافية مثل حجم الجسم وشكل الجسم ووضعية الجسم.

لإثبات قدرة النظام ، قمنا بفحص العلاقة الفوقانية الكلاسيكية بين مستقبل الأنسولين ، المشفر بواسطة الجين daf-2 ، وعامل النسخ العائلي FOXO في اتجاه مجرى النهر المشفر بواسطة daf-16 في سياق العمر ، والصحة ، والنشاط اليومي للحيوانات الفردية. فقدان الوظيفة من النوع البري (السلالة N2) و daf-16 (mu68) (السلالة CF1038) C. elegans التي تم تغذيتها بالإشريكية القولونية (السلالة HT115) معبرة عن أي عنصر تحكم (ناقل فارغ ؛ EV) أو daf-2 RNAi تم استزراع تركيبات التغذية في أجهزة متعددة الآبار ، وتم مراقبة كل لمدى الحياة (الشكل 2 أ) ، والعمر الصحي (الشكل 2 ب) ، والنشاط اليومي (الشكل 2 ج). تمت مراقبة النشاط يوميا عن طريق التقاط سلسلة من الصور الثابتة كل 5 ثوان لمدة 2 دقيقة ، مع تعرض الديدان للضوء الأزرق الساطع لمدة 5 ثوان في 1 دقيقة لتحفيز النشاط (وفقا ل Churgin et al.13). تم تقدير النشاط اليومي لكل من خلال تطبيع الخلفية عبر الآبار والصور ، وتحديد منطقة الدودة في كل صورة ، وحساب التغير في المنطقة بين الصور المجاورة. تم تعريف العمر على أنه العمر الذي لوحظ فيه آخر نشاط لكل دودة ، وتم تعريف healthspan على أنه العمر الذي لم تعد فيه الدودة قادرة على التحرك بطول كامل للجسم. كما هو متوقع من العديد من الدراسات السابقة (على سبيل المثال ، Kenyon et al.26 ، Murphy et al.27) ، أدت طفرة daf-16 (mu86) إلى عمر قصير ومنعت إطالة العمر من ضربة قاضية RNAi ل daf-2 (الشكل 2A). وقد لوحظ نمط مماثل ل healthspan (الشكل 2B). كميزة لاستخدام أنظمة الاستزراع متعددة الآبار ، فإن القدرة على تتبع الحيوانات الفردية طوال الحياة تسمح بإجراء تحليل مفصل للتباين الفردي في كل نمط ظاهري تم قياسه عبر السكان. على سبيل المثال ، يمكن مقارنة التباين في العمر والصحة عبر الحيوانات الفردية إما من حيث المطلق (الشكل 2 د) أو كجزء من إجمالي العمر (الشكل 2 ه). يمكن مقارنة الأنماط الظاهرية في وقت مبكر من الحياة بالأنماط الظاهرية في أواخر العمر ، بما في ذلك العمر ، في الحيوانات الفردية عبر السكان. على سبيل المثال ، يرتبط النشاط التراكمي لكل على حدة عبر العمر (أي المنطقة الواقعة تحت المنحنى [AUC] للنشاط الفردي) بشكل أفضل مع العمر (الشكل 2F) من العمر التراكمي حتى اليوم 5 من الحياة (الشكل 2G) عبر جميع الظروف المقاسة. نؤكد أن الغرض من هذا العمل هو توفير بروتوكول مفصل لبناء بيئة متعددة الآبار لتتبع الحيوانات الفردية بمرور الوقت ، وليس لقياس نمط ظاهري معين باستخدام الجهاز. تقدم النتائج التمثيلية الموضحة في الشكل 2 مثالا واحدا فقط على الأنماط الظاهرية التي يمكن قياسها في هذا النظام. بمجرد بنائها ، تتوافق البيئة متعددة الآبار مع مجموعة واسعة من التقنيات لقياس الأنماط الظاهرية للديدان الزاحفة الحرة على الوسائط الصلبة.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي للأجهزة متعددة الآبار الدقيقة . (أ) يتم استزراع C. elegans الفردية على منصات أغاروز صلبة منخفضة الذوبان (lmNGM) مزروعة بالأغذية البكتيرية في الآبار الفردية. يتم طلاء الفراغ بين الآبار بمادة كيميائية مكروهة (كبريتات النحاس) لعزل كل دودة داخل بئرها. يتم تأمين كل جهاز داخل صينية بئر واحدة. يمتلئ محيط الدرج ببلورات الماء للحفاظ على الرطوبة. الدرج مغلق ب Parafilm للسماح بتبادل الأكسجين. تم إنشاء الصورة باستخدام BioRender.com. (ب) نظرة عامة على جهاز الآبار المتعددة مع الإشارة إلى الترتيب المقترح لتحميل الآبار. تتلقى الآبار الداخلية (البيضاء) 14 ميكرولتر من lmNGM. تتلقى الآبار الخارجية (الرمادية) 15 ميكرولتر من lmNGM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: ارتباط الأنماط الظاهرية المقاسة عبر المجموعات في الحيوانات الفردية باستخدام أجهزة متعددة الآبار. توفر جميع اللوحات بيانات من نفس التجربة تقارن أربع مجموعات من الحيوانات: الحيوانات البرية (N2) الخاضعة للناقل الفارغ EV (RNAi) (N = 138) ، والحيوانات البرية الخاضعة ل daf-2 (RNAi) (N = 151) ، daf-16 (mu86) الحيوانات الخاضعة ل EV (RNAi) (N = 123) ، و daf-16 (mu86) الحيوانات الخاضعة ل daf-2 (RNAi ) (N = 135). (أ) يتم حظر امتداد العمر من daf-2 (RNAi) بواسطة طفرة daf-16 (mu86) الصفرية. الدلالة الزوجية بين المجموعات التي يحددها اختبار رتبة اللوغاريتم (دالة survdiff في R). (ب) يتم حظر الطفرة الصفرية daf-16 (mu86) التي تعرف هنا بأنها اليوم الذي لم يعد فيه الحيوان قادرا على تحريك امتداد طول الجسم بالكامل من daf-2 (RNAi) بواسطة طفرة daf-16 (mu86). الدلالة الزوجية بين المجموعات التي يحددها اختبار رتبة اللوغاريتم (دالة survdiff في R). (ج) يتم تقليل متوسط النشاط المتداول لمدة 3 أيام عبر العمر الافتراضي بواسطة كل من daf-16 (mu86) و daf-2 (RNAi). تم حساب الدلالة بواسطة اختبار Mann-Whitney U لمقارنة المنطقة الواقعة أسفل منحنى النشاط عبر العمر الافتراضي للحيوانات الفردية بين المجموعات. (د) العمر الصحي والعمر لكل مجتمع كقيم مطلقة (المتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط). (ه) العمر الصحي والعمر لكل مجموعة سكانية تمت تسويته إلى إجمالي العمر داخل كل مجموعة (المتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط). (F) يرتبط النشاط التراكمي عبر العمر (المنطقة الواقعة أسفل المنحنى [AUC] عبر العمر) للحيوانات الفردية بشكل أفضل مع العمر من (G) النشاط للحيوانات الفردية في أي يوم محدد عبر العمر (يظهر ارتباط النشاط في اليوم 8 ، والذي يمثل النقطة التي يتم فيها تعظيم متوسط النشاط) ، كما تم حسابه بواسطة الانحدار الخطي (دالة lm في R). n.s. = غير معنوي ، * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، *** p < 0.001. تم تعديل جميع القيم p لإجراء مقارنات متعددة باستخدام طريقة Bonferroni للمقارنات التي تتم داخل كل لوحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي 1: ملف STL لطباعة قالب الجهاز متعدد الآبار 3D الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعد نظام WorMotel أداة قوية لجمع البيانات الفردية لمئات من C. elegans المعزولة بمرور الوقت. بعد الدراسات السابقة التي استخدمت أجهزة متعددة الآبار للتطبيقات في السكون التنموي والسلوك الحركي والشيخوخة ، كان الهدف من هذا العمل هو تحسين إعداد الأجهزة متعددة الآبار للمراقبة طويلة الأجل للنشاط والصحة والعمر بطريقة إنتاجية أعلى. يوفر هذا العمل بروتوكولا مفصلا لإعداد أجهزة متعددة الآبار يحسن العديد من الخطوات من البروتوكول الأصلي13 ، ويسلط الضوء على النقاط الرئيسية التي قد تشكل صعوبات فنية ، ويوفر مناقشة حول إعادة استخدام الألواح والمواد الأخرى.

لأغراض التوسع - كمختبر يقوم حاليا بإعداد ما بين 10 و 20 جهازا في أسبوع نموذجي - كان الاعتبار الأول هو ما إذا كان يمكن إعادة استخدام الأجهزة ، وإذا كان الأمر كذلك ، فإلى أي درجة. هناك تكلفة أعلى من حيث الوقت والمال في إعداد أجهزة PDMS مقارنة بإجراء الثقافة التقليدية على لوحات بتري ، ولكن يمكن تقليل هذه التكاليف المرتفعة عن طريق إعادة استخدام PDMS أو المكونات الأخرى للنظام. مع العديد من عمليات إعادة الاستخدام ، بدأ PDMS في تطوير لون أصفر ، مما يعكس على الأرجح تراكم المركبات من وسائط lmNGM أو البكتيريا. كما أظهرت الحيوانات المستزرعة على هذه اللوحات معدلا أعلى من الفرار وانخفاض العمر. استنادا إلى عشرات التجارب ، هناك ثلاثة استخدامات مثالية لإعادة استخدام أجهزة PDMS هذه ، مما يسمح بتقييم الأنماط الظاهرية المرتبطة بالعمر دون تأثير قابل للقياس من تدهور PDMS مع تقليل عدد الأجهزة الجديدة التي تحتاج إلى تشكيل (وبالتالي توفير التكاليف). أكدنا كذلك أن الحيوانات المطابقة للتجارب التي نمت على الأجهزة في استخدامها الأول والثاني والثالث أنتجت منحنيات بقاء لا يمكن تمييزها تقريبا وغير مختلفة إحصائيا (البيانات غير معروضة). الصواني المستخدمة لاحتواء الأجهزة مصنوعة من البوليسترين ويمكن تنظيفها وإعادة استخدامها إلى أجل غير مسمى إذا ظلت خالية من الخدوش أو العلامات الأخرى التي قد تتداخل مع تصور الديدان.

يتمثل التحدي الرئيسي لإعداد أجهزة متعددة الآبار للتطبيقات التي تدوم أكثر من ~ 2 أسابيع في منع تلوث الألواح بالبكتيريا والفطريات البيئية. هناك العديد من الخطوات التي يكون فيها التعقيم أمرا بالغ الأهمية لمنع التلوث. وتشمل هذه تعقيم جميع الأجهزة قبل الاستخدام ، وغلي الأجهزة المعدة لإعادة الاستخدام ، وتعقيم بلورات الماء الماصة المستخدمة للحفاظ على الرطوبة ، وتنظيف الصواني التي تحتوي على الأجهزة بكل من المبيض والإيثانول قبل الاستخدام ، وتعقيم محلول المنظف الذي يتم تطبيقه على غطاء الدرج لمنع الضباب وإضافته إلى محلول كبريتات النحاس. أدى تنفيذ كل من هذه التغييرات بشكل ملحوظ إلى تقليل أحداث التلوث ، مما يسمح باستخدام الأجهزة المختومة باستمرار للمراقبة الطولية عبر العمر الافتراضي ، حتى في ظل ظروف طول العمر المؤيدة (على سبيل المثال ، خروج المغلوب من daf-2) التي تتطلب المراقبة لمدة >45 يوما. يتضمن البروتوكول الموصوف هنا تعديلين على البروتوكول الأصلي للتطبيقات طويلة الأجل المصممة للحفاظ على تجفيف الآبار بشكل متسق ومنع الجفاف. أولا ، تم زيادة العمق الكلي للجهاز بمقدار 2 مم لزيادة سعة بلورات الماء. على مدى التجارب الطويلة ، خاصة في بيئة منخفضة الرطوبة ، أدى عدد قليل جدا من بلورات الماء في الدرج إلى جفاف lmNGM. إلى جانب المزيد من بلورات الماء ، كان من الضروري زيادة حجم الأغاروز الذي تمت إضافته إلى الآبار على طول حافة الجهاز. تميل هذه الآبار إلى الجفاف أولا بعد تحميل البئر (القسم 6) والانكماش. كان استخدام 14 ميكرولتر من الأغاروز في الآبار الداخلية حجما كافيا لملء الآبار بالكامل دون إنشاء قمة مقببة ناتجة عن الإفراط في ملء الآبار. إن إضافة 15 ميكرولتر من الأغاروز إلى الآبار الخارجية وفر حجما كافيا ، عندما بدأت الآبار في الجفاف ، تقلصت إلى مستوى مماثل ل 14 ميكرولتر المضافة في الآبار الداخلية.

كان أحد أكبر الانحرافات عن البروتوكول الأصلي هو عكس الترتيب الذي يقوم به المستخدم بتحميل lmNGM (القسم 6) وكبريتات النحاس (القسم 7). في الأصل ، تمت إضافة كبريتات النحاس إلى الخندق أولا ، تليها ملء الآبار ب lmNGM13. وقد لوحظ أن ملء الآبار ب lmNGM في أقرب وقت ممكن بعد تنظيف البلازما قدر الإمكان يحسن التصاق lmNGM بجدران البئر. أدى الانتظار لفترة طويلة بعد تنظيف البلازما إلى آبار بها فقاعات وقمم مقببة ، والتي يمكن أن تتداخل مع تصور الديدان. يعد إعطاء الأولوية لملء الآبار على إضافة كبريتات النحاس أمرا مهما بشكل خاص عند تحضير أجهزة متعددة في نفس الوقت لضمان أسطح lmNGM متسقة وعالية الجودة. الجانب السلبي لملء الآبار أولا هو أن تعديل السطح المحب للماء الذي ينتجه منظف البلازما سوف يتلاشى بشكل ملحوظ بحلول الوقت الذي ينتقل فيه المستخدم إلى إضافة كبريتات النحاس. لا تتدفق كبريتات النحاس بسهولة عبر الخندق عندما يصبح السطح أقل محبة للماء ، مما يجعل من الصعب تحقيق تغطية كاملة. تؤدي إضافة المنظفات إلى محلول كبريتات النحاس ليكون بمثابة خافض للتوتر السطحي إلى تحسين تدفق المحلول عبر الخندق. يمكن أيضا استخدام معول سلك البلاتين لتوجيه كبريتات النحاس برفق عبر الخندق عن طريق كسر التوتر في أي نقاط تواجه فيها كبريتات النحاس صعوبة في التدفق. علاوة على ذلك ، إذا ترك محلول كبريتات النحاس في الخندق ، فسوف ينسكب بسهولة في الآبار ويلوث سطح lmNGM عند إمالة الدرج. تجعل طبيعة عملية التحميل من المستحيل تقريبا الحفاظ على مستوى الجهاز بشكل كاف طوال الوقت لمنع النحاس من تلويث مجموعة فرعية من الآبار. لحساب ذلك ، تتم إزالة محلول كبريتات النحاس من الخندق (الخطوة 7.3) ، وكبريتات النحاس المتبقية المتبقية كافية لردع معظم الديدان عن الفرار. كملاحظة أخيرة حول استخدام كبريتات النحاس كحاجز مكروه ، يمكن أن تؤثر بعض المواد الطاردة على الأنماط الظاهرية المرتبطة بالعمر ، بما في ذلك العمر. تم فحص استخدام كبريتات النحاس في هذه الأجهزة متعددة الآبار بواسطة Churgin et al.13 ووجد أنه ليس له تأثير يمكن اكتشافه على العمر الافتراضي أو التطور.

تركز التحديثات الطفيفة الأخرى للبروتوكول على تحسين الخطوات المتخذة لإعداد PDMS. تمت إضافة خطوة تفريغ إضافية بعد خلط قاعدة PDMS وعامل المعالجة ، لأن هذه عملية تولد العديد من الفقاعات. تؤدي إزالة غالبية الفقاعات قبل إضافة الخليط إلى قوالب الجهاز إلى تقليل الفقاعات المتبقية بعد خطوة التفريغ الثانية. للتأكد من أن الجزء السفلي من الجهاز مسطح تماما وحتى ، وهي ميزة مهمة لتصوير اللوحة بالكامل ، تم وضع قطعة من الزجاج أو الأكريليك عبر الجزء العلوي من القالب المملوء. هذه الخطوة ليست ضرورية - على الرغم من أنها لا تزال مفيدة - للتطبيقات التي تفحص بئرا واحدا فقط في كل مرة ، حيث يمكن للمستخدم ضبط التركيز يدويا لكل بئر. أخيرا ، كان من الضروري معالجة PDMS عند درجة حرارة أعلى (55 درجة مئوية) في الموقع الذي تم فيه تحسين هذا الإصدار من البروتوكول (توكسون ، أريزونا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، على عكس 40 درجة مئوية المشار إليها في البروتوكول الأصلي (الأمثل في فيلادلفيا ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). يشير هذا إلى أن الاختلافات بين المواقع (مثل المناخ أو الكواشف الدقيقة والمعدات المستخدمة) يمكن أن تؤثر على الخطوات المحددة في البروتوكول ، مثل درجة حرارة المعالجة أو تقنيات التجفيف ، وأن هذه قد تحتاج إلى تحسين في كل موقع. على سبيل المثال ، تلعب الرطوبة البيئية دورا كبيرا في تحديد وقت تجفيف الألواح بعد اكتشافها ، ويمكن أن يختلف هذا اختلافا كبيرا بين المواقع أو المواسم.

من حيث المبدأ ، يمكن استخدام نظام الجهاز متعدد الآبار هذا لجمع البيانات عن أي نمط ظاهري يمكن قياسه تحت المجهر القياسي برايت فيلد على ألواح بتري - العمر الافتراضي ، والعمر الصحي ، والحركة غير المحفزة / المحفزة ، وحجم الجسم وشكله ، وهندسة الحركة - مع القدرة الإضافية على تتبع تلك المقاييس للديدان الفردية بمرور الوقت. كما لوحظ في المقدمة ، هناك طرق أخرى للحصول على بيانات العمر الكامل الفردية. توفر أجهزة الموائع الدقيقة28 أو الألواح متعددة الآبار29 القدرة على متابعة تاريخ حياة الحيوانات الفردية ، ولكن فقط عن طريق زراعة الديدان في الوسائط السائلة. يمكن للبيئة السائلة أن تغير نسخ الديدان 10،11،30 بالنسبة إلى الوسائط الصلبة وتحفز تغييرات فسيولوجية وسلوكية مميزة ، بما في ذلك السباحة العرضية31 ، وزيادة إنفاق الطاقة 10،32 ، وارتفاع الإجهاد التأكسدي 10. درجة يمكن مقارنة العمر والمقاييس الأخرى المتعلقة بالشيخوخة الصحية مباشرة بين الوسائط السائلة والصلبة غير واضحة. تسمح الأجهزة متعددة الآبار ذات الثقافة الصلبة بتتبع دودة واحدة في بيئة يمكن مقارنتها بثقافة المجموعة القياسية على ألواح بتري. يسمح الهيكل المنحني لجدار الجهاز بتصوير الديدان في أي مكان داخل البئر ، مما يجعل هذه الأجهزة متوافقة ، من حيث المبدأ ، مع أدوات أكثر تطورا لتحليل الدودة الواحدة ، مثل Worm Tracker33.

يرافق القدرة على مراقبة الحيوانات الفردية طوال فترة التجربة على جهاز متعدد الآبار العديد من القيود. أولا ، حتى مع وجود بروتوكول محسن ، تتطلب هذه الأجهزة وقتا أطول لإعداد كل مقارنة بالثقافة القياسية على ألواح بتري ، وبالتالي توفير بيانات واحد على حساب الحجم الكلي للعينة. ومع ذلك ، يتم عزل الديدان أيضا في آبار فردية ، مما يزيل بعض المضاعفات المرتبطة بالقياس الآلي لعمر العمر ، مثل الكشف التلقائي عن الحيوانات الفردية التي تتوقف عن الحركة أثناء لمس بعضها البعض. تعمل الأتمتة أكثر من استعادة الوقت الضائع في الإعداد الأكثر تعقيدا وتوفر الفرصة لمزيد من الفحص عالي الإنتاجية13,18. ثانيا ، الظروف التجريبية التي تكرهها الديدان أكثر من خندق كبريتات النحاس ، مثل العوامل القوية المسببة للإجهاد (مثل الباراكوات) أو القيود الغذائية ، ستؤدي إلى هروب الديدان من الآبار إلى الخندق. ثالثا ، في حين أن أجهزة PDMS تسمح بالفحص المجهري للحقل الساطع والحقل المظلم ، فإن مادة PDMS تميل إلى أن يكون لها مضان خلفية مرتفع وغير متساو ، ومن المحتمل أن يكون الأخير ناتجا عن الغبار أو الجسيمات الدقيقة الأخرى التي تصبح مضمنة في PDMS أثناء التشكيل ، مما يحد من تطبيقها في الفحص المجهري الفلوري. أخيرا ، يشير تغير اللون الذي لوحظ في PDMS للأجهزة المعاد استخدامها خلال تجارب متعددة وما يرتبط به من انخفاض في العمر وزيادة في الهروب إلى أن مكونات الوسائط والمواد الكيميائية المضافة الأخرى تعلق في PDMS بمرور الوقت. ويجري حاليا استكشاف الدرجة التي قد يؤثر بها ذلك على الأنماط الظاهرية للشيخوخة أو العلاجات الدوائية. كما ذكرنا سابقا ، هناك طريقة بديلة لثقافة دودة واحدة تشبه أجهزة PDMS متعددة الآبار ولكنها تستخدم بدلا من ذلك صواني دقيقة متاحة تجاريا لاستزراع الحيوانات المعزولة16. هذه الصواني الدقيقة مصنوعة من البوليسترين ، مما يتجنب المشكلة المحتملة لمكونات وسائط الإمتصاص ، ولها خلفية مضان متسقة ، مما يسمح بالتصوير المباشر في الجسم الحي مباشرة على اللوحة. تحاط آبار microtray أيضا بحمض النخيل بدلا من كبريتات النحاس المستخدمة في البروتوكول الموصوف هنا ، وهو أكثر كرها ويقلل من جزء الديدان التي تترك آبارها ، حتى في حالة العوامل المسببة للإجهاد والقيود الغذائية. تتحقق هذه الفوائد على حساب انخفاض كفاءة تعبئة الآبار ، حيث تسمح الصواني الدقيقة بزراعة 96 دودة كحد أقصى في صينية واحدة على عكس سعة 240 دودة لأجهزة PDMS. ستؤثر تفاصيل النتيجة المرجوة من التجربة على أي من هذه الأنظمة يجب استخدامه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يذكر المؤلفون أنه ليس لديهم أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل NIH R35GM133588 إلى G.L.S. ، وهي جائزة محفز من الأكاديمية الوطنية الأمريكية للطب إلى G.L.S. ، وصندوق مبادرة التكنولوجيا والبحوث في ولاية أريزونا الذي يديره مجلس حكام أريزونا ، ومؤسسة إليسون الطبية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 lb weight CAP Barbell RP-002.5
Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) Falken Design ACRYLIC-CL-3-8/1224 Large sheet cut to smaller sizes 
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518
Autoclavable squeeze bottle Nalgene 2405-0500
Bacto agar BD Difco 214030
Bacto peptone Thermo Scientific 211677
Basin, 25 mL VWR 89094-664 Disposable pipette basin 
Cabinet style vacuum desiccator  SP Bel-Art F42400-4001 Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. 
CaCl2 Acros Organics 349615000
Caenorhabditis elegans N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Wildtype strain
Carbenicillin  GoldBio C-103-25
Centrifuge Beckman 360902
Cholesterol ICN Biomedicals Inc 101380
Compressed oxygen tank Airgas UN1072
CuSO4 Fisher Chemical C493-500
Dry bead bath incubator Fisher Scientific 11-718-2
Escherichia coli OP50  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Standard labratory food for C. elegans
Ethanol Millipore ex0276-4
Floxuridine Research Products International F10705-1.0
Hybridization oven Techne 731-0177 Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice
Incubators Shel Lab 2020 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria 
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) GoldBio I2481C100
K2HPO4 Fisher Chemical P288-500
KH2PO4 Fisher Chemical P286-1
Kimwipes KimTech 34155 Task wipes
LB Broth, Lennox BD Difco 240230
Low melt agarose Research Products International A20070-250.0
MgSO4 Fisher Chemical M-8900
Microwave  Sharp R-530DK
Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 Rainin 17013800 The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided
NaCl Fisher Bioreagents BP358-1
Nunc OmniTray Thermo Scientific 264728 Clear polystyrene trays
Parafilm M Fisher Scientific 13-374-10 Double-wide (4 in)
Petri plate, 100 mM  VWR 25384-342
Petri plate, 60 mM  Fisher Scientific FB0875713A
Plasma cleaner Plasma Etch, Inc. PE-50
PLATINUM vacuum pump JB Industries DV-142N 
PolyJet 3D printer Stratasys  Objet500 Connex3 PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi)
Shaking incubator Lab-Line 3526CC
smartSpatula LevGo, Inc. 17211 Disposable spatula
Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) M2 Polymer Technologies Type S Referred to in main text as "water crystals"
SYLGARD 184 Silicone Elastomer base The Dow Chemical Company 2065622
SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent The Dow Chemical Company 2085925
Syringe filter (0.22 µm) Nest Scientific USA Inc.  380111
Syringe, 10 mL  Fisher Scientific 14955453
TWEEN 20 Thermo Scientific J20605-AP Detergent
Vacuum pump oil VWR 54996-082
VeroBlackPlus Stratasys  RGD875 Rigid 3D printing filament
Weigh boat Thermo Scientific WB30304 Large enough for PDMS mixture volume

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
  2. Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
  3. Rahman, M., et al. NemaLife chip: A micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10, 16190 (2020).
  4. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  5. Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. Microfluidic devices for imaging and manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. Liu, X., Sun, Y. 13, Academic Press. Cambridge, MA. Chapter 13 295-321 (2021).
  6. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  7. Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9, 14340 (2019).
  8. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).
  9. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).
  10. Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).
  11. Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).
  12. Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
  13. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  14. Jushaj, A., et al. Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system. PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).
  15. Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
  16. Espejo, L., et al. Long-term culture of individual Caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
  17. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  18. Freitas, S. Worm Paparazzi - A high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. University of Arizona. , Tucson, USA. Master's thesis (2021).
  19. Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: High-throughput analysis of nematode size and shape. PLoS One. 8 (2), e57142 (2013).
  20. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , (2013).
  21. Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), 982437 (2014).
  22. Grubbs, J. J., vander Linden, A. M., Raizen, D. M. Regulation of sleep by KIN-29 is not developmental. microPublication Biology. 2020, (2020).
  23. Iannacone, M. J., et al. The RFamide receptor DMSR-1 regulates stress-induced sleep in C. elegans. eLife. 6, 19837 (2017).
  24. McClanahan, P. D., et al. A quiescent state following mild sensory arousal in Caenorhabditis elegans is potentiated by stress. Scientific Reports. 10, 4140 (2020).
  25. Churgin, M. A., McCloskey, R. J., Peters, E., Fang-Yen, C. Antagonistic serotonergic and octopaminergic neural circuits mediate food-dependent locomotory behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 37 (33), 7811-7823 (2017).
  26. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
  27. Murphy, C. T., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
  28. Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C . elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  29. Lionaki, E., Tavernarakis, N. High-throughput and longitudinal analysis of aging and senescent decline in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 965, 485-500 (2013).
  30. Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C. elegans under dietary restriction. The Journal of Experimental Biology. 209, 4129-4139 (2006).
  31. Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. The Journal of Experimental Biology. 211, 3703-3711 (2008).
  32. Hartman, J. H., et al. Swimming exercise and transient food deprivation in Caenorhabditis elegans promote mitochondrial maintenance and protect against chemical-induced mitotoxicity. Scientific Reports. 8, 8359 (2018).
  33. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).

Tags

التراجع، العدد 190،
ثقافة طويلة الأجل ومراقبة <em>Caenorhabditis elegans المعزولة</em> على الوسائط الصلبة في الأجهزة متعددة الآبار
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gardea, E. A., DeNicola, D.,… More

Gardea, E. A., DeNicola, D., Freitas, S., Peterson, W., Dang, H., Shuck, K., Fang-Yen, C., Sutphin, G. L. Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices. J. Vis. Exp. (190), e64681, doi:10.3791/64681 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter