Method Article

Flusso di lavoro "Cell Surface Capture" per la quantificazione senza marcatura del proteoma della superficie cellulare

DOI:

10.3791/64952

⸱

March 24th, 2023

 ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, University of California, San Francisco, 2Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Bombay, 3Deptartment of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, 4Chan Zuckerberg Biohub

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, descriviamo un flusso di lavoro proteomico per la caratterizzazione del proteoma della superficie cellulare di vari tipi di cellule. Questo flusso di lavoro include l'arricchimento delle proteine della superficie cellulare, la successiva preparazione del campione, l'analisi utilizzando una piattaforma LC-MS/MS e l'elaborazione dei dati con un software specializzato.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nell'ultimo decennio, la proteomica basata sulla spettrometria di massa ha permesso una caratterizzazione approfondita dei sistemi biologici in un'ampia gamma di applicazioni. Il proteoma della superficie cellulare ("surfaceoma") nelle malattie umane è di notevole interesse, poiché le proteine della membrana plasmatica sono l'obiettivo primario della maggior parte delle terapie clinicamente approvate, nonché una caratteristica chiave con cui distinguere diagnosticamente le cellule malate dai tessuti sani. Tuttavia, la caratterizzazione mirata delle proteine di membrana e di superficie della cellula è rimasta impegnativa, principalmente a causa della complessità dei lisati cellulari, che mascherano le proteine di interesse con altre proteine ad alta abbondanza. Per superare questa barriera tecnica e definire con precisione il proteoma della superficie cellulare di vari tipi di cellule utilizzando la proteomica della spettrometria di massa, è necessario arricchire il lisato cellulare per le proteine della superficie cellulare prima dell'analisi sullo spettrometro di massa. Questo articolo presenta un flusso di lavoro dettagliato per la marcatura delle proteine della superficie cellulare dalle cellule tumorali, arricchendo queste proteine dal lisato cellulare e la successiva preparazione del campione per l'analisi della spettrometria di massa.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le proteine sono le unità fondamentali con cui viene svolta la maggior parte delle funzioni cellulari. Caratterizzare la struttura e la funzione di proteine rilevanti è un passo essenziale per comprendere i processi biologici. Nell'ultimo decennio, i progressi nella tecnologia della spettrometria di massa, nel software di analisi e nei database hanno consentito il rilevamento e la misurazione accurati delle proteine su scala proteomica1. La proteomica basata sulla spettrometria di massa può essere utilizzata in una vasta gamma di applicazioni, dall'analisi scientifica di base dei percorsi biochimici, all'identificazione di nuovi bersagli farmacologici in un contesto traslazionale, alla diagnosi e al monitoraggio delle malattie in clinica2. Nello screening di nuovi bersagli farmacologici, la caratterizzazione del proteoma della superficie cellulare è particolarmente importante, con oltre il 65% dei farmaci umani attualmente approvati che hanno come bersaglio le proteine della superficie cellulare3. Il campo dell'immunoterapia del cancro si basa anche interamente su antigeni di superficie cellulare specifici per il cancro per colpire ed eliminare specificamente le cellule tumorali4. La proteomica basata sulla spettrometria di massa può quindi fungere da strumento promettente per identificare nuove proteine della superficie cellulare verso interventi terapeutici.

Tuttavia, ci sono diverse limitazioni quando si utilizzano metodi di proteomica convenzionali per esaminare le cellule tumorali alla ricerca di nuovi bersagli proteici della superficie cellulare. Una preoccupazione primaria è che le proteine di superficie costituiscono una frazione molto piccola delle molecole proteiche totali in una cellula. Pertanto, i frammenti di queste proteine sono mascherati da un'elevata abbondanza di proteine intracellulari quando si esegue l'analisi della spettrometria di massa del lisato dell'intera cellula5. Questa limitazione rende difficile caratterizzare con precisione il proteoma della superficie cellulare con un flusso di lavoro proteomico tradizionale. Per affrontare questa sfida, è necessario sviluppare modi per arricchire le proteine della superficie cellulare a partire dal lisato dell'intera cellula, prima dell'analisi sullo spettrometro di massa. Uno di questi metodi prevede l'ossidazione e la marcatura della biotina delle proteine della superficie cellulare glicosilata nelle cellule intatte e il successivo arricchimento di queste proteine biotinilate dal lisato con un pulldown della neutravidina, un processo che è stato definito "cattura della superficie cellulare"6. Poiché si ritiene che ~85% delle proteine della superficie cellulare dei mammiferi siano glicosilate7, questo serve come metodo efficace per arricchire il proteoma della superficie cellulare dall'intero lisato cellulare. Questo articolo descrive un flusso di lavoro completo, a partire dalle cellule in coltura, della marcatura della biotina sulla superficie cellulare e della successiva preparazione del campione per l'analisi della spettrometria di massa (Figura 1). Su diverse repliche, questo metodo fornisce una copertura robusta del proteoma della superficie cellulare di un particolare campione. L'utilizzo di questo metodo per caratterizzare il proteoma della superficie cellulare sia delle cellule tumorali che di quelle sane può facilitare la scoperta di nuovi antigeni di superficie cellulare per identificare potenziali bersagli immunoterapeutici8.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Per questo esperimento sul proteoma della superficie cellulare sono state utilizzate cellule di plasmocitoma AMO1. Lo stesso protocollo potrebbe essere utilizzato anche per altri tipi di cellule, tra cui un'ampia gamma di linee cellulari in sospensione e aderenti9, nonché vari tipi di campioni primari10. Tuttavia, il numero di cellule (materiale di partenza per l'esperimento) deve in genere essere ottimizzato per una copertura del proteoma equivalente. Per i dettagli relativi ai materiali e alle attrezzature, vedere la Tabella dei materiali. Per i dettagli relativi ai tamponi e alle soluzioni reagenti e alla loro composizione, vedere la Tabella 1.

1. Marcatura della superficie cellulare con la biotina

  1. Contare le cellule in coltura e il pellet a circa 3,5 × 107 cellule vive mediante centrifugazione (5 minuti a 500 × g, 24 °C).
    NOTA: Le cellule di plasmocitoma AMO1 sono state sottoposte a passaggio con terreni freschi ogni 3 giorni prima della raccolta.
  2. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet aggiungendo 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (D-PBS) fredda (4 °C) (senza calcio, senza magnesio) e pipettando delicatamente su e giù.
  3. Pellettare nuovamente le celle (come al punto 1.1) e ripetere ancora una volta la fase di lavaggio (passaggio 1.2) (due lavaggi in totale).
  4. Dopo il secondo lavaggio, pellettare le cellule (come al punto 1.1) e risospenderle in 990 μL di D-PBS freddo mediante pipettaggio delicato.
  5. Preparare preventivamente una soluzione madre di 160 mM di metaperiodato di sodio (NaIO4). Dividere in aliquote da 50 μl e conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi. Aggiungere 10 μl di soluzione di metaperiodato di sodio 160 mM alla sospensione cellulare al passaggio 1.4, mescolare accuratamente e incubare su un rotore end-to-end per 20 minuti a 4 °C.
  6. Al termine dell'incubazione, pellettare le cellule (come al punto 1.1), decantare il surnatante e risospendere in 1 mL di D-PBS freddo. Ripetere questa fase di lavaggio due volte (tre lavaggi in totale). Dopo il terzo lavaggio, risospendere le cellule in 989 μL di D-PBS.
  7. Preparare preventivamente una soluzione madre di 100 mM di biocitina idrazide. Dividere in aliquote da 50 μl e conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi. Aggiungere 1 μL di anilina e 10 μL di 100 mM di biocitina idrazide alla sospensione cellulare al passaggio 1.6, mescolare accuratamente e incubare su un rotore end-to-end per 60 minuti a 4 °C.
  8. Al termine dell'incubazione, pellettare le cellule (come al punto 1.1), decantare il surnatante e risospendere in 1 mL di D-PBS freddo. Ripetere questa fase di lavaggio due volte (tre lavaggi in totale).
  9. Dopo il terzo lavaggio, aspirare accuratamente il surnatante con una pipetta e congelare il pellet cellulare ponendo la provetta nel liquido N2. Posizionare il pellet congelato a -80 °C, fino al momento di procedere con la lisi e il pulldown.

2. Lisi cellulare e pulldown della biotina

  1. Scongelare il pellet di cella congelato con ghiaccio.
  2. Aggiungere 500 μl di tampone di lisi 2x al pellet, mescolare accuratamente e agitare per 30 s.
    NOTA: Per lisare completamente il pellet possono essere necessari un pipettaggio vigoroso e un vortice. Alcuni detriti insolubili (ad esempio, il DNA) sono accettabili, poiché vengono rimossi nella successiva fase di sonicazione.
  3. Sonicare il lisato cellulare su ghiaccio (tre raffiche, 20 s ciascuna, ciclo di lavoro del 60%).
  4. Centrifugare il lisato per pellettare eventuali detriti rimanenti (10 min a 17.200 × g a 4 °C).
  5. Mentre il lisato è in fase di centrifugazione, aggiungere 100 μL di perle di resina di agarosio di neutravidina a una colonna di filtrazione. Collegare la colonna a un collettore a vuoto, applicare un vuoto delicato e lavare le perle facendo scorrere 3 ml di tampone di lavaggio 1 su di esse.
  6. Rimuovere la colonna di filtrazione dal collettore del vuoto, tappare il fondo e aggiungere il lisato cellulare chiarificato alla colonna con le perline. Tappare la parte superiore della colonna e incubare il lisato con le perle su un rotore da un capo all'altro per 120 minuti a 4 °C.
    NOTA: Quando si chiude la parte superiore della colonna, tenere saldamente in posizione il tappo inferiore, altrimenti potrebbe staccarsi e il lisato cellulare potrebbe fuoriuscire durante l'incubazione.
  7. Preparare i tamponi di lavaggio 1, 2 e 3 (circa 5 mL di ciascun tampone di lavaggio per campione, fare riferimento alla Tabella 1) e metterli in un bagno d'acqua a 42 °C
  8. Dopo che il lisato ha terminato l'incubazione, riposizionare la colonna di filtrazione sul collettore del vuoto, applicare un vuoto delicato e lavare le perle facendo scorrere 5 ml di tampone di lavaggio 1 su di esse.
    NOTA: Per il lavaggio è possibile utilizzare più di 5 ml di tamponi di lavaggio; Un lavaggio extra può ridurre il fondo, il legame non specifico sulle perline.
  9. Ripetere la fase di lavaggio con 5 mL di tampone di lavaggio 2.
  10. Ripetere la fase di lavaggio con 5 mL di tampone di lavaggio 3.
  11. Una volta che il tampone di lavaggio finale è fluito interamente attraverso i cordoni, rimuovere la colonna dal collettore. Aggiungere 100 μl di soluzione di "lisi" alle perle e trasferirle in una provetta da microcentrifuga a basso contenuto proteico da 1,7 mL con una pipetta. Far girare brevemente il tubo per depositare le perle e rimuovere 50 μl di soluzione senza disturbare le perle depositate.
    NOTA: I reagenti in questa fase e in tutte le fasi successive utilizzano un kit di preparazione del campione di proteomica disponibile in commercio. Il kit offre un flusso di lavoro ottimizzato e semplificato per la preparazione dei campioni. Tuttavia, questi passaggi possono anche essere eseguiti indipendentemente dal kit, utilizzando un flusso di lavoro di proteomica tradizionale come descritto in Verma et al.9. Se le perle rimangono attaccate al lato o al fondo della colonna, lasciare che le perle che sono state trasferite nel tubo si depositino e utilizzare una soluzione extra di "lisi" nel tubo per trasferire le perle rimanenti.
  12. Posizionare il tubo su un blocco termico/agitatore a 65 °C e agitare a 1.000 giri/min per 10 min.
    NOTA: Questa fase è necessaria per la riduzione e l'alchilazione dei residui di cisteina prima della digestione.

3. Digestione delle proteine

  1. Risospendere la tripsina essiccata (provetta "Digest" nel kit, conservata a -20 °C) aggiungendo 210 μl della soluzione "Resuspend". Pipettare la soluzione su e giù più volte per assicurarsi che tutta la tripsina essiccata sia risospesa.
  2. Al termine dell'incubazione, aggiungere 50 μl della soluzione di tripsina risospesa alle microsfere. Incubare la provetta a 37 °C, agitando a 500 giri/min per almeno 90 minuti per digerire la proteina.
  3. Una volta completata la digestione, trasferire la soluzione contenente le perle in una colonna rotante e inserire la colonna in una provetta da microcentrifuga a basso contenuto proteico da 1,7 mL. Centrifugare il tubo (500 × g per 5 minuti a temperatura ambiente [RT]) per separare la soluzione peptidica digerita dalle perle.
    NOTA: In questa fase, il trattamento PNGasi può essere eseguito sulle perle una volta separate dalla soluzione peptidica, per eluire frammenti di peptidi biotinilati dalle perle di streptavidina. Questo campione di peptidi può quindi essere portato avanti attraverso il resto del flusso di lavoro come campione di peptidi secondario separato che può essere analizzato e confrontato con il campione primario dalla tripsinizzazione su perline. È probabile che l'approccio PNGase fornisca dati complementari alla tripsinizzazione su microsfera, data la specificità aggiuntiva per le asparagine N-glicosilate catturate sulla base della modifica della catena laterale rilevabile da MS12. Tuttavia, lo svantaggio di questo approccio di eluizione sequenziale è la necessità di raddoppiare il tempo dello strumento dello spettrometro di massa per analisi del campione.
  4. Aggiungere 100 μl della soluzione "Stop" per arrestare la reazione di digestione e acidificare la soluzione peptidica.

4. Desalinizzazione dei peptidi

  1. Utilizzando un adattatore per provette, posizionare una colonna di desalinizzazione in una provetta per microcentrifuga a basso contenuto proteico da 1,7 mL. Aggiungere l'intera soluzione di peptidi acidificati alla colonna. Centrifugare la colonna (3.800 × g per 3 minuti) in modo che la soluzione fluisca attraverso la colonna. I peptidi sono ora legati alla colonna; Scartare il flusso.
  2. Aggiungere 200 μl di soluzione "Wash 1" alla colonna e centrifugare (3.800 × g per 3 min, RT). Scartare il flusso.
  3. Aggiungere 200 μl di soluzione "Wash 2" alla colonna e centrifugare (3.800 × g per 3 min, RT). Scartare il flusso.
  4. Trasferire la colonna in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,7 mL a basso contenuto proteico. Aggiungere 100 μl di soluzione "Eluito" alla colonna e centrifugare (3.800 × g per 3 min, RT). Aggiungere altri 100 μl di soluzione "Eluito" alla colonna e centrifugare (3.800 × g per 3 min, RT). I peptidi vengono ora eluiti dalla colonna nel tubo.
  5. Mettere la soluzione peptidica in una centrifuga sottovuoto e lasciarla asciugare per una notte. Posizionare i peptidi essiccati a -80 °C fino al momento della quantificazione e analizzarli sullo spettrometro di massa.

5. Risospensione e quantificazione dei peptidi

  1. Risospendere i peptidi essiccati in 20 μL di solvente A (0,1% acido formico, 2% acetonitrile).
  2. Centrifugare i peptidi risospesi (17.200 × g per 10 minuti) per pellettare eventuali detriti insolubili.
  3. Preparare gli standard peptidici per il saggio di quantificazione colorimetrica dei peptidi.
    1. Collocare 5 μL di soluzione madre di peptidi da 1.000 mg/mL in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
    2. Eseguire una diluizione seriale in sette fasi nella piastra con acqua deionizzata (DI), come segue, con 5 μL di ciascuno standard per pozzetto: 1.000 mg/mL, 500 mg/mL, 250 mg/mL, 125 mg/mL, 62,5 mg/mL, 31,25 mg/mL e 15,625 mg/mL. Mettere 5 μL di acqua deionizzata in un ottavo pozzetto per il bianco.
  4. Mettere 4 μL di acqua deionizzata in tre pozzetti separati della piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 1 μL della soluzione di peptide risospeso a ciascun pozzetto, per un volume totale di 5 μL.
    NOTA: Quando si pipetta la soluzione peptidica per la quantificazione, pipettare accuratamente dalla parte superiore della soluzione per evitare di disturbare eventuali detriti depositati.
  5. Calcolare la quantità di reagente di lavoro necessaria (45 μl per pozzetto). Preparare il volume richiesto del reagente di lavoro del saggio colorimetrico; vortice il reagente di lavoro per garantire una corretta miscelazione dei componenti.
  6. Aggiungere 45 μl del reagente di lavoro a ciascuno dei pozzetti standard e campioni.
    NOTA: Realizzare gli standard in duplice copia e utilizzare una pipetta multicanale per garantire una differenza minima nei tempi di aggiunta del reagente ai pozzetti.
  7. Coprire la piastra con un foglio di alluminio e incubare a 37 °C per 15 min.
  8. Analizza la lastra su un lettore automatico di lastre. Utilizzare i valori di assorbanza registrati per i campioni standard per generare una curva standard lineare. Determina l'equazione della curva standard e del valore R2. Se il valore di R2 è ragionevole (≥0,95), utilizzare la curva standard per determinare la concentrazione di peptidi risospesi, tenendo conto della diluizione quintuplicata nella piastra di saggio colorimetrica.

6. Analisi della cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) dei peptidi digeriti

  1. Regolare la concentrazione dei campioni di peptidi a 0,2 μg/μl aggiungendo il solvente A e trasferire 10 μl in una provetta da 0,6 mL a basso legame proteico.
  2. Posizionare la provetta nell'autocampionatore LC.
  3. Imposta i parametri LC e MS/MS, secondo Figura 2 e Figura 3.
  4. Iniettare 5 μl (1 μg) del campione di peptide nella configurazione LC-MS/MS per l'analisi.
    NOTA: Le impostazioni LC-MS/MS mostrate qui sono rappresentative solo per le illustrazioni. A seconda della disponibilità degli strumenti LC e MS, gli utenti possono modificare le impostazioni per il gradiente LC e i parametri MS/MS per ottenere una copertura profonda del proteoma. Per questo articolo, l'analisi dei dati MS è stata eseguita utilizzando MaxQuant https://www.maxquant.org/, l'analisi dei dati secondari è stata eseguita utilizzando Perseus https://maxquant.net/perseus/ e l'analisi del percorso utilizzando https://reactome.org/.

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Results

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Per questo esperimento, abbiamo caratterizzato il proteoma della superficie cellulare di una linea cellulare tumorale marcando le proteine di membrana N-glicosilate di cellule intatte con biotina e arricchendo queste proteine marcate dall'intero lisato cellulare con un pulldown della neutravidina (Figura 1). Inoltre, abbiamo eseguito l'analisi del proteoma utilizzando LC-MS/MS per caratterizzare le proteine arricchite della superficie cellulare. A differenza dell'analisi del proteom...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La proteomica basata sulla spettrometria di massa è uno strumento potente che ha permesso la caratterizzazione imparziale di migliaia di proteine sconosciute su una scala precedentemente impossibile. Questo approccio ci consente di identificare e quantificare le proteine, nonché di raccogliere una serie di informazioni sulle capacità strutturali e di segnalazione di cellule e tessuti, caratterizzando la varietà di proteine presenti in un particolare campione. Andando oltre la profilazione proteica globale in un campione,...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo il Dr. Kamal Mandal (Dipartimento di Medicina di Laboratorio, UCSF) per l'aiuto nell'impostazione della corsa LC-MS/MS, Deeptarup Biswas (BSBE, IIT Bombay) per l'aiuto nell'analisi dei dati e la Dott.ssa Audrey Reeves (Dipartimento di Medicina di Laboratorio, UCSF) per l'aiuto nell'analisi dei dati. Il lavoro correlato nel laboratorio APW è supportato dal NIH R01 CA226851 e dal Chan Zuckerberg Biohub. La Figura 1 e la Figura 2B sono state realizzate utilizzando BioRender.com.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kits
96X iST Kit di preparazione del campionePreOmicsP.O.00027Kit di preparazione del campione di proteomica. Include reagenti per la riduzione, l'alchilazione e la digestione. Include anche colonne di desalinizzazione e reagenti.
Thermo23275saggio colorimetrico quantitativo dei peptidi Pierce. Include gli standard peptidici e i componenti dei reagenti funzionanti.
Reagenti
AcetonitrileFisherA955-1
Bicarbonato di ammonioMillipore Sigma09830-1KG
Biocitina idrazideBiotium90060
D-PBS (senza sali di calcio e magnesio)UCSF Cell Culture FacilityCCFAL003-225B01
Acido formicoHoneywell94318
Cocktail monouso Inibitore della proteasi e della fosfatasiHalt Thermo1861280
Resina di agarosio di neuravidina ad alta capacitàThermo29204
salina tamponata con fosfatoUCSF Impianto di coltura cellulareCCFAL001-22J01
Tampone di lisi RIPA, 10xMillipore Sigma20-188
Cloruro di sodioFisherBP358-212
Metaperiodato di sodioAlfa Aesar13798
Trypan Blue Stain (0,4%)Gibco15250-061
Ultrapuro 0,5 M EDTA, pH 8,0Invitrogen15575-038
Urea (grado di proteomica)VWRM123-1KG
strong>Equipment
TC20 Contatore di celle automatizzatoBio-Rad1450102
PrismR MicrocentrifugaLabnet InternationalC2500-R-230V
SonicatoreVWRBranson Sonifier 240
Collettore per vuotoPromegaPromega Vac-Man
Blocco di calore con agitazioneEppendorf EppendorfThermomixer C
Rotatore end-to-endLabnetRevolver Rotatore
LCThermo Ultimate3000 HPLC e UHPLC
Q Exactive Plus Hybrid Quadrapole Orbitrap Mass SpectrometerThermoIQLAAEGAAPFALGMBDK
Lettore di micropiastreBiotekBiotek Synergy 2 
Concentratore sottovuotoLabconco7810010
Forniture
1,5 mL Provette LoBind per proteineEppendorf22431081
1,7 mL Provette
Colonne di filtrazioneBio-Rad7326008
SpinColonne ThermoCodice 69725
Kit di quantificazione dei peptidi per il Soluzione <regolabileper microcentrifuga

References

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