Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Çok Kuyulu Cihazlarda Katı Ortamda İzole Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Kültürü ve İzlenmesi

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64681
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, 2Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Pennsylvania

Summary

Burada sunulan, mikrofabrikasyon çok kuyucuklu cihazlarda katı ortam üzerinde izole edilmiş bireysel nematodların kültürlenmesi için optimize edilmiş bir protokoldür. Bu yaklaşım, bireysel hayvanların, aktivite, vücut büyüklüğü ve şekli, hareket geometrisi ve hayatta kalma dahil olmak üzere yaşlanma ve sağlıkla ilgili çeşitli fenotipler için yaşamları boyunca izlenmesini sağlar.

Abstract

Nematod Caenorhabditis elegans , basit ve ucuz kültür teknikleri, hızlı üreme döngüsü (~ 3 gün), kısa ömrü (~ 3 hafta) ve genetik manipülasyon ve moleküler analiz için çok sayıda mevcut araç nedeniyle yaşlanma araştırmalarında kullanılan en yaygın model sistemler arasındadır. Hayatta kalma analizi de dahil olmak üzere C. elegans'ta yaşlanma çalışmaları yürütmek için en yaygın yaklaşım, Petri plakalarındaki katı nematod büyüme ortamı (NGM) üzerinde onlarca ila yüzlerce hayvanın popülasyonlarının birlikte kültürlenmesini içerir. Bu yaklaşım bir hayvan popülasyonu hakkında veri toplarken, çoğu protokol zaman içinde bireysel hayvanları izlemez. Burada, bireysel hayvanların WorMotels adı verilen mikrofabrikasyon polidimetilsiloksan (PDMS) cihazlarında uzun süreli kültürlenmesi için optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır. Her cihaz, NGM içeren küçük kuyucuklarda 240'a kadar hayvanın kültürlenmesine izin verir ve her bir kuyu, hayvanların kaçmasını önleyen bakır sülfat içeren bir hendek ile izole edilir. Orijinal WorMotel açıklamasına dayanan bu makale, her bir cihazın kalıplanması, hazırlanması ve doldurulması için yaygın teknik komplikasyonların açıklamaları ve sorun giderme önerileri ile ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu protokolde, küçük hacimli NGM'nin tutarlı bir şekilde yüklenmesi, hem NGM hem de bakteriyel gıdaların tutarlı bir şekilde kurutulması için teknikler, farmakolojik müdahaleler sunma seçenekleri, PDMS cihazlarının yeniden kullanımına ilişkin talimatlar ve pratik sınırlamalar ve düşük nemli ortamlarda bile kurumayı en aza indirmek için ipuçları bulunmaktadır. Bu teknik, Petri plakalarındaki katı ortamlarda grup kültürü için standart tekniğe benzer bir ortamda, uyarılmış aktivite, uyarılmamış aktivite, vücut büyüklüğü, hareket geometrisi, sağlık süresi ve sağkalım dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik parametrelerin uzunlamasına izlenmesini sağlar. Bu yöntem, otomatik mikroskopi ve analiz yazılımı ile birlikte kullanıldığında yüksek verimli veri toplama ile uyumludur. Son olarak, bu tekniğin sınırlamaları tartışılmakta ve bu yaklaşımın katı ortam üzerinde izole nematodları kültürlemek için mikro tepsiler kullanan yeni geliştirilen bir yöntemle karşılaştırılması tartışılmaktadır.

Introduction

Caenorhabditis elegans , kısa üretim süreleri (yaklaşık 3 gün), kısa ömürleri (yaklaşık 3 hafta), laboratuvarda yetiştirme kolaylığı, memelilerle moleküler süreçlerin ve yolakların yüksek derecede evrimsel olarak korunması ve genetik manipülasyon tekniklerinin geniş mevcudiyeti nedeniyle yaşlanma çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Yaşlanma çalışmaları bağlamında, C. elegans , canlı hayvanlarda geç yaşam fenotiplerinin analizi için uzun ömür verilerinin ve yaşlı popülasyonların hızlı bir şekilde üretilmesine izin verir. Solucan yaşlanma çalışmalarını yürütmek için tipik yaklaşım, 6 cm Petri plakalarında katı agar nematod büyüme ortamı (NGM) üzerinde 20 ila 70 hayvanlık gruplar halinde tutulan bir solucan popülasyonunun ömrünün manuel olarak ölçülmesini içerir1. Yaş senkronize popülasyonların kullanılması, popülasyondaki bireysel hayvanlarda yaşam süresinin veya kesitsel fenotiplerin ölçülmesine izin verir, ancak bu yöntem bireysel hayvanların zaman içindeki özelliklerinin izlenmesini engeller. Bu yaklaşım aynı zamanda emek yoğundur, bu nedenle test edilebilecek nüfusun büyüklüğünü kısıtlar.

Bireysel C. elegans'ın yaşamları boyunca uzunlamasına izlenmesine izin veren sınırlı sayıda kültür yöntemi vardır ve her birinin farklı avantajları ve dezavantajları vardır. WormFarm2, NemaLife3 ve "davranış" çipi4 de dahil olmak üzere mikroakışkan cihazlar, diğerlerinin yanı sıra 5,6,7, bireysel hayvanların zaman içinde izlenmesine izin verir. Çok kuyucuklu plakalar kullanılarak sıvı kültürde solucanların kültürlenmesi, benzer şekilde, bireysel hayvanların veya küçük C. elegans popülasyonlarının zaman içinde izlenmesini sağlar 8,9. Sıvı ortam, Petri plakalarındaki katı ortamlardaki ortak kültür ortamından farklı bir çevresel bağlamı temsil eder; bu, yağ içeriği ve stres-tepki genlerinin ekspresyonu da dahil olmak üzere hayvan fizyolojisinin yaşlanma ile ilgili yönlerini değiştirebilir10,11. Bu çalışmaları yaşlanan C. elegans hakkında toplanan verilerin çoğunluğu ile doğrudan karşılaştırma yeteneği, potansiyel olarak önemli çevresel değişkenlerdeki farklılıklarla sınırlıdır. Worm Corral12, tipik katı medya kültürünü daha yakından kopyalayan bir ortamda bireysel hayvanları barındırmak için geliştirilen bir yaklaşımdır. Worm Corral, hidrojel kullanan bir mikroskop slaytında her hayvan için kapalı bir oda içerir ve izole hayvanların uzunlamasına izlenmesini sağlar. Bu yöntem, vücut büyüklüğü ve aktivitesi gibi morfolojik verileri kaydetmek için standart parlak alan görüntülemeyi kullanır. Bununla birlikte, hayvanlar hidrojel ortamına embriyo olarak yerleştirilir ve burada ömürleri boyunca rahatsız edilmeden kalırlar. Bu, şartlı olarak steril mutant veya transgenik genetik arka planların kullanılmasını gerektirir, bu da hem genetik tarama kapasitesini sınırlar, çünkü her yeni mutasyon veya transgenin koşullu kısırlığa sahip bir arka plana geçmesi gerekir hem de ilaç tarama kapasitesi, çünkü tedaviler embriyo olarak hayvanlara yalnızca bir kez uygulanabilir.

Fang-Yen laboratuvarı tarafından geliştirilen alternatif bir yöntem, WorMotel13,14 adı verilen mikrofabrikasyon polidimetilsiloksan (PDMS) cihazının bireysel kuyularında katı ortam üzerinde solucanların yetiştirilmesine izin verir. Her cihaz tek kuyucuklu bir tepsiye yerleştirilir (yani, 96 delikli bir plaka ile aynı boyutlarda) ve solucanların kuyucuklar arasında hareket etmesini önlemek için önleyici bir çözelti ile doldurulmuş bir hendekle ayrılmış 240 kuyucuğa sahiptir. Her kuyu, ömrü boyunca tek bir solucanı barındırabilir. Cihaz su emici poliakrilamid jel peletleri ("su kristalleri" olarak adlandırılır) ile çevrilidir ve tepsi, nemi korumak ve ortamın kurumasını en aza indirmek için Parafilm laboratuvar filmi ile kapatılmıştır. Bu sistem, bireysel hayvanlar için sağlık süresi ve yaşam süresi verilerinin toplanmasına izin verirken, katı ortam kullanımı, yayınlanmış C. elegans yaşam süresi çalışmalarının büyük çoğunluğunda hayvanların yaşadığı çevreyi daha iyi özetler ve böylece daha doğrudan karşılaştırmalara izin verir. Son zamanlarda, PDMS cihazı16 yerine mikrositotoksisite testleri15 için orijinal olarak kullanılan polistiren mikrotepsiler kullanılarak benzer bir teknik geliştirilmiştir. Mikrotepsi yöntemi, katı ortamda kültürlenen solucanlar için kişiselleştirilmiş verilerin toplanmasına izin verir ve tipik olarak kaçmaya neden olacak koşullar altında (örneğin, stresörler veya diyet kısıtlaması) solucanları içerme kapasitesini artırır; bunun karşılığı, her mikro tepsinin yalnızca 96 hayvan içerebileceğidir16, oysa burada kullanılan çok kuyucuklu cihaz 240'a kadar hayvan içerebilir.

Burada, plakadan plakaya tutarlılık ve paralel olarak birden fazla cihazın hazırlanması için optimize edilmiş çok kuyulu cihazların hazırlanması için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, Fang-Yen laboratuvarı13'teki orijinal protokolden uyarlanmıştır. Özellikle, kontaminasyonu en aza indirmek, hem katı ortamın hem de bakteriyel gıda kaynağının tutarlı kurumasını optimize etmek ve RNAi ve ilaçlar vermek için teknikler için açıklamalar vardır. Bu sistem, bireysel sağlık süresini, ömrünü ve vücut büyüklüğü ve şekli gibi diğer fenotipleri izlemek için kullanılabilir. Bu çok kuyucuklu cihazlar, kullanım ömrünü ölçmek için mevcut yüksek verimli sistemlerle uyumludur, bu da geleneksel yaşam süresi deneylerinde yer alan el emeğinin çoğunu ortadan kaldırabilir ve bireysel C. elegans'ta otomatik, doğrudan uzun ömür ölçümü ve sağlık takibi için fırsat sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Stok çözümlerinin ve ortamların hazırlanması

NOT: Çok kuyulu cihazların hazırlanmasına başlamadan önce, aşağıdaki stok çözümlerini ve ortamları hazırlayın.

  1. Nematod büyüme ortamı (NGM) ve düşük erimeli NGM (lmNGM) için stok çözümleri:
    1. 1 M K 2 HPO4 hazırlayın: 1 L'lik bir şişeye 174.18 g K2HPO4 ekleyin ve steril deiyonize suyla 1 L'ye kadar doldurun. 30 dakika boyunca otoklav (121 ° C, 15 psig) ve oda sıcaklığında (RT) saklayın.
    2. 1 M KPi, pH 6.0 hazırlayın: 1 L'lik bir şişeye 136.09 g KH2HPO4 ekleyin ve steril deiyonize suyla 1 L'ye kadar doldurun. 1 M K2HPO4 ila pH 6.0 ile titre edin. 30 dakika boyunca otoklav (121 ° C, 15 psig) ve RT'de saklayın.
    3. 1 M CaCl 2 hazırlayın: 500 mL'lik bir şişeye 73.5 g CaCl2 ekleyin ve steril deiyonize suyla 500 mL'ye kadar doldurun. 30 dakika boyunca otoklav (121 ° C, 15 psig) ve RT'de saklayın.
    4. 1 M MgSO 4 hazırlayın: 500 mL'lik bir şişeye 123.25 g MgSO4 ekleyin ve steril deiyonize suyla 500 mL'ye kadar doldurun. 30 dakika boyunca otoklav (121 ° C, 15 psig) ve RT'de saklayın.
    5. 5 mg / mL kolesterol hazırlayın: 2.5 g kolesterol, 275 mL% 100 etanol ve 25 mL steril deiyonize suyu 500 mL amber şişede birleştirin. RT'de depolayın.
    6. 50 mM floksuridin hazırlayın: 0.1231 g floksuridin ve 10 mL steril deiyonize suyu 15 mL'lik bir konik tüpte birleştirin. 10 mL'lik bir şırınga kullanarak 0,22 μm'lik bir filtre ile filtreleyin-sterilize edin. Her biri 10 mikrosantrifüj tüpüne 1 mL aliquot edin ve bunları -20 ° C'de saklayın.
    7. 50 mg / mL karbenisilin hazırlayın: 15 mL'lik bir konik tüpte, 500 mg karbenisilin ile 10 mL steril deiyonize su ile birleştirin. 10 mL'lik bir şırınga kullanarak 0,22 μm'lik bir filtre ile filtreleyin-sterilize edin. Her biri 10 mikrosantrifüj tüpüne 1 mL aliquot edin ve bunları -20 ° C'de saklayın.
    8. 1 mM izopropil ß-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) hazırlayın: 15 mL'lik bir konik tüpte, 2.38 g IPTG'yi 10 mL steril deiyonize su ile birleştirin. 10 mL'lik bir şırınga kullanarak 0,22 μm'lik bir filtre ile filtreleyin-sterilize edin. Her biri 10 mikrosantrifüj tüpüne 1 mL aliquot edin ve bunları -20 ° C'de saklayın.
    9. 100 mg / mL ampisilin hazırlayın: 15 mL'lik bir konik tüpte, 1 g ampisilin'i 10 mL steril deiyonize su ile birleştirin. 10 mL'lik bir şırınga kullanarak 0,22 μm'lik bir filtre ile filtreleyin-sterilize edin. Her biri 10 mikrosantrifüj tüpüne 1 mL aliquot edin ve bunları -20 ° C'de saklayın.
  2. Genel C. elegans bakımı için nematod büyüme ortamının (NGM) hazırlanması
    1. 50 plaka yapmak için, 1 L'lik bir şişede, 10 g Bacto agar, 1.5 g NaCl, 1.25 g Bacto pepton ve 486 mL ultra saf su birleştirin. Sterilize etmek için en az 30 dakika boyunca bir sıvı döngüsünde (121 ° C, 15 psig) otoklav yapın.
    2. Otoklav sonrası, ortam 55 ° C'ye soğutulduktan sonra, 1 M KPi'nin 12,5 mL'si, 1 M MgSO4'ün 500 μL'si, 1 M CaCl2'nin 500 μL'si ve 500 μL'si 5 mg / mL kolesterolü ekleyin.
    3. Steril bir teknik kullanarak, her 60 mm'lik plakaya (toplam 50) 10 mL ortam dökün. Medya katılaştıktan sonra (dökülmeden en az 30 dakika sonra), plakanın ortasına gece boyunca yetiştirilen 300 μL bakteri kültürü pipeti (adım 4 ve adım 10'a göre hazırlanır). Plakayı tezgahta bırakın, bakteri kültürünün kurumasını ve kalınlaşmasını sağlayın (1-2 gün). Plakaları 4 °C'de saklayın.
  3. Düşük erimeli nematod büyüme ortamı (lmNGM) ön karışımını hazırlayın:
    1. 500 mL'lik bir şişede, 4 g düşük erimeli agaroz, 0.5 g Bacto Peptone ve 195 mL ultra saf su birleştirin. Sterilize etmek için en az 30 dakika boyunca bir sıvı döngüsünde (121 ° C, 15 psig) otoklav yapın.
    2. Medya hala erimiş durumdayken, 10 mL aliquots'u steril cam test tüplerine dağıtın. lmNGM ön karışımını korumak ve kurumayı önlemek için her bir test tüpünü Parafilm ve ardından bir test tüpü kapağı ile kapatın. Medya katılaşır ve kullanımdan önce RT'de ~ 2 hafta saklanabilir.
  4. 142.8 mM NaCl hazırlayın: 250 mL'lik bir şişede, 0.8345 g NaCl ve 100 mL steril deiyonize suyu birleştirin. 30 dakika boyunca otoklav (121 ° C, 15 psig) ve RT'de saklayın.
  5. Deterjan çözeltisi hazırlayın: 15 mL'lik bir konik tüpte, 3 mL Tween 20 ve 7 mL steril deiyonize su birleştirin. İyice karıştırın, 10 mL'lik bir şırınga kullanarak 0,22 μm'lik bir filtreyle filtreleyin-sterilize edin ve RT'de saklayın.
  6. Bakır sülfat çözeltisi hazırlayın: Steril 50 mL'lik bir şişede, 20 mL steril deiyonize su, 0.5 g CuSO4 ve 100 μL deterjan çözeltisini (adım 1.5'te hazırlanan) birleştirin. CuSO4 çözünene kadar karıştırın. RT'de depolayın.
  7. Su emici poliakrilamid kristalleri hazırlayın: Otoklav güvenli bir sıkma şişesinde, 150 mL deiyonize su ve 1 g Tip S süper emici polimeri birleştirin. Şişeyi birkaç kez ters çevirerek hafifçe karıştırın. Bir sıvı döngüsünde (121 ° C, 15 psig) en az 20 dakika boyunca otoklavlayın ve RT'de saklayın.
  8. Lizojeni suyu (LB) hazırlayın: 1 L veya daha büyük bir beherde, 20 g LB tozunu 1 L deiyonize su ile birleştirin. İki adet 500 mL beher içine Aliquot. 30 dakika boyunca otoklav (121 °C, 15 psig) ve RT'de saklayın
  9. Lizojeni suyu (LB) agar plakalarını hazırlayın:
    1. 1 L'lik bir şişede, 10 g LB tozu, 7.5 g Bacto Agar ve 500 mL deiyonize su birleştirin. 30 dakika boyunca bir sıvı döngüsünde (121 ° C, 15 psig) otoklav.
    2. İstenirse, isteğe bağlı antibiyotikler ekleyin (otoklav sonrası, ortam 55 ° C'ye soğutulduktan sonra): 500 μL 100 mg / mL ampisilin. Steril bir teknik kullanarak, her 100 mm'lik plakaya (toplam 25 adet) 20 mL ortam dökün ve 4 °C'de saklayın.

2. 3D çok kuyulu cihaz kalıbının basılması

NOT: Her cihaz, özel bir 3D baskılı kalıp kullanılarak PDMS'den kalıplanır. Tek bir kalıp gerektiği kadar cihaz üretebilir; Bununla birlikte, aynı anda birden fazla cihaz hazırlanmaya çalışılıyorsa, paralel olarak yapılacak her cihaz için bir adet 3D baskılı kalıp gerekir.

  1. STL dosyasını indirin (bkz. Ek Dosya 1).
  2. Kalıbı yüksek çözünürlüklü bir 3D yazıcı ile yazdırın.
    NOT: Yazıcının çözünürlüğü, tutarlı kuyu ve hendek hacimlerine izin verecek kadar yüksek olmalıdır. Önerilen yazıcı çözünürlüğü, ~ 40 μm minimum XY çözünürlüğü ve 28 μm katman çözünürlüğüdür. 3D yazıcı tarafından kullanılan malzeme de aynı derecede önemlidir, çünkü birçok malzeme türü PDMS'nin kürlenmesini önleyecektir. Deneyimlere göre, Vero Black baskı malzemesi kullanılarak yüksek çözünürlüklü PolyJet yazıcılar tarafından üretilen kalıplar (çözünürlük: X ekseni = 600 dpi, Y ekseni = 600 dpi, Z ekseni = 1.600 dpi) tutarlı bir şekilde çalışır. Bu çalışmada kullanılan kalıpların 3D baskısı dış kaynaklı olmuştur (baskı detayları Malzeme Tablosunda bulunabilir).

3. Çok kuyulu cihazın hazırlanması

NOT: Bu bölümde, PDMS çok kuyucuklu cihazı oluşturmak için 3D yazdırılmış kalıbın nasıl kullanıldığı açıklanmaktadır.

  1. Ön ısıtmaya izin vermek için kürleme fırınını 55 °C'ye ayarlayın.
  2. Bir partide hazırlanacak cihaz sayısını belirleyin. Her cihaz için 60 g PDMS baz ve 6 g kürleme maddesini tek kullanımlık bir spatula kullanarak büyük, tek kullanımlık bir tartım teknesinde (veya benzer bir tek kullanımlık kapta) karıştırın.
  3. Kabarcıkları gidermek için PDMS karışımını -0.08 MPa'da 30 dakika boyunca bir vakum odasına yerleştirin.
  4. PDMS karışımını her 3D baskılı kalıba dökün. Kalıbı, PDMS karışımı kalıbın üst kısmının biraz yukarısına uzanacak şekilde tamamen doldurun. Dökülme durumunda kalıbı yeniden doldurmak için fazla PDMS karışımını saklayın.
  5. Dökme işlemi sırasında oluşan kabarcıkları gidermek için doldurulmuş kalıbı ve herhangi bir ekstra PDMS karışımını -0.08 MPa'da 25 dakika boyunca vakum odasına koyun.
  6. Doldurulmuş kalıbı vakum odasından çıkarın ve kalan kabarcıkları tek kullanımlık bir spatula ile patlatın. Görünür kalıntıları veya kalan kabarcıkları kalıbın kenarına kuyucuklardan uzaklaştırmak için spatulayı kullanın. Kalan herhangi bir enkaz veya kabarcık, sonraki adımlarda görüntülemeye potansiyel olarak müdahale edebilir.
  7. Kalıbın PDMS karışımı ile tamamen doldurulduğundan emin olun; Karışımın küçük bir kısmının vakum odasındayken veya transfer sırasında dökülmesi yaygındır. Adım 3.5'te gazdan arındırılan ekstra PDMS karışımını kullanarak yeniden doldurun. Bu kabarcıklar oluşturmamalıdır, ancak herhangi biri oluşursa, spatula ile kalıbın yanına hafifçe fırçalanabilir.
  8. PDMS dolgulu kalıbın üzerine, önce bir kenarı yerleştirerek ve akrilik kalıbın üzerine düz bir şekilde oturana kadar diğerini yavaşça indirerek, kenarın üzerine uzanan herhangi bir PDMS karışımının yerini alarak düz bir akrilik tabaka yerleştirin. Akrilik tabakayı yerleştirirken kabarcıklar oluşursa, akriliği yavaşça çıkarın, gerekirse kalıbı PDMS karışımıyla doldurun ve akrilik yerleştirmeyi yeniden başlatın. Akrilik levha, kalıplanmış cihaz için düz bir taban oluşturacak ve tüm kuyucukların tabana göre aynı seviyede olmasını sağlayacaktır.
  9. Akriliğin üzerine 2,5 lb ağırlık yerleştirin. Her biri ayrı bir akrilik tabakaya sahip birden fazla kalıp istiflenebilir. Ağırlıklı kalıpları fırına yerleştirin ve gece boyunca 55 ° C'de kürlenmelerine izin verin.
  10. Ertesi gün, ağırlıkları ve kalıpları fırından çıkarın.
  11. Contayı kırmak için akrilik ve kürlenmiş PDMS arasında bir tıraş bıçağını dikkatlice çalışın. Akriliği kalıbın üstünden dikkatlice çıkarın. PDMS bu noktaya kadar ayarlanmış olacak ve akriliğin çıkarılması biraz kuvvet alabilir.
  12. Bir tıraş bıçağı veya metal bir spatula kullanarak, kürlenmiş PDMS'nin kenarlarını kalıptan dikkatlice gevşetin. Bu aşamada PDMS'yi yırtmak kolaydır; PDMS cihazını sağlam bir şekilde çıkarmak için kenarın etrafında yavaşça ve nazikçe çalışın.
    NOT: Yeni basılmış kalıplar ilk üç kullanım için özellikle yapışkandır ve PDMS cihazı çıkarmaya çalışırken sıklıkla yırtılır. Daha fazla kullanımla, kürlenmiş PDMS'yi kalıptan çıkarmak daha kolay hale gelir.
  13. Cihazı alüminyum folyoya sarın ve otoklav bantla kapatın. Kuru bir döngüde 121 ° C'de en az 15 dakika, sterilize etmek için 15 psig otoklav. Otoklavlamadan sonra, sarılmış cihazları tezgahta saklayın ve gerektiğinde kullanın.

4. Bakterileri çizgilemek

NOT: Solucanların besin kaynağı olarak kullanılacak bakterileri çok kuyucuklu cihazdayken hazırlamaya başlayın. En yaygın bakteri Escherichia coli suşu OP50'dir (veya RNAi deneyleri için HT115 suşu). Solucanları cihaza eklemeden en az 2 gün önce bu adımı tamamlayın.

  1. Bakterileri taze bir LB plakasına çizin. Herhangi bir suşa özgü seçici katkı maddesinin (örneğin, bakterilere ampisilin direnci kazandıran bir plazmid seçmek için ampisilin) LB plakalarına dahil edildiğinden emin olun.
  2. Kolonilerin büyümesine izin vermek için plakayı gece boyunca 37 ° C'de (~ 18 saat) inkübe edin.

5. Medya yüklemesi için çok kuyulu cihazın hazırlanması

NOT: Cihazı oluşturan silikon PDMS malzemesinin yüzeyi hidrofobiktir, bu da küçük hacimli kuyucukların ve önleyici hendeklerin sırasıyla NGM ve bakır sülfat ile doldurulmasını önler. Bu sorunu aşmak için, cihazın yüzey özelliklerini geçici olarak hidrofilik olacak şekilde değiştirmek için bir oksijen plazması kullanılır ve kuyuların ve hendeğin sınırlı bir süre içinde (~ 2 saate kadar) doldurulmasına izin verilir. Bu bölüm, plazma temizleme işlemini tamamlama adımlarını ortaya koymaktadır. Bu adımı, cihazın bakteri kuyularını tespit etmeden en az 1 gün önce tamamlayın, çünkü plazma temizliğinin kalıcı etkileri lekelenmeyi engelleyebilir. Bölüm 5-7'nin zamanlaması göz önüne alındığında, teknisyen başına bu adımlar için pratik sınır paralel olarak üç cihazdır.

  1. Bölüm 6'ya hazırlık olarak kuru boncuk banyosu inkübatörünü önceden 90 ° C'ye ısıtın.
  2. Çok kuyulu bir cihazın kuyularını doldurmak için gereken toplam ortam hacmi, Petri plakalarına kıyasla küçük olduğundan, büyük bir NGM partisi hazırlayın ve test tüplerine ayırın (bkz. adım 1.3).
    NOT: Bu, ortam tüpleri tezgahta ~ 2 hafta boyunca saklanabildiğinden, önceden yapılabilir. Medya hazırlanmışsa ve tüplere aktarılmışsa, adım 5.3'e geçin.
  3. Eldiven giyerken, otoklavlanmış çok kuyucuklu bir cihazın ambalajını açın; Kuyulardan herhangi birine dokunmaktan kaçının. Kaç kez kullanıldığını/yeniden kullanıldığını belirtmek için cihazın sağ üst köşesindeki küçük bir çentiği kesin (her bir cihazın temizlenmesi ve yeniden kullanılmasıyla ilgili talimatlar ve öneriler için aşağıdaki bölüm 15'e bakın).
  4. Plazma temizleyiciye, kuyucuklar yukarı bakacak şekilde üç adede kadar ambalajsız cihaz yerleştirin. Plazma temizleyiciyi çalıştırın.
    NOT : Aşağıdaki ayrıntılı talimatlar Plasma Etch PE-50 plazma temizleyici içindir. Özel adımların ve ayarların diğer plazma temizleyiciler için uyarlanması ve muhtemelen yeniden optimize edilmesi gerekir.
    1. Plazma temizleyici güç seviyesinin %75 olarak ayarlandığını kontrol edin.
    2. Hem havalandırma hem de izolasyon vanalarının KAPALI konumda olduğundan emin olun.
    3. Oksijen tankındaki ana valfi açın. Regülatör basıncı 15 psig ile 20 psig arasına düşene kadar bekleyin ve ardından izolasyon valfini AÇIK konuma getirin.
    4. Vakum pompasını ve plazma temizleyiciyi açın.
    5. Plazma temizleyiciye aşağıdaki ayarları girin (ilk kullanım) veya önceden programlanmış ayarların doğru olduğundan emin olun:
      Plazma Süresi: 3:00 dk
      Vakum Ayar Noktası: 149.5 mTorr
      Atmosferik Havalandırma: 45 s
      Boşaltma Menfezi: 5 s
      Gaz Stabilizasyonu: 15 s
      Vakum Alarmı: 3:00 dk
      Otomatik Kapanma: AÇIK
    6. Komutlar Menüsü'ne gitmek için Enter tuşuna basın. Sağ Ok tuşunu kullanarak Ayarlar Menüsü'nü seçin ve Enter tuşuna basın. Her geçerli ayarı onaylamak için Enter tuşuna basarak tüm ayarlar arasında gezinin ve ardından bir sonraki ayara geçmek için Sağ Ok'u kullanın.
    7. Yukarı Ok'a ve ardından Sol Ok'a basarak Komutlar Menüsü'ne dönün.
    8. Komutlar Menüsü ekranında Enter tuşuna basın. Enter tuşuna basarak PLASMA Komutları'nı seçin. Sistem aşağıdaki aşamalardan geçecektir:
      Plazma Pompalama
      Gaz Stabilize: Bu aşamada, plazma temizleyici üzerindeki Gaz 1 düğmesini debimetre 10 cc / dak'ya gelene kadar ayarlayın.
      Plazma Zamanı
      Boşaltma Pompası
      Plazma Döngüsü Tamamlandı
      Oda Havalandırması
      NOT: Bu işlemin tamamlanması yaklaşık 5-10 dakika sürmelidir. Tüm aşamalar tamamlandığında, Komutlar Menüsü ekranda tekrar görüntülenir. Plazma Pompalama aşaması sırasında, basınç yeterince düşmezse, plazma temizleyici bir sonraki aşamaya geçmez ve ekran bir hata mesajı görüntüler. Bu durumda, vakum pompası yağını kontrol edin. Yağ seviyeleri düşükse veya yağ bulutlu/kirliyse, yağın değiştirilmesi vakum basıncının gerekli seviyeye ulaşmasına izin verebilir.
    9. Oksijen tankındaki ana valfi kapatın.
    10. Çok yavaşça, havalandırma valfini AÇIK konumuna getirin ve oksijen tankının regülatör basıncının sıfıra dönmesine izin verin.
    11. İzolasyon valfini KAPALI konumuna getirin.
    12. Vakum pompasını ve plazma temizleyiciyi kapatın.
      NOT: Çok kuyulu cihazın plazma temizleyici tarafından hidrofilik yüzey modifikasyonu geçicidir ve zamanla (yaklaşık 2 saate kadar) giderek daha az etkili hale gelir. Bölüm 6 ve bölüm 7'de mümkün olduğunca çabuk ilerleyin.

6. Kuyuların lmNGM ile doldurulması

NOT: Bir kuru boncuk banyosu inkübatörü açık olmalı ve adım 5.1'den itibaren önceden ısıtılmalıdır. Banyonun 90 ° C'ye ulaştığından emin olun.

  1. Tepsinin içine% 70 etanol püskürterek ve bir görev mendili ile kurutarak cihaz başına bir adet tek kuyucuklu polistiren tepsiyi sterilize edin.
  2. Her cihazı eldivenli bir elinizle plazma temizleyiciden çıkarın ve temizlenmiş bir tepsiye yerleştirin.
  3. Boncuk banyosu inkübatörüne 90 ° C'ye ısıttıktan sonra 25 mL'lik tek kullanımlık bir pipet havuzu yerleştirin.
  4. Doldurulacak cihaz başına bir tüp katılaşmış lmNGM ön karışımı toplayın (bkz. adım 1.3).
  5. lmNGM ön karışım test tüplerini 200 mL'lik bir cam beher içine yerleştirin ve kapakları ve Parafilmi çıkarın. Ortam dökülecek kadar eriyene kadar ~ 20 s boyunca mikrodalga fırın (bazı katı ortamların varlığı bu aşamada iyidir).
  6. Erimiş lmNGM ön karışımını birden fazla test tüpünden başka bir steril 200 mL beherde birleştirin. Toplam 40 sn'ye ulaşmak için 20 saniye daha mikrodalgaya devam edin. LmNGM ön karışımı kaynamaya başlarsa, mikrodalgayı durdurun ve devam etmeden önce lmNGM ön karışımının yerleşmesine izin verin.
  7. Erimiş lmNGM ön karışımını mikrodalgadan çıkarın ve ~60 °C'ye soğumasını bekleyin.
    NOT: Bu aşamada, ortam ~5 dakika sonra soğuyacak ve yeniden katılaşacaktır. Hemen adım 6.8 ve adım 6.9'a geçin.
  8. Her 10 mL lmNGM ön karışımı için aşağıdakileri ekleyin (sırayla): 250 μL 1 M KPi, 10 μL 1 M MgSO4, 10 μL 1 M CaCl2 ve 10 μL 5 mg / mL kolesterol.
    1. Cihazdaki yetişkinleri izlerken yumurtadan çıkmayı önlemek için, 10 μL 50 mM floksuridin ekleyin.
    2. Bir RNAi plazmidi seçmek ve RNA'nın ekspresyonunu indüklemek için, 5 μL 50 mg / mL karbenisilin ve 12 μL 1 mM IPTG ekleyin.
      NOT: Antibiyotikler veya diğer katkı maddeleri, deneyin tasarımına bağlı olarak değiştirilebilir. Test bileşikleri/ilaçlar da bu aşamada ortama eklenebilir.
  9. Erimiş lmNGM'yi boncuk banyosundaki 25 mL havzasına dökün.
  10. 200 μL çok kanallı tekrarlayıcı pipet kullanarak cihaz kuyucuklarını lmNGM ile doldurun.
    1. Tekrarlayıcıyı 14 μL'lik alikotları dağıtacak şekilde ayarlayın (200 μL'lik bir pipet ucu kullanılıyorsa 14 μL'ye kadar 14 kez dağıtılabilir).
    2. Beş pipet ucu takın. Cihazın kuyuları, 384 delikli bir plaka ile aynı aralığa sahiptir. Standart çok kanallı pipetler, kullanıcının bir satır/sütun halinde diğer her bir kuyucuğa pipet atabileceği şekilde aralıklıdır.
    3. Uçları erimiş lmNGM ile yükleyin. İlk 14 μL'yi lmNGM içeren havzaya geri dağıtın.
    4. Hızlı ama dikkatli bir şekilde hareket ederek, Şekil 1B'de bir "x" ile işaretlenenlerden başlayarak ve plaka boyunca sağa ve sonra aşağıya doğru hareket ederek toplam 12 kez (60 kuyucuk) dağıtarak iç kuyucuklara (Şekil 1B'de beyaz) 14 μL dağıtın.
    5. Kalan lmNGM'yi havzaya geri dağıtın, çünkü son aliquot tipik olarak 14 μL'den azdır.
    6. Tüm iç kuyucuklar doldurulana kadar 6.10.3-6.10.5 adımlarını tekrarlayın.
    7. Daha sonra, tekrarlayıcıyı 15 μL'lik alikotları dağıtacak şekilde ayarlayın. 6.10.3-6.10.5 adımlarını tekrarlayın, ancak iç kuyucuklar yerine, Şekil 1B'de "+" ile işaretlenmiş kuyucuklarla başlayan ve plakanın dış kenarı etrafında hareket eden en dıştaki kuyucuk halkasını (Şekil 1B'de gri) doldurun.
      NOT: Ortamın pipet uçlarında katılaşmaması için hızlı çalışın. Hendeğe herhangi bir lmNGM dökmekten kaçının. Dış kuyular daha çabuk kuruma eğilimindedir. Ekstra 1 μL lmNGM, nihai kurutulmuş kuyucuğun iç kuyucuklarla aynı kuruma süresinde düz bir yüzeye sahip olmasını sağlar.
  11. Bir kalite kontrol adımı olarak, az doldurulmuş (lmNGM yüzeyi kuyunun kenarının altına batırılmış), aşırı doldurulmuş (lmNGM yüzeyinin kubbeli bir tepesi vardır) ve kabarcıklar veya döküntüler içeren kuyular da dahil olmak üzere görüntülemeye müdahale edebilecek kusurları olanları belirlemek için her bir kuyuyu inceleyin.
  12. Katılaşmış lmNGM'yi kısa bir platin tel çekme veya vakumlu aspiratör ile tatmin edici olmayan kuyucuklardan çıkarın. Boş kuyucukları taze erimiş lmNGM ile doldurun. Ayrıca, hendeğe taşan ortamları kısa bir platin tel çekme veya vakum aspiratörü ile çıkarın.

7. Hendeğe bakır sülfat eklenmesi

NOT: Bu cihazın kuyuları sürekli bir hendek ile çevrilidir. Burada, hendek bir kovucu görevi gören ve solucanların kuyularından kaçmasını engelleyen bakır sülfat ile doldurulur.

  1. 200 μL'lik bir pipet kullanarak, her köşedeki cihaz hendeğine, köşe başına 2 kat olmak üzere 200 μL bakır sülfat çözeltisi (bkz. adım 1.6) dağıtın. Bu, bakır sülfatın tüm hendek boyunca akması için yeterince büyük bir hacim olmalıdır. Hendeği hiçbir noktada aşırı doldurmamaya dikkat edin; Bakır sülfat, kuyucukların üst yüzeyine temas etmemelidir.
  2. Bakır sülfat tüm hendek boyunca kolayca akmazsa, gerginliği kırmaya yardımcı olmak ve bakır sülfatı hendek boyunca sürüklemek için kısa bir platin tel çekme kullanın.
  3. Bakır sülfat hendeğin tamamı boyunca aktıktan sonra, 200 μL'lik bir pipet veya vakumlu aspirasyon kullanarak hendekten mümkün olduğunca fazla bakır sülfat çıkarın. Geride kalan kalıntı, solucanların kuyularını terk etmelerini engellemek için yeterli olacaktır. Hendeği bakır sülfat çözeltisi ile dolu bırakmak, bakır sülfatın kuyucuklara dökülmesini önler ve bu da solucanların kaçmasına neden olur.

8. Otoklavlanmış su kristallerinin eklenmesi

NOT: Plaka içindeki nemi korumak ve lmNGM'nin kurumasını önlemek için, her cihaz doymuş su emici poliakrilamid kristalleri ile çevrilidir.

  1. Su kristallerini hazırlayın (bkz. adım 1.7).
  2. Bir sıkma şişesi kullanarak, su kristallerini cihaz ile tepsi duvarları arasındaki boşluklara ekleyin. Tepsi kapağını kapatın ve dört tarafı da bir parça Parafilm ile sarın. Plakayı tamamen kapatmak için iki ek Parafilm parçası ekleyin.
    NOT: Su kristalleri bir beherde hazırlanabilir ve sterilize edilmiş bir spatula ile tepsiye kepçelenebilir. Bununla birlikte, bu prosedüre zaman kazandırır ve her tepsinin açık olduğu ve potansiyel kirleticilere maruz kaldığı süreyi arttırır.
  3. Mühürlü cihazı, bakterilerin tespit edilmeye hazır olduğu ertesi güne kadar tezgahta bırakın. Cihazların, lmNGM eklendikten sonra kuyucuklar yukarı bakacak şekilde depolandığından emin olun.

9. Yaşa senkronize solucan popülasyonunun hazırlanması

NOT: Aşağıdaki adımlar, dördüncü larva aşamasında (L4) çok kuyucuklu cihaza eklenmeye hazır senkronize bir solucan popülasyonu verir. Bununla birlikte, gelişimin farklı aşamalarındaki solucanlar da eklenebilir. L4'ler istenirse solucanlar cihaza eklenmeden 2 gün önce bu adım tamamlanmalıdır. İstenen yaşam aşaması için senkronizasyon zamanlamasını ayarlayın.

  1. Tutarlı yaşlanma çalışmaları için, C. elegans'ı standart NGM plakalarında tutun (iyi beslenen koşullar altında 20 ° C'de adım 1.2'ye bakınız).
  2. Standart yöntemlerle , örneğin ağartma17 veya zamanlanmış yumurtlama1 gibi bir stok plakasından senkronize bir hayvan popülasyonu elde edin.
  3. Bakterilerle lekelenmiş bir NGM plakasına izole edilmiş yumurtalar ekleyin. Yumurtalar bu tabakta yumurtadan çıkacak ve solucanlar vahşi tip hayvanlar için 2 gün içinde L4 larva aşamasına ulaşacaktır.

10. Bakteri kültürünün aşılanması

NOT: Bakteriler, C. elegans, en yaygın olarak E. coli suşları OP50 veya HT115 için birincil besin kaynağı olarak kullanılır. Bakteriler, hazırlanan kültürün hacminde hesaba katılması gereken 10 kat konsantre edilir. Cihazı tespit etmeden bir gün önce bir bakteri kültürü hazırlayın.

  1. 4. adımda hazırlanan LB plakasından tek bir koloni seçin ve tespit edilecek cihaz başına 12 mL steril LB aşılayın. Kullanılan bakteri suşu için gerekirse seçici ajanlar ekleyin.
  2. Bakteri kültürünü gece boyunca (~ 18 saat) 37 ° C'lik bir inkübatörde ~ 250 rpm'de çalkalayarak büyütün.

11. Konsantre bakterilerle kuyuların tespit edilmesi

NOT: Her bir kuyucuğa az miktarda konsantre bakteri eklenir, bu da solucanları cihazdaki tüm ömürleri boyunca beslemek için yeterlidir. Solucanlar kuyucuklara eklenmeden önce bakteri kültürünün kurutulması gerekir. Her bir kuyucuktaki ortam hacmi, eklenen bakteri hacmine (5 μL) göre küçük (14-15 μL) olduğundan, bakteriyel ortamın kimyasal içeriği kuyunun kimyasal ortamını etkileyebilir. Bunu açıklamak için, bakteriler hipoozmotik stresten kaçınırken tükenmiş LB'yi gidermek için tuzlu suda konsantre edilir ve yeniden askıya alınır. Bu aşamada eklendiği için lmNGM tarifine tuz eklenmez (bkz. adım 1.3-1.4).

  1. Bakterileri bölüm 10'da açıklandığı gibi bir gecede büyüttükten sonra, bakteri kültürünü 10x konsantre edin. 20 dakika boyunca ~ 3.400 x g'de santrifüj yaparak bakterileri pelet edin, süpernatanı atın ve peleti 142.8 mM NaCl'lik orijinal kültür hacminin 1 / 10'unda yeniden askıya alın (bkz. adım 1.4). Örneğin, 240 kuyucuklu bir cihazı tespit etmek için 12 mL kültürü döndürün ve 142,8 mM NaCl'nin 1,2 mL'sinde yeniden askıya alın.
    NOT: Test bileşikleri/ilaçları, lekelenmeden önce yeniden askıya alınmış bakteri kültürüne eklenebilir.
  2. Tekrarlanan bir pipet kullanarak, her bir kuyucuğu 5 μL konsantre bakteri ile tespit edin. Pipet ucu lmNGM'yi delebileceğinden ve solucanın kuyu yüzeyinin altına girmesine izin verebileceğinden, lmNGM yüzeyiyle doğrudan temastan kaçının. Bakterilerin hendeğe dökülmesine izin vermemeye dikkat edin, çünkü solucanlar ona çekilecek ve hendeğe kaçacaktır.
  3. Benekli bakterileri tepsi kapakları çıkarılmış olarak kurutun. Bu adım, kuyu ortamının uzun vadeli bütünlüğü için önemlidir ve lekeli cihazları kurutmanın çeşitli yolları vardır. Hangi yöntem kullanılırsa kullanılsın, bakteriler kururken açıkta kalması gerektiğinden, cihazın steril bir ortamda kaldığından emin olun. Artan hava akışı, kuruma süresini büyük ölçüde azaltır. Kurutma, aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi gerçekleştirilebilir:
    1. Cihazı, %10 ağartıcı ve ardından %70 etanol ile temizlenmiş plastik bir kutu gibi temiz, kapalı bir kapta açıkta bırakın. Bu kurutma yöntemi birkaç saat sürebilir.
    2. Ortaya çıkarılan cihazları steril laminer akış başlığına yerleştirin (aşağıda tercih edilen yönteme benzer).
    3. Cihazları, bilgisayar kasası fanları ve HEPA filtreleri kullanılarak minimum maliyetle inşa edilebilen özel yapım bir "kurutma kutusu" (bu çalışmada izlenen optimize edilmiş yöntem) kullanarak kurutun ( Ek Dosya 1'e bakınız).
      NOT: Kullanılan metottan bağımsız olarak, kurutma adımının yerel ortam için optimize edilmesi gerekir. Tipik kuruma süresi belirlenene kadar kuyucukların ne kadar hızlı kuruduğunu sık sık izleyin. Düşük nemli bir ortamda, bir kurutma kutusunun kullanılması ~ 30-40 dakikalık bir kuruma süresine neden olur. Plakaların çok kurumasına izin vermeyin, çünkü kuyucuklardaki ortam büzülür ve batar. Birkaç kuyucuk hala ıslakken cihazın kurumasını engellemek, daha uzun süre kurumasına ve potansiyel olarak çok sayıda kuyucuğun aşırı kurumasına izin vermekten daha iyidir.
  4. Su kristallerini kontrol edin. Tepsideki su kristallerinin çoğunluğu kurutma işlemi sırasında kurumuş ve hacim kaybetmişse, tepsiye daha fazlasını ekleyin.
  5. Bakteriler kuruduktan sonra, solucanları hemen ekleyin (bölüm 12) veya daha sonra kullanmak üzere tepsiyi kapatın. Kapatmak için tepsi kapağını kapatın ve dört tarafı da tek bir Parafilm parçasıyla sarın. Toplam üç Parafilm katmanı için iki kez tekrarlayın. Tepsiyi tamamen sardıktan sonra, cihaz solucanları eklemeden önce 4 güne kadar oda sıcaklığında tezgahta bırakılabilir (bölüm 12).

12. Çok kuyulu cihaza solucanlar ekleme

  1. Hayvanları bölüm 9'da hazırlanan solucan plakalarından aktarmak için bir platin toplama kullanarak her kuyucuğa manuel olarak bir solucan ekleyin. Sadece istenen yaşam aşamasında ve yaşında olan solucanları seçin.
    NOT: Solucanları cihaza eklemek için 1 saatten fazla zaman geçmesi lmNGM kurumasına neden olabilir, bu nedenle solucanlar mümkün olduğunca çabuk eklenmelidir. Cihaz kuyularına eklemeden önce aynı anda birden fazla solucan (20+) seçmek, hızı artırmaya yardımcı olabilir.

13. Cihazın uzun süreli kullanım için hazırlanmasının tamamlanması

NOT: Bu adımlar, cihaz kuyularının deney süresince sulu kalmasını sağlar.

  1. Su kristallerini inceleyin. Su kristallerinin cihazın üst kısmı ile aynı hizada olduğundan ancak üzerine taşmadığından emin olun. Gerekirse tepsiye ilave su kristalleri ekleyin.
  2. Tepsi kapağının içine bir damla hazır deterjan çözeltisi ekleyin (bkz. adım 1.5) ve deterjan çözeltisi kuruyana kadar bir görev mendili ile ovalayın. Bu, cihaz tepsinin içine kapatıldıktan sonra kapakta buğulanmayı önler, böylece solucanlar açıkça görülebilir.
  3. Parafilm mührünün uzun vadeli bütünlüğünü destekleyen özel bir teknik kullanarak tepsiyi üç parça Parafilm ile sarın.
    1. Bir parça Parafilm'i tepsinin sadece iki tarafını kaplayacak şekilde hafifçe gerin. Diğer iki tarafı örtmek için bunu ikinci bir Parafilm parçası ile tekrarlayın.
    2. Parafilm'in ilk katmanının üzerine katmanlanmış, son bir Parafilm parçası alın, tamamen gerin ve dört tarafını da sarın. Düzgün bir şekilde kapatılırsa, cihaz kuyuları ~ 2 ay boyunca sulu kalmalıdır.
      NOT: Parafilm bütünlüğü her 1-2 haftada bir izlenmeli ve Parafilm kırılırsa değiştirilmelidir.
  4. %70 etanol ile ıslatılmış bir görev mendili kullanarak tepsinin üst kısmındaki parmak izlerini çıkarın.

14. Verilerin toplanması

NOT: Bu çalışmanın amacı kültür metodolojisini tanımlamaktır. Doldurulduktan sonra, çok kuyulu cihazlar çeşitli fenotiplerin uzunlamasına izlenmesiyle uyumludur. Burada, en yaygın parametrelerden birkaçını ölçmek için temel rehberlik sağlanmaktadır.

  1. Ömrü: Plakaya dokunarak veya solucanları her 1-3 günde bir parlak mavi ışığa maruz bırakarak ömrü izleyin. Hiçbir hareket gözlenmezse ölü olarak puanlayın. Bu çok kuyulu cihazlar, kullanım ömrünü tahmin etmek için otomatik görüntüleme ve analiz boru hatlarıyla da uyumludur13,18.
  2. Aktivite: Cihaz kuyularındaki hayvanların statik görüntülerini veya videolarını çekerek ve kat edilen mesafeyi, hızı veya diğer hareket metriklerini değerlendirerek bireysel hayvanların yaşam boyunca aktivitesini izleyin. Cihazlar ayrıca aktiviteyi tahmin etmek için otomatik görüntüleme ve analiz boru hatlarıyla uyumludur13,18.
  3. Vücut büyüklüğü ve şekli: Cihaz kuyularındaki hayvanların statik görüntülerini alarak ve standart görüntüleme tekniklerini kullanarak görsel parametreleri ölçerek vücut büyüklüğü ve şeklindeki değişiklikleri izleyin. Prensip olarak, bu kültür yöntemi, solucan vücut şeklinin daha sofistike bir değerlendirmesi için mevcut yazılımlarla uyumlu olmalıdır 19,20,21.

15. Cihazların yeniden kullanılması

NOT: Bir deney tamamlandıktan sonra, çok kuyulu cihazlar üç defaya kadar temizlenebilir ve yeniden kullanılabilir. Ek yeniden kullanım, muhtemelen ortamdan gelen kimyasalların veya PDMS malzemesinin duvarlarında biriken bakterilerin neden olduğu solucan fenotiplerini etkilemeye başlar.

  1. Parafilmi atın ve cihazı tepsiden çıkarın. Cihazın sağ üst köşesindeki, kaç kez kullanıldığını gösteren çentikleri kontrol edin. Üç kez kullanılmışsa, cihazı atın. Üç kereden az kullanılmışsa, temizleyin ve tekrar kullanın.
    NOT: Tepsiler polistirenden yapılmıştır ve lmNGM, bakteri veya ortama herhangi bir katkı maddesi ile doğrudan temas halinde değildir. Görsel olarak net kaldıkları sürece birçok kez tekrar kullanılabilirler.
  2. Tepsiden kalan su kristallerini durulayın. Tepsinin içine% 10 ağartıcı çözeltisi püskürtün ve 10 dakika bekletin. Deiyonize su ile durulayın ve su lekelerini önlemek için hemen kurutun.
  3. Ortamı kuyucuklardan temizlemeye başlamak için cihazı akan suyun altında tutun. Ortamı kuyucuklardan gevşetmeye yardımcı olmak için cihazı suyun altında yavaşça bükün ve bükün, ancak cihazın yırtılmasına neden olacak kadar bükülmeyin. 200 μL pipet ucu ile kuyucuklara sıkışmış kalan ortamları seçin.
  4. 2 L'lik bir beheri ~ 3/4 deiyonize suyla dolu bir karıştırma çubuğu ile doldurun ve sıcak bir tabak üzerinde kaynatın.
  5. Kaynar suya bir veya iki çok kuyucuklu cihaz ve bir karıştırma çubuğu ekleyin. Sudaki cihazları nazikçe çalkalamak için manyetik karıştırmayı düşük bir hıza (~ 200 rpm) açın. Cihazların 10 dakika kaynamasına izin verin.
  6. Cihazları metal cımbızla sudan çıkarın ve boşaltmak için kağıt havluların üzerine iyice yan yana yerleştirin. Cihazların gece boyunca en az kurumasına izin verin.
  7. Cihazlar tamamen kuruduğunda, folyoya sarın ve otoklav bantla kapatın. Otoklav bandına, cihazın kaç kez kullanıldığını yazın. Sterilize etmek için 121 ° C'de 15 dakika boyunca kuru bir döngüde otoklavlayın. Cihazlar artık yeniden kullanıma hazırdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

WorMotel kültür sistemi, yaşam süresi, sağlık süresi ve aktivite dahil olmak üzere çeşitli veriler toplamak için kullanılabilir. Yayınlanan çalışmalar, yaşam süresi ve sağlık süresi 13,14, sessizlik ve uyku 22,23,24 ve davranış 25'i incelemek için çok kuyulu cihazlar kullanmıştır. Kullanım ömrü manuel olarak veya bir görüntü koleksiyonu ve aşağı akış görüntüleme analizi yoluyla puanlanabilir. İlk yaklaşımda, solucanlar her 1-3 günde bir uyaranın ardından (örneğin, plakaya dokunmak veya mavi ışığa maruz kalmak) manuel olarak gözlemlenebilir ve Petri plakaları1'deki standart yöntemlere benzer şekilde, hiçbir hareket gözlenmezse ölü olarak puanlanabilir. İkinci yaklaşım benzerdir, ancak solucan hareketi, uyaran uygulandıktan sonra çekilen görüntüler arasındaki kare-kare farklılıklar karşılaştırılarak belirlenebilir. Bu, hareketin hem o zaman noktasındaki bireysel hayvanların aktivite seviyesi hakkında bilgi sağlaması hem de yaşam süresinin (örneğin, hareketin durması) ve sağlık süresinin (birden fazla tanım önerilmiştir) belirlenebileceği bir metrik sağlaması açısından ek bir fayda sağlar. Görüntüler ayrıca vücut büyüklüğü, vücut şekli ve vücut duruşu gibi ek fizyolojik parametreleri çıkarmak için de kullanılabilir.

Sistemin kapasitesini göstermek için, daf-2 geni tarafından kodlanan insülin reseptörü ile daf-16 tarafından kodlanan aşağı akış FOXO ailesi transkripsiyon faktörü arasındaki klasik epistatik ilişkiyi, bireysel hayvanlar için yaşam süresi, sağlık süresi ve günlük aktivite bağlamında inceledik. Vahşi tip (gerinim N2) ve daf-16(mu68) fonksiyon kaybı (gerinim CF1038) C. elegans, her iki kontrolü de ifade eden E. coli (HT115 suşu) ile beslendi (boş vektör; EV) veya daf-2 RNAi besleme yapıları çok kuyucuklu cihazlarda kültürlendi ve her hayvan yaşam süresi (Şekil 2A), sağlık süresi (Şekil 2B) ve günlük aktivite (Şekil 2C) açısından izlendi. Aktivite, 2 dakika boyunca her 5 saniyede bir bir dizi hareketsiz görüntü alınarak günlük olarak izlendi, solucanlar aktiviteyi uyarmak için 1 dakikada 5 sn boyunca parlak mavi ışığa maruz bırakıldı (Churgin ve ark.13'e göre). Her hayvan için günlük aktivite, kuyular ve görüntüler arasında arka planı normalleştirerek, her görüntüdeki solucan alanını tanımlayarak ve bitişik görüntüler arasındaki alandaki değişimi hesaplayarak tahmin edildi. Yaşam süresi, her solucan için aktivitenin en son gözlendiği yaş olarak tanımlandı ve sağlık süresi, bir solucanın artık tam vücut uzunluğunu hareket ettiremediği yaş olarak tanımlandı. Daha önceki birçok çalışmadan beklendiği gibi (örneğin, Kenyon ve ark.26, Murphy ve ark.27), daf-16 (mu86) mutasyonu kısa ömürlerle sonuçlandı ve daf-2'nin RNAi yıkımından kaynaklanan yaşam süresinin uzamasını önledi (Şekil 2A). Benzer bir model sağlık süresi için de gözlenmiştir (Şekil 2B). Çok kuyulu cihaz kültürü sistemlerini kullanmanın bir avantajı olarak, yaşam boyunca bireysel hayvanları izleme kapasitesi, popülasyon genelinde ölçülen her fenotipteki bireysel varyasyonun ayrıntılı bir analizini sağlar. Örneğin, bireysel hayvanlar arasındaki yaşam süresi ve sağlık süresindeki değişim, mutlak (Şekil 2D) terimlerle veya toplam ömrün bir kısmı olarak (Şekil 2E) karşılaştırılabilir. Erken yaşam fenotipleri, bir popülasyondaki bireysel hayvanlarda, yaşam süresi de dahil olmak üzere geç yaşam fenotipleriyle karşılaştırılabilir. Örneğin, yaşam süresi boyunca her bir hayvan için kümülatif aktivite (yani, bireysel aktivite için eğrinin [AUC] altındaki alan), ölçülen tüm koşullar boyunca yaşamın 5. gününe kadar kümülatif ömürden (Şekil 2G) daha iyi korelasyon göstermiştir. Bu çalışmanın amacının, cihazı kullanarak belirli bir fenotipi ölçmek için değil, zaman içinde bireysel hayvanları izlemek için çok kuyulu ortamı oluşturmak için ayrıntılı bir protokol sağlamak olduğunu vurguluyoruz. Şekil 2'de sunulan temsili sonuçlar, bu sistemde ölçülebilen fenotiplerin sadece bir örneğini sunmaktadır. Bir kez inşa edildikten sonra, çok kuyulu ortam, katı ortam üzerinde serbest sürünen solucanların fenotiplerini ölçmek için çok çeşitli tekniklerle uyumludur.

Figure 1
Resim 1: Mikrofabrikasyon çok kuyucuklu cihazların şeması . (A) Bireysel C. elegans, bireysel kuyucuklarda bakteriyel gıdalarla tohumlanmış katı düşük erimeli nematod büyüme ortamı (lmNGM) agaroz pedleri üzerinde kültürlenir. Kuyular arasındaki boşluk, her solucanı kuyu içinde izole etmek için caydırıcı bir kimyasal (bakır sülfat) ile kaplanmıştır. Her cihaz tek kuyucuklu bir tepsinin içine sabitlenir. Tepsinin çevresi, nemi korumak için su kristalleri ile doldurulur. Tepsi, oksijen değişimine izin vermek için Parafilm ile kapatılmıştır. BioRender.com ile oluşturulan görüntü. (B) Kuyuların yüklenmesi için önerilen sırayı gösteren çok kuyulu cihaza genel bakış. İç kuyucuklar (beyaz) 14 μL lmNGM alır. Dış kuyucuklar (gri) 15 μL lmNGM alır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Çok kuyulu cihazlar kullanılarak bireysel hayvanlarda ölçülen fenotiplerin popülasyonlar arasında korelasyonu. Tüm paneller, dört hayvan grubunu karşılaştıran aynı deneyden veri sağlar: boş vektör EV'ye (RNAi) (N = 138) maruz kalan vahşi tip (N2) hayvanlar, daf-2 (RNAi) (N = 151) 'e tabi vahşi tip hayvanlar, EV'ye (RNAi) (N = 123) tabi olan daf-16 (mu86) hayvanlar ve daf-2 (RNAi) (N = 135) 'e tabi olan daf-16 (mu86 ) hayvanlar. (A) Daf-2 (RNAi) 'den yaşam süresi uzaması, daf-16 (mu86) null mutasyonu tarafından bloke edilir. Log-rank testi tarafından belirlenen gruplar arasındaki çift anlamlılık (R'de survdiff fonksiyonu). (B) Burada bir hayvanın daf-2'den (RNAi) tam vücut uzunluğu uzamasını artık hareket ettiremediği gün olarak tanımlanan sağlık süresi, daf-16 (mu86) null mutasyonu tarafından bloke edilir. Log-rank testi tarafından belirlenen gruplar arasındaki çift anlamlılık (R'de survdiff fonksiyonu). (C) Yaşam süresi boyunca 3 günlük yuvarlanan aktivite ortalaması hem daf-16 (mu86) hem de daf-2 (RNAi) tarafından azaltılır. Gruplar arasında bireysel hayvanların ömrü boyunca aktivite için eğrinin altındaki alanı karşılaştırmak için Mann-Whitney U testi tarafından hesaplanan anlamlılık. (D) Mutlak değerler olarak her popülasyon için sağlık süresi ve ömrü (ortalamanın ortalama ± standart hatası). (E) Her popülasyon için sağlık süresi ve yaşam süresi, her gruptaki toplam yaşam süresine normalleştirilir (ortalamanın ortalama ± standart hatası). (F) Bireysel hayvanlar için yaşam süresi boyunca kümülatif aktivite (yaşam süresi boyunca eğrinin [AUC] altındaki alan), doğrusal regresyon (R'de lm fonksiyonu) ile hesaplandığı gibi, yaşam süresi boyunca belirli bir günde bireysel hayvanlar için aktiviteden (ortalama aktivitenin maksimize edildiği noktayı temsil eden 8. gündeki aktivite korelasyonu gösterilmiştir) daha iyi ilişkilidir. n.s. = anlamlı değil, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. Tüm p değerleri, her panelde yapılan karşılaştırmalar için Bonferroni yöntemi kullanılarak çoklu karşılaştırmalar için ayarlandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: 3D çok kuyulu cihaz kalıbını yazdırmak için STL dosyası Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

WorMotel sistemi, zaman içinde yüzlerce izole C. elegans için kişiselleştirilmiş veriler toplamak için güçlü bir araçtır. Gelişimsel sessizlik, lokomotor davranış ve yaşlanma uygulamaları için çok kuyulu cihazların kullanıldığı daha önceki çalışmaları takiben, bu çalışmanın amacı, aktivitenin, sağlığın ve ömrün uzun vadeli izlenmesi için çok kuyulu cihazların hazırlanmasını optimize etmekti. Bu çalışma, orijinal protokol13'teki adımların çoğunu optimize eden, teknik zorluklar yaratabilecek kilit noktaları vurgulayan ve plakaların ve diğer malzemelerin yeniden kullanımı hakkında bir tartışma sağlayan çok kuyulu cihazların hazırlanması için ayrıntılı bir protokol sağlar.

Şu anda tipik bir haftada 10 ila 20 cihaz hazırlayan bir laboratuvar olarak ölçeklendirme amacıyla, cihazların yeniden kullanılıp kullanılamayacağı ve eğer öyleyse, ne dereceye kadar kullanılabileceğiydi. PDMS cihazlarının hazırlanmasında Petri plakaları üzerinde geleneksel kültürün uygulanmasına göre hem zaman hem de para açısından daha yüksek bir maliyet vardır, ancak bu yüksek maliyetler PDMS'nin veya sistemin diğer bileşenlerinin yeniden kullanılmasıyla azaltılabilir. Birçok yeniden kullanımla PDMS, muhtemelen lmNGM ortamından veya bakterilerinden bileşiklerin birikimini yansıtan sarı bir renklenme geliştirmeye başladı. Bu plakalarda kültürlenen hayvanlar da daha yüksek bir kaçış oranı ve daha kısa ömür gösterdi. Düzinelerce deneye dayanarak, bu PDMS cihazlarının yeniden kullanımı için üç kullanım en uygunudur ve yaşa bağlı fenotiplerin PDMS bozulmasından ölçülebilir bir etki olmadan değerlendirilmesine izin verirken, kalıplanması gereken yeni cihazların sayısını azaltır (böylece maliyetlerden tasarruf sağlar). Ayrıca, birinci, ikinci ve üçüncü kullanımlarında cihazlarda yetiştirilen deneyle eşleşen hayvanların, neredeyse ayırt edilemeyen ve istatistiksel olarak farklı olmayan hayatta kalma eğrileri ürettiğini doğruladık (veriler gösterilmedi). Cihazları içermek için kullanılan tepsiler polistirenden yapılmıştır ve solucanların görselleştirilmesine müdahale edebilecek çiziklerden veya diğer izlerden arındırılmış kalırlarsa süresiz olarak temizlenebilir ve yeniden kullanılabilir.

~ 2 haftadan fazla süren uygulamalar için çok kuyulu cihazların hazırlanmasında önemli bir zorluk, çevresel bakteri ve mantar tarafından plaka kontaminasyonunun önlenmesidir. Kontaminasyonu önlemek için sterilizasyonun kritik olduğu birçok adım vardır. Bunlar arasında kullanımdan önce tüm cihazların otoklavlanması, yeniden kullanılması amaçlanan cihazların kaynatılması, nemi korumak için kullanılan emici su kristallerinin otoklavlanması, cihazların bulunduğu tepsilerin kullanımdan önce hem ağartıcı hem de etanol ile temizlenmesi ve buğulanmayı önlemek için tepsinin kapağına uygulanan ve bakır sülfat çözeltisine eklenen deterjan çözeltisinin filtreyle sterilize edilmesi sayılabilir. Bu değişikliklerin her birinin uygulanması, kontaminasyon olaylarını önemli ölçüde azaltarak, sızdırmaz cihazların, >45 gün boyunca izlenmesini gerektiren uzun ömürlülük koşulları (örneğin, daf-2'nin nakavtlanması) altında bile, kullanım ömrü boyunca uzunlamasına izleme için tutarlı bir şekilde kullanılmasına olanak tanır. Burada açıklanan protokol, tutarlı kuyu kurumasını sağlamak ve kurumayı önlemek için tasarlanmış uzun vadeli uygulamalar için orijinal protokolde iki değişiklik içerir. İlk olarak, su kristallerinin kapasitesini artırmak için cihazın toplam derinliği 2 mm artırıldı. Uzun deneyler boyunca, özellikle düşük nemli bir ortamda, tepsideki çok az su kristali lmNGM'nin kurumasına neden oldu. Daha fazla su kristali ile birlikte, cihazın kenarı boyunca kuyucuklara eklenen agaroz hacmini arttırmak gerekiyordu. Bu kuyular, kuyu yüklemesini takiben (bölüm 6) önce kuruma ve büzülme eğilimindeydi. İç kuyucuklarda 14 μL agaroz kullanılması, kuyuların aşırı doldurulmasından kaynaklanan kubbeli üst kısmı oluşturmadan kuyuları tamamen doldurmak için yeterli hacimdi. Dış kuyucuklara 15 μL agaroz eklenmesi, kuyular kurumaya başladığında, iç kuyucuklara eklenen 14 μL ile karşılaştırılabilir bir seviyeye küçülmeleri için yeterli hacim sağlamıştır.

Orijinal protokolden en büyük sapmalardan biri, kullanıcının lmNGM (bölüm 6) ve bakır sülfat (bölüm 7) yüklediği sırayı tersine çevirmekti. Başlangıçta, bakır sülfat önce hendeğe eklendi, ardından kuyucuklar lmNGM13 ile dolduruldu. Plazma temizliğinden sonra kuyuların mümkün olan en kısa sürede lmNGM ile doldurulmasının lmNGM'nin kuyu duvarlarına yapışmasını iyileştirdiği gözlenmiştir. Plazma temizliğinden sonra çok uzun süre beklemek, solucanların görselleştirilmesine müdahale edebilecek kabarcıklar ve kubbeli üstleri olan kuyucuklarla sonuçlandı. Bakır sülfat ilavesinden ziyade kuyuların doldurulmasına öncelik verilmesi, tutarlı, yüksek kaliteli lmNGM yüzeyleri sağlamak için aynı anda birden fazla cihaz hazırlarken özellikle önemlidir. İlk önce kuyucukları doldurmanın bir dezavantajı, plazma temizleyici tarafından üretilen hidrofilik yüzey modifikasyonunun, kullanıcı bakır sülfat eklemeye geçtiğinde gözle görülür şekilde aşınmış olmasıdır. Bakır sülfat, yüzey daha az hidrofilik hale geldiğinde hendeklerden kolayca akmaz, bu nedenle tam kapsama elde etmeyi zorlaştırır. Bir yüzey aktif madde olarak hareket etmek için bakır sülfat çözeltisine deterjan eklenmesi, çözeltinin hendek boyunca akışını iyileştirir. Bir platin tel toplama, bakır sülfatın akmakta zorlandığı herhangi bir noktadaki gerginliği kırarak bakır sülfatı hendek boyunca nazikçe yönlendirmek için de kullanılabilir. Ayrıca, bakır sülfat çözeltisi hendekte bırakılırsa, tepsiyi eğerken kuyucuklara kolayca dökülür ve lmNGM yüzeyini kirletir. Yükleme işleminin doğası, bakırın kuyuların bir alt kümesini kirletmesini önlemek için cihazı yeterince düz tutmayı neredeyse imkansız hale getirir. Bunu açıklamak için, bakır sülfat çözeltisi hendekten çıkarılır (adım 7.3) ve geride kalan artık bakır sülfat, çoğu solucanın kaçmasını engellemek için yeterlidir. Bakır sülfatın caydırıcı bir bariyer olarak kullanılmasına ilişkin son bir not olarak, bazı kovucular yaşam süresi de dahil olmak üzere yaşa bağlı fenotipleri etkileyebilir. Bu çok kuyucuklu cihazlarda bakır sülfat kullanımı Churgin ve ark.13 tarafından incelenmiş ve yaşam süresi veya gelişim üzerinde tespit edilebilir bir etkisi olmadığı bulunmuştur.

Protokoldeki diğer küçük güncellemeler, PDMS'yi hazırlamak için atılan adımların geliştirilmesine odaklanmaktadır. PDMS bazını ve kürleme maddesini karıştırdıktan sonra ekstra bir gaz giderme adımı eklenmiştir, çünkü bu birçok kabarcık üreten bir işlemdir. Karışımı cihaz kalıplarına eklemeden önce kabarcıkların çoğunluğunun çıkarılması, ikinci gaz giderme adımından sonra kalan kabarcıkları en aza indirir. Cihazın tabanının tamamen düz ve hatta tüm plaka görüntüleme için önemli bir özellik olmasını sağlamak için, doldurulmuş kalıbın üstüne bir parça cam veya akrilik döşenmiştir. Bu adım, kullanıcı her bir kuyucuk için odağı manuel olarak ayarlayabildiğinden, bir seferde yalnızca bir kuyucuğu inceleyen uygulamalar için gerekli değildir. Son olarak, PDMS'nin daha yüksek bir sıcaklıkta (55 ° C) kürlenmesi, protokolün bu versiyonunun optimize edildiği yerde (Tucson, Arizona, ABD), orijinal protokol tarafından belirtilen 40 ° C'nin aksine (Philadelphia, Pennsylvania, ABD'de optimize edilmiştir) gerekliydi. Bu, konumlar arasındaki farklılıkların (iklim veya kullanılan hassas reaktifler ve ekipman gibi), kürleme sıcaklığı veya kurutma teknikleri gibi protokoldeki belirli adımları etkileyebileceğini ve bunların her sahada optimize edilmesi gerekebileceğini düşündürmektedir. Örneğin, çevresel nem, lekelenmeden sonra plakaların kuruma süresinin belirlenmesinde büyük rol oynar ve bu, yerler veya mevsimler arasında büyük ölçüde değişebilir.

Prensip olarak, bu çok kuyucuklu cihaz sistemi, Petri plakaları üzerinde standart parlak alan mikroskobu altında ölçülebilen herhangi bir fenotip hakkında veri toplamak için kullanılabilir - ömrü, sağlık süresi, uyarılmamış / uyarılmamış hareket, vücut büyüklüğü ve şekli, hareket geometrisi - zaman içinde bireysel solucanlar için bu ölçümleri izleme yeteneği eklenmiştir. Girişte belirtildiği gibi, bireysel tüm yaşam süresi verilerini elde etmek için başka yöntemler de vardır. Mikroakışkan cihazlar28 veya çok kuyucuklu plakalar29, bireysel hayvanların yaşam geçmişini takip etme yeteneği sunar, ancak yalnızca solucanları sıvı ortamda kültürleyerek. Sıvı bir ortam, solucanların transkriptomunu katı ortama göre 10,11,30 değiştirebilir ve epizodik yüzme 31, artan enerji harcaması 10,32 ve yüksek oksidatif stres 10 dahil olmak üzere farklı fizyolojik ve davranış değişikliklerine neden olur. Yaşam süresinin ve sağlıklı yaşlanma ile ilgili diğer metriklerin sıvı ve katı ortamlar arasında doğrudan ne derece doğrudan karşılaştırılabileceği belirsizdir. Katı kültür çok kuyucuklu cihazlar, Petri plakalarındaki standart grup kültürüyle karşılaştırılabilir bir ortamda tek solucan izlemesine izin verir. Cihaz duvarının kavisli yapısı, kuyunun içinde herhangi bir yerde solucanların görüntülenmesine izin verir ve bu cihazları prensip olarak, Worm Tracker33 gibi tek solucan analizi için daha sofistike araçlarla uyumlu hale getirir.

Çok kuyulu bir cihazda yapılan bir deney boyunca bireysel hayvanları izleme yeteneğine çeşitli sınırlamalar eşlik eder. İlk olarak, optimize edilmiş bir protokolle bile, bu cihazların hayvan başına kurulması Petri plakalarındaki standart kültürden daha fazla zaman gerektirir, böylece genel numune büyüklüğü pahasına tek hayvanlı veriler sağlanır. Bununla birlikte, solucanlar aynı zamanda kişiselleştirilmiş kuyucuklara izole edilir ve birbirlerine dokunurken hareket etmeyi bırakan bireysel hayvanları otomatik olarak tespit etmek gibi otomatik ömür ölçümü ile ilişkili bazı komplikasyonları ortadan kaldırır. Otomasyon, daha karmaşık kurulumda kaybedilen zamanı yeniden yakalamaktan daha fazlasını yapar ve daha yüksek verimli tarama fırsatı sunar13,18. İkincisi, solucanların bakır sülfat hendeğinden daha fazla sevmediği deneysel koşullar, örneğin güçlü strese neden olan ajanlar (örneğin, paraquat) veya diyet kısıtlaması, solucanların kuyulardan ve hendeklere kaçmasına yol açacaktır. Üçüncüsü, PDMS cihazları parlak alan ve karanlık alan mikroskopisine izin verirken, PDMS malzemesi hem yüksek hem de düzensiz arka plan floresansına sahip olma eğilimindedir, ikincisi muhtemelen kalıplama sırasında PDMS'ye gömülen toz veya diğer mikropartiküllerden kaynaklanır ve bu da floresan mikroskobundaki uygulamalarını sınırlar. Son olarak, birden fazla deney sırasında yeniden kullanılan cihazlar için PDMS'de gözlenen renk değişikliği ve buna bağlı olarak yaşam süresindeki azalma ve kaçıştaki artış, medya bileşenlerinin ve diğer ilave kimyasalların zamanla PDMS'ye sülük yaptığını göstermektedir. Bunun yaşlanma fenotiplerini veya ilaç tedavilerini ne derece etkileyebileceği şu anda araştırılmaktadır. Daha önce de belirtildiği gibi, PDMS çok kuyucuklu cihazlara benzeyen tek solucanlı bir kültür için alternatif bir yöntem vardır, ancak bunun yerine izole edilmiş hayvanları kültürlemek için ticari olarak temin edilebilen mikro tepsileri kullanır16. Bu mikro tepsiler polistirenden yapılmıştır, sülük ortamı bileşenlerinin potansiyel sorununu önler ve doğrudan plaka üzerinde doğrudan in vivo floresan görüntülemeye izin veren tutarlı floresan arka planına sahiptir. Mikrotepsi kuyuları ayrıca burada açıklanan protokolde kullanılan bakır sülfat yerine palmitik asit ile çevrilidir, bu da daha caydırıcıdır ve strese neden olan ajanlar ve diyet kısıtlaması durumunda bile kuyularını terk eden solucanların fraksiyonunu azaltır. Bu faydalar, PDMS cihazlarının 240 solucan kapasitesinin aksine, mikro tepsiler tek bir tepside maksimum 96 solucanın kültürlenmesine izin verdiği için kuyucukların daha düşük paketleme verimliliği pahasına gerçekleştirilir. Bir deneyin istenen sonucunun özellikleri, bu sistemlerden hangisinin kullanılması gerektiğini etkileyecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması olmadığını belirtmektedir.

Acknowledgments

Bu çalışma, NIH R35GM133588 to G.L.S., G.L.S.'ye Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Tıp Akademisi Katalizör Ödülü, Arizona Regents Kurulu tarafından yönetilen Arizona Eyaleti Teknoloji ve Araştırma Girişimi Fonu ve Ellison Tıp Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 lb weight CAP Barbell RP-002.5
Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) Falken Design ACRYLIC-CL-3-8/1224 Large sheet cut to smaller sizes 
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518
Autoclavable squeeze bottle Nalgene 2405-0500
Bacto agar BD Difco 214030
Bacto peptone Thermo Scientific 211677
Basin, 25 mL VWR 89094-664 Disposable pipette basin 
Cabinet style vacuum desiccator  SP Bel-Art F42400-4001 Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. 
CaCl2 Acros Organics 349615000
Caenorhabditis elegans N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Wildtype strain
Carbenicillin  GoldBio C-103-25
Centrifuge Beckman 360902
Cholesterol ICN Biomedicals Inc 101380
Compressed oxygen tank Airgas UN1072
CuSO4 Fisher Chemical C493-500
Dry bead bath incubator Fisher Scientific 11-718-2
Escherichia coli OP50  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Standard labratory food for C. elegans
Ethanol Millipore ex0276-4
Floxuridine Research Products International F10705-1.0
Hybridization oven Techne 731-0177 Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice
Incubators Shel Lab 2020 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria 
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) GoldBio I2481C100
K2HPO4 Fisher Chemical P288-500
KH2PO4 Fisher Chemical P286-1
Kimwipes KimTech 34155 Task wipes
LB Broth, Lennox BD Difco 240230
Low melt agarose Research Products International A20070-250.0
MgSO4 Fisher Chemical M-8900
Microwave  Sharp R-530DK
Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 Rainin 17013800 The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided
NaCl Fisher Bioreagents BP358-1
Nunc OmniTray Thermo Scientific 264728 Clear polystyrene trays
Parafilm M Fisher Scientific 13-374-10 Double-wide (4 in)
Petri plate, 100 mM  VWR 25384-342
Petri plate, 60 mM  Fisher Scientific FB0875713A
Plasma cleaner Plasma Etch, Inc. PE-50
PLATINUM vacuum pump JB Industries DV-142N 
PolyJet 3D printer Stratasys  Objet500 Connex3 PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi)
Shaking incubator Lab-Line 3526CC
smartSpatula LevGo, Inc. 17211 Disposable spatula
Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) M2 Polymer Technologies Type S Referred to in main text as "water crystals"
SYLGARD 184 Silicone Elastomer base The Dow Chemical Company 2065622
SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent The Dow Chemical Company 2085925
Syringe filter (0.22 µm) Nest Scientific USA Inc.  380111
Syringe, 10 mL  Fisher Scientific 14955453
TWEEN 20 Thermo Scientific J20605-AP Detergent
Vacuum pump oil VWR 54996-082
VeroBlackPlus Stratasys  RGD875 Rigid 3D printing filament
Weigh boat Thermo Scientific WB30304 Large enough for PDMS mixture volume

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
  2. Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
  3. Rahman, M., et al. NemaLife chip: A micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10, 16190 (2020).
  4. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  5. Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. Microfluidic devices for imaging and manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. Liu, X., Sun, Y. 13, Academic Press. Cambridge, MA. Chapter 13 295-321 (2021).
  6. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  7. Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9, 14340 (2019).
  8. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).
  9. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).
  10. Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).
  11. Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).
  12. Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
  13. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  14. Jushaj, A., et al. Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system. PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).
  15. Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
  16. Espejo, L., et al. Long-term culture of individual Caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
  17. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  18. Freitas, S. Worm Paparazzi - A high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. University of Arizona. , Tucson, USA. Master's thesis (2021).
  19. Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: High-throughput analysis of nematode size and shape. PLoS One. 8 (2), e57142 (2013).
  20. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , (2013).
  21. Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), 982437 (2014).
  22. Grubbs, J. J., vander Linden, A. M., Raizen, D. M. Regulation of sleep by KIN-29 is not developmental. microPublication Biology. 2020, (2020).
  23. Iannacone, M. J., et al. The RFamide receptor DMSR-1 regulates stress-induced sleep in C. elegans. eLife. 6, 19837 (2017).
  24. McClanahan, P. D., et al. A quiescent state following mild sensory arousal in Caenorhabditis elegans is potentiated by stress. Scientific Reports. 10, 4140 (2020).
  25. Churgin, M. A., McCloskey, R. J., Peters, E., Fang-Yen, C. Antagonistic serotonergic and octopaminergic neural circuits mediate food-dependent locomotory behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 37 (33), 7811-7823 (2017).
  26. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
  27. Murphy, C. T., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
  28. Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C . elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  29. Lionaki, E., Tavernarakis, N. High-throughput and longitudinal analysis of aging and senescent decline in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 965, 485-500 (2013).
  30. Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C. elegans under dietary restriction. The Journal of Experimental Biology. 209, 4129-4139 (2006).
  31. Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. The Journal of Experimental Biology. 211, 3703-3711 (2008).
  32. Hartman, J. H., et al. Swimming exercise and transient food deprivation in Caenorhabditis elegans promote mitochondrial maintenance and protect against chemical-induced mitotoxicity. Scientific Reports. 8, 8359 (2018).
  33. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).

Tags

Geri Çekme Sayı 190
Çok Kuyulu Cihazlarda Katı Ortamda İzole <em>Caenorhabditis elegans'ın</em> Uzun Süreli Kültürü ve İzlenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gardea, E. A., DeNicola, D.,… More

Gardea, E. A., DeNicola, D., Freitas, S., Peterson, W., Dang, H., Shuck, K., Fang-Yen, C., Sutphin, G. L. Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices. J. Vis. Exp. (190), e64681, doi:10.3791/64681 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter