Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Långtidsodling och övervakning av isolerade Caenorhabditis elegans på fasta medier i flerbrunnsenheter

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64681
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, 2Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Pennsylvania

Summary

Här presenteras ett optimerat protokoll för odling av isolerade enskilda nematoder på fasta medier i mikrofabricerade flerbrunnsanordningar. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för enskilda djur att övervakas under hela livet för en mängd olika fenotyper relaterade till åldrande och hälsa, inklusive aktivitet, kroppsstorlek och form, rörelsegeometri och överlevnad.

Abstract

Nematoden Caenorhabditis elegans är bland de vanligaste modellsystemen som används inom åldringsforskning på grund av dess enkla och billiga odlingstekniker, snabba reproduktionscykel (~3 dagar), korta livslängd (~3 veckor) och många tillgängliga verktyg för genetisk manipulation och molekylär analys. Det vanligaste tillvägagångssättet för att genomföra åldringsstudier i C. elegans, inklusive överlevnadsanalys, innebär odling av populationer av tiotals till hundratals djur tillsammans på fasta nematodtillväxtmedier (NGM) i Petri-plattor. Även om detta tillvägagångssätt samlar in data om en population av djur, spårar de flesta protokoll inte enskilda djur över tid. Här presenteras ett optimerat protokoll för långsiktig odling av enskilda djur på mikrofabricerade polydimetylsiloxanenheter (PDMS) som kallas WorMotels. Varje anordning gör det möjligt att odla upp till 240 djur i små brunnar som innehåller NGM, där varje brunn isoleras av en kopparsulfathaltig vallgrav som hindrar djuren från att fly. Baserat på den ursprungliga WorMotel-beskrivningen ger detta dokument ett detaljerat protokoll för gjutning, förberedelse och fyllning av varje enhet, med beskrivningar av vanliga tekniska komplikationer och råd för felsökning. Inom detta protokoll finns tekniker för konsekvent laddning av NGM med små volymer, konsekvent torkning av både NGM och bakteriemat, alternativ för att leverera farmakologiska ingrepp, instruktioner för och praktiska begränsningar för återanvändning av PDMS-enheter och tips för att minimera uttorkning, även i miljöer med låg luftfuktighet. Denna teknik möjliggör longitudinell övervakning av olika fysiologiska parametrar, inklusive stimulerad aktivitet, ostimulerad aktivitet, kroppsstorlek, rörelsegeometri, hälsospan och överlevnad, i en miljö som liknar standardtekniken för gruppkultur på fasta medier i Petri-plattor. Denna metod är kompatibel med datainsamling med hög genomströmning när den används tillsammans med automatiserad mikroskopi och analysprogramvara. Slutligen diskuteras begränsningarna med denna teknik, liksom en jämförelse av detta tillvägagångssätt med en nyligen utvecklad metod som använder mikrobrickor för att odla isolerade nematoder på fasta medier.

Introduction

Caenorhabditis elegans används ofta i åldrandestudier på grund av deras korta generationstid (cirka 3 dagar), korta livslängd (cirka 3 veckor), enkel odling i laboratoriet, hög grad av evolutionärt bevarande av molekylära processer och vägar med däggdjur och bred tillgänglighet av genetiska manipulationstekniker. I samband med åldrandestudier möjliggör C. elegans snabb generering av livslängdsdata och åldrade populationer för analys av sena fenotyper hos levande djur. Det typiska tillvägagångssättet för att genomföra maskåldringsstudier innefattar manuell mätning av livslängden hos en population av maskar som hålls i grupper om 20 till 70 djur på fasta agarnematodtillväxtmedier (NGM) i 6 cm Petri-plattor1. Genom att använda ålderssynkroniserade populationer kan man mäta livslängden eller tvärsnittsfenotyper hos enskilda djur över hela populationen, men denna metod utesluter övervakning av enskilda djurs egenskaper över tid. Detta tillvägagångssätt är också arbetsintensivt, vilket begränsar storleken på befolkningen som kan testas.

Det finns ett begränsat antal odlingsmetoder som möjliggör longitudinell övervakning av enskilda C. elegans under hela deras livslängd, och var och en har en distinkt uppsättning fördelar och nackdelar. Mikrofluidikanordningar, inklusive WormFarm2, NemaLife3 och "beteende" chip4, bland annat 5,6,7, möjliggör övervakning av enskilda djur över tid. Odling av maskar i flytande kultur med flerbrunnsplattor möjliggör på liknande sätt övervakning av antingen enskilda djur eller små populationer av C. elegans över tiden 8,9. Den flytande miljön representerar ett distinkt miljösammanhang från den vanliga odlingsmiljön på fasta medier i Petri-plattor, vilket kan förändra aspekter av djurfysiologi som är relevanta för åldrande, inklusive fettinnehåll och uttryck av stressresponsgener10,11. Möjligheten att direkt jämföra dessa studier med majoriteten av data som samlats in om åldrande C. elegans begränsas av skillnader i potentiellt viktiga miljövariabler. Worm Corral12 är ett tillvägagångssätt som utvecklats för att hysa enskilda djur i en miljö som närmare replikerar typisk solid mediekultur. Worm Corral innehåller en förseglad kammare för varje djur på ett mikroskopglas med hydrogel, vilket möjliggör longitudinell övervakning av isolerade djur. Denna metod använder standard ljusfältsavbildning för att registrera morfologiska data, såsom kroppsstorlek och aktivitet. Djur placeras dock i hydrogelmiljön som embryon, där de förblir ostörda under hela sin livslängd. Detta kräver användning av villkorligt steril mutant eller transgen genetisk bakgrund, vilket begränsar både kapaciteten för genetisk screening, eftersom varje ny mutation eller transgen måste korsas in i en bakgrund med villkorlig sterilitet, och kapaciteten för läkemedelsscreening, eftersom behandlingar endast kan tillämpas en gång på djuren som embryon.

En alternativ metod som utvecklats av Fang-Yen-laboratoriet möjliggör odling av maskar på fasta medier i enskilda brunnar i en mikrofabricerad polydimetylsiloxan (PDMS) -anordning som kallas WorMotel13,14. Varje enhet placeras i en bricka med en brunn (dvs. med samma dimensioner som en 96-brunnsplatta) och har 240 brunnar åtskilda av en vallgrav fylld med en aversiv lösning för att förhindra att maskarna reser mellan brunnar. Varje brunn kan hysa en enda mask under hela sin livslängd. Enheten är omgiven av vattenabsorberande polyakrylamidgelpellets (kallad "vattenkristaller") och brickan är förseglad med Parafilm laboratoriefilm för att bibehålla fuktigheten och minimera uttorkningen av mediet. Detta system gör det möjligt att samla in data om hälsa och livslängd för enskilda djur, medan användningen av fasta medier bättre rekapitulerar miljön som djuren upplever i de allra flesta publicerade C. elegans livslängdsstudier, vilket möjliggör mer direkta jämförelser. Nyligen har en liknande teknik utvecklats med användning av polystyrenmikrobrickor som ursprungligen användes för mikrocytotoxicitetsanalyser15 i stället för PDMS-enheten16. Mikrobrickmetoden möjliggör insamling av individualiserade data för maskar odlade på fasta medier och har förbättrad kapacitet för att innehålla maskar under förhållanden som vanligtvis skulle orsaka flykt (t.ex. stressorer eller kostbegränsning), med avvägningen att varje mikrobricka endast kan innehålla 96 djur16, medan multibrunnsenheten som används här kan innehålla upp till 240 djur.

Här presenteras ett detaljerat protokoll för beredning av flerbrunnsenheter som är optimerat för platt-till-platt-konsistens och förberedelse av flera enheter parallellt. Detta protokoll anpassades från det ursprungliga protokollet från Fang-Yen-laboratoriet13. Specifikt finns det beskrivningar för tekniker för att minimera kontaminering, optimera konsekvent torkning av både det fasta mediet och den bakteriella matkällan och leverera RNAi och läkemedel. Detta system kan användas för att spåra individuell hälsa, livslängd och andra fenotyper, såsom kroppsstorlek och form. Dessa multi-well-enheter är kompatibla med befintliga system med hög genomströmning för att mäta livslängden, vilket kan ta bort mycket av det manuella arbetet som är involverat i traditionella livslängdsexperiment och ge möjlighet till automatiserad, direkt livslängdsmätning och hälsospårning i enskilda C. elegans i stor skala.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av stamlösningar och media

OBS: Innan du börjar förbereda flerbrunnsanordningarna, förbered följande stamlösningar och media.

  1. Stamlösningar för tillväxtmedier för nematoder (NGM) och NGM med låg smältning (lmNGM):
    1. Bered 1 MK2 HPO4: Tillsätt 174,18 g K2HPO4 till en 1 L flaska och fyll den upp till 1 L med sterilt avjoniserat vatten. Autoklav (121 °C, 15 psig) i 30 minuter och förvaras i rumstemperatur (RT).
    2. Förbered 1 M KPi, pH 6,0: Tillsätt 136,09 g KH2HPO4 till en 1 L flaska och fyll den upp till 1 L med sterilt avjoniserat vatten. Titrera med 1 M K2HPO4 till pH 6,0. Autoklav (121 °C, 15 psig) i 30 minuter och förvaras vid rumstemperatur.
    3. Förbered 1 M CaCl 2: Tillsätt 73,5 g CaCl2 till en 500 ml flaska och fyll den upp till 500 ml med sterilt avjoniserat vatten. Autoklav (121 °C, 15 psig) i 30 minuter och förvaras vid rumstemperatur.
    4. Förbered 1 M MgSO4: Tillsätt 123,25 gMgSO4 till en 500 ml flaska och fyll den upp till 500 ml med sterilt avjoniserat vatten. Autoklav (121 °C, 15 psig) i 30 minuter och förvaras vid rumstemperatur.
    5. Förbered 5 mg / ml kolesterol: Kombinera 2,5 g kolesterol, 275 ml 100% etanol och 25 ml sterilt avjoniserat vatten i en 500 ml bärnstensfärgad flaska. Förvara på RT.
    6. Förbered 50 mM floxuridin: Kombinera 0,1231 g floxuridin och 10 ml sterilt avjoniserat vatten i ett 15 ml koniskt rör. Filtersterilisera det med ett 0,22 μm filter med en 10 ml spruta. Alikvot 1 ml vardera i 10 mikrocentrifugrör och förvara dem vid −20 °C.
    7. Förbered 50 mg / ml karbenicillin: I ett 15 ml koniskt rör, kombinera 500 mg karbenicillin med 10 ml sterilt avjoniserat vatten. Filtersterilisera det med ett 0,22 μm filter med en 10 ml spruta. Alikvot 1 ml vardera i 10 mikrocentrifugrör och förvara dem vid −20 °C.
    8. Förbered 1 mM isopropyl ß-D-1-tiogalaktospyranosid (IPTG): I ett 15 ml koniskt rör, kombinera 2,38 g IPTG med 10 ml sterilt avjoniserat vatten. Filtersterilisera det med ett 0,22 μm filter med en 10 ml spruta. Alikvot 1 ml vardera i 10 mikrocentrifugrör och förvara dem vid −20 °C.
    9. Förbered 100 mg / ml ampicillin: I ett 15 ml koniskt rör, kombinera 1 g ampicillin med 10 ml sterilt avjoniserat vatten. Filtersterilisera det med ett 0,22 μm filter med en 10 ml spruta. Alikvot 1 ml vardera i 10 mikrocentrifugrör och förvara dem vid −20 °C.
  2. Beredning av tillväxtmedier för nematoder (NGM) för allmänt underhåll av C. elegans
    1. För att göra 50 plattor, i en 1 L kolv, kombinera 10 g Bacto agar, 1,5 g NaCl, 1,25 g Bacto pepton och 486 ml ultrarent vatten. Autoklav i vätskecykel (121 °C, 15 psig) i minst 30 minuter för sterilisering.
    2. Efter autoklav, efter att mediet har svalnat till 55 °C, tillsätt 12,5 ml 1 M KPi, 500 μL 1 MMgSO4, 500 μL 1 MCaCl2 och 500 μL 5 mg/ml kolesterol.
    3. Häll 10 ml media i varje 60 mm platta (totalt 50) med steril teknik. Efter att mediet har stelnat (minst 30 min efter hällning), pipettera 300 μL bakteriekultur (beredd enligt steg 4 och steg 10) som har odlats över natten på mitten av plattan. Lämna plattan på bänken, låt bakteriekulturen torka och växa tjockare (1-2 dagar). Förvara plattorna vid 4 °C.
  3. Bered förblandningen av nematodtillväxtmedier med låg smälthalt (lmNGM):
    1. I en 500 ml kolv, kombinera 4 g smält agaros, 0,5 g Bacto Peptone och 195 ml ultrarent vatten. Autoklav i vätskecykel (121 °C, 15 psig) i minst 30 minuter för sterilisering.
    2. Medan mediet fortfarande är smält, fördela 10 ml alikvoter i sterila glasprovrör. Försegla varje provrör med Parafilm följt av ett provrörslock för att bevara lmNGM-förblandningen och förhindra uttorkning. Mediet stelnar och kan lagras i ~ 2 veckor vid RT före användning.
  4. Förbered 142,8 mM NaCl: I en 250 ml flaska, kombinera 0,8345 g NaCl och 100 ml sterilt avjoniserat vatten. Autoklav (121 °C, 15 psig) i 30 minuter och förvaras vid rumstemperatur.
  5. Förbered tvättmedelslösning: Kombinera 3 ml Tween 20 och 7 ml sterilt avjoniserat vatten i ett 15 ml koniskt rör. Blanda noggrant, filtersterilisera med ett 0,22 μm filter med en 10 ml spruta och förvara vid rumstemperatur.
  6. Förbered kopparsulfatlösning: I en steril 50 ml flaska, kombinera 20 ml sterilt avjoniserat vatten, 0,5 gCuSO4 och 100 μL tvättmedelslösning (beredd i steg 1,5). Blanda tills CuSO4 har lösts upp. Förvara på RT.
  7. Förbered vattenabsorberande polyakrylamidkristaller: I en autoklavsäker pressflaska, kombinera 150 ml avjoniserat vatten och 1 g typ S superabsorberande polymer. Blanda försiktigt genom att vända flaskan flera gånger. Autoklav på en vätskecykel (121 °C, 15 psig) i minst 20 minuter och förvaras vid rumstemperatur.
  8. Förbered lysogenbuljong (LB): I en 1 L eller större bägare, kombinera 20 g LB-pulver med 1 L avjoniserat vatten. Alikvot i två 500 ml bägare. Autoklav (121 °C, 15 psig) i 30 minuter och förvaras vid rumstemperatur
  9. Förbered agarplattor för lysogenbuljong (LB):
    1. I en 1 L kolv, kombinera 10 g LB-pulver, 7,5 g Bacto Agar och 500 ml avjoniserat vatten. Autoklav på vätskecykel (121 °C, 15 psig) i 30 minuter.
    2. Tillsätt eventuellt antibiotika (efter autoklav, efter att mediet har svalnat till 55 °C): 500 μl 100 mg/ml ampicillin. Häll 20 ml medium med steril teknik i varje 100 mm platta (totalt 25) och förvara vid 4 °C.

2. Skriva ut 3D-formen för flera brunnar

Varje enhet är gjuten från PDMS med en anpassad 3D-tryckt form. En enda form kan producera så många enheter som behövs; Men om du försöker förbereda flera enheter samtidigt krävs en 3D-tryckt form för att varje enhet ska tillverkas parallellt.

  1. Ladda ner STL-filen (se kompletterande fil 1).
  2. Skriv ut formen med en högupplöst 3D-skrivare.
    Skrivarens upplösning måste vara tillräckligt hög för att möjliggöra jämna brunns- och vallgravsvolymer. Den föreslagna skrivarupplösningen är en minsta XY-upplösning på ~40 μm och en lagerupplösning på 28 μm. Materialet som används av 3D-skrivaren är lika viktigt, eftersom många materialtyper förhindrar att PDMS härdar. Av erfarenhet fungerar formar som produceras av högupplösta PolyJet-skrivare (upplösning: X-axel = 600 dpi, Y-axel = 600 dpi, Z-axel = 1 600 dpi) med Vero Black-utskriftsmaterialet konsekvent. 3D-utskriften av formarna som användes i denna studie outsourcades (utskriftsdetaljer finns i materialförteckningen).

3. Förberedelse av multibrunnsanordningen

Det här avsnittet beskriver hur den 3D-utskrivna formen används för att skapa PDMS-enheten med flera brunnar.

  1. Ställ in härdugnen på 55 °C för att tillåta förvärmning.
  2. Bestäm antalet enheter som ska förberedas i en sats. Blanda 60 g PDMS-bas och 6 g härdningsmedel i en stor engångsvågsbåt (eller liknande engångsbehållare) med en engångsspatel för varje apparat.
  3. Placera PDMS-blandningen i en vakuumkammare i 30 minuter vid -0,08 MPa för att avlägsna bubblor.
  4. Häll PDMS-blandningen i varje 3D-tryckt form. Fyll formen helt, med PDMS-blandningen som sträcker sig något ovanför formens topp. Förvara överskott av PDMS-blandning för att fylla på formen vid spill.
  5. Sätt den fyllda formen och eventuell extra PDMS-blandning i vakuumkammaren i 25 minuter vid -0,08 MPa för att ta bort eventuella bubblor som skapats under hällprocessen.
  6. Ta bort den fyllda formen från vakuumkammaren och poppa eventuella kvarvarande bubblor med en engångsspatel. Använd spateln för att borsta synligt skräp eller kvarvarande bubblor till kanten av formen bort från brunnarna. Eventuellt kvarvarande skräp eller bubblor kan potentiellt störa avbildningen i de senare stegen.
  7. Se till att formen är helt fylld med PDMS-blandningen; Det är vanligt att en liten del av blandningen spills ut i vakuumkammaren eller under överföringen. Fyll på med den extra PDMS-blandningen som avgasades i steg 3.5. Detta bör inte skapa bubblor, men om någon bildas kan de försiktigt borstas till sidan av formen med spateln.
  8. Placera ett platt akrylark ovanpå den PDMS-fyllda formen genom att först placera en kant och långsamt sänka den andra tills akrylen sitter platt ovanpå formen och förskjuta eventuell PDMS-blandning som sträcker sig över kanten. Om bubblor bildas när du placerar akrylarket, ta långsamt bort akrylen, fyll på formen med PDMS-blandning om det behövs och starta om akrylplaceringen. Akrylarket kommer att bilda en platt botten för den gjutna anordningen och se till att alla brunnar ligger på samma nivå i förhållande till basen.
  9. Lägg en vikt på 2,5 kg ovanpå akrylen. Flera formar, var och en med ett separat akrylark, kan staplas. Ställ in de viktade formarna i ugnen och låt dem härda vid 55 °C över natten.
  10. Nästa dag, ta bort vikterna och formarna från ugnen.
  11. Arbeta försiktigt ett rakblad mellan akryl och härdat PDMS för att bryta tätningen. Ta försiktigt bort akrylen från toppen av formen. PDMS kommer att ha satt vid denna punkt, och att ta bort akrylen kan ta lite kraft.
  12. Lossa försiktigt sidorna på det härdade PDMS från formen med en rakhyvel eller en metallspatel. Det är lätt att riva PDMS i detta skede; arbeta långsamt och försiktigt runt kanten för att ta bort PDMS-enheten intakt.
    OBS: Nytryckta formar är särskilt klibbiga för de tre första användningarna, och PDMS tårar ofta när du försöker ta bort enheten. Med fler användningsområden blir det lättare att ta bort det härdade PDMS från formen.
  13. Förpacka enheten i aluminiumfolie och försegla den med autoklavtejp. Autoklav på torr cykel i minst 15 min vid 121 °C, 15 psig för sterilisering. Efter autoklavering, förvara de inslagna enheterna på bänken och använd dem efter behov.

4. Strimla bakterierna

OBS: Börja förbereda bakterierna som kommer att användas som maskens matkälla medan de är på multibrunnsenheten. Den vanligaste bakterien är Escherichia coli-stammen OP50 (eller stam HT115 för RNAi-experiment). Slutför det här steget minst 2 dagar innan du lägger till maskarna i enheten.

  1. Stryk bakterierna på en färsk LB-platta. Se till att alla stamspecifika selektiva tillsatser (t.ex. ampicillin för att välja en plasmid som ger ampicillinresistens mot bakterierna) ingår i LB-plattorna.
  2. Inkubera plattan vid 37 °C över natten (~18 timmar) så att kolonierna kan växa.

5. Förberedelse av multibrunnsanordningen för medialaddning

OBS: Ytan på silikon PDMS-materialet som utgör enheten är hydrofob, vilket förhindrar att små volymbrunnar och aversiva vallgravar fylls med NGM respektive kopparsulfat. För att kringgå detta problem används en syreplasma för att tillfälligt ändra enhetens ytegenskaper för att vara hydrofila, vilket gör att brunnarna och vallgraven kan fyllas inom ett begränsat tidsfönster (upp till ~ 2 timmar). I det här avsnittet beskrivs stegen för att slutföra plasmarengöringsprocessen. Slutför detta steg minst 1 dag innan du upptäcker enhetens brunnar med bakterier, eftersom kvardröjande effekter av plasmarengöringen kan störa spotting. Med tanke på tidpunkten för avsnitt 5-7 är den praktiska gränsen för dessa steg per tekniker tre enheter parallellt.

  1. Förvärm en inkubator för torrsträngbad till 90 °C som förberedelse för avsnitt 6.
  2. Eftersom den totala medievolymen som behövs för att fylla brunnarna i en flerbrunnsanordning är liten jämfört med Petri-plattor, förbered en stor sats NGM och alikvotera den i provrör (se steg 1.3).
    OBS: Detta kan göras i förväg, eftersom rören av media kan förvaras på bänken i ~ 2 veckor. Om mediet har beretts och alikvoterats i rör, fortsätt till steg 5.3.
  3. Medan du bär handskar, packa upp en autoklaverad multibrunnsenhet; Undvik att röra vid någon av brunnarna. Klipp ut ett litet hack i det övre högra hörnet av enheten för att ange hur många gånger den har använts/återanvänts (se avsnitt 15 nedan för instruktioner och rekommendationer för rengöring och återanvändning av varje enhet).
  4. Placera upp till tre oinslagna enheter i plasmarenaren med brunnarna uppåt. Kör plasmarenaren.
    OBS : Följande detaljerade instruktioner gäller för plasmarenaren Plasma Etch PE-50. De specifika stegen och inställningarna måste anpassas och eventuellt optimeras för andra plasmarenare.
    1. Kontrollera att plasmarenarens effektnivå är inställd på 75 %.
    2. Se till att både ventilations- och isoleringsventilerna är i OFF-läge .
    3. Öppna huvudventilen på syretanken. Vänta tills regulatortrycket sjunker till mellan 15 psig och 20 psig och vrid sedan isoleringsventilen till ON-läge .
    4. Slå på vakuumpumpen och plasmarenaren.
    5. Ange följande inställningar på plasmarenaren (första användningen) eller kontrollera att de tidigare programmerade inställningarna är korrekta:
      Plasmatid: 3:00 min
      Börvärde för vakuum: 149,5 mTorr
      Atmosfärisk ventil: 45 s
      Rensa ventil: 5 s
      Gasstabilisering: 15 s
      Vakuumlarm: 3:00 min
      Automatisk avkörning: PÅ
    6. Tryck på Enter för att gå till menyn Kommandon. Använd högerpilen för att välja Inställningsmenyn och tryck sedan på Retur. Bläddra igenom alla inställningar genom att trycka på Enter för att bekräfta varje aktuell inställning och sedan högerpilen för att gå till nästa inställning.
    7. Gå tillbaka till menyn Kommandon genom att trycka på uppåtpilen och sedan vänsterpilen.
    8. På skärmen Kommandomeny trycker du på Retur. Välj Kommandon PLASMA genom att trycka på Enter. Systemet kommer att gå igenom följande faser:
      Plasma Pumpdown
      Gasstabilisering: Under denna fas, justera Gas 1-ratten på plasmarenaren tills flödesmätaren är på 10 cc/min.
      Plasma tid
      Rensa Pumpdown
      Plasmacykeln slutförd
      Kammare Vent
      OBS: Denna process bör ta cirka 5-10 minuter att slutföra. När alla faser är klara visas menyn Kommandon på skärmen igen. Om trycket inte blir tillräckligt lågt under plasmapumpningsfasen fortsätter plasmarenaren inte till nästa fas och skärmen visar ett felmeddelande. Om detta händer, kontrollera vakuumpumpoljan. Om oljenivåerna är låga eller oljan är grumlig/smutsig kan byte av olja göra att vakuumtrycket når den nödvändiga nivån.
    9. Stäng av huvudventilen på syretanken.
    10. Vrid ventilen mycket långsamt till ON-läge och låt syretankens regulatortryck återgå till noll.
    11. Vrid isoleringsventilen till OFF-läge .
    12. Stäng av dammsugaren och plasmarenaren.
      OBS: Den hydrofila ytmodifieringen av flerbrunnsanordningen av plasmarenaren är tillfällig och blir gradvis mindre effektiv med tiden (upp till cirka 2 timmar). Gå igenom avsnitt 6 och avsnitt 7 så snabbt som möjligt.

6. Fyllning av brunnarna med lmNGM

OBS: En torrpärlbadinkubator ska vara på och förvärmd från steg 5.1. Se till att badet har nått 90 °C.

  1. Sterilisera en polystyrenbricka med en brunn per enhet genom att spraya insidan av brickan med 70% etanol och torka den torr med en arbetstorkning.
  2. Ta bort varje enhet från plasmarenaren med en handske och placera den i ett rengjort fack.
  3. Placera en 25 ml engångspipettbassäng i pärlbadsinkubatorn efter uppvärmning till 90 °C.
  4. Samla ett rör stelnad lmNGM-förblandning per enhet som ska fyllas (se steg 1.3).
  5. Placera lmNGM-förblandningsprovrören i en 200 ml glasbägare och ta bort locken och Parafilm. Mikrovågsugn i ~ 20 s tills mediet smälter tillräckligt för att hälla (närvaron av vissa fasta medier är bra i detta skede).
  6. Kombinera den smälta lmNGM-förblandningen från flera provrör till en annan steril 200 ml bägare. Fortsätt mikrovågsugn i ytterligare 20 s för att nå totalt 40 s. Om lmNGM-förblandningen börjar koka över, stoppa mikrovågsugnen och låt lmNGM-förblandningen sedimentera innan den fortsätter.
  7. Ta bort den smälta lmNGM-förblandningen från mikrovågsugnen och låt den svalna till ~ 60 ° C.
    OBS: I detta skede kommer media att svalna och stelna igen efter ~ 5 min. Fortsätt omedelbart till steg 6.8 och steg 6.9.
  8. Tillsätt följande (i ordning) för varje 10 ml lmNGM-förblandning: 250 μl 1 M KPi, 10 μL 1 MMgSO4, 10 μL 1 MCaCl2 och 10 μL 5 mg/ml kolesterol.
    1. För att förhindra äggkläckning vid övervakning av vuxna på enheten, tillsätt 10 μL 50 mM floxuridin.
    2. För att välja för en RNAi-plasmid och för att inducera uttrycket av RNA, tillsätt 5 μL 50 mg / ml karbenicillin och 12 μL 1 mM IPTG.
      OBS: Antibiotika eller andra tillsatser kan ändras beroende på experimentets utformning. Testföreningar/läkemedel kan också läggas till media i detta skede.
  9. Häll den smälta lmNGM i 25 ml bassängen i pärlbadet.
  10. Fyll apparatbrunnarna med lmNGM med en 200 μL flerkanalig repeaterpipett.
    1. Ställ in repeatern på att dosera alikvoter på 14 μL (14 μL kan dispenseras upp till 14 gånger om man använder en 200 μL pipettspets).
    2. Montera fem pipettspetsar. Enhetens brunnar har samma avstånd som en 384-brunnsplatta. Standard flerkanaliga pipetter är placerade så att användaren kan pipettera in i varannan brunn i rad / kolumn.
    3. Ladda spetsarna med smält lmNGM. Fördela de första 14 μl tillbaka i den lmNGM-innehållande bassängen.
    4. Rör dig snabbt men försiktigt, fördela 14 μL i de inre brunnarna (vita i figur 1B), börja med de som är markerade med ett "x" i figur 1B och rör dig över plattan till höger och sedan nedåt, fördela totalt 12 gånger (60 brunnar).
    5. Fördela återstående lmNGM tillbaka i bassängen, eftersom den slutliga alikvoten vanligtvis är mindre än 14 μl.
    6. Upprepa steg 6.10.3-6.10.5 tills alla inre brunnar har fyllts.
    7. Ställ sedan in repeatern på att dosera alikvoter på 15 μl. Upprepa steg 6.10.3-6.10.5, men fyll i stället för de inre brunnarna den yttersta brunnsringen (grå i figur 1B), börja med brunnarna markerade med "+" i figur 1B och rör sig runt plattans ytterkant.
      OBS: Arbeta snabbt så att mediet inte stelnar i pipettspetsarna. Undvik att spilla lmNGM i vallgraven. De yttre brunnarna tenderar att torka snabbare. De extra 1 μL lmNGM gör att den slutliga torkade brunnen kan ha en plan yta under samma torktid som de inre brunnarna.
  11. Som ett kvalitetskontrollsteg, undersök varje brunn för att identifiera de med brister som kan störa avbildning, inklusive brunnar som är underfyllda (lmNGM-ytan är nedsänkt under brunnens kant), överfyllda (lmNGM-ytan har en kupolformad topp) och innehåller bubblor eller skräp.
  12. Ta bort den stelnade lmNGM från de otillfredsställande brunnarna med en kort platinatrådplock eller vakuumsugare. Fyll på de tomma brunnarna med färsk smält lmNGM. Ta också bort alla medier som flödade över i vallgraven med en kort platinatrådplockning eller vakuumaspirator.

7. Tillsätt kopparsulfat till vallgraven

OBS: Den här enhetens brunnar är omgivna av en kontinuerlig vallgrav. Här fylls vallgraven med kopparsulfat, som fungerar som ett repellent och avskräcker maskarna från att fly från sina brunnar.

  1. Använd en 200 μL pipett och fördela 200 μL kopparsulfatlösning (se steg 1.6) i enhetens vallgrav i varje hörn, 2x per hörn. Detta bör vara en tillräckligt stor volym för att kopparsulfatet ska strömma genom hela vallgraven. Var försiktig så att du inte överfyller vallgraven när som helst; Kopparsulfatet bör inte vidröra brunnarnas övre yta.
  2. Om kopparsulfatet inte flyter lätt genom hela vallgraven, använd en kort platinatrådplockning för att bryta spänningen och dra kopparsulfatet genom vallgraven.
  3. Efter att kopparsulfatet har flödat genom hela vallgraven, ta bort så mycket kopparsulfat som möjligt från vallgraven med en 200 μL pipett eller aspiration med vakuum. Återstoden som lämnas kvar kommer att vara tillräcklig för att avskräcka maskarna från att lämna sina brunnar. Att lämna vallgraven full av kopparsulfatlösning riskerar att kopparsulfat spills ut i brunnarna, vilket skulle få maskar att fly.

8. Lägga till autoklaverade vattenkristaller

OBS: För att bibehålla fuktigheten i plattan och förhindra uttorkning av lmNGM är varje enhet omgiven av mättade vattenabsorberande polyakrylamidkristaller.

  1. Förbered vattenkristallerna (se steg 1.7).
  2. Använd en pressflaska, tillsätt vattenkristallerna i mellanrummen mellan enheten och brickväggarna. Stäng bricklocket och linda alla fyra sidorna med en bit Parafilm. Lägg till ytterligare två bitar Parafilm för att helt försegla plattan.
    OBS: Vattenkristaller kan beredas i en bägare och skopas in i brickan med en steriliserad spatel. Detta lägger dock till tid för proceduren och ökar tiden som varje bricka är öppen och utsatt för potentiella föroreningar.
  3. Lämna den förseglade enheten på bänken till nästa dag när bakterierna är redo att upptäckas. Se till att enheterna förvaras med brunnarna uppåt efter att lmNGM har lagts till.

9. Förberedelse av en ålderssynkroniserad population av maskar

OBS: Följande steg ger en synkroniserad population av maskar som är redo att läggas till multibrunnsanordningen vid det fjärde larvstadiet (L4). Men maskar i olika utvecklingsstadier kan också läggas till. Detta steg bör slutföras 2 dagar innan maskarna läggs till enheten om L4s önskas. Justera tidpunkten för synkronisering för önskat livsstadium.

  1. För konsekventa åldringsstudier, behåll C. elegans på NGM-standardplattor (se steg 1.2 vid 20 °C under välmatade förhållanden).
  2. Skaffa en synkroniserad population av djur från en stamplatta via standardmetoder, till exempel blekning17 eller tidsbestämd äggläggning1.
  3. Lägg isolerade ägg till en NGM-platta fläckig med bakterier. Äggen kläcks på denna tallrik, och maskarna når L4-larvstadiet om 2 dagar för vilda djur.

10. Inympning av bakteriekulturen

OBS: Bakterier används som den primära näringskällan för C. elegans, oftast E. coli-stammar OP50 eller HT115. Bakterierna är koncentrerade 10 gånger, vilket bör redovisas i volymen av den beredda kulturen. Förbered en bakteriekultur dagen innan du upptäcker enheten.

  1. Från LB-plattan som bereddes i steg 4, välj en enda koloni och inokulera 12 ml steril LB per enhet som ska upptäckas. Inkludera selektiva medel om det behövs för bakteriestammen som används.
  2. Odla bakteriekulturen över natten (~18 timmar) i en 37 °C inkubator med skakning vid ~250 rpm.

11. Spotting brunnarna med koncentrerade bakterier

OBS: En liten volym koncentrerade bakterier läggs till varje brunn, vilket är tillräckligt för att mata maskarna under hela deras livslängd på enheten. Bakteriekulturen måste torkas innan maskarna kan läggas till brunnarna. Eftersom medievolymen i varje brunn är liten (14-15 μL) i förhållande till bakterievolymen tillsatt (5 μL) kan det kemiska innehållet i bakteriemediet påverka brunnens kemiska miljö. För att ta hänsyn till detta koncentreras bakterierna och återsuspenderas i saltvatten för att avlägsna utarmad LB samtidigt som hypoosmotisk stress undviks. Inget salt tillsätts i lmNGM-receptet (se steg 1.3-1.4) eftersom det tillsätts i detta skede.

  1. Efter att ha odlat bakterierna över natten enligt beskrivningen i avsnitt 10, koncentrera bakteriekulturen 10x. Pelletera bakterierna genom centrifugering vid ~ 3 400 x g i 20 minuter, kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1/10 av den ursprungliga odlingsvolymen på 142,8 mM NaCl (se steg 1.4). Till exempel, för att upptäcka en 240-brunnsenhet, snurra ner 12 ml kultur och resuspendera i 1,2 ml 142,8 mM NaCl.
    OBS: Testföreningar / läkemedel kan läggas till den återsuspenderade bakteriekulturen före spotting.
  2. Använd en upprepad pipett och spotta varje brunn med 5 μL av de koncentrerade bakterierna. Undvik direktkontakt med lmNGM-ytan, eftersom pipettspetsen kan genomborra lmNGM och låta masken gräva sig under brunnens yta. Var försiktig så att du inte låter bakterierna spilla ut i vallgraven eftersom maskarna kommer att lockas till den och fly in i vallgraven.
  3. Torka de prickiga bakterierna med bricklocken borttagna. Detta steg är viktigt för brunnsmiljöns långsiktiga integritet, och det finns en mängd olika sätt att torka de prickade enheterna. Oavsett vilken metod som används, se till att enheten förblir i en steril miljö, eftersom den måste sitta utan lock medan bakterierna torkar. Ökat luftflöde minskar torktiden kraftigt. Torkning kan utföras enligt beskrivningen i stegen nedan:
    1. Lämna enheten avtäckt i en ren, förseglad behållare, till exempel en plastbehållare som har rengjorts med 10% blekmedel, följt av 70% etanol. Denna metod för torkning kan ta flera timmar.
    2. Placera enheterna utan lock i en steril laminär flödeshuv (liknande den föredragna metoden nedan).
    3. Torka enheterna med en specialbyggd "torkbox" (den optimerade metoden som följdes i denna studie), som kan konstrueras till minimal kostnad med hjälp av datorfläktar och HEPA-filter (se tilläggsfil 1).
      OBS: Oavsett vilken metod som används måste torkningssteget optimeras för den lokala miljön. Övervaka ofta hur snabbt brunnarna torkar tills den typiska torktiden har identifierats. I en miljö med låg luftfuktighet resulterar användningen av en torklåda i en torktid på ~ 30-40 min. Låt inte plattorna bli för torra, eftersom media i brunnarna kommer att krympa och sjunka. Det är bättre att ta bort enheten från torkning medan några brunnar fortfarande är våta än att låta den torka längre och eventuellt övertorka ett stort antal brunnar.
  4. Kontrollera vattenkristallerna. Om majoriteten av vattenkristallerna i brickan har torkat ut och tappat volym under torkningsprocessen, lägg till mer i brickan.
  5. När bakterierna är torra, tillsätt maskarna omedelbart (avsnitt 12) eller försegla brickan för att använda senare. För att försegla, stäng bricklocket och linda alla fyra sidorna med en enda bit Parafilm. Upprepa två gånger för totalt tre Parafilm-lager. Efter att ha förpackat brickan helt kan enheten lämnas på bänken vid rumstemperatur i upp till 4 dagar innan maskarna tillsätts (avsnitt 12).

12. Lägga till maskar i multibrunnsenheten

  1. Tillsätt manuellt en mask per brunn till varje brunn med hjälp av en platinaplockning för att överföra djuren från plattorna med maskar som beretts i avsnitt 9. Välj bara maskar som är i önskat livsstadium och ålder.
    OBS: Att ta mer än 1 timme att lägga till maskarna i enheten kan resultera i lmNGM-uttorkning, så maskarna bör läggas till så snabbt som möjligt. Att välja flera maskar (20+) åt gången innan du lägger till dem i enhetens brunnar kan hjälpa till att öka hastigheten.

13. Avsluta förberedelsen av enheten för långvarig användning

Dessa steg säkerställer att enhetens brunnar förblir hydratiserade under hela experimentet.

  1. Undersök vattenkristallerna. Se till att vattenkristallerna är i nivå med toppen av enheten men inte överflödar på den. Tillsätt ytterligare vattenkristaller i brickan om det behövs.
  2. Tillsätt en droppe beredd tvättmedelslösning (se steg 1.5) på insidan av brickans lock och gnugga in med en specialduk tills tvättmedelslösningen har torkat. Detta förhindrar imma på locket efter att enheten är förseglad inuti brickan så att maskarna är tydligt synliga.
  3. Vik in brickan med tre bitar Parafilm med en specifik teknik som främjar Parafilm-tätningens långsiktiga integritet.
    1. Sträck lite en bit Parafilm så att den bara täcker två sidor av brickan. Upprepa detta med en andra bit Parafilm för att täcka de andra två sidorna.
    2. Skiktad ovanpå det första lagret av Parafilm, ta en sista bit Parafilm, sträck den helt och linda alla fyra sidor. Om de är ordentligt förseglade bör enhetens brunnar förbli hydratiserade i ~ 2 månader.
      OBS: Parafilmens integritet bör övervakas var 1-2: e vecka, och Parafilm bör bytas ut om den går sönder.
  4. Ta bort eventuella fingeravtryck från toppen av facket med en arbetstorkning fuktad med 70% etanol.

14. Insamling av uppgifter

OBS: Syftet med denna studie är att beskriva odlingsmetodiken. När de väl är befolkade är flerbrunnsenheter kompatibla med longitudinell övervakning av en mängd olika fenotyper. Här ges grundläggande vägledning för mätning av flera av de vanligaste parametrarna.

  1. Livslängd: Övervaka livslängden genom att knacka på plattan eller utsätta maskarna för ett starkt blått ljus var 1-3: e dag. Poäng som död om ingen rörelse observeras. Dessa multibrunnsenheter är också kompatibla med automatiserade bild- och analysrörledningar för att uppskatta livslängden13,18.
  2. Aktivitet: Övervaka enskilda djurs aktivitet under hela livet genom att ta statiska bilder eller videor av djuren i enhetens brunnar och bedöma avståndet, hastigheten eller andra rörelsemått. Enheterna är också kompatibla med automatiserade bild- och analysledningar för uppskattning av aktivitet13,18.
  3. Kroppsstorlek och form: Övervaka förändringar i kroppsstorlek och form genom att ta statiska bilder av djuren i enhetens brunnar och kvantifiera de visuella parametrarna med hjälp av standardbildtekniker. I princip bör denna odlingsmetod vara kompatibel med befintlig programvara för en mer sofistikerad bedömning av maskkroppsform 19,20,21.

15. Återanvändning av enheterna

OBS: När ett experiment är klart kan multibrunnsenheterna rengöras och återanvändas upp till tre gånger. Ytterligare återanvändning börjar påverka maskfenotyperna, eventuellt orsakad av kemikalier från media eller bakterier som byggs upp i väggarna i PDMS-materialet.

  1. Kassera Parafilm och ta bort enheten från facket. Kontrollera skårorna i det övre högra hörnet av enheten, som anger hur många gånger den har använts. Om den har använts tre gånger, kassera enheten. Om den har använts färre än tre gånger, rengör och återanvänd den.
    OBS: Brickorna är tillverkade av polystyren och är inte direkt i kontakt med lmNGM, bakterier eller några tillsatser till mediet. De kan återanvändas många gånger så länge de förblir visuellt klara.
  2. Skölj ut eventuella kvarvarande vattenkristaller från brickan. Spraya insidan av brickan med 10% blekmedelslösning och låt den sitta i 10 minuter. Skölj med avjoniserat vatten och torka omedelbart för att undvika vattenfläckar.
  3. Håll enheten under rinnande vatten för att börja rengöra mediet ur brunnarna. Böj försiktigt och vrid enheten under vattnet för att lossa mediet från brunnarna, men böj inte så långt att enheten rivs. Plocka ut eventuella kvarvarande medier som fastnat i brunnar med en 200 μL pipettspets.
  4. Fyll en 2 L bägare med en omrörningsstång ~ 3/4 full med avjoniserat vatten och koka upp på en värmeplatta.
  5. Tillsätt en eller två flerbrunnsenheter och en omrörningsstång i kokande vatten. Slå på den magnetiska omrörningen till låg hastighet (~ 200 rpm) för att försiktigt agitera enheterna i vattnet. Låt enheterna koka i 10 minuter.
  6. Ta bort enheterna från vattnet med metallpincett och placera dem med god sida nedåt på pappershanddukar för att tömma. Låt enheterna torka åtminstone över natten.
  7. När enheterna är helt torra, linda dem i folie och försegla dem med autoklavtejp. Skriv på autoklavbandet hur många gånger enheten har använts. Autoklav på en torr cykel i 15 min vid 121 °C för att sterilisera. Enheterna är nu redo för återanvändning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

WorMotels kultursystem kan användas för att samla in en mängd olika data, bland annat om livslängd, hälsa och aktivitet. Publicerade studier har använt multi-well-enheter för att studera livslängd och hälsa 13,14, lugn och sömn 22,23,24 och beteende 25. Livslängden kan poängsättas manuellt eller genom en samling bilder och nedströms bildanalys. I det förra tillvägagångssättet kan maskarna observeras manuellt efter en stimulans (t.ex. knackning på plattan eller exponering för blått ljus) var 1-3: e dag och poängsättas som döda om ingen rörelse observeras, liknande standardmetoder på Petri-plattor1. Det senare tillvägagångssättet är likartat, förutom att maskrörelsen kan bestämmas genom att jämföra ram-till-ram-skillnader mellan bilderna som tagits efter att stimulansen har applicerats. Detta ger en extra fördel genom att förflyttning ger information både om aktivitetsnivån hos enskilda djur vid den tidpunkten och ger ett mått genom vilket livslängd (t.ex. upphörande av förflyttning) och hälsospann (flera definitioner har föreslagits) kan bestämmas. Bilderna kan vidare användas för att extrahera ytterligare fysiologiska parametrar som kroppsstorlek, kroppsform och kroppshållning.

För att demonstrera systemets kapacitet undersökte vi det klassiska epistatiska förhållandet mellan insulinreceptorn, kodad av genen daf-2, och nedströms FOXO-familjens transkriptionsfaktor kodad av daf-16 i samband med livslängd, hälsa och daglig aktivitet för enskilda djur. Vildtyp (stam N2) och daf-16 (mu68) funktionsförlust (stam CF1038) C. elegans matad E. coli (stam HT115) som uttrycker endera kontrollen (tom vektor; EV) eller daf-2 RNAi-matningskonstruktioner odlades i flerbrunnsanordningar, och varje djur övervakades för livslängd (figur 2A), hälsospann (figur 2B) och daglig aktivitet (figur 2C). Aktiviteten övervakades dagligen genom att ta en serie stillbilder var 5: e sekund i 2 minuter, med maskarna utsatta för starkt blått ljus i 5 s vid 1 min för att stimulera aktivitet (enligt Churgin et al.13). Den dagliga aktiviteten för varje djur uppskattades genom att normalisera bakgrunden över brunnar och bilder, identifiera maskområdet i varje bild och beräkna förändringen i området mellan intilliggande bilder. Livslängden definierades som den ålder då aktivitet senast observerades för varje mask, och hälsospann definierades som den ålder då en mask inte längre kunde röra sig en hel kroppslängd. Som förväntat från många tidigare studier (t.ex. Kenyon et al.26, Murphy et al.27) resulterade daf-16 (mu86) -mutationen i kort livslängd och förhindrade livslängdsförlängning från RNAi-knockdown av daf-2 (figur 2A). Ett liknande mönster observerades för healthspan (figur 2B). Som en fördel med att använda odlingssystem med flera brunnar möjliggör kapaciteten att spåra enskilda djur under hela livet en detaljerad analys av den individuella variationen i varje uppmätt fenotyp över hela populationen. Till exempel kan variationen i livslängd och hälsa mellan enskilda djur jämföras antingen i absoluta termer (figur 2D) eller som en bråkdel av den totala livslängden (figur 2E). Fenotyper i tidigt liv kan vidare jämföras med fenotyper i slutet av livet, inklusive livslängd, hos enskilda djur i en population. Till exempel korrelerade den kumulativa aktiviteten för varje enskilt djur under hela livslängden (dvs. arean under kurvan [AUC] för individuell aktivitet) bättre med livslängden (figur 2F) än kumulativ livslängd fram till dag 5 i livet (figur 2G) under alla uppmätta förhållanden. Vi betonar att syftet med detta arbete är att tillhandahålla ett detaljerat protokoll för att konstruera flerbrunnsmiljön för att spåra enskilda djur över tid, inte för att mäta en specifik fenotyp med hjälp av enheten. De representativa resultaten som presenteras i figur 2 ger bara ett exempel på de fenotyper som kan mätas i detta system. När den väl är konstruerad är flerbrunnsmiljön kompatibel med ett brett spektrum av tekniker för att mäta fenotyperna hos fritt krypande maskar på fasta medier.

Figure 1
Figur 1: Schematisk bild av mikrofabricerade flerbrunnsanordningar . (A) Enskilda C. elegans odlas på fasta lågsmälta nematodtillväxtmedier (lmNGM) agaroskuddar sådda med bakteriell mat i enskilda brunnar. Utrymmet mellan brunnarna är belagt med en aversiv kemikalie (kopparsulfat) för att isolera varje mask i dess brunn. Varje enhet är säkrad i ett fack med en brunn. Brickans omkrets är fylld med vattenkristaller för att bibehålla fuktigheten. Tråget är förseglat med Parafilm för att möjliggöra syreutbyte. Bild skapad med BioRender.com. (B) Översikt över flerbrunnsanordningen med angivande av den föreslagna ordningen för lastning av brunnarna. De inre brunnarna (vita) tar emot 14 μL lmNGM. De yttre brunnarna (grå) tar emot 15 μL lmNGM. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Korrelation mellan uppmätta fenotyper över populationer hos enskilda djur med hjälp av flerbrunnsanordningar. Alla paneler tillhandahåller data från samma experiment som jämför fyra grupper av djur: vildtypsdjur (N2) som omfattas av tom vektor EV(RNAi) (N = 138), vildtypsdjur som är föremål för daf-2(RNAi) (N = 151), daf-16(mu86) djur som är föremål för EV(RNAi) (N = 123) och daf-16(mu86) djur som är föremål för daf-2(RNAi ) (N = 135). (A) Livslängdsförlängningen från daf-2(RNAi) blockeras av daf-16(mu86) nollmutationen. Parvis signifikans mellan grupper bestämda av log-rank-testet (survdiff-funktionen i R). (B) Den hälsospann som definieras här som den dag då ett djur inte längre kan flytta en hel kroppslängdsförlängning från daf-2 (RNAi) blockeras av daf-16 (mu86) nollmutationen. Parvis signifikans mellan grupper bestämda av log-rank-testet (survdiff-funktionen i R). (C) Det rullande medelvärdet för aktiviteten under 3 dagar under hela livslängden reduceras med både daf-16(mu86) och daf-2(RNAi). Signifikans beräknad med Mann-Whitney U-testet för att jämföra arean under kurvan för aktivitet över livslängden för enskilda djur mellan grupper. (D) Hälsospann och livslängd för varje population som absoluta värden (medelvärde ± medelfel för medelvärdet). (E) Hälsospann och livslängd för varje population normaliserad till total livslängd inom varje grupp (medelvärde ± medelfel för medelvärdet). (F) Den kumulativa aktiviteten över hela livslängden (arean under kurvan [AUC] över hela livslängden) för enskilda djur korrelerar bättre med livslängden än (G) aktiviteten för enskilda djur vid en viss dag under hela livslängden (aktivitetskorrelationen på dag 8, som representerar den punkt där den genomsnittliga aktiviteten maximeras, visas), beräknad genom linjär regression (lm-funktionen i R). n.s. = inte signifikant, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Alla p-värden justerades för multipla jämförelser med Bonferroni-metoden för jämförelser inom varje panel. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande fil 1: STL-fil för utskrift av 3D-flerbrunnsformen Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

WorMotel-systemet är ett kraftfullt verktyg för att samla in individualiserade data för hundratals isolerade C. elegans över tid. Efter de tidigare studierna med multibrunnsenheter för applikationer inom utvecklingslugn, rörelsebeteende och åldrande var målet med detta arbete att optimera förberedelsen av flerbrunnsenheter för långsiktig övervakning av aktivitet, hälsa och livslängd på ett högre genomströmningssätt. Detta arbete ger ett detaljerat protokoll för att förbereda flerbrunnsenheter som optimerar många av stegen från det ursprungliga protokollet13, belyser viktiga punkter som kan ge tekniska svårigheter och ger en diskussion om återanvändning av plattorna och andra material.

För skalning - som ett laboratorium som för närvarande förbereder mellan 10 och 20 enheter under en typisk vecka - var en viktig fråga om enheterna kunde återanvändas och i så fall i vilken grad. Det finns en högre kostnad när det gäller både tid och pengar för att förbereda PDMS-enheter jämfört med att utföra traditionell kultur på Petri-plattor, men dessa högre kostnader kan minskas genom att återanvända PDMS eller andra komponenter i systemet. Med många återanvändningar började PDMS utveckla en gul färg, vilket sannolikt återspeglar ackumuleringen av föreningar från lmNGM-mediet eller bakterierna. Djuren som odlades på dessa plattor visade också en högre flykthastighet och minskad livslängd. Baserat på dussintals experiment är tre användningsområden optimala för att återanvända dessa PDMS-enheter, vilket gör att åldersrelaterade fenotyper kan bedömas utan mätbar påverkan från PDMS-nedbrytning samtidigt som antalet nya enheter som behöver formas minskas (vilket sparar kostnader). Vi bekräftade vidare att experimentmatchade djur som odlades på enheter på deras första, andra och tredje användning producerade överlevnadskurvor som var nästan oskiljbara och inte statistiskt olika (data visas inte). Brickorna som används för att innehålla enheterna är gjorda av polystyren och kan rengöras och återanvändas på obestämd tid om de förblir fria från repor eller andra märken som kan störa visualiseringen av maskarna.

En viktig utmaning för att förbereda flerbrunnsenheter för applikationer som varar mer än ~ 2 veckor är att förhindra plattkontaminering av miljöbakterier och svampar. Det finns flera steg där sterilisering är avgörande för att förhindra kontaminering. Dessa inkluderar autoklavering av alla enheter före användning, kokning av enheterna avsedda för återanvändning, autoklavering av de absorberande vattenkristallerna som används för att bibehålla fuktighet, rengöring av brickorna som innehåller enheterna med både blekmedel och etanol före användning och filtersterilisering av tvättmedelslösningen som appliceras på locket på brickan för att förhindra dimma och tillsatt till kopparsulfatlösningen. Genom att genomföra var och en av dessa förändringar minskade särskilt kontamineringshändelserna, vilket gjorde att de förseglade enheterna konsekvent kunde användas för longitudinell övervakning under hela livslängden, även under livslängdsförhållanden (t.ex. knockout av DAF-2) som kräver övervakning i >45 dagar. Protokollet som beskrivs här innehåller två modifieringar av det ursprungliga protokollet för långvariga applikationer som är utformade för att upprätthålla konsekvent brunnstorkning och förhindra uttorkning. Först ökades enhetens totala djup med 2 mm för att öka kapaciteten för vattenkristaller. Under långa experiment, särskilt i en miljö med låg luftfuktighet, ledde för få vattenkristaller i brickan till uttorkning av lmNGM. Tillsammans med fler vattenkristaller var det nödvändigt att öka volymen agaros som tillsattes till brunnarna längs kanten av anordningen. Dessa brunnar tenderade att torka först efter brunnsbelastningen (avsnitt 6) och krympa. Att använda 14 μL agaros på de inre brunnarna var tillräckligt med volym för att fylla brunnarna helt utan att skapa den kupolformade toppen som härrör från överfyllning av brunnarna. Tillsats av 15 μL agaros till de yttre brunnarna gav tillräckligt med volym för att brunnarna, när de började torka ut, krympte till en nivå jämförbar med de 14 μL som tillsattes i de inre brunnarna.

En av de största avvikelserna från det ursprungliga protokollet var att vända den ordning i vilken användaren laddar lmNGM (avsnitt 6) och kopparsulfat (avsnitt 7). Ursprungligen tillsattes kopparsulfatet till vallgraven först, följt av att brunnarna fylldes med lmNGM13. Det observerades att fyllning av brunnarna med lmNGM så snart efter plasmarengöring som möjligt förbättrade lmNGM: s vidhäftning till brunnsväggarna. Att vänta för länge efter plasmarengöringen resulterade i brunnar med bubblor och kupolformade toppar, vilket kan störa visualiseringen av maskarna. Att prioritera fyllning av brunnarna framför tillsats av kopparsulfat är särskilt viktigt när man förbereder flera enheter samtidigt för att säkerställa konsekventa, högkvalitativa lmNGM-ytor. En nackdel med att fylla brunnarna först är att den hydrofila ytmodifieringen som produceras av plasmarenaren kommer att ha slitits märkbart när användaren går vidare till att tillsätta kopparsulfatet. Kopparsulfat flyter inte lätt genom vallgraven när ytan blir mindre hydrofil, vilket gör det utmanande att uppnå fullständig täckning. Att tillsätta tvättmedel till kopparsulfatlösningen för att fungera som ett ytaktivt medel förbättrar lösningens flöde genom vallgraven. En platinatrådplockning kan också användas för att försiktigt styra kopparsulfatet genom vallgraven genom att bryta spänningen vid alla punkter där kopparsulfatet har svårt att flöda. Dessutom, om kopparsulfatlösningen lämnades i vallgraven, skulle den lätt spillas in i brunnarna och förorena lmNGM-ytan när brickan lutas. Laddningsprocessens natur gör det nästan omöjligt att hålla enheten tillräckligt jämn hela tiden för att förhindra att koppar förorenar en delmängd av brunnarna. För att ta hänsyn till detta avlägsnas kopparsulfatlösningen från vallgraven (steg 7.3), och det kvarvarande kopparsulfatet som finns kvar är tillräckligt för att avskräcka de flesta maskar från att fly. Som en sista anmärkning om användningen av kopparsulfat som en aversiv barriär kan vissa repellenter påverka åldersassocierade fenotyper, inklusive livslängd. Användningen av kopparsulfat i dessa flerbrunnsanordningar undersöktes av Churgin et al.13 och befanns inte ha någon detekterbar inverkan på vare sig livslängd eller utveckling.

Andra mindre uppdateringar av protokollet fokuserar på att förbättra de åtgärder som vidtagits för att förbereda PDMS. Ett extra avgasningssteg efter blandning av PDMS-basen och härdningsmedlet tillsattes, eftersom detta är en process som genererar många bubblor. Att ta bort majoriteten av bubblorna innan blandningen tillsätts till enhetens formar minimerar bubblorna som återstår efter det andra avgasningssteget. För att säkerställa att enhetens botten är helt platt och jämn, en funktion som är viktig för avbildning av hela plattan, lades en bit glas eller akryl över toppen av den fyllda formen. Det här steget är inte nödvändigt - men fortfarande användbart - för applikationer som bara undersöker en brunn i taget, eftersom användaren manuellt kan justera fokus för varje brunn. Slutligen var härdning av PDMS vid en högre temperatur (55 °C) nödvändig på den plats där denna version av protokollet optimerades (Tucson, Arizona, USA), i motsats till de 40 °C som indikerades av det ursprungliga protokollet (optimerat i Philadelphia, Pennsylvania, USA). Detta tyder på att skillnader mellan platser (t.ex. klimat eller exakta reagens och utrustning som används) kan påverka de specifika stegen i protokollet, såsom härdningstemperatur eller torkningstekniker, och att dessa kan behöva optimeras på varje plats. Till exempel spelar luftfuktigheten en stor roll för att bestämma torktiden för plattorna efter spotting, och detta kan variera kraftigt mellan platser eller årstider.

I princip kan detta flerbrunnssystem användas för att samla in data om vilken fenotyp som helst som kan mätas under standard ljusfältmikroskopi på Petri-plattor-livslängd, hälsospan, ostimulerad / stimulerad rörelse, kroppsstorlek och form, rörelsegeometri-med den extra förmågan att spåra dessa mätvärden för enskilda maskar över tiden. Som noterades i inledningen finns det andra metoder för att förvärva individuella livslängdsdata. Mikrofluidikanordningar28 eller flerbrunnsplattor29 erbjuder möjligheten att följa enskilda djurs livshistoria, men endast genom att odla maskarna i flytande media. En flytande miljö kan förändra maskarnas transkriptom 10,11,30 i förhållande till fasta medier och inducerar distinkta fysiologiska och beteendeförändringar, inklusive episodisk simning 31, ökad energiförbrukning 10,32 och förhöjd oxidativ stress 10. I vilken grad livslängd och andra mätvärden relaterade till hälsosamt åldrande direkt kan jämföras mellan flytande och fasta medier är oklart. Multibrunnsenheter med fast kultur möjliggör spårning av enstaka maskar i en miljö som är jämförbar med standardgruppkultur på Petri-plattor. Den böjda strukturen på enhetsväggen möjliggör avbildning av maskar var som helst inuti brunnen, vilket gör dessa enheter i princip kompatibla med mer sofistikerade verktyg för analys av en mask, såsom Worm Tracker33.

Möjligheten att övervaka enskilda djur under ett experiment på en flerbrunnsanordning åtföljs av flera begränsningar. För det första, även med ett optimerat protokoll, kräver dessa enheter mer tid att ställa in per djur än standardkultur på Petri-plattor, vilket ger data för enstaka djur på bekostnad av den totala provstorleken. Maskarna är emellertid också isolerade till individualiserade brunnar, vilket tar bort några av de komplikationer som är förknippade med automatiserad livslängdsmätning, till exempel att automatiskt upptäcka enskilda djur som slutar röra sig medan de rör varandra. Automatisering mer än återvinner den tid som förlorats till den mer komplexa installationen och ger möjlighet till mer screening med hög genomströmning13,18. För det andra kommer experimentella förhållanden som maskarna ogillar mer än kopparsulfatvallgraven, såsom starka stressinducerande medel (t.ex. parakvat) eller dietbegränsning, att leda till att maskarna flyr från brunnarna och in i vallgraven. För det tredje, medan PDMS-enheterna tillåter ljusfält- och mörkfältmikroskopi, tenderar PDMS-materialet att ha både hög och ojämn bakgrundsfluorescens, den senare sannolikt härrörande från damm eller andra mikropartiklar som blir inbäddade i PDMS under gjutning, vilket begränsar deras tillämpning i fluorescerande mikroskopi. Slutligen tyder missfärgningen som observerats i PDMS för enheter som återanvänds under flera experiment och den därmed sammanhängande minskningen av livslängden och ökningen av flykt på att mediekomponenterna och andra tillsatta kemikalier leech i PDMS över tiden. I vilken grad detta kan påverka åldrande fenotyper eller läkemedelsbehandlingar undersöks för närvarande. Som tidigare nämnts finns det en alternativ metod för en enkelmaskkultur som liknar PDMS multi-well-enheter men istället använder kommersiellt tillgängliga mikrobrickor för att odla isolerade djur16. Dessa mikrobrickor är tillverkade av polystyren, vilket undviker det potentiella problemet med läckande mediekomponenter och har konsekvent fluorescensbakgrund, vilket möjliggör direkt in vivo-fluorescensavbildning direkt på plattan. Mikrobrickbrunnarna är också omgivna av palmitinsyra i stället för kopparsulfatet som används i protokollet som beskrivs här, vilket är mer aversivt och minskar fraktionen av maskar som lämnar sina brunnar, även när det gäller stressinducerande medel och kostbegränsning. Dessa fördelar realiseras på bekostnad av lägre förpackningseffektivitet hos brunnarna, eftersom mikrobrickorna tillåter maximalt 96 maskar att odlas i en enda bricka i motsats till PDMS-enheternas 240 maskkapacitet. Specifikationerna för det önskade resultatet av ett experiment kommer att påverka vilket av dessa system som ska användas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna uppger att de inte har några intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av NIH R35GM133588 till G.L.S., en United States National Academy of Medicine Catalyst Award till G.L.S., State of Arizona Technology and Research Initiative Fund administrerad av Arizona Board of Regents och Ellison Medical Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 lb weight CAP Barbell RP-002.5
Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) Falken Design ACRYLIC-CL-3-8/1224 Large sheet cut to smaller sizes 
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518
Autoclavable squeeze bottle Nalgene 2405-0500
Bacto agar BD Difco 214030
Bacto peptone Thermo Scientific 211677
Basin, 25 mL VWR 89094-664 Disposable pipette basin 
Cabinet style vacuum desiccator  SP Bel-Art F42400-4001 Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. 
CaCl2 Acros Organics 349615000
Caenorhabditis elegans N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Wildtype strain
Carbenicillin  GoldBio C-103-25
Centrifuge Beckman 360902
Cholesterol ICN Biomedicals Inc 101380
Compressed oxygen tank Airgas UN1072
CuSO4 Fisher Chemical C493-500
Dry bead bath incubator Fisher Scientific 11-718-2
Escherichia coli OP50  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Standard labratory food for C. elegans
Ethanol Millipore ex0276-4
Floxuridine Research Products International F10705-1.0
Hybridization oven Techne 731-0177 Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice
Incubators Shel Lab 2020 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria 
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) GoldBio I2481C100
K2HPO4 Fisher Chemical P288-500
KH2PO4 Fisher Chemical P286-1
Kimwipes KimTech 34155 Task wipes
LB Broth, Lennox BD Difco 240230
Low melt agarose Research Products International A20070-250.0
MgSO4 Fisher Chemical M-8900
Microwave  Sharp R-530DK
Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 Rainin 17013800 The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided
NaCl Fisher Bioreagents BP358-1
Nunc OmniTray Thermo Scientific 264728 Clear polystyrene trays
Parafilm M Fisher Scientific 13-374-10 Double-wide (4 in)
Petri plate, 100 mM  VWR 25384-342
Petri plate, 60 mM  Fisher Scientific FB0875713A
Plasma cleaner Plasma Etch, Inc. PE-50
PLATINUM vacuum pump JB Industries DV-142N 
PolyJet 3D printer Stratasys  Objet500 Connex3 PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi)
Shaking incubator Lab-Line 3526CC
smartSpatula LevGo, Inc. 17211 Disposable spatula
Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) M2 Polymer Technologies Type S Referred to in main text as "water crystals"
SYLGARD 184 Silicone Elastomer base The Dow Chemical Company 2065622
SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent The Dow Chemical Company 2085925
Syringe filter (0.22 µm) Nest Scientific USA Inc.  380111
Syringe, 10 mL  Fisher Scientific 14955453
TWEEN 20 Thermo Scientific J20605-AP Detergent
Vacuum pump oil VWR 54996-082
VeroBlackPlus Stratasys  RGD875 Rigid 3D printing filament
Weigh boat Thermo Scientific WB30304 Large enough for PDMS mixture volume

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
  2. Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
  3. Rahman, M., et al. NemaLife chip: A micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10, 16190 (2020).
  4. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  5. Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. Microfluidic devices for imaging and manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. Liu, X., Sun, Y. 13, Academic Press. Cambridge, MA. Chapter 13 295-321 (2021).
  6. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  7. Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9, 14340 (2019).
  8. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).
  9. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).
  10. Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).
  11. Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).
  12. Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
  13. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  14. Jushaj, A., et al. Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system. PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).
  15. Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
  16. Espejo, L., et al. Long-term culture of individual Caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
  17. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  18. Freitas, S. Worm Paparazzi - A high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. University of Arizona. , Tucson, USA. Master's thesis (2021).
  19. Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: High-throughput analysis of nematode size and shape. PLoS One. 8 (2), e57142 (2013).
  20. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , (2013).
  21. Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), 982437 (2014).
  22. Grubbs, J. J., vander Linden, A. M., Raizen, D. M. Regulation of sleep by KIN-29 is not developmental. microPublication Biology. 2020, (2020).
  23. Iannacone, M. J., et al. The RFamide receptor DMSR-1 regulates stress-induced sleep in C. elegans. eLife. 6, 19837 (2017).
  24. McClanahan, P. D., et al. A quiescent state following mild sensory arousal in Caenorhabditis elegans is potentiated by stress. Scientific Reports. 10, 4140 (2020).
  25. Churgin, M. A., McCloskey, R. J., Peters, E., Fang-Yen, C. Antagonistic serotonergic and octopaminergic neural circuits mediate food-dependent locomotory behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 37 (33), 7811-7823 (2017).
  26. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
  27. Murphy, C. T., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
  28. Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C . elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  29. Lionaki, E., Tavernarakis, N. High-throughput and longitudinal analysis of aging and senescent decline in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 965, 485-500 (2013).
  30. Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C. elegans under dietary restriction. The Journal of Experimental Biology. 209, 4129-4139 (2006).
  31. Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. The Journal of Experimental Biology. 211, 3703-3711 (2008).
  32. Hartman, J. H., et al. Swimming exercise and transient food deprivation in Caenorhabditis elegans promote mitochondrial maintenance and protect against chemical-induced mitotoxicity. Scientific Reports. 8, 8359 (2018).
  33. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).

Tags

Indragning utgåva 190
Långtidsodling och övervakning av isolerade <em>Caenorhabditis elegans</em> på fasta medier i flerbrunnsenheter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gardea, E. A., DeNicola, D.,… More

Gardea, E. A., DeNicola, D., Freitas, S., Peterson, W., Dang, H., Shuck, K., Fang-Yen, C., Sutphin, G. L. Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices. J. Vis. Exp. (190), e64681, doi:10.3791/64681 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter