Summary
מחקר זה פיתח שיטה לא פולשנית ובזמן אמת להערכת ההתפלגות של ליגנד מוות מתוכנת 1 בכל הגוף, בהתבסס על הדמיה טומוגרפית של פליטת פוזיטרונים של אנטגוניסט D-dodecapeptide [68Ga]. לטכניקה זו יתרונות על פני אימונוהיסטוכימיה קונבנציונלית והיא משפרת את יעילות זיהוי החולים המתאימים אשר יפיקו תועלת מטיפול בחסימת נקודות בקרה חיסוניות.
Abstract
הפיתוח של טיפול בחסימת נקודות בקרה חיסוניות המבוסס על חלבון מוות תאי מתוכנת 1 (PD-1)/ליגנד מוות מתוכנת 1 (PD-L1) חולל מהפכה בטיפולים בסרטן בשנים האחרונות. עם זאת, רק חלק קטן מהחולים מגיב למעכבי PD-1/PD-L1, בשל הביטוי ההטרוגני של PD-L1 בתאי הגידול. הטרוגניות זו מציבה אתגר בזיהוי מדויק של תאי גידול על ידי הגישה האימונוהיסטוכימית הנפוצה (IHC). מצב זה דורש שיטות טובות יותר לריבוד חולים שייהנו מטיפול בחסימת נקודות בקרה חיסוניות, כדי לשפר את יעילות הטיפול. טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) מאפשרת הדמיה בזמן אמת של ביטוי PD-L1 בכל הגוף באופן לא פולשני. לכן, יש צורך בפיתוח נותבים רדיואקטיביים לאיתור התפלגות PD-L1 בגידולים באמצעות הדמיית PET.
בהשוואה לעמיתיהם L, לפפטידים דקסטרורוטאריים (D) יש תכונות כגון עמידות פרוטאוליטית וזמן מחצית חיים מטבולי ממושך להפליא. מחקר זה תכנן שיטה חדשה לזיהוי ביטוי PD-L1 המבוססת על הדמיית PET של 68פפטיד D-L1 ממוקד PD-L1, אנטגוניסט D-dodecapeptide (DPA), בעכברים נושאי גידול. התוצאות הראו כי [68Ga]DPA יכול להיקשר באופן ספציפי לגידולים בעלי ביטוי יתר של PD-L1 in vivo, והראו יציבות חיובית כמו גם יכולת הדמיה מצוינת, דבר המצביע על כך [68Ga]DPA-PET היא גישה מבטיחה להערכת מצב PD-L1 בגידולים.
Introduction
גילוי חלבוני נקודות הביקורת החיסונית היווה פריצת דרך בטיפול בגידולים, והוביל להתקדמות משמעותית בפיתוח טיפול בחסימת נקודות בקרה חיסוניות1. חלבון מוות תאי מתוכנת 1 (PD-1) וליגנד מוות מתוכנת 1 (PD-L1) הם מטרות פוטנציאליות לתרופות עם מספר נוגדנים שאושרו על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA). PD-1 מבוטא על ידי תאי חיסון חודרי גידול, כגון CD4+, תאי T CD8+ ותאי T רגולטוריים. PD-L1 היא אחת מהליגנדות PD-1, אשר באה לידי ביטוי יתר במגוון תאי גידול 2,3. האינטראקציה בין PD-1 ו-PD-L1 משביתה את PD-1, ובכך מדכאת את התגובה החיסונית האנטי-סרטנית4. ממצאים אלה מציעים כי עיכוב PD-L1 יכול לשפר את אפקט ההרג של תאי מערכת החיסון ולחסל תאים סרטניים5. נכון לעכשיו, אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית (IHC) היא הגישה הנפוצה ביותר לזיהוי חולים בעלי הסבירות הגבוהה ביותר להגיב לטיפול בנקודות בקרה חיסוניות 6,7. עם זאת, בשל הביטוי ההטרוגני של PD-L1 בתאי גידול, תוצאות IHC מביופסיות אינן יכולות לספק מידע מדויק על ביטוי PD-L1 בחולים8. מחקרים קודמים דיווחו כי רק 20%-40% מהמטופלים משיגים יתרונות ארוכי טווח מטיפול בחסימת נקודות בקרה חיסוניות 1,9,10. לכן, יש צורך דחוף לפתח שיטה חדשה כדי לעקוף את התוצאות השליליות הכוזבות הנגרמות על ידי ביטוי הטרוגני של חלבוני בקרה חיסונית אלה.
טכנולוגיית הדמיה מולקולרית, כגון טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET), מאפשרת הדמיה בזמן אמת של כל הגוף באופן לא פולשני, ובכך יכולה לעלות בביצועיה על שיטת IHC הקונבנציונלית 11,12,13. נוגדנים, פפטידים ומולקולות קטנות בעלי תווית רדיואקטיבית הם נותבים מבטיחים לניטור ביטוי PD-L1 בחולי סרטן 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. ה-FDA אישר שלושה נוגדנים חד-שבטיים טיפוליים PD-L1: avelumab, atezolizumab ו-durvalumab26. נותבי PET חיסוניים המבוססים על נוגדנים אלה תועדו היטב 27,28,29,30,31,32. ניסויים קליניים בשלב מוקדם גילו ערך מוגבל ליישום קליני, בגלל הפרמקוקינטיקה30 השלילית. בהשוואה לנוגדנים, פפטידים מפגינים פינוי מהיר יותר של דם ואיברים מאיברים בריאים, וניתן לשנות אותם כימית בקלות33. מספר פפטידים בעלי זיקה גבוהה ל-PD-1/PD-L1 דווחו2; WL12 הוא פפטיד מדווח המראה קשירה ספציפית ל-PD-L134. דווח כי עוקבים עם תווית רדיו, [64Cu]WL12, [68Ga]WL12 ו-[18F]FPyWL12, הראו יכולת מיקוד גידול ספציפית גבוהה in vivo, המאפשרת קציר של תמונות באיכות גבוהה של ביטוי PD-L1 בגידולים 26,35,36,37. יתר על כן, ההערכה הראשונה בבני אדם של WL12 עם תווית רדיו הראתה כי [68Ga]WL12 (כלאט על ידי NOTA) יש פוטנציאל בטוח ויעיל להדמיית גידול קליני38. בשל הידרופוביות גבוהה וספיגה גבוהה בכבד בריא, WL12 יש שימוש קליני מוגבל. פפטידים אחרים של תיוג רדיו, כגון TPP1 ו-SETSKSF, שנקשרים באופן ספציפי ל-PD-L1, הראו גם הם יציבות וספציפיות פוטנציאליות כדי להמחיש ביטוי PD-L1 של כל הגוף39,40. עם זאת, פפטידים שלא שונו מתפרקים בקלות על ידי פרוטאזות, והם מטבוליזם במהירות על ידי הכליה. Dextrorotary(D)-peptides נמצאים בשימוש נרחב כמתווכים יעילים, בשל יציבות ירודה של פפטידים שמאליים (L) 41,42,43. D-פפטידים עמידים במיוחד בפני פירוק פרוטאוליטי ויש להם זמן מחצית חיים מטבולי ממושך להפליא. בהשוואה לעמיתיהם L, D-peptides מראים בעיקר יכולות קישור ספציפיות 44,45,46.
מחקר זה תכנן שיטה חדשה לזיהוי ביטוי PD-L1, המבוססת על הדמיית PET של 68Ga-labeled PD-L1-targeted D-peptide, D-dodecapeptide antagonist (DPA), בעכבר נושא גידול מודל47. היציבות של [68Ga]DPA נחקרה לראשונה במי מלח חוצצי פוספט (PBS) ובסרום עכברים, ולאחר מכן נבדקה זיקה קושרת של [68Ga]DPA בגידולים בעלי ביטוי יתר PD-L1. לאחר מכן, הדמיית PET בוצעה במודלים של גליובלסטומה קסנוגרפט כדי לאשר אם [68Ga]DPA היה עוקב PET אידיאלי לניטור ביטוי PD-L1 בגידולים. השילוב של דימות PET ו- DPA לא רק מספק גישה חדשה להתגבר על אתגרים הקשורים לביטוי ההטרוגני של PD-L1, אלא גם מניח את הבסיס לפיתוח רדיוטרייסרים מבוססי D-פפטידים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הליכי הניסוי בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים באוניברסיטה הרפואית נאנג'ינג או המכונים הלאומיים למדע וטכנולוגיה קוונטיים. ניסויי העכברים בוצעו בקפדנות בהתאם להנחיות המוסדיות של הוועדה לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
1. סינתזת פפטיד
- להתנפח 100 מ"ג של שרף 4-methylbenzhydrylamine (MBHA) (כושר טעינה של 0.37 mmol / g) ב 1 מ"ל של N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) במשך 30 דקות תחת N2 מבעבע קל.
- הכינו מאגר מלאי טרי המורכב מחומצות אמינו מוגנות Fmoc (5.0 שווה ערך), HCTU (4.9 שווה ערך) ו-DIPEA (שווה ערך ל-10.0) ב-1 מ"ל של תמ"ג, והוסיפו לשרף (100 מ"ג). אפשר לתגובת הצימוד להמשיך במשך 1.5-2 שעות.
- הכינו חיץ הגנה המורכב מ-50% (vol/vol) מורפולין בתמ"א. שטפו את השרף (100 מ"ג) 2 x 30 דקות עם 1 מ"ל של חיץ ההגנה בכל שטיפה כדי להסיר את קבוצת ה-Fmoc מקבוצת האמין. שטפו את השרף עם דיכלורומתאן (DCM; 1 מ"ל) למשך דקה אחת, הסירו את ה-DCM ושטפו מחדש את השרף עם NMP (1 מ"ל) למשך דקה נוספת. לאחר מכן, להסיר את התמ"א ולשטוף מחדש את השרף עם DCM במשך 1 דקה.
הערה: כל הליכי הכביסה מתבצעים תחת בעבוע N2 קל. ההליכים הנ"ל חוזרים על עצמם עד חומצת האמינו האחרונה. - להוספת 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) לפפטיד, יש להפעיל מראש את DOTA עם N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC· HCl) ו-N-hydroxysuccinimide (NHS). לדגור על מאגר המניות של DOTA/EDC· HCl/NHS ביחס מולארי של 1:1:1 בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) למשך 3 שעות, עם ריכוז DOTA סופי של 1 M. לאחר מכן, הוסף את מאגר המניות (1 מ"ל) לשרף (100 מ"ג), ואפשר לתגובה להמשיך במשך שעתיים עם N2 עדין מבעבע.
הערה: 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid (NOTA) יכול לשמש גם ככלטור עבור קומפלקס 68Ga. ניתן להשתמש באותם נהלים עבור צימוד NOTA. - שטפו היטב את השרף מלמעלה באמצעות DCM והפעילו ואקום כדי להסיר את שאריות התגובה בו זמנית. שטפו את השרף 3x באמצעות DCM (1.5 מ"ל), ולאחר מכן שטפו עם MeOH (1.5 מ"ל) כדי לכווץ את השרף. שים את השרף תחת חנקן במשך הלילה, או תחת ואקום גבוה לפחות 4 שעות, עד שהשרף הופך יבש.
- מניחים את השרף המיובש המכיל פפטיד DPA במיכל פוליפרופילן בנפח 2 מ"ל עם מכסה בורג. הוסיפו את קוקטייל המחשוף המתאים (95/2.5/2.5 TFA/TIS/H2O בנפח; 1 מ"ל/100 מ"ג שרף) ואטמו היטב את המיכל באמצעות מכסה בורג. בעדינות לעורר את התגובה על שייקר מסלול במכסה אדים ב 20-25 ° C במשך 2 שעות.
אזהרה: הכינו חומצה טריפלואורואצטית (TFA) במכסה אדים עם ביגוד מגן, בשל טבעה הקורוזיבי מאוד. - הסר את רוב TFA על ידי אידוי תחת חנקן במכסה האדים. לזרז את הפפטידים על ידי הוספת אתר דיאתיל (~ 1.5 מ"ל / 100 מ"ג שרף).
- מערבבים את התערובת כדי לערבב את הפפטידים והצנטריפוגות בטמפרטורת החדר (10,000 × גרם, 5 דקות). בזהירות לשפוך את הממס מתוך המיכל. חזור על שלבים 1.7-1.8.
- יבשו באוויר את השאריות במיכל הפתוח למשך 10 דקות. הוסף 50% (vol/vol) אצטוניטריל מימי, ומערבול עבור 1-2 s כדי להמיס את המוצרים (1 מ"ל / 100 מ"ג שרף).
- הסר את השרף על ידי סינון התערובת, ולאחר מכן לשטוף את השרף 2x באמצעות 0.2 מ"ל של 50% (vol/vol) אצטוניטריל מימי. ערבבו את התסנין לטיהור כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) בעלת ביצועים גבוהים. השתמש בתנאי HPLC הבאים. עמודה: YMC-Triat-C18 (קוטר פנימי 4.6 מ"מ, 150 מ"מ, 5 מ"מ); שיפוע ממס: ממס מים A-deionized; ממס B-acetonitrile (0.1% TFA); זמן זרימה: 20 דקות, עם אצטוניטריל מ 10% ל 90%; קצב זרימה: 1 מ"ל/דקה.
- יש להקפיא את אלונטי HPLC שנאספו למשך הלילה בטמפרטורה של -80°C ולבצע ליופיליזציה (-50°C ו-<1 pa). עבור תיוג רדיו, להמיס את הפפטיד המוצק במאגר נתרן אצטט (100 mM, pH 5.0) בריכוז סופי של 1 mg/mL כחיץ מלאי.
2. תיוג רדיו 68Ga
הערה 68Ga נוצרה בבית החולים הראשון נאנג'ינג (נאנג'ינג, סין) באמצעות גנרטור 68Ge/68Ga.
- פיפטה 5 μL של מאגר מלאי לתוך מיכל פוליפרופילן 1.5 מ"ל עם מכסה בורג. הוסף 200 MBq [68Ga]GaCl3 (400 μL) למכל.
- מערבבים את התערובת במשך 5 שניות. מדוד את ה- pH באמצעות רצועות בדיקת pH. כוונן את ה- pH ל- 4-4.5 עם NaOH (0.1 M).
הערה: pH מתאים הוא קריטי עבור מורכבות בין 68Ga ו- DOTA. - לדגור על התמיסה בטמפרטורת החדר במשך 5-10 דקות. נושא את תערובת התגובה לרדיו-HPLC לצורך ניתוח תפוקת תיוג רדיו בתנאים הבאים: עמודה: YMC-Triat-C18 (4.6 מ"מ תעודת זהות, 150 מ"מ, 5 מ"מ); שיפוע ממס: ממס מים A-deionized; ממס B-acetonitrile (0.1% TFA); זמן זרימה: 20 דקות, עם אצטוניטריל מ 10% ל 90%; קצב זרימה: 1 מ"ל/דקה.
הערה: כרומטוגרפיית רדיו בשכבה דקה (TLC) יכולה לשמש כגישה חלופית לבחינת תפוקת תיוג רדיו. חיץ האלוציה המוצע של TLC הוא 0.1 M Na3C6H5O7, pH 4.
3. בדיקת יציבות Tracer
- בדיקת יציבות Tracer ב- PBS
- הוסף [68Ga]DPA (10 μL, 3.7 MBq, ב- NaOAc) ל- PBS (990 μL). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 1, 2 ו-4 שעות עם תסיסה קלה.
- אסוף 200 μL של התמיסה בכל נקודת זמן. הזריקו אותו לרדיו-HPLC לצורך ניתוח.
- יציבות Tracer בסרום עכבר
- הוסף [68Ga]DPA (10 μL, ~ 3.7 MBq, ב-NaOAc) לסרום העכבר (90 μL, מוכן טרי). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 1, 2 ו-4 שעות עם תסיסה קלה.
- לאסוף 20 μL של הפתרון בכל נקודת זמן. מוסיפים MeCN ומים (100 μL, 1:1, v/v).
- צנטריפוגה את התערובת במשך 10 דקות (5,000 × גרם, 25 ° C). נתח את supernatant באמצעות רדיו-HPLC.
4. ניתוח ביטוי PD-L1 על ידי ציטומטריית זרימה
- הכינו מדיום תרבית על ידי תוספת RPMI-1640 בינוני עם 10% (vol/vol) נסיוב בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (vol/vol). השהה מחדש את תאי U87MG בתווך תרבית, וזרע בצלחות 12 בארות בצפיפות של 105 תאים / באר. מניחים את התאים באינקובטור (5% CO2, 37 מעלות צלזיוס), ותרבית לפחות 24 שעות מבלי להפריע.
- לשטוף את התאים עם 0.5 מ"ל של PBS ולהוסיף 250 μL של טריפסין-EDTA (0.25%). מחזירים את התאים לאינקובטור (5% CO2, 37°C) למשך 2 דקות.
- הוסף 1 מ"ל של מדיום תרבית כדי לעצור את הדיסוציאציה של התא. הוסיפו מדיום לתאים כדי לנתק אותם מהכלים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ואספו אותם בצינורות של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה את התאים במשך 5 דקות (100 × גרם).
- הסר את supernatant ו resuspend את התאים ב 1 מ"ל של PBS. צנטריפוגה את התאים במשך 5 דקות (100 × גרם). חזור על שלב זה פעם נוספת.
- לדלל את נוגדן PD-L1 מצומד פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) עם 3% אלבומין בסרום בקר (BSA) ל-20nmol/L. הוסף לתאים ודגור ב-4°C למשך שעה אחת.
- צנטריפוגה את התאים במשך 5 דקות (100 × גרם), ולאחר מכן שטיפה עם PBS קר פעמיים. נתח את התאים החיוביים PD-L1 באמצעות ציטומטר זרימה ותוכנת ניתוח.
5. אימונוציטוכימיה
- זרעו את תאי U87MG בצלחות תרבית תחתית זכוכית (35 מ"מ) בצפיפות של 2.5 × 105 תאים לכל באר. כאשר מגיעים למפגש של 60%, שואפים למדיום התרבות ומוסיפים 1 מ"ל של PBS. נערו בעדינות מספר פעמים ושאפו. בצעו את שלב הכביסה 3x.
- מוסיפים 500 μL של 4% paraformaldehyde למנות. מניחים את התאים בטמפרטורת החדר ומקבעים למשך 30 דקות.
- שטפו את התאים 3x עם PBS. הוסף 1 מ"ל של 3% BSA (wt/vol, ב-PBS) וחסום את התאים הקבועים למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
- הסר את 3% BSA ודגור ישירות על התאים עם נוגדן אנטי PD-L1 ראשוני (mAb,1:100, מדולל ב -3% BSA) למשך הלילה ב 4 ° C.
הערה: לאחר חסימת התאים עם BSA, אין לשטוף עם PBS. - שטפו את התאים פי 3 עם מאגר BSA של 3%. לדגור על התאים עם נוגדן משני IgG Fc אנטי-אנושי מצומד FITC (1:500, מדולל ב-PBS) למשך שעה אחת.
- שטפו את התאים 3x עם PBS. הוסף 0.5 מ"ל DAPI (1 מיקרוגרם/מ"ל) לתאים ודגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. שטפו את התאים המוכתמים 3x עם PBS, והתבוננו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי.
6. ניסוי קליטה ועיכוב של תאים
- ניסוי קליטה תאית
- תרבית את תאי U87MG בצלחות של 12 בארות עד שמגיעים למפגש של 80%. הסר את המדיום ולשטוף את התאים עם 0.5 מ"ל של PBS.
- יש לדלל את התר"מ [68Ga] בתווך טרי לריכוז של 74 KBq/mL. הוסף 0.5 מ"ל של חיץ DPA מדולל [68Ga] לכל באר.
- דגור על התאים עם [68Ga]DPA ב-37°C לפרקי זמן שונים (10, 30, 40 ו-120 דקות). שאפו את המדיום באמצעות פיפטה. לשטוף את התאים עם PBS (0.5 מ"ל) שלוש פעמים.
- הוסף תמיסת NaOH (0.5 M, 300 μL לכל באר) כדי ליזה את התאים. לאחר 30 שניות, לאסוף את התא צמיג lysates בצינורות 1.5 מ"ל.
- לשטוף את הצלחת עם 0.4 מ"ל של PBS פעמיים. אסוף את תמיסת הכביסה בצינור 1.5 מ"ל לעיל.
- הפעל את המחשב המובנה של מונה הגמא האוטומטי; הכניסו את הצינורות למדף המובנה. לאחר טעינת כל הדגימות על המסוע, לחץ על כפתור START. התוצאות מחושבות בתוכנה הפנימית. הקריאה מתעדת את הספירה לדקה (CPM) המתואמת לדעיכה של כל צינור.
- מבחן מחייב תחרותי
- תרבית את תאי U87MG בצלחות של 12 בארות עד שמגיעים למפגש של 80%. הסר את המדיום ולשטוף את התאים עם 0.5 מ"ל של PBS.
- לדלל [68Ga]DPA במדיום טרי לריכוז של 74 KBq/mL. יש להמיס כמות מתאימה של תרכובות BMS202 ב-10% DMSO כדי להפיק ריכוז של 10 מילימטר (400 מיקרוליטר).
- לדלל 4 μL של 10 mM BMS202 ב 396 μL של PBS כדי לקבל ריכוז של 100 μM. חזור על שלב זה כדי להניב ריכוזים שונים של BMS202 (1 μM, 10 nM, 100 pM, ו 1 pM).
- הוסף 0.5 מ"ל של חיץ DPA מדולל [68Ga] לכל באר (0.37 MBq לכל באר). הוסף 5 μL של תמיסות BMS202 לכל באר (שלוש בארות לכל ריכוז). לדגור את התאים באינקובטור תאים ב 37 ° C במשך 120 דקות.
- שאפו את המדיום באמצעות פיפטה. לשטוף את התאים עם 3 x 0.5 מ"ל של PBS.
- הוסף את תמיסת NaOH (0.5 M, 300 μL לכל באר) כדי lyse את התאים. לאחר 30 שניות, לאסוף את התא צמיג lysates לתוך צינורות 1.5 מ"ל. לשטוף את הצלחת עם 2 x 0.4 מ"ל של PBS.
- אסוף את תמיסת הכביסה בצינור 1.5 מ"ל לעיל. הכנס את הצינורות למדף המובנה של מונה הגמא האוטומטי.
- בצע את אותם הליכים כמו שלב 6.1.6.
7. הדמיית PET
הערה: בצע הדמיית PET של בעלי חיים קטנים, באמצעות סורק micro PET המספק 159 חתכים ציריים רוחביים במרווחים של 0.796 מ"מ זה מזה (ממרכז למרכז), עם שדה ראייה אופקי של 10 ס"מ ושדה ראייה צירי של 12.7 ס"מ. כל הנתונים שנאספו במצב הרשימה מאורגנים בסינוגרמות תלת מימדיות. לאחר מכן פורייה מורכב מחדש לסינוגרמות דו-ממדיות (מסגרת × דקות: 4 × 1, 8 × 2, 8 × 5).
- השתמשו בעכברי BALB/C עירומים זכרים בני 5-8 שבועות במחקר זה. אספו את תאי U87MG בעקבות שלבים 4.1-4.4 ושאפו את התאים לתוך מזרק 0.5 מ"ל. תת עורית להזריק את התאים לתוך העכברים (1 × 106 תאים לכל גידול, שני גידולים לכל עכבר). מעקב אחר צמיחת הגידול לאחר ההזרקה עד שנפח הגידול הוא 100-300 מ"מ3.
- מרדימים את העכברים באמצעות איזופלורן 1%-2% (v/v) (1 מ"ל/דקה). הפעל את מכשיר החימום ושמור על מיטת החיות של PET ב 37 ° C.
- הניחו את העכברים המורדמים במיקום הנכון על מיטת בעלי החיים של מכונת ה-PET. יש למרוח משחה אופתלמית על שתי העיניים למניעת יובש.
אזהרה: יש לשמור את העכברים במצב נוטה כדי למנוע מוות במהלך הסריקה. במהלך כל תהליך ההדמיה, יש להזרים איזופלורן (1.0 מ"ל/דקה) דרך האף באמצעות צינור מותקן מראש. - כוונן את מיקום מיטת החיות באמצעות לוח הבקרה. יש להזריק את הנותבים (10-17 MBq/100-200 μL) לווריד דרך צנתר וריד זנב מותקן מראש.
- יצירת זרימת עבודה של סריקה במחשב מארח באמצעות התוכנה שאליה מתבצעת הפניה (ראה רשימת חומרים) צור תיקיית לימוד והגדר את פרוטוקול הרכישה בהתאם לפרוטוקול היצרן. בצע סריקות דינמיות (60 דקות עבור כל עכבר) על כל העכברים במצב רשימה תלת-ממדית.
- הגדר פרוטוקול היסטוגרמה ופרוטוקול שחזור בהתאם לפרוטוקול היצרן. השתמשו בפילטר של Hanning עם חיתוך Nyquist של 0.5 מחזור/פיקסל כדי לשחזר תמונות דינמיות של PET (25-30 דקות ו-55-60 דקות) באמצעות הקרנה אחורית מסוננת. צרו תמונות הקרנה בעוצמה מרבית (MIP) לכל העכברים.
- שלב את הפרוטוקולים בזרימת עבודה והפעל את זרימת העבודה. נתח את התמונות התלת מימדיות המתקבלות באמצעות התוכנה, בהתאם לפרוטוקול היצרן.
הערה: השתמש בתוכנת הסימולציה כדי לבחור את אמצעי האחסון של תחומי עניין. הרדיואקטיביות מתוקנת לזמן ההזרקה ומוצגת כאחוז מסך מינון ההזרקה/לגרם רקמה (% ID/g).
8. הפצה ביולוגית Ex vivo
- יש לתת [68Ga]DPA (1.85 MBq/100 μL) לעכברים העירומים נושאי U87MG BALB/C באמצעות הזרקת ורידי זנב. הרדימו את העכברים באמצעות איזופלורן של 1%-2% (v/v) (1 מ"ל/דקה), ולאחר מכן הקריבו שלושה עכברים באמצעות נקע צוואר הרחם לאחר ההזרקה למשך 5, 30, 60 ו-120 דקות.
הערה: יש להכשיר את האנשים המדגימים הליך זה במיומנויות הטכניות של פריקת צוואר הרחם כדי להבטיח את אובדן ההכרה המושרה במהירות. זה יבטיח כי הליכי המתת החסד בניסוי זה מבוצעים כולם באופן הומני. - לאחר המוות הוא אישר, לפתוח את קיר החזה של העכברים. לאחר מכן, פתחו את הלב. השתמש מזרק 1 מ"ל כדי לצייר דם; לסחוט את הדם מן המזרק לתוך צינור radioimmunoassay (RIA) (13 מ"מ קוטר) עבור מונה גמא.
- הבלו על האיברים העיקריים והגידולים ומניחים אותם בצינורות RIA (בקוטר 13 מ"מ) עבור מונה הגמא. האיברים העיקריים כוללים את סך הדם, הלב, בלוטת התימוס, הכבד, הטחול, העצם, הקיבה, הכליות, השרירים, בלוטת הלימפה של המעי, המעי הדק, הלבלב, האשכים, המוח והריאות. לשקול את כל האיברים.
- למדוד את הרדיואקטיביות בתוך האיברים שנאספו באמצעות מונה אוטוגמה ולתקן את הערכים. חשב את אחוז המינון המוזרק לגרם של רקמה רטובה (% ID/g).
9. אימונוהיסטוכימיה
- לאסוף את רקמות glioma ולשטוף אותם 3x עם PBS. שים את הרקמות הטריות 4% paraformaldehyde ולתקן לילה ב 4 ° C.
- הטמיעו את הרקמות הקבועות בפרפין וחתכו אותן לעובי של 10 מיקרומטר. מניחים את המקטעים באינקובטור (60 מעלות צלזיוס) ודגרים במשך שעתיים. יש ללחלח את החלקים על ידי דגירה במשך 10 דקות כל אחד בחלקים הבאים: קסילן (פעמיים), אלכוהול מוחלט, 95% אלכוהול, 90% אלכוהול, 80% אלכוהול, 75% אלכוהול.
- שים את החלקים 0.01 מ 'ציטראט נתרן ומחממים אותם ל 92-95 מעלות צלזיוס. שמור על הטמפרטורה במשך 40 דקות כדי להשיג אחזור אנטיגן.
- הוסף 200 μL של תמיסת H2O2 (3%) למקטעים והשבת את האנדופרוקסידאזות למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. חסום את האתרים הלא ספציפיים על ידי טיפול עם 3% BSA למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
- יש לדגור על החלקים בנוגדן הראשוני נגד PD-L1 (mAb, 1:100, מדולל ב-3% BSA) למשך הלילה ב-4°C.
הערה: לאחר חסימה עם BSA, אין לשטוף עם PBS. - שטפו את המקטעים 3x עם PBS. יש לדגור על המקטעים עם נוגדן משני נגד ארנב עז (1:500, מדולל ב-PBS) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
- שטפו את התאים 3x עם PBS. הוסף 200 μL של 3,3-diaminobenzidine (DAB) פתרון עבודה (פתרון A: פתרון B: פתרון C = 1:1:18) לחלקים ודגור במשך 5 דקות בחושך.
- שטפו את המקטעים 3x עם PBS. מוסיפים 500 μL של תמיסת המטוקסילין (100%), ודגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את החלקים עם מים במשך 30 שניות. הכניסו את החלקים לתמיסת בידול (75% אלכוהול:HCL = 99:1) למשך 30 שניות. שטפו את החלקים במים במשך דקה.
- יש לייבש את הדגימות על ידי דגירה רציפה עם 75% אלכוהול, 80% אלכוהול, 90% אלכוהול, 95% אלכוהול, אלכוהול מוחלט וקסילן (פעמיים) (10 דקות כל אחת). הרכיבו את כל החלקים באמצעות שרף נייטרלי והתבוננו בהם תחת מיקרוסקופ אופטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
[68Ga]תיוג רדיו DPA ויציבות
פפטיד המודל, DPA, הוא אנטגוניסט PD-L1 יעיל. DOTA-DPA הושג בטוהר של >95% ותשואה של 68%. המסה של DOTA-DPA נצפית בניסוי ב-1,073.3 ([M+2H]2+). 68גליום נחשב רדיונוקליד מתאים לסימון פפטידים להדמיית PET, ולכן נבחר למחקר זה. לתווית רדיו DPA עם 68Ga (זמן מחצית חיים: 68 דקות), DOTA-PEG3-DPA סונתז (איור 1A). DOTA שימש ככלטור עבור תיוג הרדיו 68Ga. לחלל DOTA ו- DPA, PEG3 שימש כמקשר. [68Ga]-DOTA-PEG3-DPA (המכונה [68Ga]DPA בטקסט הבא) הראה תפוקה רדיוכימית גבוהה (>95%) וטוהר רדיוכימי (>95%) (טבלה 1). בדיקת יציבות נותב בוצעה גם באמצעות HPLC, והתוצאות הראו כי [68Ga]DPA היה יציבות רבה הן PBS והן בסרום עכבר. פירוק 68Ga או הידרוליזה פפטידית לא זוהה לאחר דגירה של 4 שעות ב-37°C (איור 1B).
ביטוי PD-L1 בתאי U87MG
מחקר קודם הראה כי ביטוי מוגבר של PD-L1 נמצא בקורלציה עם הישרדות נמוכה של חולים בגידולי גליובלסטומה, מה שמצביע על כך ש- PD-L1 עשוי להיות סמן ביולוגי פרוגנוסטי יוצא דופן ומטרה טיפולית בגליובלסטומה48. לכן, קו תאי גליובלסטומה אנושי, U87MG, שימש כדי לבסס מודל גידול כדי לקבוע את היעילות של [68Ga]DPA ב- PET/CT עבור הדמיית גידול PD-L1. תוצאות ציטומטריית הזרימה הצביעו על כך שכ-60% מתאי U87MG היו חיוביים ל-PD-L1 (איור 2A). יתר על כן, צביעה אימונופלואורסצנטית אישרה את הביטוי החזק של PD-L1 בתאי U87MG (איור 2B). יחד, נתונים אלה הוכיחו כי קו התאים U87MG מתאים למחקר זה.
ספיגה תאית וספציפיות של [68Ga]DPA
ספיגת [68Ga]DPA על ידי תאי U87MG הציגה דפוס תלוי זמן. כאשר מעכב PD-L1, BMS202, שימש כגורם חוסם, החלק הקושר והספיגה של [68Ga]DPA הופחתו באופן משמעותי (איור 3A). בדיקת קשירה תחרותית בחנה עוד יותר את זיקת הקישור (Ki) של BMS202 לתאי U87MG. הזיקה המחייבת המשוערת הייתה 43.8 ±-8.6nmol/L עבור BMS202 כאשר [68Ga]DPA שימש כמתחרה (איור 3B).
[68Ga]DPA PET הדמיית מודלים של גידולים
הדמיית PET של [68Ga]DPA בוצעה בעכברים עירומים מסוג U87MG BALB/C. [68גא] DPA ניתן באמצעות הזרקה תוך ורידית עד הגידול U87MG גדל ל 100 מ"מ3. תמונות PET של כל הגוף חשפו הצטברות DPA גבוהה [68Ga] בגידול לאחר 30 ו-60 דקות של הזרקה, והראו את ההצטברות הגבוהה ביותר בכליה ובשלפוחית השתן (איור 4A). כדי לוודא אם [68Ga]DPA הצטבר באופן ספציפי בגידולים חיוביים ל-PD-L1, מודל עכבר אחר הנושא את קו תאי PanNET Bon-1 שימש כבקרה שלילית. ניסוי מקביל הדגים הצטברות מועטה [68Ga]DPA בגידולי Bon-1 60 דקות לאחר ההזרקה (איור 4B).
כדי להבהיר הבדל זה, בוצע צביעה אימונוהיסטוכימית כדי לנתח ביטוי PD-L1 ברקמות הגידול. התוצאות הראו כי תאי U87MG הציגו ביטוי משמעותי של PD-L1 (איור 5A,C), אך לא את הגידול Bon-1 (איור 5B,C). נתונים אלה תאמו את תוצאות הבחינה הפסיכומטרית. לכן, ייתכן שסטטוסים שונים של צמיחת תאי גידול גרמו לביטוי שונה של PD-L1 (למשל, נמק רקמות). כדי לאמת זאת, בוצעה צביעת המטוקסילין ואוזין (H&E). כצפוי, נצפתה מורפולוגיית תאים דומה בין שתי רקמות הגידול (איור 5D).
הפצה ביולוגית Ex vivo של [68Ga]DPA בגידולי U87MG
מחקר ההפצה הביולוגית ex vivo נערך גם באמצעות עכברים נושאי U87MG (טבלה 2). התוצאות הראו פינוי מהיר בדם וברוב האיברים שנותחו, כולל הלב, הכבד, הריאות והשרירים. הכליה צברה את הכמות הגבוהה ביותר של רדיואקטיביות והראתה שיעור פינוי של 0.12% ID/(g∙min) בין 5 דקות ל-120 דקות. הגידול הציג ספיגה של ספיגת הנותב השנייה בגובהה בכל נקודות הזמן. בנוסף, בין 5 דקות ל-60 דקות לאחר ההזרקה, הגידול הציג שיעור פינוי נותב נמוך יותר של 0.027% ID/(g∙min). עבור דם, שיעור הסילוק היה 0.069% ID/(g∙min), ואילו עבור שרירים, שיעור הסילוק היה 0.037% ID/(g∙min).
איור 1: [68Ga]תיוג רדיו ויציבות של DPA. (A) המבנה הכימי של [68Ga]DPA והייצוג הסכמטי של הקישור שלו לתאי גידול PD-L1. (B) עקומות HPLC המראות את הרדיואקטיביות של [68Ga]DPA לאחר דגירה עם PBS או סרום עכבר במשך 0.5, 2 ו-4 שעות. נתון זה שונה מ Hu et al.47. קיצורים: DPA = אנטגוניסט דודקפפטיד; PD-L1 = ליגנד מוות מתוכנת 1; PBS = מלח חוצץ פוספט; HPLC = כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ביטוי PD-L1 בקו התאים U87MG. (A) הביטוי של PD-L1 בקו התאים U87MG נמדד באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה. (B) הביטוי של PD-L1 בתאי U87MG נמדד על ידי בדיקת צביעה אימונופלואורסצנטית. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. נתון זה שונה מ Hu et al.47. קיצורים: PD-L1 = ליגנד מוות מתוכנת 1; SSC = פיזור צד; FITC = איזותיוציאנט פלואורסצאין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: קליטה תאית ועיכוב של [68Ga]DPA. (A) ספיגה של תאי U87MG כאשר הם מודגרים עם [68Ga]DPA (0.74 MBq/mL) או [68Ga]DPA (0.74 MBq /mL) + BMS202 (100 μmol/L) לפרקי זמן שונים. (B) קשירה תחרותית של [68Ga]DPA (0.74 MBq /mL) לתאי U87MG לאחר הדגירה עם BMS202. ערך Ki מוצג בחלונית. נתון זה שונה מ Hu et al.47. קיצורים: DPA = אנטגוניסט דודקפפטיד; %AD = מינון מנוהל (ביחס לחלק המחייב). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הדמיית PET של [68Ga]DPA בגידולי U87MG בעלי ביטוי יתר של PD-L1. (A,B) תמונות PET-CT המראות את ההתפלגות של [68Ga]DPA בעכברים נושאי U87MG (A) ובעכברים נושאי Bon-1 (ביקורת שלילית, B) לאחר הזרקה תוך ורידית (~18.5 MBq) למשך 30 דקות ו-60 דקות. מוצגות הקרנה מייצגת בעוצמה מקסימלית (MIP) (פאנל עליון) ותמונות PET-CT רוחביות (פאנל תחתון). מיקומי הגידול מסומנים בעיגולים מקווקווים לבנים. נתון זה שונה מ Hu et al.47. קיצורים: DPA = אנטגוניסט דודקפפטיד; PD-L1 = ליגנד מוות מתוכנת 1; PET-CT = טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוזיטרונים; MIP = הקרנה בעוצמה מקסימלית; p.i. = לאחר הזרקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניתוח אימונוהיסטוכימי של גידולים שטופלו ב-DPA [68Ga]. (א,ב) תמונות אימונוהיסטוכימיות בחתך שלם של PD-L1 בגידולי (A) U87MG ו-(B) Bon-1. (ג) תמונות מוגדלות של האזורים המסומנים ב-A וב-B. (D) צביעת H&E של גידול U87MG ו-Bon-1. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר (C,D). נתון זה שונה מ Hu et al.47. קיצורים: DPA = אנטגוניסט דודקפפטיד; PD-L1 = ליגנד מוות מתוכנת 1; H&E = hematoxylin ו eosin. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| עוקבים | [68גא] תר"מ |
| תשואה רדיוכימית (%) | >95 |
| פעילות מולרית (GBq μmol-1) | 37 ± 8 |
| טוהר רדיוכימיא (%) | >95 |
טבלה 1: תיוג רדיו ובקרת איכות של [68Ga]DPA. תפוקה רדיוכימית, פעילות מולרית וטוהר רדיוכימי של [68Ga]DPA. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SD (n = 7). טבלה זו שונתה מ- Hu et al.47. קיצור: DPA = אנטגוניסט dodecapeptide. אטוהר רדיוכימי של [68Ga]DPA נותח על ידי HPLC בפאזה הפוכה במצב אופטימלי: 1) עמודה: YMC-Triat-C18 (4.6 מ"מ מזהה, 150 מ"מ, 5 מ"מ); 2) שיפוע ממס: מים ממסים A-deionized; ממס B-acetonitrile (0.1% חומצה trifluoroacetic); זמן זרימה: 20 דקות, עם אצטוניטריל מ 10% ל 90%; ספיקה של 1 מ"ל/דקה.
| [68גא] תר"מ | ||||||||
| 5 דקות | 30 דק' | 60 דק' | 120 דק' | |||||
| דם | 3.89 | ±0.43 | 1.55 | ±1.07 | 0.11 | ±0.02 | 0.05 | ±0.01 |
| לב | 1.19 | ±0.39 | 0.52 | ±0.33 | 0.06 | ±0.02 | 0.05 | ±0.02 |
| כבד | 1.06 | ±0.26 | 0.59 | ±0.43 | 0.19 | ±0.02 | 0.16 | ±0.04 |
| טחול | 0.98 | ±0.14 | 0.68 | ±0.67 | 0.14 | ±0.06 | 0.09 | ±0.03 |
| ריאה | 1.64 | ±0.42 | 1.03 | ±0.9 | 0.13 | ±0.05 | 0.09 | ±0.02 |
| כליה | 19.23 | ±1.95 | 16.13 | ±1.51 | 11.5 | ±0.44 | 5.2 | ±0.31 |
| קיבה | 1.54 | ±0.1 | 0.61 | ±0.35 | 0.08 | ±0.01 | 0.08 | ±0.03 |
| מעיים | 0.72 | ±0.27 | 0.47 | ±0.35 | 0.08 | ±0.02 | 0.06 | ±0.03 |
| לבלב | 1.88 | ±0.28 | 0.77 | ±0.75 | 0.16 | ±0.03 | 0.13 | ±0.03 |
| שריר | 2.21 | ±0.27 | 0.71 | ±0.37 | 0.18 | ±0.02 | 0.14 | ±0.04 |
| עצם | 2.18 | ±0.11 | 0.85 | ±0.51 | 0.26 | ±0.09 | 0.14 | ±0.06 |
| מוח | 0.19 | ±0.04 | 0.11 | ±0.08 | 0.03 | ±0.01 | 0.02 | ±0.01 |
| גידול | 4.5 | ±0.32 | 3.77 | ±0.27 | 2.99 | ±0.03 | 0.89 | ±0.19 |
| שומן | 2.09 | ±0.49 | 0.81 | ±0.12 | 0.27 | ±0.07 | 0.1 | ±0.07 |
טבלה 2: התפלגות ביולוגית של [68Ga]DPA בעכברים נושאי גידול U87MG לאחר מתן לפרקי זמן שונים (n = 3 לכל נקודת זמן). טבלה זו שונה מ Hu et al.47. קיצור: DPA = אנטגוניסט dodecapeptide.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלבים הקריטיים המתוארים בשיטה זו כוללים תיוג יעיל של 68Ga ל- DPA ובחירת חלון זמן מתאים להדמיית PET, אשר חייב להתאים באופן מושלם לדפוס הפרמקודינמי של DPA בגידול.
בניגוד ל-IHC, הדמיית PET מאפשרת זיהוי בזמן אמת של ביטוי PD-L1 בכל הגוף באופן לא פולשני, ומאפשרת הדמיה של כל אזור חיובי בגידול הטרוגני 6,7. פפטידים נבחרו כליגנדים כדי למנוע את החסרונות של נוגדנים ומולקולות קטנות. לנוגדנים בעלי משקל מולקולרי גדול יש בדרך כלל זמן מחצית חיים ארוך, מה שגורם לרעילות גבוהה יותר לאיברים בריאים. פינוי המולקולות הקטנות הוא בדרך כלל מהיר מכדי להשיג את שימור הגידול הנדרש. המשקל המולקולרי של הפפטידים נע בין זה של נוגדנים לבין מולקולות קטנות. זה מאפשר רדיוטרייסרים מבוססי פפטידים להשיג הן שימור גידול לטווח ארוך והן חדירה טובה לרקמות עם רעילות מינימלית 13,49,50,51,52,53. חשוב לציין, התועלת של DPA D-peptide, ולא L-peptides המדווח בדרך כלל, מעניקה ל- [68Ga]DPA מחצית חיים מטבולית ממושכת להפליא. יתר על כן, DPA הוא טעון חיובי הידרופילי in vivo, ולכן יש מסיסות גבוהה והוא יכול למנוע מיקוד לא ספציפי בדם, להקל על יצירת תמונות PET עם איכות הדמיה גבוהה.
יש לציין כי תיוג רדיו מוצלח של 68Ga דורש pH ספציפי וללא הפרעה מיוני מתכת מעבר, כגון קטיונים Cu (II) ו-Fe (III). במקרים מסוימים, זיהום Cu2+ מוביל לתשואה רדיוכימית נמוכה. לכן, חשוב לוודא שכל המיכלים וקצות הפיפטה אינם מזוהמים. בנוסף, בשיטה זו, U87MG שימש לחיסון הגידול. למרות שביטוי PD-L1 ב- U87MG xenografts אומת במחקרים קודמים, ביטויו משתנה בין בעלי חיים בודדים. לכן, הספיגה האבסולוטית של הנותב בגידולי U87MG השתנתה בין עכברים בודדים. כדי להבטיח ספיגה יעילה של נותב בגידולים, יש לבחור בעלי חיים בעלי גודל גידול מתאים (500 מ"מ3 < נפח < 100 מ"מ3) לסריקת PET.
אחת המגבלות של [68Ga]DPA היא שהזיקה הקשירה של DPA ל-PD-L1 נמוכה יחסית למספר פפטידים אחרים המכוונים ל-PD-L1, כגון WL12, מה שהופך אותו ללא מתאים לגידולים עם ביטוי PD-L1 נמוך יחסית26,47. שינוי נוסף של D-peptide ישפר את יכולת הקישור הספציפית שלה. בנוסף, כדי לשפר את אפקט ההדמיה של [68Ga]DPA, ניתן לייעל את גיבוש אסטרטגיית ההזרקה, לדוגמה, על ידי הזרקת DPA לא מסומן במקביל לפני [68Ga]DPA כדי לחסום את אתרי הקישור הלא ספציפיים 54,55,56.
לסיכום, מחקר זה פיתח שיטה לא פולשנית ובזמן אמת למעקב אחר התפלגות PD-L1 בכל הגוף של בעלי חיים באמצעות [68Ga]DPA כרדיוטרייסר (radiotracer). התוצאות חשפו זיקה קשירה ספציפית גבוהה יחסית, in vivo , יציבות חיובית ויכולת הדמיה מצוינת של [68Ga]DPA, דבר המצביע על כך ש- [68Ga]DPA-PET היא גישה מבטיחה להדמיית גידולים בעלי ביטוי יתר של PD-L1. יתר על כן, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם לטיפול בגידולים חיוביים PD-L1 בעת תיוג DPA עם רדיונוקלידים אחרים, כגון 177Lu ו- 225Ac. לכן, טכניקת התיוג הרדיואקטיבי של DPA לא רק מתגברת על המגבלה של אבחון תלוי IHC, אלא גם מספקת אפשרות חדשה לטיפול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא מוצהרים אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי קרן מכון המחקר המרכזי ללא כוונת רווח של האקדמיה הסינית למדעי הרפואה (מס' 2022-RC350-04) וקרן החדשנות CAMS למדעי הרפואה (מס' 2021-I2M-1-026, 2022-I2M-1-026-1, 02120101, 02130101 ו-2022-I2M-2-002).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) | Merck | 60239-18-1 | 68Ga chelation |
| 3,3-diaminobenzidine (DAB) Kit | Sigma-Aldrich | D7304-1SET | Immunohistochemistry |
| anti-PD-L1 monoclonal antibody | Wuhan Proteintech | 17952-1-ap | Immunohistochemistry: primary antibody |
| BMS202 | Selleck | 1675203-84-5 | Competitive binding assay: inhibitor |
| BSA | Merck | V900933 | Immunofluorescent : blocking |
| DAPI | Merck | D9542 | Immunofluorescent: staining of nucleus |
| Dichloromethane (DCM) | Merck | 34856 | Solvent |
| DIPEA | Merck | 3439 | Peptide coupling |
| EDC·HCl | Merck | E6383 | Activation of DOTA |
| FBS | Gibco | 10099 | Cell culture: supplement |
| FITC-conjugated anti-human IgG Fc Antibody | Biolegend | 409310 | Immunofluorescent: secondary antibody |
| FITC-conjugated anti PD-L1 antibody | Biolegend | 393606 | Flow cytometry: direct antibody |
| HCTU | Energy Chemical | E070004-25g | Peptide coupling |
| HRP labeled goat anti-rabbit antibody | Servicebio | GB23303 | Immunohistochemistry: secondary antibody |
| Hydroxysuccinimide (NHS) | Merck | 130672 | Activation of DOTA |
| MeCN | Merck | PHR1551 | Solvent |
| Morpholine | Merck | 8.06127 | Fmoc- deprotection |
| NMP | Merck | 8.06072 | Solevent |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Fixation of tissues |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture: buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 10378016 | Cell culture: supplement |
| RIA tube | PolyLab | P10301A | As tissue sample container |
| RPMI-1640 medium | Gibco | 11875093 | Cell culture: basic medium |
| Sodium acetate | Merck | 1.06264 | Salt for buffer |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell culture: dissociation agent |
| U87MG cell line | Procell Life Science & Technology Co | CL-0238 | Cell model |
| Equipment | |||
| 68Ge/68Ga generator | Isotope Technologies Munich, ITM | Not applicable | Generation of [68Ga] |
| Autogamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | Detection of radioactivity |
| Confocal fluorescent microscopy | Keyence | Observation of immunofluorescent results | |
| Flow cytometer | Becton Dickinson, BD | LSRII | Monitoring the PD-L1 positive cells |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | SHIMAZU | LC-20AT | Purification of DPA peptide |
| PET scanner | Siemens Medical Solutions | Inveon MultiModality System | PET imaging |
| Optical microscopy | Nikon | Eclipse E100 | Observation of immunohistochemistry results |
| Solid phase peptide synthesizer | Promega Vac-Man Laboratory Vacuum Manifold | LOT#11101 | Synthesis of DPA-DOTA peptide |
| Software | |||
| ASIPro | Siemens Medical Solutions | Not applicable | Analysis of PET-CT results |
| FlowJo | Becton Dickinson, BD | FlowJo 7.6.1 | Analysis of the flow cytometer results |
| Inveon Acquisition Workplace (IAW) | Siemens Medical Solutions | Not applicable | Management of PET mechine |
| Prism | Graphpad | Prism 8.0 | Analysis of the data |
References
- Doroshow, D. B., et al. PD-L1 as a biomarker of response to immune-checkpoint inhibitors. Natire Reviews Clinical Oncology. 18 (6), 345-362 (2021).
- Krutzek, F., Kopka, K., Stadlbauer, S. Development of radiotracers for imaging of the PD-1/PD-L1 axis. Pharmaceuticals. 15 (6), 747 (2022).
- Topalian, S. L., Drake, C. G., Pardoll, D. M. Immune checkpoint blockade: a common denominator approach to cancer therapy. Cancer Cell. 27 (4), 450-461 (2015).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Xiao, Z., et al. PEIGel: A biocompatible and injectable scaffold with innate immune adjuvanticity for synergized local immunotherapy. Materials Today Bio. 15, 100297 (2022).
- Teng, M. W. L., Ngiow, S. F., Ribas, A., Smyth, M. J. Classifying cancers based on T-cell infiltration and PD-L1. Cancer Research. 75 (11), 2139-2145 (2015).
- Dolled-Filhart, M., et al. Development of a companion diagnostic for pembrolizumab in non-small cell lung cancer using immunohistochemistry for programmed death ligand-1. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 140 (11), 1243-1249 (2016).
- Meng, X. J., Huang, Z. Q., Teng, F. F., Xing, L. G., Yu, J. M. Predictive biomarkers in PD-1/PD-L1 checkpoint blockade immunotherapy. Cancer Treatment Reviews. 41 (10), 868-876 (2015).
- Hakozaki, T., Hosomi, Y., Kitadai, R., Kitagawa, S., Okuma, Y. Efficacy of immune checkpoint inhibitor monotherapy for patients with massive non-small-cell lung cancer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 146 (11), 2957-2966 (2020).
- Haslam, A., Prasad, V. Estimation of the percentage of US patients with cancer who are eligible for and respond to checkpoint inhibitor immunotherapy drugs. Jama Network Open. 2 (5), 192535 (2019).
- Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S.
- Zhang, L., et al. Recent developments on PET radiotracers for TSPO and their applications in neuroimaging. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (2), 373-393 (2021).
- Sun, J., et al. Imaging-guided targeted radionuclide tumor therapy: From concept to clinical translation. Advanced Drug Delivery Reviews. 190, 114538 (2022).
- Xu, M., et al. Preclinical study of a fully human Anti-PD-L1 antibody as a theranostic agent for cancer immunotherapy. Molecular Pharmaceutics. 15 (10), 4426-4433 (2018).
- Niemeijer, A. N., et al. Whole body PD-1 and PD-L1 positron emission tomography in patients with non-small-cell lung cancer. Nature Communications. 9 (1), 4664 (2018).
- Mayer, A. T., et al. Practical immuno-PET radiotracer design considerations for human immune checkpoint imaging. Journal of Nuclear Medicine. 58 (4), 538-546 (2017).
- Lv, G., et al. PET Imaging of tumor PD-L1 expression with a highly specific nonblocking single-domain antibody. Journal of Nuclear Medicine. 61 (1), 117-122 (2020).
- Li, D., et al. Immuno-PET imaging of 89Zr labeled anti-PD-L1 domain antibody. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1674-1681 (2018).
- Lesniak, W. G., et al. PD-L1 detection in tumors using [(64)Cu]Atezolizumab with PET. Bioconjugate Chemistry. 27 (64), 2103-2110 (2016).
- Kristensen, L. K., et al. CD4(+) and CD8a(+) PET imaging predicts response to novel PD-1 checkpoint inhibitor: studies of Sym021 in syngeneic mouse cancer models. Theranostics. 9 (26), 8221-8238 (2019).
- Christensen, C., Kristensen, L. K., Alfsen, M. Z., Nielsen, C. H., Kjaer, A. Quantitative PET imaging of PD-L1 expression in xenograft and syngeneic tumour models using a site-specifically labelled PD-L1 antibody. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 47 (5), 1302-1313 (2020).
- Bensch, F., et al. 89Zr-atezolizumab imaging as a non-invasive approach to assess clinical response to PD-L1 blockade in cancer. Nature Medicine. 24 (12), 1852-1858 (2018).
- Gonzalez Trotter, D. E., et al. In vivo imaging of the programmed death ligand 1 by 18F PET. Journal of Nuclear Medicine. 58 (11), 1852-1857 (2017).
- Lv, G., et al. Promising potential of a 18F-labelled small-molecular radiotracer to evaluate PD-L1 expression in tumors by PET imaging. Bioorganic Chemistry. 115, 105294 (2021).
- Miao, Y., et al. One-step radiosynthesis and initial evaluation of a small molecule PET tracer for PD-L1 imaging. Bioorganic & Medicinal Chemical Letters. 30 (24), 127572 (2020).
- Kumar, D., et al. Peptide-based PET quantifies target engagement of PD-L1 therapeutics. The Journal of Clinical Investigation. 129 (2), 616-630 (2019).
- Powles, T., et al. MPDL3280A (anti-PD-L1) treatment leads to clinical activity in metastatic bladder cancer. Nature. 515 (7528), 558-562 (2014).
- Herbst, R. S., et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature. 515 (7528), 563-567 (2014).
- Marciscano, A. E., Gulley, J. L. Avelumab demonstrates promise in advanced NSCLC. Oncotarget. 8 (61), 102767-102768 (2017).
- Vaddepally, R. K., Kharel, P., Pandey, R., Garje, R., Chandra, A. B. Review of indications of FDA-approved immune checkpoint inhibitors per NCCN guidelines with the level of evidence. Cancers. 12 (3), 738 (2020).
- Antonia, S. J., et al. Durvalumab after chemoradiotherapy in stage III non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 377 (20), 1919-1929 (2017).
- Wang, D. Y., et al. Fatal toxic effects associated with immune checkpoint inhibitors: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 4 (12), 1721-1728 (2018).
- Sgouros, G., Bodei, L., McDevitt, M. R., Nedrow, J. R. Radiopharmaceutical therapy in cancer: clinical advances and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (9), 589-608 (2020).
- (US) M. M. M, et al. Macrocyclic inhibitors of the pd-1/pd-l1 and cd80(b7-1)/pd-l1 protein/protein interactions. United States patent. , US-2017260237-A1 (2014).
- Chatterjee, S., et al. Rapid PD-L1 detection in tumors with PET using a highly specific peptide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 258-263 (2017).
- De Silva, R. A., et al. Peptide-based 68Ga-PET radiotracer for imaging PD-L1 expression in cancer. Molecular Pharmaceutics. 15 (9), 3946-3952 (2018).
- Lesniak, W. G., et al. Development of [18F]FPy-WL12 as a PD-L1 specific PET imaging peptide. Molecular Imaging. 18, 1536012119852189 (2019).
- Zhou, X., et al. First-in-humans evaluation of a PD-L1-binding peptide PET radiotracer in non-small cell lung cancer patients. Journal of Nuclear Medicine. 63 (4), 536-542 (2022).
- Hu, K., et al. Developing native peptide-based radiotracers for PD-L1 PET imaging and improving imaging contrast by pegylation. Chemical Communications. 55 (29), 4162-4165 (2019).
- Liu, H., et al. A novel small cyclic peptide-based 68Ga-Radiotracer for positron emission tomography imaging of PD-L1 expression in tumors. Molecular Pharmaceutics. 19 (1), 138-147 (2022).
- Rabideau, A. E., Pentelute, B. L. A D-amino acid at the N-terminus of a protein abrogates its degradation by the N-end rule pathway. ACS Central Science. 1 (8), 423-430 (2015).
- Uppalapati, M., et al. A potent D-protein antagonist of VEGF-A is nonimmunogenic, metabolically stable, and longer-circulating in vivo. ACS Chemical Biology. 11 (4), 1058-1065 (2016).
- Garton, M., et al. Method to generate highly stable D-amino acid analogs of bioactive helical peptides using a mirror image of the entire PDB. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1505-1510 (2018).
- Jia, F. J., et al. D-amino acid substitution enhances the stability of antimicrobial peptide polybia-CP. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (10), 916-925 (2017).
- Carmona, G., Rodriguez, A., Juarez, D., Corzo, G., Villegas, E. Improved protease stability of the antimicrobial peptide Pin2 substituted with D-amino acids. Protein Journal. 32 (6), 456-466 (2013).
- Feng, Z., Xu, B. Inspiration from the mirror: D-amino acid containing peptides in biomedical approaches. Biomolecular Concepts. 7 (3), 179-187 (2016).
- Hu, K., et al. Whole-body PET tracking of a d-dodecapeptide and its radiotheranostic potential for PD-L1 overexpressing tumors. Acta Pharmaceutica Sinica. B. 12 (3), 1363-1376 (2022).
- Qiu, X. Y., et al. PD-L1 confers glioblastoma multiforme malignancy via Ras binding and Ras/Erk/EMT activation. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864, 1754-1769 (2018).
- Hu, K., et al. Development of a stable peptide-based PET tracer for detecting CD133-expressing cancer cells. ACS Omega. 7 (1), 334-341 (2021).
- Jin, Z. -H., et al. Radiotheranostic agent 64Cu-cyclam-RAFT-c(-RGDfK-)4 for management of peritoneal metastasis in ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 26 (23), 6230-6241 (2020).
- Hu, K., et al. Harnessing the PD-L1 interface peptide for positron emission tomography imaging of the PD-1 immune checkpoint. RSC Chemical Biology. 1 (4), 214-224 (2020).
- Hu, K., et al. PET imaging of VEGFR with a novel 64Cu-labeled peptide. ACS Omega. 5 (15), 8508-8514 (2020).
- Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
- Zhao, J., et al. Concurrent injection of unlabeled antibodies allows positron emission tomography imaging of programmed cell death ligand 1 expression in an orthotopic pancreatic tumor model. ACS Omega. 5 (15), 8474-8482 (2020).
- Moroz, A., et al. A preclinical assessment of 89Zr-atezolizumab identifies a requirement for carrier added formulations not observed with 89Zr-C4. Bioconjugate Chemistry. 29 (10), 3476-3482 (2018).
- Nedrow, J. R., et al. Imaging of programmed cell death ligand 1: impact of protein concentration on distribution of anti-PD-L1 SPECT agents in an immunocompetent murine model of melanoma. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1560-1566 (2017).
