Summary
Ici, nous décrivons un flux de travail protéomique pour la caractérisation du protéome de surface cellulaire de différents types cellulaires. Ce flux de travail comprend l’enrichissement des protéines de surface cellulaire, la préparation ultérieure des échantillons, l’analyse à l’aide d’une plate-forme LC-MS/MS et le traitement des données avec un logiciel spécialisé.
Abstract
Au cours de la dernière décennie, la protéomique basée sur la spectrométrie de masse a permis une caractérisation approfondie des systèmes biologiques dans un large éventail d’applications. Le protéome de surface cellulaire (« surfaceome ») dans la maladie humaine présente un intérêt important, car les protéines de la membrane plasmique sont la cible principale de la plupart des traitements cliniquement approuvés, ainsi qu’une caractéristique clé permettant de distinguer diagnostiquement les cellules malades des tissus sains. Cependant, la caractérisation ciblée des protéines membranaires et de surface de la cellule est restée difficile, principalement en raison de la complexité des lysats cellulaires, qui masquent les protéines d’intérêt pour d’autres protéines à forte abondance. Pour surmonter cette barrière technique et définir avec précision le protéome de surface cellulaire de différents types cellulaires à l’aide de la protéomique de spectrométrie de masse, il est nécessaire d’enrichir le lysat cellulaire pour les protéines de surface cellulaire avant l’analyse sur le spectromètre de masse. Cet article présente un flux de travail détaillé pour le marquage des protéines de surface cellulaire à partir de cellules cancéreuses, l’enrichissement de ces protéines hors du lysat cellulaire et la préparation ultérieure des échantillons pour l’analyse par spectrométrie de masse.
Introduction
Les protéines servent d’unités fondamentales par lesquelles la majorité des fonctions cellulaires sont effectuées. La caractérisation de la structure et de la fonction des protéines pertinentes est une étape essentielle pour comprendre les processus biologiques. Au cours de la dernière décennie, les progrès de la technologie de spectrométrie de masse, des logiciels d’analyse et des bases de données ont permis la détection et la mesure précises des protéines à l’échelle du protéome1. La protéomique basée sur la spectrométrie de masse peut être utilisée dans un large éventail d’applications, allant de l’analyse scientifique fondamentale des voies biochimiques à l’identification de nouvelles cibles médicamenteuses dans un contexte translationnel, en passant par le diagnostic et la surveillance des maladies en clinique2. Lors du criblage de nouvelles cibles médicamenteuses, la caractérisation du protéome de surface cellulaire est particulièrement importante, avec plus de 65% des médicaments humains actuellement approuvés ciblant les protéines de surface cellulaire3. Le domaine de l’immunothérapie du cancer repose également entièrement sur des antigènes de surface cellulaire spécifiques au cancer pour cibler et éliminer spécifiquement les cellules tumorales4. La protéomique basée sur la spectrométrie de masse peut donc servir d’outil prometteur pour identifier de nouvelles protéines de surface cellulaire en vue d’interventions thérapeutiques.
Cependant, il existe plusieurs limites lors de l’utilisation de méthodes protéomiques conventionnelles pour étudier les cellules tumorales à la recherche de nouvelles cibles protéiques de surface cellulaire. Une préoccupation majeure est que les protéines de surface constituent une très petite fraction des molécules protéiques totales dans une cellule. Par conséquent, les fragments de ces protéines sont masqués par une grande abondance de protéines intracellulaires lors de l’analyse par spectrométrie de masse du lysat de cellules entières5. Cette limitation rend difficile la caractérisation précise du protéome de surface cellulaire avec un flux de travail protéomique traditionnel. Pour relever ce défi, il est nécessaire de développer des moyens d’enrichir les protéines de surface cellulaire à partir du lysat de cellules entières, avant l’analyse sur le spectromètre de masse. L’une de ces méthodes implique l’oxydation et le marquage à la biotine des protéines de surface cellulaire glycosylées dans les cellules intactes, et l’enrichissement ultérieur de ces protéines biotinylées à partir du lysat avec un pulldown de neutravidine, un processus qui a été appelé « capture de surface cellulaire»6. Puisque ~85% des protéines de surface des cellules de mammifères sont considérées comme glycosylées7, cela sert de méthode efficace pour enrichir le protéome de surface cellulaire à partir du lysat cellulaire entier. Cet article décrit un flux de travail complet, commençant par les cellules en culture, de marquage de la biotine de surface cellulaire et de préparation ultérieure des échantillons pour l’analyse par spectrométrie de masse (Figure 1). Sur plusieurs réplications, cette méthode fournit une couverture robuste du protéome de surface cellulaire d’un échantillon particulier. L’utilisation de cette méthode pour caractériser le protéome de surface cellulaire des cellules tumorales et saines peut faciliter la découverte de nouveaux antigènes de surface cellulaire pour identifier des cibles immunothérapeutiques potentielles8.
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Protocol
REMARQUE: Les cellules de plasmocytome AMO1 ont été utilisées pour cette expérience sur le protéome de surface cellulaire. Le même protocole pourrait également être utilisé pour d’autres types de cellules, y compris un large éventail de suspensions et de lignées cellulaires adhérentes9, ainsi que divers types d’échantillons primaires10. Cependant, le nombre de cellules (matériau de départ de l’expérience) doit généralement être optimisé pour une couverture protéomique équivalente. Pour plus de détails sur les matériaux et l’équipement, consultez le Tableau des matériaux. Pour plus de détails sur les tampons et les solutions de réactifs et leur composition, voir le tableau 1.
1. Marquage de la surface cellulaire avec de la biotine
- Compter les cellules cultivées et granuler environ 3,5 × 107 cellules vivantes par centrifugation (5 min à 500 × g, 24 °C).
NOTE: Les cellules du plasmocytome AMO1 ont été transmises avec un milieu frais tous les 3 jours avant le prélèvement. - Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille en ajoutant 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (D-PBS) froide (4 °C) (sans calcium, sans magnésium) et en pipetant doucement de haut en bas.
- Enduisez à nouveau les cellules (comme à l’étape 1.1) et répétez l’étape de lavage (étape 1.2) une fois de plus (deux lavages au total).
- Après le deuxième lavage, enduire les cellules (comme à l’étape 1.1) et les remettre en suspension dans 990 μL de D-PBS froid en les pipetant doucement.
- Préparer au préalable une solution mère de métaperiodate de sodium 160 mM (NaIO4). Diviser en aliquotes de 50 μL et conserver à -20 °C jusqu’à 6 mois. Ajouter 10 μL de solution de métaperiodate de sodium à 160 mM à la suspension cellulaire à l’étape 1.4, bien mélanger et incuber sur un rotor de bout en bout pendant 20 min à 4 °C.
- Une fois l’incubation terminée, enduire les cellules en granulés (comme à l’étape 1.1), décanter le surnageant et remettre en suspension dans 1 mL de D-PBS froid. Répétez cette étape de lavage deux fois (trois lavages au total). Après le troisième lavage, remettre les cellules en suspension dans 989 μL de D-PBS.
- Préparer au préalable une solution mère de 100 mM d’hydrazide de biocytine. Diviser en aliquotes de 50 μL et conserver à -20 °C jusqu’à 6 mois. Ajouter 1 μL d’aniline et 10 μL de 100 mM de biocytine hydrazide à la suspension cellulaire à l’étape 1.6, bien mélanger et incuber sur un rotor de bout en bout pendant 60 min à 4 °C.
- Une fois l’incubation terminée, enduire les cellules en granulés (comme à l’étape 1.1), décanter le surnageant et remettre en suspension dans 1 mL de D-PBS froid. Répétez cette étape de lavage deux fois (trois lavages au total).
- Après le troisième lavage, aspirer soigneusement le surnageant avec une pipette et congeler la pastille de cellule en plaçant le tube dans le liquide N2. Placer la pastille congelée à -80 °C, jusqu’à ce qu’elle soit prête à procéder à la lyse et au retrait.
2. Lyse cellulaire et extraction de biotine
- Décongeler la pastille de cellule congelée sur de la glace.
- Ajouter 500 μL de tampon de lyse 2x à la pastille, bien mélanger et vortex pendant 30 s.
REMARQUE : Un pipetage et un vortex vigoureux peuvent être nécessaires pour lyser complètement la pastille. Certains débris insolubles (c.-à-d. l’ADN) sont acceptables, car ils sont éliminés lors de l’étape de sonication suivante. - Soniquer le lysat cellulaire sur de la glace (trois rafales, 20 s chacune, 60% du rapport cyclique).
- Centrifuger le lysat pour enduire les débris restants (10 min à 17 200 × g à 4 °C).
- Pendant que le lysat est centrifugé, ajoutez 100 μL de billes de résine d’agarose de neutravidine à une colonne de filtration. Fixez la colonne à un collecteur à vide, appliquez un aspirateur doux et lavez les billes en y versant 3 ml de tampon de lavage 1.
- Retirez la colonne de filtration du collecteur à vide, coiffez le fond et ajoutez le lysat cellulaire clarifié à la colonne avec les billes. Boucher le haut de la colonne et incuber le lysat avec les billes sur un rotor de bout en bout pendant 120 min à 4 °C.
REMARQUE: Lorsque vous coiffez le haut de la colonne, maintenez fermement le capuchon inférieur en place, sinon il pourrait se déloger et le lysat cellulaire pourrait fuir pendant l’incubation. - Préparer les tampons de lavage 1, 2 et 3 (environ 5 mL de chaque tampon de lavage par échantillon, voir le tableau 1) et les placer dans un bain-marie à 42 °C.
- Une fois l’incubation du lysat terminée, replacez la colonne de filtration sur le collecteur à vide, appliquez un aspirateur doux et lavez les billes en y faisant couler 5 ml de tampon de lavage 1.
REMARQUE : Plus de 5 mL des tampons de lavage peuvent être utilisés pour le lavage; Un lavage supplémentaire peut réduire le bruit de fond, la liaison non spécifique sur les perles. - Répétez l’étape de lavage avec 5 mL de tampon de lavage 2.
- Répétez l’étape de lavage avec 5 ml de tampon de lavage 3.
- Une fois que le tampon de lavage final a entièrement traversé les billes, retirez la colonne du collecteur. Ajouter 100 μL de solution de « Lyse » aux billes et les transférer dans un tube microcentrifuge à faible liaison aux protéines de 1,7 mL à l’aide d’une pipette. Faites tourner brièvement le tube pour déposer les billes et retirez 50 μL de la solution sans déranger les billes déposées.
REMARQUE: Les réactifs de cette étape et de toutes les étapes suivantes utilisent une trousse de préparation d’échantillons protéomiques disponible dans le commerce. Le kit fournit un flux de travail de préparation d’échantillons optimisé et simplifié. Cependant, ces étapes peuvent également être effectuées indépendamment de la trousse, en utilisant un flux de travail protéomique traditionnel tel que décrit dans Verma et al.9. Si les billes restent collées sur le côté ou au bas de la colonne, laissez les perles qui ont été transférées dans le tube se déposer et utilisez une solution supplémentaire de « Lyse » dans le tube pour transférer les perles restantes. - Placer le tube sur un bloc de chaleur ou un agitateur à 65 °C et agiter à 1 000 tr/min pendant 10 min.
NOTE: Cette étape est nécessaire pour la réduction et l’alkylation des résidus de cystéine avant la digestion.
3. Digestion des protéines
- Remettez en suspension la trypsine séchée (tube « Digest » dans le kit, conservé à -20 °C) en ajoutant 210 μL de la solution « Resuspendre ». Pipeter la solution de haut en bas plusieurs fois pour s’assurer que toute la trypsine séchée est remise en suspension.
- Une fois l’incubation terminée, ajouter 50 μL de la solution de trypsine en suspension aux billes. Incuber le tube à 37 °C, en agitant à 500 tr/min pendant au moins 90 min pour digérer la protéine.
- Une fois la digestion terminée, transférer la solution contenant les billes dans une colonne d’essorage et insérer la colonne dans un tube microcentrifuge à faible liaison aux protéines de 1,7 mL. Faites tourner le tube (500 × g pendant 5 min à température ambiante [RT]) pour séparer la solution peptidique digérée des billes.
REMARQUE: À ce stade, le traitement par PNGase peut être effectué sur les billes une fois qu’elles sont séparées de la solution peptidique, pour éluer les fragments de peptides biotinylés des billes de streptavidine. Cet échantillon de peptide peut ensuite être transféré dans le reste du flux de travail en tant qu’échantillon peptidique secondaire séparé qui peut être analysé et comparé à l’échantillon primaire de trypsinisation sur bille. L’approche PNGase est susceptible de fournir des données complémentaires à la trypsinisation sur bille, compte tenu de la spécificité supplémentaire des asparagines N-glycosylées capturées sur la base de la modification de la chaîne latérale détectable par la SM12. Cependant, l’inconvénient de cette approche d’élution séquentielle est l’exigence de deux fois le temps d’instrument du spectromètre de masse par analyse d’échantillon. - Ajouter 100 μL de la solution « Stop » pour arrêter la réaction de digestion et acidifier la solution peptidique.
4. Dessalage de peptides
- À l’aide d’un adaptateur de tube, placer une colonne de dessalage dans un tube microcentrifuge à faible liaison aux protéines de 1,7 mL. Ajouter toute la solution peptidique acidifiée à la colonne. Faire tourner la colonne (3 800 × g pendant 3 min) pour que la solution circule à travers la colonne. Les peptides sont maintenant liés à la colonne; Ignorez le flux.
- Ajouter 200 μL de solution « Wash 1 » à la colonne et faire tourner (3 800 × g pendant 3 min, RT). Ignorez le flux.
- Ajouter 200 μL de solution « Wash 2 » à la colonne et faire tourner (3 800 × g pendant 3 min, RT). Ignorez le flux.
- Transférer la colonne dans un nouveau tube microcentrifuge à faible liaison aux protéines de 1,7 mL étiqueté. Ajouter 100 μL de solution « élute » dans la colonne et faire tourner (3 800 × g pendant 3 min, RT). Ajouter 100 μL supplémentaires de solution « élute » dans la colonne et faire tourner (3 800 × g pendant 3 min, RT). Les peptides sont maintenant élués de la colonne dans le tube.
- Placez la solution peptidique dans une centrifugeuse sous vide et laissez-la sécher pendant la nuit. Placez les peptides séchés à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être quantifiés et analysez-les sur le spectromètre de masse.
5. Remise en suspension peptidique et quantification
- Remettez en suspension les peptides séchés dans 20 μL de solvant A (0,1% d’acide formique, 2% d’acétonitrile).
- Centrifuger les peptides remis en suspension (17 200 × g pendant 10 min) pour enrober les débris insolubles.
- Préparer des étalons peptidiques pour le test de quantification colorimétrique des peptides.
- Placer 5 μL de solution mère de peptide à 1 000 mg/mL dans un puits d’une plaque de 96 puits.
- Effectuer une dilution en série en sept étapes dans la plaque avec de l’eau désionisée (DI), comme suit, avec 5 μL de chaque étalon par puits : 1 000 mg/mL, 500 mg/mL, 250 mg/mL, 125 mg/mL, 62,5 mg/mL, 31,25 mg/mL et 15,625 mg/mL. Placez 5 μL d’eau DI dans un huitième puits pour l’blanc.
- Placez 4 μL d’eau DI dans trois puits distincts de la plaque de 96 puits. Ajouter 1 μL de la solution peptidique remise en suspension à chaque puits, pour un volume total de 5 μL.
REMARQUE: Lors du pipetage de la solution peptidique pour la quantification, pipeter soigneusement à partir du haut de la solution pour éviter de perturber les débris déposés. - Calculez la quantité de réactif de travail nécessaire (45 μL requis par puits). Préparer le volume requis du réactif de travail du test colorimétrique; Vortex le réactif de travail pour assurer un bon mélange des composants.
- Ajouter 45 μL du réactif de travail à chacun des puits étalons et échantillons.
REMARQUE : Faites les étalons en double et utilisez une pipette multicanal pour assurer une différence minimale dans le moment où le réactif est ajouté aux puits. - Couvrir la plaque de papier d’aluminium et incuber à 37 °C pendant 15 min.
- Analysez la plaque sur un lecteur de plaque automatisé. Utilisez les valeurs d’absorbance enregistrées pour les échantillons étalons pour générer une courbe étalon linéaire. Déterminez l’équation de la courbe standard et de la valeurR2 . Si la valeur R2 est raisonnable (≥0,95), utiliser la courbe standard pour déterminer la concentration de peptides en suspension en tenant compte de la dilution quintuplée dans la plaque d’essai colorimétrique.
6. Analyse par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) des peptides digérés
- Ajuster la concentration des échantillons de peptides à 0,2 μg/μL en ajoutant le solvant A et transférer 10 μL dans un tube à faible teneur en protéines de 0,6 mL.
- Placez le tube dans l’échantillonneur automatique LC.
- Réglez les paramètres LC et MS/MS, conformément à la figure 2 et à la figure 3.
- Injecter 5 μL (1 μg) de l’échantillon de peptide dans la configuration LC-MS/MS pour analyse.
REMARQUE: Les paramètres LC-MS/MS indiqués ici ne sont représentatifs que pour les illustrations. En fonction de la disponibilité des instruments LC et MS, les utilisateurs peuvent modifier les paramètres du gradient LC et des paramètres MS/MS pour obtenir une couverture protéome profonde. Pour cet article, l’analyse des données MS a été effectuée à l’aide de MaxQuant https://www.maxquant.org/, l’analyse des données secondaires a été effectuée à l’aide de Perseus https://maxquant.net/perseus/ et l’analyse de la voie à l’aide de https://reactome.org/.
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Representative Results
Pour cette expérience, nous avons caractérisé le protéome de surface cellulaire d’une lignée cellulaire tumorale en marquant les protéines membranaires N-glycosylées de cellules intactes avec de la biotine et en enrichissant ces protéines marquées du lysat cellulaire entier avec un pulldown de neutravidine (Figure 1). De plus, nous avons effectué une analyse du protéome en utilisant la LC-MS/MS pour caractériser les protéines de surface cellulaire enrichies. Contrairement à l’analyse du protéome des cellules entières, ici, l’objectif était de caractériser uniquement les protéines de surface cellulaire. Par conséquent, nous avons commencé avec un échantillon de 3,5 × 107 cellules de plasmocytome AMO-1. Nous avons obtenu une concentration finale de peptides de ~630 ng / μL sur la base du test de quantification colorimétrique des peptides, et le rendement total était de ~12,6 μg de peptides (dans 20 μL) (Figure 2A). Nous avons ensuite injecté 1 μg d’échantillon de peptide dans le système LC-MS/MS, et répété l’injection trois fois pour des répétitions techniques. Les paramètres LC et MS utilisés ont été optimisés sur la base d’expériences antérieures (Figure 2C et Figure 3A). Nous avons utilisé une longue pente LC de 4 h pour assurer une couverture maximale.
Les données LC-MS/MS ont été analysées à l’aide de MaxQuant; Nous avons pu identifier 2 221 protéines avec au moins un peptide unique et 1 764 protéines avec au moins deux peptides uniques dans les trois réplications. Au total, 12 307 peptides uniques ont été identifiés. Nous avons déterminé l’enrichissement en protéines de surface cellulaire dans l’échantillon en utilisant un script Python (le script exact que nous avons utilisé se trouve dans la figure supplémentaire S1) qui compare les résultats obtenus à partir de MaxQuant à plusieurs ensembles de données établis de protéines de surface cellulaire. Ces ensembles de données comprennent le « surfaceome in silico »3 précédemment rapporté et un ensemble de données établi à partir de protéines annotées comme localisées en membrane dans UniProt13 (les ensembles de données sont disponibles dans le tableau supplémentaire S1). Cette analyse a produit 601 protéines de surface dans notre échantillon (environ 27 % de toutes les protéines identifiées) (figure 4A). Une annotation d’ontologie génique (http://geneontology.org/) a été effectuée, indiquant qu’environ 30% des protéines devaient être localisées canoniquement à la membrane plasmique. L’analyse de la voie du réactome (https://reactome.org/) a également indiqué un enrichissement relatif des protéines membranaires impliquées dans le transport transmembranaire et les interactions à la surface cellulaire (figure 5 et tableau supplémentaire S2).
Figure 1 : Flux de travail pour le marquage de la surface cellulaire et la préparation ultérieure des échantillons pour l’analyse par spectrométrie de masse. Tout d’abord, les protéines à la surface de l’échantillon cellulaire souhaité sont marquées avec de la biotine. Ces cellules sont ensuite lysées, suivies d’une incubation avec des billes de neutravidine qui se lient aux protéines marquées à la biotine. Les billes sont ensuite lavées à plusieurs reprises pour éliminer les protéines intracellulaires et autres contaminants. L’échantillon de protéines subit ensuite une digestion sur bille avec l’ajout de trypsine. L’échantillon résultant de fragments peptidiques subit ensuite un dessalage pour éliminer les contaminants des étapes de lavage et de digestion. L’échantillon peptidique final est ensuite séché et prêt à subir une analyse par spectrométrie de masse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Courbe standard de quantification colorimétrique des peptides et gradient LC. (A) Courbe standard en huit points générée par le test de quantification colorimétrique des peptides utilisé pour déterminer la concentration de peptides dans les échantillons traités. (B) Une illustration du système LC-MS/MS utilisé pour traiter les échantillons. (C) Gradient de chromatographie liquide et débit utilisés pour l’injection d’échantillons sur le spectromètre de masse. Abréviations : LC-MS/MS = chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Paramètres de spectrométrie de masse et chromatogramme représentatif. (A) Paramètres utilisés pour cette expérience à l’aide d’un spectromètre de masse Orbitrap. (B) Chromatogramme représentatif généré par analyse par spectrométrie de masse suivant le protocole de « capture de surface cellulaire » pour un gradient de 4 heures. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse de l’enrichissement protéique de surface cellulaire et comparaison des réplications techniques. Ces ensembles de données comprennent le « surfaceome in silico »3 précédemment rapporté et un ensemble de données établi à partir de protéines annotées comme localisées par membrane dans UniProt13. (A) Le nombre de protéines et de peptides identifiés avec un seuil différent après élimination des contaminants, les protéines inverses et une valeur q > 0,05. (B) Le graphique représente la distribution de la protéine identifiée et le score d’Andromède14. (C) Le nuage de points illustre la corrélation entre les échantillons. La corrélation de rang de Spearman mesure la force et la direction de l’association entre deux variables classées. (D) Graphiques encadrés illustrant la variation d’une course à l’autre. E) Diagramme de distribution par échantillon représentant la qualité des données des répétitions. Abréviation : LFQ = quantification sans étiquette. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Analyse des parcours. L’analyse des voies a été réalisée à l’aide de Reactome version 8222. Une représentation illustrative des interactions de surface cellulaire au niveau de la paroi vasculaire, montrant l’enrichissement du protéome de surface cellulaire pour les interactions clés impliquées dans l’interaction plaquettaire et leucocytaire avec l’endothélium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Nom du réactif | Composition | Stockage | |||||
| 100 mM d’hydrazide de biocytine | sous forme de poudre d’hydrazide de biocytine dissoute dans le DMSO | Diviser en aliquotes de 50 μL et conserver à -20 °C jusqu’à 6 mois. | |||||
| 160 mM métaperiodate de sodium (NaIO4) | NaIO4 solide dissous dans l’eau DI | Diviser en aliquotes de 50 μL et conserver à -20 °C jusqu’à 6 mois. | |||||
| 2x tampon de lyse RIPA | 2x tampon de lyse RIPA, EDTA 1,25 mM, cocktail inhibiteur de protéase à usage unique | Préparez frais à chaque fois avant d’utiliser 10x RIPA Lysis Buffer. | |||||
| Réactif de travail de dosage colorimétrique peptidique | 50 % Réactif A, 48 % Réactif B, 2 % Réactif C | Préparer frais à chaque fois avant utilisation. Conserver les composants à 4 °C. | |||||
| Solvant A | 0,1 % d’acide formique, 2 % d’acétonitrile | Peut se préparer à l’avance et conserver à température ambiante | |||||
| Tampon de lavage 1 | 1x tampon de lyse RIPA, 1 mM EDTA | Peut préparer de gros lots à l’avance et stocker à température ambiante | |||||
| Tampon de lavage 2 | 1x PBS, 1 M NaCl | Peut préparer de gros lots à l’avance et stocker à température ambiante | |||||
| Tampon de lavage 3 | 2 M d’urée, 50 mM de bicarbonate d’ammonium | Préparez frais à chaque fois car l’urée se dégradera rapidement avec le temps. | |||||
Tableau 1 : Tampons et solutions réactives utilisés dans ce protocole.
Figure supplémentaire S1 : Script Python pour comparer les résultats obtenus à partir de MaxQuant à plusieurs ensembles de données établis de protéines de surface cellulaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire S1 : Ensembles de données sur les protéines de surface cellulaire. Ces ensembles de données comprennent le « surfaceome in silico »3 précédemment rapporté et un ensemble de données établi à partir de protéines annotées comme localisées par membrane dans UniProt13. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire S2 : Les 10 voies les plus pertinentes (triées par valeur p ) sont présentées ici. Abréviations : FDR = taux de fausses découvertes; SLC = porteur de soluté; TCR = récepteur des lymphocytes T. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
La protéomique basée sur la spectrométrie de masse est un outil puissant qui a permis la caractérisation impartiale de milliers de protéines inconnues à une échelle auparavant impossible. Cette approche nous permet d’identifier et de quantifier les protéines, ainsi que de glaner une gamme d’informations sur les capacités structurelles et de signalisation des cellules et des tissus, en caractérisant la variété de protéines présentes dans un échantillon particulier. Au-delà du profilage global des protéines dans un échantillon, la spectrométrie de masse nous permet de caractériser diverses modifications post-traductionnelles (PTM) sur ces protéines, offrant un aperçu encore plus profond des étapes des voies de signalisation et de la dynamique des protéines non disponibles lors de l’analyse au niveau de l’ADN ou de l’ARN1. En vue du développement de nouvelles thérapies anticancéreuses, la protéomique basée sur la spectrométrie de masse nous permet de comparer le profil protéique des cellules tumorales malignes par rapport aux tissus sains, afin d’identifier des cibles médicamentables potentielles.
Le domaine en pleine expansion de l’immunothérapie du cancer repose sur des antigènes exprimés à la surface des cellules malignes pour identifier et détruire sélectivement les tumeurs. Étant donné que le développement de nouvelles immunothérapies anticancéreuses est limité par le manque d’antigènes uniques spécifiques au cancer, qui sont absents dans les tissus sains, il est essentiel d’identifier davantage de nouveaux antigènes spécifiques aux cellules tumorales15. Les antigènes spécifiques de la tumeur n’ont pas besoin d’être des protéines entières uniques à la cellule tumorale, mais peuvent également être des conformations protéiques spécifiques ou des PTM absents dans les tissus sains16,17. L’analyse protéomique des protéines de surface cellulaire sur les cellules tumorales et saines peut fournir de nouvelles cibles antigéniques spécifiques au cancer. La protéomique de surface cellulaire nécessite l’enrichissement des protéines de surface à partir du lysat de cellules entières avant l’analyse par spectrométrie de masse, afin de réduire la complexité de l’échantillon et d’éviter la suppression ionique des protéines membranaires souhaitées (souvent de faible abondance) par des protéines intracellulaires fortement exprimées18. Bien que la stratégie de capture de la surface cellulaire employée ici soit l’une des approches d’enrichissement les plus couramment utilisées pour la protéomique de surface cellulaire, il existe d’autres méthodes d’enrichissement des protéines de surface cellulaire qui ont été intégrées à un flux de travail de spectrométrie de masse, notamment l’ultracentrifugation sélective des membranes cellulaires, le marquage NHS-biotine des lysines de surface et la biotinylation enzymatique des protéines de surface cellulaire19, 20. Les comparaisons directes suggèrent que l’approche de capture de la surface cellulaire offre l’équilibre optimal entre facilité d’utilisation et enrichissement réussi et relativement impartial des protéines de surface cellulaire avec le marquage de fond le plus faible des protéines intracellulaires20.
Cet article présente un protocole efficace et rapide pour un flux de travail protéomique de surface cellulaire en intégrant la procédure d’étiquetage et de retrait de la surface cellulaire à un flux de travail optimisé de préparation d’échantillons protéomiques (Figure 1). L’ensemble de la procédure, de la récolte des cellules cultivées à l’analyse sur le spectromètre de masse, pourrait être réalisé en 3 jours. Pour obtenir une couverture plus robuste du protéome de surface, il peut être nécessaire d’optimiser l’entrée initiale des cellules en fonction du type de cellule utilisé. Il est recommandé d’effectuer une expérience pilote avec des entrées cellulaires variables, allant de quelques millions de cellules à 50 millions de cellules, pour assurer une couverture maximale. De plus, si une grande quantité de protéines intracellulaires hautement exprimant est observée, un lavage accru des billes de neutravidine après l’incubation avec le lysat pourrait minimiser la liaison non spécifique des protéines aux billes.
Nous recommandons d’effectuer l’expérience avec au moins trois réplicats biologiques et trois réplicas techniques par condition, afin d’améliorer la confiance que les marqueurs de surface cellulaire identifiés sont effectivement présents sur la majorité des cellules. De plus, lors de l’exécution du flux de travail de capture de la surface cellulaire pour un nouveau type d’échantillon, il peut être utile d’analyser un lysat de cellule entière en utilisant une approche protéomique conventionnelle21, pour comparer avec les résultats de capture de la surface cellulaire. L’analyse des données brutes de spectrométrie de masse peut être effectuée par divers logiciels de recherche de bases de données et logiciels - ici, nous avons utilisé MaxQuant - pour obtenir une liste de protéines identifiées22,23. Cette liste peut être filtrée par rapport à diverses bases de données connues 3,24 de protéines de surface pour établir une liste des protéines de surface cellulaire identifiées dans une seule expérience. Une fois qu’une liste de protéines de surface cellulaire a été établie, elles peuvent être analysées plus avant pour leur rôle dans les voies biochimiques pertinentes25 ou les candidats cibles des médicaments26. Ce flux de travail peut être appliqué à une grande variété de types de cellules, y compris les lignées cellulaires en suspension et adhérentes (pour les cellules adhérentes, nous recommandons de soulever les cellules sans utiliser de trypsine avant la préparation des échantillons, afin d’éviter le clivage des protéines de surface cellulaire), ainsi que les échantillons primaires.
En utilisant ce flux de travail, nous avons pu caractériser en toute confiance le protéome de surface cellulaire d’une lignée cellulaire particulière. En comparant le protéome de surface des lignées cellulaires tumorales à des cellules saines, et en croisant avec une base de données de séquençage de l’ARN pour les tissus normaux, une liste de cibles immunothérapeutiques potentielles a pu être établie 8,13. Une limite de cette méthode est que, malgré l’enrichissement significatif des protéines de surface cellulaire par rapport à une expérience standard de lysat à cellules entières, la majorité des protéines identifiées par analyse par spectrométrie de masse dans ce flux de travail sont toujours annotées comme intracellulaires. Selon la rigueur de la base de données sur les protéines de surface utilisée, environ 25 % à 30 % des protéines identifiées proviennent de la surface cellulaire. Nous prévoyons qu’une partie importante du fond non superficiel émane probablement de protéines de fond non spécifiquement liées aux billes (par exemple, comme caractérisé par l’analyse CRAPome27), tandis que d’autres représentent la pénétration cellulaire du réactif de marquage pour réagir avec les protéines N-glycosylées dans le réticulum endoplasmique, Golgi ou d’autres compartiments intracellulaires.
Alors que d’autres méthodes d’élution peptidique telles que le traitement par PNGase entraînent un enrichissement beaucoup plus important des N-glycosites parmi les peptides totaux analysés, cette approche ne permet que l’identification de peptides glycyosylés individuels et perd des informations précieuses du reste non glycosylé de la séquence protéiquetirée vers le bas 12. Cette information supplémentaire peut être capturée avec cette approche de trypsinisation sur bille, mais au compromis potentiel d’une spécificité réduite pour les protéines N-glycosylées analysées dans le spectromètre de masse. En outre, même l’élution de PNGase ne surmonte pas le défi du marquage des protéines glycosylées intracellulaires, et une élution de PNGase conduit généralement à un seul peptide par protéine; Cela conduit à une variabilité significative dans l’identification des protéines, selon l’expérience de notre laboratoire, alors que la digestion sur bille décrite ici conduit à plusieurs peptides par protéine capturée. Par conséquent, en fonction de l’objectif de l’expérience, on pourrait potentiellement choisir différentes stratégies pour utiliser la stratégie de capture de surface cellulaire. Ces stratégies comprennent la miniaturisation et l’automatisation du protocole de capture de la surface cellulaire pour les petits échantillons28 et l’utilisation de billes de streptavidine de capacité de liaisonvariable 29 selon l’application. La méthode et le flux de travail illustrés ici constituent une stratégie générale robuste et facile à exécuter pour l’enrichissement des protéines de surface cellulaire.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Kamal Mandal (Département de médecine de laboratoire, UCSF) pour son aide à la mise en place de la course LC-MS/MS, Deeptarup Biswas (BSBE, IIT Bombay) pour l’analyse des données, et le Dr Audrey Reeves (Département de médecine de laboratoire, UCSF) pour l’aide à l’analyse des données. Les travaux connexes dans le laboratoire A.P.W. sont soutenus par NIH R01 CA226851 et le Chan Zuckerberg Biohub. La figure 1 et la figure 2B ont été réalisées à l’aide de BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| 96X iST Sample Preparation Kit | PreOmics | P.O.00027 | Proteomics sample preparation kit. Includes reagents for reduction, alkylation, and digestion. Also include desalting columns and reagents. |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo | 23275 | Peptide quantification kit. Includes peptide standards and components of working reagents. |
| Reagents | |||
| Acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
| Ammonium bicarbonate | Millipore Sigma | 09830-1KG | |
| Biocytin hydrazide | Biotium | 90060 | |
| D-PBS (w/o Calcium and Magnesium Salts) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003-225B01 | |
| Formic Acid | Honeywell | 94318 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail | Thermo | 1861280 | |
| High Capacity Neutravidin Agarose Resin | Thermo | 29204 | |
| Phosphate Buffered Saline | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001-22J01 | |
| RIPA Lysis Buffer, 10x | Millipore Sigma | 20-188 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Sodium metaperiodate | Alfa Aesar | 13798 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
| Urea (Proteomics Grade) | VWR | M123-1KG | |
| Equipment | |||
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | |
| PrismR Microcentrifuge | Labnet International | C2500-R-230V | |
| Sonicator | VWR | Branson Sonifier 240 | |
| Vacuum Manifold | Promega | Promega Vac-Man | |
| Shaking Heatblock | Eppendorf | Eppendorf Thermomixer C | |
| End-to-End rotator | Labnet | Revolver Adjustable Rotator | |
| LC | Thermo | Ultimate 3000 HPLC and UHPLC | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrapole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| Microplate Reader | Biotek | Biotek Synergy 2 | |
| Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Supplies | |||
| 1.5 mL Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | |||
| Filtration Columns | Bio-Rad | 7326008 | |
| Spin Columns | Thermo | 69725 |
References
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