Flusso di lavoro "Cell Surface Capture" per la quantificazione senza marcatura del proteoma della superficie cellulare

Questo protocollo ci consente di studiare gli antigeni presenti sulla superficie cellulare di vari tipi di cellule per trovare antigeni specifici per quel tipo di cellula o tessuto. La tecnica che presentiamo qui consente l'arricchimento delle proteine della membrana cellulare da un intero lisato cellulare, in ultima analisi per l'analisi mediante proteomica basata sulla spettrometria di massa. Quindi un'applicazione specifica di questo protocollo è quella di applicarlo alle cellule tumorali per cercare antigeni presenti sulla superficie di quelle cellule tumorali e non cellule normali che potrebbero fungere da nuovi bersagli per le immunoterapie del cancro.

Una cosa da notare su questo protocollo è che può essere importante ottimizzare l'input del campione per l'esperimento di interesse. Pertanto, potrebbero essere necessarie diverse iterazioni o titolazioni per trovare le condizioni ottimali. A dimostrare la procedura sarà Akul Naik, uno specialista junior del nostro laboratorio.

Per iniziare, rimuovi il pellet cellulare congelato marcato con biotina da meno 80 gradi Celsius e scongelalo con ghiaccio. Aggiungere 500 microlitri di tampone di lisi 2X al pellet, mescolare accuratamente e agitare energicamente per 30 secondi. Sonicare il lisato cellulare su ghiaccio e centrifugare il lisato a 17, 200 G per 10 minuti a 4 gradi Celsius per pellettare eventuali detriti rimanenti.

Mentre il lisato è in fase di centrifugazione, aggiungere 100 microlitri di perle di resina di agarosio NeutrAvidin a una colonna di filtrazione collegata al collettore del vuoto. Applicare un delicato aspirapolvere e lavare le perle versando su di esse 3 millilitri di Wash Buffer 1. Rimuovere la colonna di filtrazione dal collettore del vuoto, tappare il fondo e aggiungere il lisato cellulare chiarificato alla colonna con le perline.

Tappare la parte superiore della colonna e incubare il lisato con le perle su un rotore end-to-end per 120 minuti a 4 gradi Celsius. Dopo aver completato l'incubazione del lisato, riposizionare la colonna di filtrazione sul collettore del vuoto e applicare un vuoto delicato. Lavare le perle facendo scorrere su di esse cinque millilitri di Wash Buffer 1.

Ripetere la fase di lavaggio con cinque millilitri di Wash Buffer 2 e Wash Buffer 3. Una volta che il tampone di lavaggio finale è fluito interamente attraverso i cordoni, rimuovere la colonna dal collettore. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione di lisi alle perle e trasferirle in una provetta da microcentrifuga a basso contenuto proteico da 1,7 millilitri con una pipetta.

Far girare brevemente il tubo per depositare le perle e rimuovere 50 microlitri di soluzione. Quindi, posizionare il tubo su uno shaker a 65 gradi Celsius per 10 minuti a 1000 giri/min agitando. Risospendere la tripsina essiccata nella provetta del digest del kit aggiungendo 210 microlitri della soluzione di risospensione e pipettandola su e giù più volte per assicurarsi che tutta la tripsina essiccata venga risospesa.

Al termine dell'incubazione delle perle, rimuoverle dall'agitatore a blocchi di calore e aggiungere 50 microlitri della soluzione di tripsina risospesa alle perle. Incubare la provetta a 37 gradi Celsius, agitando a 500 giri/min per almeno 90 minuti per digerire la proteina. Una volta completata la digestione, trasferire la soluzione contenente le perle in una colonna rotante e inserire la colonna in una provetta da microcentrifuga a basso contenuto proteico da 1,7 millilitri.

Girare il tubo per separare la soluzione peptidica digerita dalle perline. Quindi, aggiungere 100 microlitri della soluzione di arresto per fermare la reazione di digestione e acidificare la soluzione peptidica. Utilizzando un adattatore per provette, posizionare una colonna di desalinizzazione in una provetta da microcentrifuga a basso contenuto proteico da 1,7 millilitri.

Aggiungere l'intera soluzione di peptidi acidificati alla colonna. Centrifugare la colonna a 3.800 G per 3 minuti, in modo che la soluzione fluisca attraverso la colonna. Scartare il flusso poiché i peptidi sono ora legati alla colonna.

Aggiungere 200 microlitri di soluzione Wash 1 alla colonna, centrifugare a 3.800 G per 3 minuti a temperatura ambiente, quindi scartare il flusso. Ripetere la fase di lavaggio con 200 microlitri di soluzione Wash 2. Trasferire la colonna in una nuova provetta da microcentrifuga a basso contenuto proteico da 1,7 millilitri etichettata.

Aggiungere 100 microlitri di soluzione di eluizione alla colonna e centrifugare a 3.800 G per 3 minuti a temperatura ambiente. I peptidi vengono ora eluiti dalla colonna nel tubo. Mettere la soluzione peptidica in una centrifuga sottovuoto e lasciarla asciugare per una notte.

Posizionare i peptidi essiccati a meno 80 gradi Celsius fino al momento di quantificare e analizzare sullo spettrometro di massa. L'analisi del proteoma è stata eseguita per caratterizzare le proteine della superficie cellulare arricchita utilizzando la spettrometria di massa tandem con cromatografia liquida. Una concentrazione peptidica finale di circa 630 nanogrammi per microlitro è stata ottenuta sulla base del saggio di quantificazione peptidica colorimetrica.

I dati della spettrometria di massa analizzati con MaxQuant e la successiva analisi del set di dati delle proteine della superficie cellulare hanno prodotto 601 proteine di superficie nel campione, circa il 27% di tutte le proteine identificate. Qui viene mostrato un grafico che rappresenta la distribuzione della proteina identificata nel punteggio di Andromeda e il grafico a dispersione illustra la correlazione da campione a campione. I grafici a scatola rappresentavano la variazione run-to-run.

E il grafico di distribuzione per campione rappresentava la qualità dei dati delle repliche. La cosa più importante da tenere a mente è dove si trovano i peptidi in ogni fase. Inizialmente sono in soluzione, poi vengono legate alle perle fino alla digestione, quindi vengono legate alla colonna di desalinizzazione fino a quando non vengono finalmente eluite.

Seguendo questa procedura, ci sono vari modi per convalidare una manciata delle proteine identificate, come la citometria a flusso mirata e la proteomica mirata. Ciò fornirà informazioni più dettagliate sui livelli di espressione di queste proteine in tutto il campione.