Summary
هنا ، نصف سير عمل البروتينات لتوصيف بروتين سطح الخلية لأنواع الخلايا المختلفة. يتضمن سير العمل هذا إثراء بروتين سطح الخلية ، وإعداد العينات اللاحقة ، والتحليل باستخدام منصة LC-MS / MS ، ومعالجة البيانات باستخدام برامج متخصصة.
Abstract
على مدى العقد الماضي ، مكنت البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي من توصيف متعمق للأنظمة البيولوجية عبر مجموعة واسعة من التطبيقات. يعتبر بروتين سطح الخلية ("السطح") في الأمراض البشرية ذا أهمية كبيرة ، حيث أن بروتينات غشاء البلازما هي الهدف الرئيسي لمعظم العلاجات المعتمدة سريريا ، فضلا عن كونها ميزة رئيسية يمكن من خلالها تمييز الخلايا المريضة تشخيصيا عن الأنسجة السليمة. ومع ذلك ، ظل التوصيف المركز للبروتينات الغشائية والسطحية للخلية يمثل تحديا ، ويرجع ذلك أساسا إلى تعقيد المحللات الخلوية ، التي تخفي البروتينات ذات الأهمية من قبل البروتينات الأخرى عالية الوفرة. للتغلب على هذا الحاجز التقني وتحديد بروتين سطح الخلية بدقة لأنواع الخلايا المختلفة باستخدام بروتينات قياس الطيف الكتلي ، من الضروري إثراء تحلل الخلية لبروتينات سطح الخلية قبل التحليل على مطياف الكتلة. تقدم هذه الورقة سير عمل مفصل لوضع علامات على بروتينات سطح الخلية من الخلايا السرطانية ، وإثراء هذه البروتينات خارج الخلية المحللة ، وإعداد العينة اللاحقة لتحليل قياس الطيف الكتلي.
Introduction
تعمل البروتينات كوحدات أساسية يتم من خلالها تنفيذ غالبية الوظائف الخلوية. يعد توصيف بنية ووظيفة البروتينات ذات الصلة خطوة أساسية لفهم العمليات البيولوجية. على مدى العقد الماضي ، مكنت التطورات في تكنولوجيا قياس الطيف الكتلي وبرامج التحليل وقواعد البيانات من الكشف الدقيق عن البروتينات وقياسها على نطاق واسعللبروتين 1. يمكن استخدام البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي في مجموعة متنوعة من التطبيقات ، من تحليل العلوم الأساسية للمسارات الكيميائية الحيوية ، إلى تحديد أهداف الأدوية الجديدة في بيئة متعدية ، إلى تشخيص ومراقبة الأمراض في العيادة2. عند فحص أهداف الأدوية الجديدة ، يكون توصيف بروتين سطح الخلية مهما بشكل خاص ، حيث يستهدف أكثر من 65٪ من الأدوية البشرية المعتمدة حاليا بروتينات سطح الخلية3. يعتمد مجال العلاج المناعي للسرطان أيضا كليا على مستضدات سطح الخلية الخاصة بالسرطان لاستهداف الخلايا السرطانية والقضاء عليها على وجه التحديد4. وبالتالي يمكن أن تكون البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي بمثابة أداة واعدة لتحديد بروتينات سطح الخلية الجديدة نحو التدخلات العلاجية.
ومع ذلك ، هناك العديد من القيود عند استخدام طرق البروتينات التقليدية لمسح الخلايا السرطانية لأهداف بروتين سطح الخلية الجديدة. مصدر القلق الأساسي هو أن البروتينات السطحية تشكل جزءا صغيرا جدا من إجمالي جزيئات البروتين في الخلية. لذلك ، يتم إخفاء شظايا هذه البروتينات بوفرة عالية من البروتينات داخل الخلايا عند إجراء تحليل قياس الطيف الكتلي لتحلل الخليةالكاملة 5. هذا القيد يجعل من الصعب توصيف بروتين سطح الخلية بدقة مع سير عمل البروتيوميات التقليدي. لمواجهة هذا التحدي ، من الضروري تطوير طرق لإثراء بروتينات سطح الخلية من محللة الخلية بأكملها ، قبل التحليل على مطياف الكتلة. تتضمن إحدى هذه الطرق الأكسدة ووضع علامات البيوتين على بروتينات سطح الخلية الغليكوزيلاتي في الخلايا السليمة ، والإثراء اللاحق لهذه البروتينات البيوتينيلاتية من المحللة باستخدام سحب النيوترافيدين ، وهي عملية أطلق عليها "التقاط سطح الخلية"6. نظرا لأنه يعتقد أن ~ 85٪ من بروتينات سطح خلية الثدييات عبارة عن جليكوزيلاتي7 ، فإن هذا بمثابة طريقة فعالة لإثراء بروتين سطح الخلية من محللة الخلية بأكملها. تصف هذه الورقة سير عمل كامل ، بدءا من الخلايا المستزرعة ، لوضع علامات البيوتين على سطح الخلية ، وإعداد العينة اللاحقة لتحليل قياس الطيف الكتلي (الشكل 1). على مدى عدة نسخ متماثلة ، توفر هذه الطريقة تغطية قوية لبروتين سطح الخلية لعينة معينة. يمكن أن يؤدي استخدام هذه الطريقة لتوصيف بروتين سطح الخلية لكل من الورم والخلايا السليمة إلى تسهيل اكتشاف مستضدات سطح الخلية الجديدة لتحديد أهداف العلاج المناعي المحتملة8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم استخدام خلايا الورم البلازماويات AMO1 في تجربة بروتين سطح الخلية هذه. يمكن استخدام نفس البروتوكول لأنواع الخلايا الأخرى أيضا ، بما في ذلك مجموعة واسعة من خطوط الخلايا المعلقةوالملتصقة 9 ، بالإضافة إلى أنواع مختلفة من العينات الأولية10. ومع ذلك ، يجب عادة تحسين أرقام الخلايا (المادة الأولية للتجربة) لتغطية البروتين المكافئة. للحصول على التفاصيل المتعلقة بالمواد والمعدات، راجع جدول المواد. للحصول على التفاصيل المتعلقة بالمخازن المؤقتة ومحاليل الكواشف وتكوينها ، انظر الجدول 1.
1. وضع العلامات على سطح الخلية مع البيوتين
- عد الخلايا المستزرعة والحبيبات حوالي 3.5 × 107 خلايا حية عن طريق الطرد المركزي (5 دقائق عند 500 × جم ، 24 درجة مئوية).
ملاحظة: تم تمرير خلايا الورم البلازماويات AMO1 بوسائط جديدة كل 3 أيام قبل الحصاد. - قم بشفط المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات بإضافة 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (D-PBS) (بدون كالسيوم ولا مغنيسيوم) برفق لأعلى ولأسفل.
- قم بتجميع الخلايا مرة أخرى (كما في الخطوة 1.1) وكرر خطوة الغسيل (الخطوة 1.2) مرة أخرى (غسلتان في المجموع).
- بعد الغسيل الثاني ، قم بحبيبات الخلايا (كما في الخطوة 1.1) وأعد تعليقها في 990 ميكرولتر من D-PBS البارد عن طريق سحب الماصة برفق.
- قم بإعداد محلول مخزون من ميتاتراتيت الصوديوم 160 مللي متر (NaIO4) مسبقا. تقسم إلى 50 ميكرولتر من القسامات وتخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. أضف 10 ميكرولتر من محلول ميتاتريتات الصوديوم 160 مللي متر إلى معلق الخلية في الخطوة 1.4 ، واخلطها جيدا ، واحتضنها على دوار من طرف إلى طرف لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- بعد اكتمال الحضانة ، قم بتجميع الخلايا (كما في الخطوة 1.1) ، صب المادة الطافية ، وأعد تعليقها في 1 مل من D-PBS البارد. كرر خطوة الغسيل هذه مرتين (ثلاث غسلات في المجموع). بعد الغسيل الثالث ، أعد تعليق الخلايا في 989 ميكرولتر من D-PBS.
- قم بإعداد محلول مخزون من 100 mM Biocytin hydrazide مسبقا. تقسم إلى 50 ميكرولتر من القسامة، وتخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. أضف 1 ميكرولتر من الأنيلين و 10 ميكرولتر من 100 مللي متر من هيدرازيد البيوسيتين إلى معلق الخلية في الخطوة 1.6 ، واخلطها جيدا ، واحتضنها على دوار من طرف إلى طرف لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- بعد اكتمال الحضانة ، قم بتجميع الخلايا (كما في الخطوة 1.1) ، صب المادة الطافية ، وأعد تعليقها في 1 مل من D-PBS البارد. كرر خطوة الغسيل هذه مرتين (ثلاث غسلات في المجموع).
- بعد الغسيل الثالث ، قم بشفط المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة ، وقم بتجميد حبيبات الخلية عن طريق وضع الأنبوب في السائل N2. ضع الحبيبات المجمدة على حرارة -80 درجة مئوية ، حتى تصبح جاهزة للمضي قدما في التحلل والانسحاب.
2. تحلل الخلية وسحب البيوتين
- قم بإذابة حبيبات الخلية المجمدة على الجليد.
- أضف 500 ميكرولتر من 2x محلول تحلل إلى الحبيبات ، واخلطها جيدا ، ودوامة لمدة 30 ثانية.
ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى سحب قوي ودوامة لتحلل الحبيبات بالكامل. بعض الحطام غير القابل للذوبان (أي الحمض النووي) مقبول ، حيث يتم إزالته في خطوة الصوتنة اللاحقة. - Sonicate الخلية محللة على الجليد (ثلاث رشقات نارية ، 20 ثانية لكل منهما ، 60٪ دورة عمل).
- أجهزة الطرد المركزي المحللة لحبيبات أي حطام متبقي (10 دقائق عند 17200 × جم عند 4 درجات مئوية).
- أثناء التحلل بالطرد المركزي ، أضف 100 ميكرولتر من حبات راتنج النيوترافيدين أغاروز إلى عمود الترشيح. قم بتوصيل العمود بمشعب فراغ ، وقم بتطبيق فراغ لطيف ، واغسل الخرز عن طريق تدفق 3 مل من المخزن المؤقت للغسيل 1 فوقها.
- قم بإزالة عمود الترشيح من مشعب الفراغ ، وقم بتغطية الجزء السفلي ، وأضف الخلية الموضحة المحللة إلى العمود باستخدام الخرزات. قم بتغطية الجزء العلوي من العمود ، واحتضن المحللة بالخرز على دوار من طرف إلى طرف لمدة 120 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: عند تغطية الجزء العلوي من العمود ، ثبت الغطاء السفلي بإحكام في مكانه ، وإلا فقد يتم إزاحته وقد تتسرب تحلل الخلية أثناء الحضانة. - قم بإعداد مخازن الغسيل 1 و 2 و 3 (حوالي 5 مل من كل مخزن مؤقت للغسيل لكل عينة ، راجع الجدول 1) ، وضعها في حمام مائي 42 درجة مئوية
- بعد انتهاء التحلل من الحضانة ، ضع عمود الترشيح مرة أخرى على مشعب الفراغ ، وقم بتطبيق فراغ لطيف ، واغسل الخرزات عن طريق تدفق 5 مل من المخزن المؤقت للغسيل 1 فوقها.
ملاحظة: يمكن استخدام أكثر من 5 مل من مخازن الغسيل للغسيل ؛ قد يؤدي الغسيل الإضافي إلى تقليل الخلفية ، والربط غير المحدد على الخرز. - كرر خطوة الغسيل مع 5 مل من المخزن المؤقت للغسيل 2.
- كرر خطوة الغسيل مع 5 مل من المخزن المؤقت للغسيل 3.
- بمجرد تدفق المخزن المؤقت النهائي للغسيل بالكامل عبر الخرز ، قم بإزالة العمود من المشعب. أضف 100 ميكرولتر من محلول "Lyse" إلى الخرز وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي منخفض البروتين سعة 1.7 مل مع ماصة. قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة لتسوية الخرز ، وإزالة 50 ميكرولتر من المحلول دون إزعاج الخرزات المستقرة.
ملاحظة: تستخدم الكواشف في هذه الخطوة وجميع الخطوات اللاحقة مجموعة تحضير عينات البروتينات المتاحة تجاريا. توفر المجموعة سير عمل محسن ومبسط لإعداد العينات. ومع ذلك ، يمكن أيضا تنفيذ هذه الخطوات بشكل مستقل عن المجموعة ، باستخدام سير عمل البروتينات التقليدي كما هو موضح في Verma et al.9. إذا ظلت الخرزات عالقة في جانب العمود أو أسفله ، فاترك الخرزات التي تم نقلها إلى الأنبوب تستقر ، واستخدم محلول "Lyse" إضافي في الأنبوب لنقل الخرزات المتبقية. - ضع الأنبوب على كتلة حرارية / شاكر عند 65 درجة مئوية ، ورجه عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق.
ملاحظة: هذه الخطوة مطلوبة لتقليل وألكلة بقايا السيستين قبل الهضم.
3. هضم البروتين
- أعد تعليق أنبوب التربسين المجفف (أنبوب "الهضم" في المجموعة ، المخزن في -20 درجة مئوية) بإضافة 210 ميكرولتر من محلول "Resuspend". ماصة المحلول لأعلى ولأسفل عدة مرات لضمان إعادة امتصاص كل التربسين المجفف.
- بعد اكتمال الحضانة ، أضف 50 ميكرولتر من محلول التربسين المعاد تعليقه إلى الخرز. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية ، مع رجه عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 90 دقيقة على الأقل لهضم البروتين.
- بمجرد اكتمال عملية الهضم، انقل المحلول الذي يحتوي على الخرزات إلى عمود دوار، وأدخل العمود في أنبوب طرد مركزي منخفض البروتين سعة 1.7 مل. أدر الأنبوب (500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة [RT]) لفصل محلول الببتيد المهضوم عن الخرزات.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن إجراء علاج PNGase على الخرزات بمجرد فصلها عن محلول الببتيد ، للتخلص من شظايا الببتيد البيوتينيلات من حبات الستربتافيدين . يمكن بعد ذلك نقل عينة الببتيد هذه إلى الأمام خلال الفترة المتبقية من سير العمل كعينة ببتيد ثانوية منفصلة يمكن تحليلها ومقارنتها بالعينة الأولية من التربسينة على الخرزة. من المرجح أن يوفر نهج PNGase بيانات تكميلية للتربسين على الخرزة ، نظرا للخصوصية الإضافية للهليون N-glycosylated الملتقط بناء على تعديل السلسلة الجانبية التي يمكن اكتشافهابواسطة MS 12. ومع ذلك ، فإن عيب نهج الشطف المتسلسل هذا هو متطلبات ضعف وقت أداة مطياف الكتلة لكل تحليل عينة. - أضف 100 ميكرولتر من محلول "Stop" لإيقاف تفاعل الهضم وتحمض محلول الببتيد.
4. تحلية الببتيد
- باستخدام محول أنبوب ، ضع عمودا محليا في أنبوب طرد مركزي منخفض البروتين سعة 1.7 مل. أضف محلول الببتيد المحمض بالكامل إلى العمود. أدر العمود (3800 × جم لمدة 3 دقائق) بحيث يتدفق المحلول عبر العمود. ترتبط الببتيدات الآن بالعمود. تجاهل التدفق.
- أضف 200 ميكرولتر من محلول "Wash 1" إلى العمود وقم بتدويره (3800 × جم لمدة 3 دقائق ، RT). تجاهل التدفق.
- أضف 200 ميكرولتر من محلول "Wash 2" إلى العمود وقم بتدويره (3800 × جم لمدة 3 دقائق ، RT). تجاهل التدفق.
- انقل العمود إلى أنبوب طرد مركزي جديد منخفض البروتين سعة 1.7 مل يحمل علامة 1.7 مل. أضف 100 ميكرولتر من محلول "Elute" إلى العمود وقم بتدويره (3800 × جم لمدة 3 دقائق ، RT). أضف 100 ميكرولتر أخرى من محلول "Elute" إلى العمود وقم بتدويره (3800 × جم لمدة 3 دقائق ، RT). يتم الآن استخلاص الببتيدات من العمود إلى الأنبوب.
- ضع محلول الببتيد في جهاز طرد مركزي مفرغ واتركه يجف طوال الليل. ضع الببتيدات المجففة عند -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للقياس الكمي والتحليل على مطياف الكتلة.
5. إعادة تعليق الببتيد والقياس الكمي
- أعد تعليق الببتيدات المجففة في 20 ميكرولتر من المذيب A (0.1٪ حمض الفورميك ، 2٪ أسيتونيتريل).
- أجهزة الطرد المركزي الببتيدات المعاد تعليقها (17200 × جم لمدة 10 دقائق) لتكوير أي حطام غير قابل للذوبان.
- إعداد معايير الببتيد لمقايسة قياس كمية الببتيد اللوني.
- ضع 5 ميكرولتر من محلول مخزون الببتيد 1000 مجم / مل في بئر واحد من صفيحة 96 بئرا.
- قم بإجراء تخفيف تسلسلي من سبع خطوات في اللوحة بماء منزوع الأيونات (DI) ، على النحو التالي ، مع 5 ميكرولتر من كل معيار لكل بئر: 1000 مجم / مل ، 500 مجم / مل ، 250 مجم / مل ، 125 مجم / مل ، 62.5 مجم / مل ، 31.25 مجم / مل ، و 15.625 مجم / مل. ضع 5 ميكرولتر من ماء DI في بئر ثامن للفراغ.
- ضع 4 ميكرولتر من مياه DI في ثلاثة آبار منفصلة من لوحة 96 بئرا. أضف 1 ميكرولتر من محلول الببتيد المعاد تعليقه إلى كل بئر ، لحجم إجمالي قدره 5 ميكرولتر.
ملاحظة: عند سحب محلول الببتيد للقياس الكمي ، قم بسحب الماصة بعناية من أعلى المحلول لمنع إزعاج أي حطام مستقر. - احسب مقدار الكاشف العامل المطلوب (45 ميكرولتر مطلوب لكل بئر). تحضير الحجم المطلوب من كاشف عمل الفحص اللوني ؛ دوامة كاشف العمل لضمان الخلط السليم للمكونات.
- أضف 45 ميكرولتر من كاشف العمل إلى كل من الآبار القياسية والعينات.
ملاحظة: اجعل المعايير مكررة ، واستخدم ماصة متعددة القنوات لضمان الحد الأدنى من الاختلاف في توقيت إضافة الكاشف إلى الآبار. - يغطى الطبق بورق الألمنيوم ويحتضنه على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- قم بتحليل اللوحة على قارئ لوحة آلي. استخدم قيم الامتصاص المسجلة للعينات القياسية لإنشاء منحنى قياسي خطي. أوجد معادلة المنحنى القياسي وقيمة R2 . إذا كانت قيمة R2 معقولة (≥0.95) ، فاستخدم المنحنى القياسي لتحديد تركيز الببتيدات المعاد تعليقها ، وهو ما يمثل التخفيف بمقدار خمسة أضعاف في لوحة الفحص اللوني.
6. تحليل الكروماتوغرافيا السائلة - قياس الطيف الكتلي الترادفي (LC-MS / MS) للببتيدات المهضومة
- اضبط تركيز عينات الببتيد إلى 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر عن طريق إضافة المذيب A ، ونقل 10 ميكرولتر إلى أنبوب منخفض البروتين 0.6 مل.
- ضع الأنبوب في أخذ العينات الأوتوماتيكي LC.
- اضبط معلمات LC و MS / MS ، وفقا للشكل 2 والشكل 3.
- حقن 5 ميكرولتر (1 ميكروغرام) من عينة الببتيد في إعداد LC-MS / MS للتحليل.
ملاحظة: إعدادات LC-MS/MS المعروضة هنا هي إعدادات تمثيلية فقط للرسوم التوضيحية. اعتمادا على توفر أداة LC و MS ، يمكن للمستخدمين تعديل إعدادات تدرج LC ومعلمات MS / MS للحصول على تغطية بروتينية عميقة. بالنسبة لهذه الورقة ، تم إجراء تحليل بيانات MS باستخدام MaxQuant https://www.maxquant.org/ ، وتم إجراء تحليل البيانات الثانوية باستخدام Perseus https://maxquant.net/perseus/ ، وتحليل المسار باستخدام https://reactome.org/.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه التجربة ، قمنا بتمييز بروتين سطح الخلية لخط الخلايا السرطانية عن طريق تسمية بروتينات الغشاء N-glycosylated للخلايا السليمة بالبيوتين ، وإثراء هذه البروتينات الموسومة من تحلل الخلية بأكملها باستخدام سحب النيوترفيدين (الشكل 1). علاوة على ذلك ، أجرينا تحليل البروتين باستخدام LC-MS / MS لتوصيف بروتينات سطح الخلية المخصبة. على عكس تحليل بروتين الخلية الكاملة ، كان الهدف هنا هو توصيف بروتينات سطح الخلية فقط. ومن ثم ، بدأنا بإدخال عينة من 3.5 × 107 خلايا ورم البلازماويات AMO-1. حصلنا على تركيز الببتيد النهائي ~ 630 نانوغرام / ميكرولتر بناء على مقايسة قياس كمية الببتيد اللوني ، وكان العائد الإجمالي ~ 12.6 ميكروغرام من الببتيدات (في 20 ميكرولتر) (الشكل 2 أ). ثم قمنا بحقن 1 ميكروغرام من عينة الببتيد في نظام LC-MS / MS ، وكررنا الحقن ثلاث مرات للنسخ المتماثلة التقنية. تم تحسين معلمات LC و MS المستخدمة بناء على التجارب السابقة (الشكل 2C والشكل 3A). استخدمنا تدرج LC طويل يبلغ 4 ساعات لضمان أقصى تغطية.
تم تحليل بيانات LC-MS / MS باستخدام MaxQuant. تمكنا من تحديد 2,221 بروتينا يحتوي على ببتيد فريد واحد على الأقل ، و 1,764 بروتينا يحتوي على ببتيدين فريدين على الأقل عبر جميع النسخ الثلاثة المكررة. في المجموع ، تم تحديد 12307 ببتيدات فريدة. حددنا إثراء بروتين سطح الخلية في العينة باستخدام نص بايثون (يمكن العثور على البرنامج النصي الدقيق الذي استخدمناه في الشكل التكميلي S1) الذي يقارن النتائج التي تم الحصول عليها من MaxQuant بالعديد من مجموعات البيانات الثابتة لبروتينات سطح الخلية. وتشمل مجموعات البيانات هذه "في سطح السيليكو"3 المبلغ عنها سابقا ومجموعة بيانات تم إنشاؤها من بروتينات مشروحة على أنها موضعية غشائية في UniProt13 (مجموعات البيانات متاحة في الجدول التكميلي S1). أسفر هذا التحليل عن 601 بروتينا سطحيا في عينتنا (حوالي 27٪ من جميع البروتينات المحددة) (الشكل 4 أ). تم إجراء شرح أنطولوجيا الجينات (http://geneontology.org/) ، والذي أشار إلى أن ما يقرب من 30٪ من البروتينات موضعية بشكل قانوني في غشاء البلازما. كما أشار تحليل مسار المفاعل (https://reactome.org/) إلى الإثراء النسبي للبروتينات الغشائية المشاركة في النقل عبر الغشاء والتفاعلات السطحية للخلية (الشكل 5 والجدول التكميلي S2).
الشكل 1: سير العمل لوضع العلامات على سطح الخلية وإعداد العينة اللاحقة لتحليل قياس الطيف الكتلي. أولا ، يتم تمييز البروتينات الموجودة على سطح العينة الخلوية المطلوبة بالبيوتين. ثم يتم تحليل هذه الخلايا ، تليها الحضانة مع حبات النيوترفيدين التي تربط البروتينات التي تحمل علامة البيوتين. ثم يتم غسل الخرزات بشكل متكرر لإزالة البروتينات داخل الخلايا والملوثات الأخرى. ثم تخضع عينة البروتين لعملية هضم على الخرزة مع إضافة التربسين. ثم تخضع العينة الناتجة من شظايا الببتيد للتحلية لإزالة الملوثات من خطوات الغسيل والهضم. ثم يتم تجفيف عينة الببتيد النهائية وتكون جاهزة للخضوع لتحليل قياس الطيف الكتلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: المنحنى القياسي لقياس كمية الببتيد اللوني وتدرج LC . (أ) منحنى قياسي مكون من ثماني نقاط ناتج عن مقايسة تكميم الببتيد اللوني المستخدمة لتحديد تركيز الببتيد في العينات المعالجة. (ب) رسم توضيحي لنظام LC-MS/MS المستخدم لمعالجة العينات. ج: تدرج كروماتوغرافيا السائل ومعدل التدفق المستخدم لحقن العينات على مطياف الكتلة. الاختصارات: LC-MS / MS = كروماتوغرافيا سائلة - مطياف الكتلة الترادفية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: معلمات قياس الطيف الكتلي والكروماتوجرام التمثيلي . (أ) المعلمات المستخدمة في هذه التجربة باستخدام مطياف الكتلة Orbitrap. (ب) مخطط كروماتوجرام تمثيلي ناتج عن تحليل قياس الطيف الكتلي باتباع بروتوكول "التقاط سطح الخلية" لتدرج 4 ساعات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل إثراء البروتين على سطح الخلية ومقارنة التكرارات التقنية. تتضمن مجموعات البيانات هذه "في سطح السيليكو"3 ومجموعة بيانات تم إنشاؤها من البروتينات المشروحة على أنها موضعية في الغشاء في UniProt13. أ: عدد البروتينات والببتيدات المحددة بقطع مختلف بعد إزالة الملوثات، والبروتينات العكسية، وقيمة q > 0.05. (ب) يمثل المخطط توزيع البروتين المحدد ودرجةأندروميدا 14. (ج) يوضح مخطط التشتت العلاقة بين عينة وعينة. يقيس ارتباط رتبة سبيرمان قوة واتجاه الارتباط بين متغيرين مرتبين. (د) مخططات صندوقية تصور شكل التشغيل إلى التشغيل. (ه) مخطط توزيع حسب العينة يمثل جودة بيانات النسخ المتماثلة. الاختصار: LFQ = كمية خالية من التسمية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحليل المسار. تم إجراء تحليل المسار باستخدام Reactome الإصدار 8222. تصوير توضيحي لتفاعلات سطح الخلية في جدار الأوعية الدموية ، ويظهر إثراء بروتين سطح الخلية للتفاعلات الرئيسية المشاركة في تفاعل الصفائح الدموية والكريات البيض مع البطانة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم الكاشف | تكوين | خزن | |||||
| 100 مللي متر بيوسيتين هيدرازيد | شكل مسحوق بيوسيتين هيدرازيد مذاب في DMSO | تقسم إلى 50 ميكرولتر من القسامات وتخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. | |||||
| 160 مللي متر ميتازيتات الصوديوم (NaIO4) | مادة NaIO4 الصلبة المذابة في ماء DI | تقسم إلى 50 ميكرولتر من القسامات وتخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. | |||||
| 2x RIPA تحلل العازلة | 2x RIPA Lysis Buffer ، 1.25 mM EDTA ، كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني للاستخدام مرة واحدة | تحضير طازج في كل مرة قبل استخدام 10x RIPA Lysis Buffer. | |||||
| كاشف عمل الفحص اللوني الببتيد | 50٪ كاشف أ ، 48٪ كاشف ب ، 2٪ كاشف ج | تحضير طازجة في كل مرة قبل الاستخدام. قم بتخزين المكونات في درجة حرارة 4 درجات مئوية. | |||||
| المذيب أ | 0.1٪ حمض الفورميك, 2٪ أسيتونيتريل | يمكن التحضير في وقت مبكر وتخزينها في درجة حرارة الغرفة | |||||
| غسل العازلة 1 | 1x RIPA Lysis Buffer ، 1 مللي متر EDTA | يمكن تحضير دفعة كبيرة مسبقا وتخزينها في درجة حرارة الغرفة | |||||
| غسل العازلة 2 | 1x PBS ، 1 م كلوريد الصوديوم | يمكن تحضير دفعة كبيرة مسبقا وتخزينها في درجة حرارة الغرفة | |||||
| غسل عازلة 3 | 2 م يوريا ، 50 مللي متر بيكربونات الأمونيوم | تحضير طازج في كل مرة لأن اليوريا سوف تتحلل بسرعة بمرور الوقت. | |||||
الجدول 1: المخازن المؤقتة وحلول الكاشف المستخدمة في هذا البروتوكول.
الشكل التكميلي S1: نص بايثون لمقارنة النتائج التي تم الحصول عليها من MaxQuant بالعديد من مجموعات البيانات الثابتة لبروتينات سطح الخلية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي S1: مجموعات بيانات بروتينات سطح الخلية. تتضمن مجموعات البيانات هذه "في سطح السيليكو"3 ومجموعة بيانات تم إنشاؤها من البروتينات المشروحة على أنها موضعية في الغشاء في UniProt13. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي S2: يتم عرض المسارات ال 10 الأكثر صلة (مرتبة حسب قيمة p ) هنا. الاختصارات: FDR = معدل الاكتشاف الخاطئ ؛ SLC = حامل مذاب ؛ TCR = مستقبلات الخلايا التائية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتيوميات القائمة على قياس الطيف الكتلي هي أداة قوية مكنت من التوصيف غير المتحيز لآلاف البروتينات غير المعروفة على نطاق مستحيل سابقا. يسمح لنا هذا النهج بتحديد البروتينات وقياسها ، بالإضافة إلى استخلاص مجموعة من الأفكار حول القدرات الهيكلية والإشارات للخلايا والأنسجة ، من خلال توصيف مجموعة متنوعة من البروتينات الموجودة في عينة معينة. بالانتقال إلى ما هو أبعد من التنميط العالمي للبروتين في عينة ، يسمح لنا قياس الطيف الكتلي بتوصيف العديد من التعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs) على هذه البروتينات ، مما يوفر لمحة أعمق عن مراحل مسارات الإشارات وديناميكيات البروتين غير المتوفرة عند التحليل على مستوى الحمض النووي أو الحمض النوويالريبي 1. نحو تطوير علاجات جديدة للسرطان ، تسمح لنا البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي بمقارنة ملف البروتين للخلايا السرطانية الخبيثة مقابل الأنسجة السليمة ، لتحديد الأهداف المحتملة القابلة للدواء.
يعتمد مجال العلاج المناعي للسرطان سريع النمو على المستضدات المعبر عنها على سطح الخلايا الخبيثة لتحديد الأورام وتدميرها بشكل انتقائي. نظرا لأن تطوير علاجات مناعية جديدة للسرطان محدود بسبب نقص المستضدات الفريدة الخاصة بالسرطان ، والتي لا توجد في الأنسجة السليمة ، فمن الأهمية بمكان تحديد المزيد من المستضدات الجديدة الخاصة بالخلايا السرطانية15. لا يلزم أن تكون المستضدات الخاصة بالورم بروتينات كاملة فريدة من نوعها للخلية السرطانية ، ولكن يمكن أيضا أن تكون مطابقات بروتينية محددة أو PTMs غائبة في الأنسجة السليمة16,17. يمكن أن يسفر التحليل البروتيني لبروتينات سطح الخلية على كل من الورم والخلايا السليمة عن أهداف مستضد جديدة خاصة بالسرطان. تتطلب البروتينات السطحية للخلية إثراء البروتينات السطحية من محللة الخلية الكاملة قبل تحليل قياس الطيف الكتلي ، لتقليل تعقيد العينة وتجنب قمع الأيونات لبروتينات الغشاء المرغوبة (غالبا ما تكون منخفضة الوفرة) بواسطة البروتينات داخل الخلايا عالية التعبير18. في حين أن استراتيجية التقاط سطح الخلية المستخدمة هنا هي واحدة من أكثر أساليب التخصيب شيوعا لبروتينات سطح الخلية ، إلا أن هناك طرقا أخرى لإثراء بروتين سطح الخلية تم دمجها مع سير عمل قياس الطيف الكتلي ، بما في ذلك الطرد المركزي الفائق الانتقائي للأغشية الخلوية ، ووضع العلامات على NHS-biotin لللايسينات السطحية ، والبيوتينيل بوساطة الإنزيم لبروتينات سطح الخلية19 ، 20. تشير المقارنات المباشرة إلى أن نهج التقاط سطح الخلية يوفر التوازن الأمثل لسهولة الاستخدام والتخصيب الناجح وغير المتحيز نسبيا لبروتينات سطح الخلية مع أدنى تصنيف أساسي للبروتينات داخل الخلايا20.
تقدم هذه الورقة بروتوكولا فعالا وفعالا من حيث الوقت لسير عمل البروتينات على سطح الخلية من خلال دمج وضع العلامات على سطح الخلية وإجراء السحب مع سير عمل محسن لإعداد عينة البروتينات (الشكل 1). يمكن تحقيق الإجراء بأكمله ، من حصاد الخلايا المستزرعة إلى التحليل على مطياف الكتلة ، على مدار 3 أيام. للحصول على تغطية أقوى للبروتين السطحي ، قد يلزم تحسين المدخلات الأولية للخلايا بناء على نوع الخلية المستخدمة. يوصى بإجراء تجربة تجريبية بمدخلات خلايا متفاوتة ، تتراوح من بضعة ملايين من الخلايا إلى 50 مليون خلية ، لضمان أقصى قدر من التغطية. بالإضافة إلى ذلك ، إذا لوحظت كمية كبيرة من البروتينات داخل الخلايا عالية التعبير ، فإن زيادة غسل حبات النيوترافيدين بعد الحضانة مع المحللة يمكن أن يقلل من الارتباط غير المحدد للبروتينات بالخرزات.
نوصي بإجراء التجربة باستخدام ثلاث نسخ مكررة بيولوجية على الأقل وثلاث نسخ مكررة تقنية لكل حالة ، لتعزيز الثقة في أن علامات سطح الخلية المحددة موجودة بالفعل على غالبية الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، عند تنفيذ سير عمل التقاط سطح الخلية لنوع عينة جديد ، قد يكون من المفيد تحليل محللة خلية كاملة باستخدام نهج بروتينات البندقية التقليدي21 ، للمقارنة مع نتائج التقاط سطح الخلية. يمكن إجراء تحليل بيانات قياس الطيف الكتلي الخام من خلال البحث في قواعد البيانات المختلفة وحزم البرامج - هنا ، استخدمنا MaxQuant - للحصول على قائمة بالبروتينات المحددة22,23. يمكن تصفية هذه القائمة مقابل قواعد بيانات مختلفة معروفة 3,24 من البروتينات السطحية لإنشاء قائمة ببروتينات سطح الخلية المحددة في تجربة واحدة. بمجرد إنشاء قائمة ببروتينات سطح الخلية ، يمكن تحليلها بشكل أكبر لدورها في المسارات الكيميائية الحيوية ذات الصلة25 أو المرشحين المستهدفينللأدوية 26. يمكن تطبيق سير العمل هذا على مجموعة واسعة من أنواع الخلايا ، بما في ذلك خطوط الخلايا المعلقة والملتصقة (بالنسبة للخلايا الملتصقة ، نوصي برفع الخلايا دون استخدام التربسين قبل تحضير العينة ، لتجنب انقسام بروتينات سطح الخلية) ، وكذلك العينات الأولية.
باستخدام سير العمل هذا ، تمكنا من توصيف بروتين سطح الخلية لخط خلية معين بثقة. من خلال مقارنة البروتين السطحي لخطوط الخلايا السرطانية مقابل الخلايا السليمة ، والإحالة المرجعية مع قاعدة بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي للأنسجة الطبيعية ، يمكن إنشاء قائمة بأهداف العلاج المناعي المحتملة 8,13. أحد قيود هذه الطريقة هو أنه على الرغم من الإثراء الكبير لبروتينات سطح الخلية مقابل تجربة محللة قياسية للخلية الكاملة ، فإن غالبية البروتينات التي تم تحديدها بواسطة تحليل قياس الطيف الكتلي في سير العمل هذا لا تزال مشروحة على أنها داخل الخلايا. اعتمادا على صرامة قاعدة بيانات البروتين السطحي المستخدمة ، فإن ما يقرب من 25٪ -30٪ من البروتينات المحددة هي من سطح الخلية. نتوقع أن جزءا كبيرا من الخلفية غير السطحية ينبع على الأرجح من بروتين الخلفية غير المرتبط على وجه التحديد بالخرز (على سبيل المثال ، كما هو موضح في تحليل CRAPome27) ، بينما يمثل البعض الآخر تغلغل الخلايا لكاشف وضع العلامات للتفاعل مع بروتينات N-glycosylated في الشبكة الإندوبلازمية أو Golgi أو غيرها من المقصورات داخل الخلايا.
في حين أن طرق شطف الببتيد البديلة مثل علاج PNGase تؤدي إلى إثراء أكبر بكثير من N-glycosites بين إجمالي الببتيدات التي تم تحليلها ، فإن هذا النهج يسمح فقط بتحديد الببتيدات الغليسيوزيلاتية الفردية ، ويفقد معلومات قيمة من الباقي غير الغليكوزيلاتي من تسلسل البروتين المسحوب12. يمكن التقاط هذه المعلومات الإضافية من خلال نهج التربسين على الخرزة ، على الرغم من المقايضة المحتملة لانخفاض خصوصية البروتينات N-glycosylated التي تم تحليلها في مطياف الكتلة. بالإضافة إلى ذلك ، حتى شطف PNGase لا يتغلب على التحدي المتمثل في وضع العلامات على البروتينات الغليكوزيلاتية داخل الخلايا ، ويؤدي شطف PNGase عادة إلى ببتيد واحد فقط لكل بروتين. هذا يؤدي إلى تباين كبير في تحديد البروتين ، وفقا لتجربة مختبرنا ، في حين أن الهضم على الخرزة الموصوف هنا يؤدي إلى ببتيدات متعددة لكل بروتين تم التقاطه. لذلك ، اعتمادا على هدف التجربة ، يمكن للمرء أن يختار استراتيجيات مختلفة لاستخدام استراتيجية التقاط سطح الخلية. وتشمل هذه الاستراتيجيات تصغير وأتمتة بروتوكول التقاط سطح الخلية لمدخلات العينات الصغيرة28 واستخدام حبات الستربتافيدين ذات قدرة الربط المتفاوتة29 اعتمادا على التطبيق. تعمل الطريقة وسير العمل الموضح هنا كاستراتيجية عامة قوية وسهلة التنفيذ لإثراء بروتين سطح الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
نشكر الدكتور كمال ماندال (قسم الطب المخبري ، UCSF) للمساعدة في إعداد LC-MS / MS RUN ، و Deeptarup Biswas (BSBE ، IIT Bombay) للمساعدة في تحليل البيانات ، والدكتورة أودري ريفز (قسم الطب المخبري ، UCSF) للمساعدة في تحليل البيانات. يتم دعم العمل ذي الصلة في مختبر APW من قبل NIH R01 CA226851 و Chan Zuckerberg Biohub. تم عمل الشكل 1 والشكل 2 ب باستخدام BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| 96X iST Sample Preparation Kit | PreOmics | P.O.00027 | Proteomics sample preparation kit. Includes reagents for reduction, alkylation, and digestion. Also include desalting columns and reagents. |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo | 23275 | Peptide quantification kit. Includes peptide standards and components of working reagents. |
| Reagents | |||
| Acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
| Ammonium bicarbonate | Millipore Sigma | 09830-1KG | |
| Biocytin hydrazide | Biotium | 90060 | |
| D-PBS (w/o Calcium and Magnesium Salts) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003-225B01 | |
| Formic Acid | Honeywell | 94318 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail | Thermo | 1861280 | |
| High Capacity Neutravidin Agarose Resin | Thermo | 29204 | |
| Phosphate Buffered Saline | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001-22J01 | |
| RIPA Lysis Buffer, 10x | Millipore Sigma | 20-188 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Sodium metaperiodate | Alfa Aesar | 13798 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
| Urea (Proteomics Grade) | VWR | M123-1KG | |
| Equipment | |||
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | |
| PrismR Microcentrifuge | Labnet International | C2500-R-230V | |
| Sonicator | VWR | Branson Sonifier 240 | |
| Vacuum Manifold | Promega | Promega Vac-Man | |
| Shaking Heatblock | Eppendorf | Eppendorf Thermomixer C | |
| End-to-End rotator | Labnet | Revolver Adjustable Rotator | |
| LC | Thermo | Ultimate 3000 HPLC and UHPLC | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrapole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| Microplate Reader | Biotek | Biotek Synergy 2 | |
| Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Supplies | |||
| 1.5 mL Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | |||
| Filtration Columns | Bio-Rad | 7326008 | |
| Spin Columns | Thermo | 69725 |
References
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Aslam, B., Basit, M. B., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
- Bausch-Fluck, D., et al.
- Takahashi, Y., et al. Research advance in tumor specific antigens: A narrative review. AME Medical Journal. 6, 35 (2021).
- Li, Y., Qin, H., Ye, M. An overview on enrichment methods for cell surface proteome profiling. Journal of Separation Science. 43 (1), 292-312 (2020).
- Wollscheid, B., et al. Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Nature Biotechnology. 27 (4), 378-386 (2009).
- Chandler, K. B., Costello, C. C. Glycomics and glycoproteomics of membrane proteins and cell-surface receptors: present trends and future opportunities. Electrophoresis. 37 (11), 1407-1419 (2016).
- Ferguson, I. D., et al. The surfaceome of multiple myeloma cells suggests potential immunotherapeutic strategies and protein markers of drug resistance. Nature Communications. 13 (1), 4121 (2022).
- Karcini, A., Lazar, I. M. The SKBR3 cell-membrane proteome reveals telltales of aberrant cancer cell proliferation and targets for precision medicine applications. Scientific Reports. 12 (1), 10847 (2022).
- Köhnke, T., et al. Integrated multiomic approach for identification of novel immunotherapeutic targets in AML. Biomarker Research. 10 (1), 43 (2022).
- Verma, A., Kumar, V., Ghantasala, S., Mukherjee, S., Srivastava, S. Comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples. Journal of Visualized Experiments. (177), e61786 (2021).
- Leung, K. K., et al. Broad and thematic remodeling of the surfaceome and glycoproteome on isogenic cells transformed with driving proliferative oncogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (14), 7764-7775 (2020).
- Nix, M. A., et al. Surface proteomics reveals CD72 as a target for in vitro-evolved nanobody-based CAR-T cells in KMT2A/MLL1-rearranged B-ALL. Cancer Discovery. 11 (8), 2032-2049 (2021).
- Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
- Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
- Hosen, N., et al. The activated conformation of integrin β7 is a novel multiple myeloma-specific target for CAR T cell therapy. Nature Medicine. 23 (12), 1436-1443 (2017).
- Costa, A. F., Campos, D., Reis, C. A., Gomes, C. Targeting glycosylation: A new road for cancer drug discovery. Trends in Cancer. 6 (9), 757-766 (2020).
- Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface. Proteomics. Clinical Applications. 2 (6), 892-903 (2008).
- Itzhak, D. N., et al. A mass spectrometry-based approach for mapping protein subcellular localization reveals the spatial proteome of mouse primary neurons. Cell Reports. 20 (11), 2706-2718 (2017).
- Kirkemo, L. L., et al. Cell-surface tethered promiscuous biotinylators enable comparative small-scale surface proteomic analysis of human extracellular vesicles and cells. eLife. 11, 73982 (2022).
- Wojtkiewicz, M., Berg Luecke, L., Kelly, M. I., Gundry, R. L. Facile preparation of peptides for mass spectrometry analysis in bottom-up proteomics workflows. Current Protocols. 1 (3), 85 (2021).
- Välikangas, T., Suomi, T., Elo, L. L. A comprehensive evaluation of popular proteomics software workflows for label-free proteome quantification and imputation. Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1344-1355 (2018).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Bausch-Fluck, D., et al. A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas. PLoS One. 10 (3), 0121314 (2015).
- Griss, J., et al. ReactomeGSA-efficient multi-omics comparative pathway analysis. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (12), 2115-2125 (2020).
- Waas, M., et al. SurfaceGenie: a web-based application for prioritizing cell-type-specific marker candidates. Bioinformatics. 36 (11), 3447-3456 (2020).
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
- van Oostrum, M., et al. Classification of mouse B cell types using surfaceome proteotype maps. Nature Communications. 10 (1), 5734 (2019).
- Berg Luecke, L., Gundry, R. L. Assessment of streptavidin bead binding capacity to improve quality of streptavidin-based enrichment studies. Journal of Proteome Research. 20 (2), 1153-1164 (2021).
