Summary
Her beskriver vi en protokol til ekstraktion af endogent tubulin fra pattedyrceller, som kan mangle eller indeholde specifikke mikrotubulusmodificerende enzymer, for at opnå mikrotubuli beriget til en specifik modifikation. Vi beskriver derefter, hvordan de ekstraherede mikrotubuli kan dekoreres med oprensede mikrotubulusbindende proteiner for at forberede gitter til kryo-elektronmikroskopi.
Abstract
Mikrotubuli er en vigtig del af cytoskelettet og er involveret i intracellulær organisation, celledeling og migration. Afhængigt af de posttranslationelle modifikationer kan mikrotubuli danne komplekser med forskellige interaktive proteiner. Disse mikrotubulus-proteinkomplekser er ofte impliceret i menneskelige sygdomme. Forståelse af strukturen af sådanne komplekser er nyttig til belysning af deres virkningsmekanismer og kan studeres ved kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM). For at opnå sådanne komplekser til strukturelle undersøgelser er det vigtigt at ekstrahere mikrotubuli, der indeholder eller mangler specifikke posttranslationelle modifikationer. Her beskriver vi en forenklet protokol til ekstraktion af endogent tubulin fra genetisk modificerede pattedyrceller, der involverer mikrotubuluspolymerisering efterfulgt af sedimentering ved hjælp af ultracentrifugering. Det ekstraherede tubulin kan derefter bruges til at fremstille kryo-elektronmikroskopgitter med mikrotubuli, der er bundet til et renset mikrotubulibindende protein af interesse. Som et eksempel demonstrerer vi ekstraktion af fuldt tyrosinerede mikrotubuli fra cellelinjer, der er konstrueret til at mangle de tre kendte tubulin-detyrosinerende enzymer. Disse mikrotubuli bruges derefter til at fremstille et proteinkompleks med enzymatisk inaktiv mikrotubulusassocieret tubulindelyserosinase på kryo-EM-gitter.
Introduction
Mikrotubuli er en afgørende del af cytoskelettet; De er involveret i forskellige funktioner såsom cellemigration og deling, men bidrager også til intracellulær organisation. For at tilpasse sig forskellige funktionelle fedtstoffer interagerer mikrotubuli med en række mikrotubulusassocierede proteiner (MAP'er), enzymer og andre proteiner, som vi samlet vil henvise til som "mikrotubulus-interagerende proteiner." Mikrotubulusbindingen af disse proteiner kan styres af forskellige tubulinmodifikationer, almindeligvis benævnt "tubulinkoden"1. Eksempler på denne præference er den mitotiske centromerassocierede kinesin (MCAK)2 og dynein-dynactin CAP-Gly-domænet af p1503, som fortrinsvis associeres med tyrosineret tubulin, mens kinesinmotorerne centromerassocieret protein E (CENP-E)4 og kinesin-25 foretrækker tubulin, der mangler den C-terminale tyrosin.
Mens en række forskellige metoder kan anvendes til at studere mikrotubuli-proteininteraktioner, bruges kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) ofte til at studere disse interaktioner ved næratomopløsning 6,7. I de senere år har kryo-EM-strukturer afsløret, hvor store motoriske proteiner som dynein 8,9,10 og kinesin 11, +TIP-proteiner som EB312,13 og MCAK 14, andre proteiner som Tau15,16 og endda små molekyler som paclitaxel, pelorusid og zampanolid 17 interagere med mikrotubuli. For at studere mikrotubuli-proteininteraktioner ekstraheres mikrotubuli typisk fra svinehjernen18. Efter dette udføres de fleste in vitro-undersøgelser, herunder cryo-EM-mikrotubulusstrukturer, ved hjælp af tubulin fra svinehjerne. Resultaterne af disse undersøgelser tilslører derfor betydningen af den heterogene karakter af tubulinmodifikationer19 mellem væv og celletyper. Dette skaber et særligt problem, når man undersøger et protein, der kræver eller foretrækker en specifik modifikation for at binde til mikrotubuli. Dette kan illustreres med tyrosineret tubulin, substratet for mikrotubulus detyrosinase MATCAP.
Detyrosination er en tubulinmodifikation, hvor den C-terminale aminosyretyrosin af α-tubulin mangler, hvilket er forbundet med mitotisk, hjerte- og neuronal funktion20. Mens fuldt tyrosinerede mikrotubuli er det ideelle substrat for MATCAP, er dette stort set fraværende i kommercielt tilgængelige mikrotubuli fra svinehjernen på grund af funktionen af vasohibins 21,22 og MATCAP 23 detyrosinaser i dette væv 22,23,24,25,26. Selvom kommercielt tilgængelig HeLa-tubulin for det meste indeholder tyrosinerede mikrotubuli, kan detyrosination forekomme, og denne kilde til tubulin er derfor mindre egnet til at skabe en ensartet prøve til kryo-EM-analyse.
For at stimulere bindingen af MATCAP til mikrotubuli og skabe en homogen prøve til strukturel analyse søgte vi en kilde til mikrotubuli, der er fuldt tyrosineret. Til dette formål blev der skabt en MATCAP og vasohibin-mangelfuld cellelinje, som blev brugt til at ekstrahere fuldt tyrosinerede mikrotubuli. Ekstraktionsproceduren var baseret på veletablerede protokoller, der bruger gentagne cyklusser af polymerisering og depolymerisering af mikrotubuli til at ekstrahere tubulin fra hjernevæv eller celler 18,27,28,29,30, med kun et enkelt polymerisationstrin og centrifugering over en glycerolpude. Ved hjælp af MATCAP som eksempel demonstrerer vi derefter, hvordan disse mikrotubuli kan bruges til kryo-EM-undersøgelser. For at forberede kryo-EM-gitter beskrives en totrins applikationsprotokol ved en lav saltkoncentration. Metoderne i dette papir beskriver ekstraktionen af tilpasselige mikrotubuli i tilstrækkelige mængder og renhed til at udføre kryo-EM-analyse og giver en detaljeret protokol for, hvordan man bruger disse mikrotubuli til at skabe protein-mikrotubuluskomplekser på kryo-EM-gitter.
Protocol
BEMÆRK: Se materialefortegnelsen for detaljer vedrørende alle materialer og udstyr, der anvendes i denne protokol.
1. Cellekultur
BEMÆRK: Al cellekultur skal udføres i en steril laminar strømningshætte.
- For at følge denne protokol skal du først optø et hætteglas med frosne celler i et 37 °C vandbad. Her bruger vi en genetisk modificeret HCT116-cellelinje, der mangler de tre kendte detyrosinerende enzymer, VASH1, VASH2 og MATCAP, til at skabe tyrosineret tubulin.
- Der fremstilles en Ø 10 cm plade indeholdende 10 ml af det passende cellekulturmedium.
BEMÆRK: I denne protokol blev DMEM (Dulbeccos modificerede Eagle-medium) suppleret med 10% v/v FCS (føtalt kalveserum) og penicillin/streptomycin-antibiotikum (dyrkningsmedium) anvendt til den genetisk modificerede HCT116-cellelinje. - Tæl cellerne, og frø ~ 2,5 × 106 levedygtige celler (~ 20% sammenløb) i den forberedte 10 cm plade. Ryst pladen forsigtigt for at fordele cellerne jævnt. Inkuber skålen i en 37 °C cellekulturkuvøse gasset med 5% (v/v) CO2 , indtil cellerne når 80% -90% sammenløb.
BEMÆRK: Dette tager typisk 3 dage for HCT116-celler, men tiden kan afhænge af den specifikke såtæthed og anvendte cellelinje. - Kassér cellekulturmediet med en pipette eller vakuumaspirator og vask skålen 2 x 5 ml PBS.
BEMÆRK: Pas på ikke at dispensere PBS for kraftigt på cellemonolaget, da dette kan løsne cellerne fra pladen. - Tilsæt 1-2 ml trypsin, og inkuber cellerne i inkubatoren i 2-5 minutter for at løsne cellerne.
- Tilsæt 2 ml af kulturmediet til pladen for at slukke trypsinet.
- Opdel cellesuspensionen i tre til fem lige store dele og så dem igen for at udvide cellerne i dyrkningsmedium, indtil der opnås 6-12 sammenflydende 15 cm plader.
2. Høst
- Cellerne vaskes forsigtigt med 10 ml PBS (1x) for at fjerne cellekulturmediet.
- Afmonter cellerne fra pladerne ved at inkubere cellerne i 5 min ved stuetemperatur med 3 ml iskold PBS suppleret med 5 mM EDTA (steril/filtreret) og derefter bruge en celleskraber.
- Saml cellerne i et 50 ml rør på is, og drej ned (10 min, 250 × g).
- Bemærk volumenet af de høstede celler med den volumetriske skala på 50 ml røret.
BEMÆRK: Den forventede lydstyrke kan være hvor som helst mellem ~ 0,5 ml og 4 ml. PAUSE TRIN: Flash-frys cellepillen i LN2, og opbevar ved -20 °C indtil brug. Bemærk, at cellepillen kun kan opbevares i et par uger eller måneder. Hvis pelleten opbevares længere, kan det resultere i et nedsat udbytte eller slet ingen mikrotubuli.
- Bemærk volumenet af de høstede celler med den volumetriske skala på 50 ml røret.
3. Ekstraktion af mikrotubulus
BEMÆRK: Opbevar alt i trin 3.1-3.5 på is; alt fra trin 3.6 og fremefter skal holdes varmt (30-37 °C).
- Forbered 10 ml iskold lysisbuffer indeholdende 100 mM RØR/KOH (pH6,9), 2 mM EGTA/KOH, 1 mM MgCl 2, 1 mM PMSF og en proteasehæmmertablet (mini).
- Resuspender den høstede cellepille i 1: 1 v / v lysisbuffer (hvis du er i tvivl om det nøjagtige volumen, skal du tage mindre lysisbuffer snarere end mere).
- Lyse cellerne ved sonikering: 15 s på, 45 s slukket, amp 30, fire cyklusser (bestem betingelserne eksperimentelt og skift i henhold til sonikatoren).
- Efter sonikering indsamles en prøve til SDS-PAGE-analyse: 2 μL lysat + 18 μL vand + 5 μL 5x SDS-prøvebuffer.
BEMÆRK: Kontroller under et standard lysmikroskop, om cellerne faktisk er fuldt lyseret.
- Efter sonikering indsamles en prøve til SDS-PAGE-analyse: 2 μL lysat + 18 μL vand + 5 μL 5x SDS-prøvebuffer.
- De lyserede celler pipetteres ind i et centrifugalrør. Spin i 1 time ved 100.000 × g ved 4 °C i en ultracentrifugerotor for at fjerne lysatet.
BEMÆRK: Sørg for, at alle lommer i rotoren er tørre og rene for at sikre korrekt afbalancering af centrifugen. - Brug en sprøjte til at tage det ryddede lysat ud. Pas på ikke at forstyrre pellet såvel som det flydende lag ovenpå.
- Der indsamles en prøve af det rensede lysat: 2 μL lysat + 18 μL vand + 5 μL 5x SDS-prøvebuffer.
- Skyl forsigtigt pelleten, og øs en lille smule af pelleten op ved at hvirvle en P10-pipettespids gennem pelleten; tilsættes 200 μL vand og 50 μL SDS-buffer.
- Supernatanten fra det foregående trin suppleres med 1 mM GTP og 20 μM paclitaxel for at polymerisere mikrotubuli. for et volumen på 1 ml tilsættes 10 μL 2 mM paclitaxel og 10 μL 100 mM GTP.
FORSIGTIG: Paclitaxel kan forårsage hudirritation, alvorlig øjenskade, irritation af luftvejene, genetiske defekter, skade på et ufødt barn og organskader. Langvarig eller gentagen eksponering forårsager organskade. Du må ikke trække vejret, sprøjte eller støve stoffet på nogen måde. Brug nitrilhandsker af gummi for at forhindre hudkontakt. - Supernatanten med GTP/paclitaxel-tilskud inkuberes i 30 minutter ved 37 °C, så mikrotubuli kan samle sig.
- Under dette inkubationstrin lades rotoren og ultracentrifugen varme op til 30 °C.
- Forbered pudebufferen: Tilsæt 0,6 ml glycerol til 0,4 ml lysisbuffer, og suppler blandingen med 20 μM paclitaxel. Forvarm pudebufferen til 37 °C.
- Tilsæt 800 μL pudebuffer til et ultracentrifugerør. Det GTP/paclitaxel-supplerede lysat pipetteres forsigtigt oven på pudebufferen.
BEMÆRK: Undgå blanding af pudebufferen og lysatet ved at pipettere meget forsigtigt. - Spin i 30 min ved 100.000 × g ved 30 °C i en ultracentrifugerotor. Marker den udadvendte kant af centrifugeringsrøret for let at genkende, hvor mikrotubulipellet skal dannes.
- Fjern pudebufferen forsigtigt ved hjælp af en pipette, og pas på ikke at forstyrre mikrotubulipellet.
- Saml en prøve af pudebufferen: 2 μL + 18 μL vand + 5 μL 5x SDS-prøvebuffer.
- Vask pillen omhyggeligt 3x med varm lysisbuffer for at fjerne glycerol. Dispenser forsigtigt den varme buffer ved siden af pelleten (skyl ikke væsken direkte over pelleten), drej røret et par gange for at fjerne så meget glycerol som muligt fra pelleten og rørets vægge, og aspirer derefter og gentag.
BEMÆRK: Hvis glycerolen ikke vaskes ordentligt af, smelter gitteret meget hurtigt under elektronbelysningen. Dette kan bevises ved høj partikelbevægelse, hvilket skaber slørede billeder. - Forbered resuspensionsbuffer med følgende ingredienser: 100 mM RØR/KOH (pH 6,9), 2 mM EGTA/KOH og 1 mMMgCl2, og opvarm bufferen til 37 °C.
- Den vaskede pellet resuspenderes forsigtigt med en skåret spids i ~50 μL forvarmet resuspensionsbuffer, og røret opbevares ved 37 °C.
- Der indsamles en prøve af den resuspenderede pelletfraktion: 2 μL + 18 μL vand + 5 μL 5x SDS-prøvebuffer.
TIP: Den afskårne spids forhindrer brud på mikrotubuli. Forbered en metalopvarmningsblok til 37 °C, og opbevar den i en polystyrenkasse, så prøverørene let kan transporteres uden at køle dem ned til stuetemperatur.
- Der indsamles en prøve af den resuspenderede pelletfraktion: 2 μL + 18 μL vand + 5 μL 5x SDS-prøvebuffer.
4. Forberedelse af kryo-EM-gitter
- Forbered springfryserenheden ved at installere blottingpapiret. Opvarm dybfryseren op til 30 °C, og indstil befugtningen til 100%. Tillad ~ 30 minutter at ligevægte temperatur og fugtighed.
- Forbered indstillingerne for springfryseren til to applikationer, og kør gennem hele programmet én gang for at være sikker på, at indstillingerne er indstillet korrekt. Sørg for, at den første applikation har en kraft på 10, 2 s blottid og 0 s ventetid, og at den anden applikation har en kraft på 10, 6,5 s blottid og 10 s ventetid.
- Glød-aflad cryo-EM-ristene ved 30 mA i 60 sekunder.
- Afkøl polystyrenbeholderenheden med LN2, og tilbered flydende ethan i en metalkop ved at kondensere etangas til en kold metalkop.
- Der fremstilles en fortyndingsbuffer med følgende komponenter: 100 mM RØR/KOH (pH 6,9), 2 mM EGTA/KOH og 1 mMMgCl2, og den opvarmes til 37 °C.
- Fortynd det mikrotubulus-interagerende protein 1:1 v/v med fortyndingsbuffer lige før det påføres ristene for at sikre, at saltkoncentrationen sænkes (vi brugte en endelig saltkoncentration på 50 mM NaCl). Opbevar blandingen ved 37 °C.
- Grib et glødafladet gitter med springpincet, og klik dem i springfryseren.
- Placer polystyrenbeholderen med flydende ethan i dykfryseren, og løb gennem det forberedte program: Påfør først 3,5 μL mikrotubulusopløsning på gitteret, lad dykfryseren blotte gitteret, påfør derefter straks 3,5 μL frisk fortyndet protein, og lad til sidst stemplet blotte og dyk-fryse gitteret i flydende ethan.
- Overfør gitterene til en gitteropbevaringsboks, og gem dem i en LN2-dewar, indtil billeddannelse.
Representative Results
Vi undersøgte tubulin detyrosinase MATCAP bundet til tyrosinerede mikrotubuli af cryo-EM. For at gøre dette ekstraherede vi fuldt tyrosinerede mikrotubuli fra en genetisk modificeret HCT116-cellelinje, der manglede alle tre kendte detyrosinerende enzymer, VASH1/2 og MATCAP. Vi brugte 6-12 sammenflydende 15 cm skåle til at ekstrahere mikrotubuli fra ca. 0,5-4 ml cellepellet (figur 1). Efter det andet centrifugeringstrin (trin 3.11) giver dette en synlig, men lille og gennemsigtig pellet (figur 1I). Mikrotubulusudbyttet er typisk ~75 μg. Hvis pellet ikke er synlig, kan dette indikere et problem i et af de foregående trin, såsom en forkert mikrotubuluspolymerisationstemperatur, problemer med kvaliteten af den anvendte GTP eller paclitaxel eller tilsætning af for meget lysisbuffer, hvilket resulterer i en tubulinkoncentration, der er for lav til polymerisation. For at vurdere kvaliteten og koncentrationen af de ekstraherede mikrotubuli analyserede vi prøver på en Coomassie-farvet SDS-gel (figur 2A). Disse analyser indikerede, at de ekstraherede mikrotubuli var relativt rene. Den interpolerede mikrotubuluskoncentration afledt af BSA-kvantificering var ~1,4 mg/ml. Dette stemmer godt overens med det tal, der måles med et spektrofotometer (figur 2B, C).
De friskekstraherede mikrotubuli kan direkte bruges til at lave prøver til cryo-EM. Mikrotubuli skal se intakt og rigeligt ud på mikrograferne. For yderligere kryo-EM-analyse er det vigtigt at have en lav mikrotubulusdensitet pr. mikrografi for at undgå, at mikrotubuli krydser hinanden (figur 3A). Ødelagte mikrotubuli eller dem, der ikke er synlige, kan indikere, at mikrotubuli depolymeriseres (f.eks. på grund af lav temperatur eller GTP-hydrolyse), eller at blotting- og springfrysningsparametrene ikke var indstillet korrekt. Baggrunden omkring mikrotubuli er tæt, formodentlig med upolymeriseret tubulin.
Molekylvægten af MATCAP er 53 kDa, og den har et kugleformet katalytisk domæne lige under størrelsen af en tubulinmonomer. Udsmykningen af MATCAP på mikrotubuli kunne derfor detekteres visuelt. Mikrotubuli, der ikke bandt MATCAP, viste "glatte" kanter, mens mikrotubuli, der bandt MATCAP, havde "ru" kanter, kendetegnet ved elektrontætte prikker på mikrotubulusoverfladen (figur 3B). MATCAP-bundne og MATCAP-ubundne mikrotubuli kunne også skelnes i de beregnede 2D-klasser, selvom dette på grund af form og størrelse kan variere for andre mikrotubulusinteragerende proteiner (figur 3C). For at bekræfte, at densiteten faktisk tilhører proteinet af interesse, kan man drage fordel af eksperimentelt bestemte eller forudsagte strukturer. Vi foreslår også at lave et kontrolgitter, der kun indeholder mikrotubuli til sammenligning. Dette indikerer, om mikrotubuli blev polymeriseret og ekstraheret intakt i en tilstrækkelig høj koncentration, og at springfrysningsprocessen blev udført korrekt. Vi bemærkede, at mikrotubulusmængden faldt i gitter med en anden MATCAP-applikation.
Figur 1: Visuel vejledning af de eksperimentelle trin. A) Cellepellet før lysis B) sonikerede celler i et ultracentrifugerør før centrifugering C) sonikerede celler i et ultracentrifugerør efter centrifugering D) sprøjte med den rensede supernatant E) pelletrester efter fjernelse af supernatant, herunder et "hvidt flydende lag" F) P10-spids med en pille til cellerester til SDS Coomassie-gelen G) GTP/paclitaxel-suppleret supernatant før inkubation H) GTP/paclitaxel-inkuberet supernatant oven på en glycerolpude i et ultracentrifugeglas I) rengør mikrotubulupelletpellet efter det andet centrifugeringstrin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Renhed og koncentrationsbestemmelse af mikrotubulus . (A) Coomassie-farvet SDS-sidegel, der viser prøverne taget under ekstraktionsprotokollen og en BSA-koncentrationssammenligning. S1 og P1 svarer til henholdsvis supernatant og pellet efter første centrifugeringstrin. S2 og P2 svarer ligeledes til det andet centrifugeringstrin. B) En ikke-lineær regressionslinje for de relative BSA-mængder afledt af A. Interpolationen af mikrotubulusbåndet omkring 50 kDa i P2-banen (mikrotubuli) indikerer en slutkoncentration på 1,42 mg/ml. (C) Den spektrofotometriske analyse af de resuspenderede mikrotubuli (P2) målt af to personer og korrigeret for den kombinerede ekstinktionskoefficient for TUBA1A og TUBB3 (0,971) indikerer en middel- og standardafvigelseskoncentration på 1,46 mg/ml ± 0,14 mg/ml. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Eksempler på mikrografier. (A) Eksempler på mikrografier, der viser mikrotubuli bundet til MATCAP. Mikrotubuli, der er angivet med en grøn boks, er intakte, dekorerede og kan bruges til cryo-EM-analysen. Mikrotubuli, der er angivet med den orange boks, er en intakt og dekoreret mikrotubuli, men er placeret tæt på mikrotubuli til venstre for den; derfor er det mindre egnet at medtage i cryo-EM-analysen. Mikrotubuli i den røde boks krydser over og brydes. Disse bør udelukkes fra cryo-EM-analysen. (B) Et zoomet billede af det grønne omkransede mikrotubuli på venstre panel. De røde pilespidser angiver de sorte prikker, der kun optrådte på mikrotubuli i mikrografierne, der havde en anvendelse af MATCAP og dermed sandsynligvis svarer til MATCAP bundet til mikrotubuli. (C) Eksempel 2D-klasser af mikrotubuluspartikler plukket fra A, der viste høj og lav dekoration og en 2D-klasse fra et andet datasæt, hvor vi ikke observerede nogen dekoration af MATCAP (panel længst til højre). Skalastænger = (A) 50 nm, (B) 25 nm, (C) 10 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Immunoblot-analyse af mikrotubuli afledt af MATCAP-mangelfulde og VASH1/2-mangelfulde triple knockout (TKO) HCT116-celler, kommerciel svinehjerne og HeLa tubulin. Forkortelser: TKO = tredobbelt knockout; mAb = monoklonalt antistof; pAb = polyklonalt antistof. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Denne metode beskriver, hvordan man hurtigt ekstraherer endogen tubulin fra cellelinjer og efterfølgende dekorerer disse mikrotubuli på kryo-EM-gitre. Mikrotubuli er temperaturfølsomme. De depolymeriserer i et koldt miljø og polymeriserer i et varmt miljø31. Det er derfor afgørende at udføre sonikering og clearance spin (trin 1.1-1.5) ved 4 ° C for at opløse tubulin. Hvis nogen faktorer stabiliserede mikrotubuli så godt, at de ikke ville depolymerisere i dette trin, ville disse mikrotubuli og de stabiliserende faktorer blive kasseret i pelleten efter den indledende clearance spin. Efter (re)polymerisering af mikrotubuli er det vigtigt at holde opløsningen, der indeholder de polymeriserede mikrotubuli, varm hele tiden. Vi ekstraherede mikrotubuli fra HCT116-celler, som mangler proteinerne VASH1, VASH2 og MATCAP. Andre cellelinjer såvel som væv kan bruges til at ekstrahere mikrotubuli29, selvom forurenende stoffer, tubulinisotyper og udbytte kan være meget forskellige fra det, der er beskrevet her. Overekspression plasmider, der indeholder modificerende enzymer, kan også bruges til at indføre specifikke tubulinmodifikationer.
Andre protokoller 18,27,28,29,30 bruger flere cyklusser af polymerisering og depolymerisering af mikrotubuli for at opnå mikrotubuli uden andre interagerende proteiner. Her har vi forenklet disse protokoller og polymeriserer kun mikrotubuli én gang. Det er muligt, at disse mikrotubuli på grund af denne enkelt polymerisation kan co-sedimentere med andre mikrotubulus-interagerende proteiner. Vi har imidlertid fundet ud af, at denne protokol giver tilstrækkeligt rene mikrotubuli til kryo-EM-formål. Hvis en renere prøve er nødvendig til specifikke assays, kan yderligere polymerisations- og depolymerisationscyklusser give en renere prøve, selvom dette kan være på bekostning af mikrotubulusudbyttet. I denne protokol brugte vi paclitaxel til at polymerisere mikrotubuli. Imidlertid kan paclitaxel bias mikrotubulusgitteret mod en bestemt drejning og stigning, hvilket kan forstyrre mikrotubulusaffiniteten af det pågældende protein. Andre mikrotubulusstabiliserende reagenser kan anvendes, hvis paclitaxel er uegnet; eksempler på disse reagenser er ikke-taxanmolekyler såsom pelorusid eller ikke-hydrolyserbare GTP-varianter såsom GMPCPP 17,32.
For strukturelt at undersøge proteiner, der binder til mikrotubuli på kryo-EM-gitter, skal man binde en tilstrækkelig mængde af proteinet af interesse for mikrotubuli. Et almindeligt forekommende problem er, at proteinkomplekser, der er stabile i opløsning, falder fra hinanden på nettet. For at danne proteinkomplekset på gitteret var det afgørende først at lægge mikrotubuli i lag og derefter påføre det mikrotubulusbindende protein med en lav saltkoncentration på det mikrotubulusbelagte gitter og dermed samle proteinkomplekset direkte på gitteret. Andre har ligeledes rapporteret en 33,34-protokol med lavt saltindhold og en totrinsansøgning 34,35,36-protokol til vellykket mikrotubulusdekoration. Det er sandsynligt, at en lavere saltkoncentration forvrider proteinkomplekset mod en mere stabil interaktion på grund af de nedsatte elektrostatiske ladninger. På grund af den lave saltkoncentration er proteinet af interesse imidlertid i fare for udfældning. Derfor anbefales det stærkt at holde proteinet på eller omkring fysiologisk relevante saltkoncentrationer indtil kort før forglasning af gitterene. Denne totrins applikationsprotokol forhindrer sandsynligvis proteinkomplekset i at falde fra hinanden under blotting- eller dykfrysningstrinnene. I denne protokol brugte vi Vitrobot. Imidlertid kan hurtigere vitrifikationsmetoder (VitroJet) eller brugen af blotfrie gitre (Puffalot) eller enheder, der har begge egenskaber (kamæleon), potentielt overvinde totrinsapplikationen, men disse er i øjeblikket ikke bredt tilgængelige til testning.
Den endelige opløsning af den rekonstruerede kryo-EM-densitet kan påvirkes af en række faktorer, herunder bevægelsen af det mikrotubulusbindende protein i forhold til mikrotubuli og det dekorationsniveau, der kan opnås. Højere mikrotubulusdekoration er sandsynligvis gavnlig for den endelige opløsning, der opnås i 3D-densitetsrekonstruktionen. Dette kan begrænses af nogle få faktorer, såsom den højeste proteinkoncentration, der opnås under oprensningen af det mikrotubulusbindende protein, den laveste saltkoncentration, som det mikrotubulus-interagerende protein kan modstå uden aggregering, og bindingstilstanden for det mikrotubulus-interagerende protein (f.eks. kan proteinet spænde over mere end en tubulindimer og dermed hindre et bindingsforhold på 1: 1). Selvom opløsningen af cryo-EM-rekonstruktionen kan blive kompromitteret af sparsomt dekorerede mikrotubuli, kan beregningsanalyse omgå mange problemer, som eksemplificeret ved en nyligt rapporteret mikrotubulus-protein-kompleks struktur, der var ekstremt sparsomt dekoreret8.
Den protokol, vi beskriver her, præsenterer en hurtig, billig metode til at opnå mikrotubuli, der er egnet til kryo-EM-formål. I modsætning til kommercielt tilgængeligt tubulin i svinehjernen er mikrotubuli afledt af MATCAP-mangelfulde og vasohibin-mangelfulde HCT116-celler fuldt tyrosinerede (figur 4). Kommercielt HeLa tubulin, et dyrt reagens, er i princippet relativt ensartet tyrosineret og indeholder lidt andre modifikationer4 såsom glutamylering, men batcher kan variere, og modifikation kunne kun opnås in vitro. En fordel ved at ekstrahere mikrotubuli fra specialfremstillede cellelinjer er den fleksibilitet, man har til at overudtrykke eller slette tubulinmodificerende enzymer, såsom tubulin detyrosinaser, for at skabe en mere homogen pulje af mikrotubuli. Dette kan gavne dekorationen og ensartetheden af cryo-EM-prøven og vil i sidste ende gavne letheden og kvaliteten af kryo-EM-densitetskortene og molekylære strukturer afledt af denne prøve.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker alle medlemmer af grupperne Sixma, Brummelkamp og Perrakis for deres frugtbare videnskabelige diskussioner og for at skabe et behageligt arbejdsmiljø, og specifikt takker vi Jan Sakoltchik ("person 2") for at hjælpe med at bestemme proteinkoncentrationen afbildet i figur 3C. Vi vil også gerne takke NKI cryo-EM-faciliteten og det hollandske center for elektronnanoskopi (NeCEN) ved Leiden University for deres støtte. Dette arbejde blev støttet af NWO Vici tilskud 016.Vici.170.033 tildelt T.R.B.. A.P. og T.R.B. er Oncode-efterforskere og modtager finansiering fra NWO ENW (OCENW. M20.324). L.L. modtog støtte fra den østrigske videnskabsfond (FWF JB4448-B). Denne forskning blev støttet af et institutionelt tilskud fra den hollandske kræftforening og det hollandske ministerium for sundhed, velfærd og sport.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Cell culture |
| 10 cm plate | Falcon | 353003 | Cell culture |
| 15 cm plate | Thermo FisherScientific | 168381 | Cell culture |
| 50 mL tubes | Sarstedt | 62.547255 | Cell culture |
| 300 mesh quantifoil holey carbon copper grid R1.2/1.3 | Quantifoil Micro Tools | N1-C14nCu30-01 | Cryo-EM grid preparation |
| Cell scrapers | Falcon | 353085 | Cell culture |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | Cell culture |
| EDTA | Merck | 108418 | Cell culture |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3899 | Microtubule extraction |
| Ethane gas | Cryo-EM grid preparation | ||
| FCS | Serana | s-FBS-EU-015 | Cell culture |
| Glycerol | VWR | 24.397.296 | Microtubule extraction |
| GTP | Fisher Scientific | G8877-1G | Microtubule extraction |
| HCT116 VASH1 VASH2 MATCAP KO cells | self made | Wild type HCT116 cells RRID: CVCL_0291 | Cell culture |
| KOH | Merck | 1.05033 | Microtubule extraction |
| MgCl2 | Merck | 105833 | Microtubule extraction |
| Microtubule binding protein | self made | Cryo-EM grid preparation | |
| Needle | BD microlance | 300600 | Microtubule extraction |
| Paclitaxel | Santa Cruz Biotechnology | sc-212517 | caution toxic, microtubule extraction |
| PBS | Fisher Scientific | BP399 | Cell culture |
| Penicillin and streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100mL | Cell culture |
| PIPES | Merck | P8203 | Microtubule extraction |
| PMSF (in EtOH) | Roche | 16837091001 | Microtubule extraction |
| SDS sample buffer | self made | Quality assessment | |
| Syringe | BD plastipak | 309658 | Microtubule extraction |
| Ultra protease tables mini | Fisher Scientific | NC0975224 | Microtubule extraction |
| Whatman blotting paper | Whatman | 47000-100 | Cryo-EM grid preparation |
| Equipment | |||
| Flow hood | cell culture | ||
| GloQube | Quorum | Cryo-EM grid preparation | |
| Grid storage box | SWISSCI | 41018 | Cryo-EM grid storage |
| Heating block, electric or metal | to warm the buffers | ||
| Incubator, cell culture | NUAIR | cell culture | |
| LN2 dewar | Cryo-EM grid storage | ||
| Plunge-tweezers | Electron Microscopy Sciences | 0508-L5-PS | Cryo-EM grid preparation, hole drilled in top to fit the vitrobot |
| Polystyrene box | to keep the buffers warm | ||
| Sonicator | Qsonica | Q700 | Microtubule extraction |
| Standard light microscope | Olympus | CKX 41 | Quality assessment |
| TLA 100.3 rotor | Beckman Coulter | Microtubule extraction | |
| TLA 120.2 rotor | Beckman Coulter | Microtubule extraction | |
| Tubes for TLA 100.3 rotor | Beckman Coulter | 326819 | Microtubule extraction |
| Tubes for TLA 120.2 rotor | Beckman Coulter | 347356 | Microtubule extraction |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Microtubule extraction |
| Vitrobot | FEI, ThermoFischer Scientific | mark IV | Cryo-EM grid preparation |
| Vitrobot polystyrene container assembly with metal ethane cup | ThermoFisher Scientific | 200703 | Cryo-EM grid preparation |
| Water bath | cell culture |
References
- Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
- Peris, L., et al. Motor-dependent microtubule disassembly driven by tubulin tyrosination. Journal of Cell Biology. 185 (7), 1159-1166 (2009).
- McKenney, R. J., Huynh, W., Tanenbaum, M. E., Bhabha, G., Vale, R. D. Activation of cytoplasmic dynein motility by dynactin-cargo adapter complexes. Science. 345 (6194), 337-341 (2014).
- Barisic, M., et al. Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis. Science. 348 (6236), 799-803 (2015).
- Sirajuddin, M., Rice, L. M., Vale, R. D. Regulation of microtubule motors by tubulin isotypes and post-translational modifications. Nature Cell Biology. 16 (4), 335-344 (2014).
- Nogales, E., Kellogg, E. H. Challenges and opportunities in the high-resolution cryo-EM visualization of microtubules and their binding partners. Current Opinion in Structural Biology. 46, 65-70 (2017).
- Manka, S. W., Moores, C. A. Microtubule structure by cryo-EM: Snapshots of dynamic instability. Essays in Biochemistry. 62 (6), 737-751 (2018).
- Chaaban, S., Carter, A. P. Structure of dynein-dynactin on microtubules shows tandem adaptor binding. Nature. 610 (7930), 212-216 (2022).
- Lacey, S. E., He, S., Scheres, S. H., Carter, A. P. Cryo-EM of dynein microtubule-binding domains shows how an axonemal dynein distorts the microtubule. eLife. 8, 47145 (2019).
- Walton, T., Wu, H., Brown, A. Structure of a microtubule-bound axonemal dynein. Nature Communications. 12, 477 (2021).
- Sindelar, C. V., Downing, K. H. An atomic-level mechanism for activation of the kinesin molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4111-4116 (2010).
- Zhang, R., Alushin, G. M., Brown, A., Nogales, E. Mechanistic origin of microtubule dynamic instability and its modulation by EB proteins. Cell. 162 (4), 849-859 (2015).
- Maurer, S. P., Fourniol, F. J., Bohner, G., Moores, C. A., Surrey, T. EBs Recognize a nucleotide-dependent structural cap at growing microtubule ends. Cell. 149 (2), 371-382 (2012).
- Benoit, M. P. M. H., Asenjo, A. B., Sosa, H. Cryo-EM reveals the structural basis of microtubule depolymerization by kinesin-13s. Nature Communications. 9, 1662 (2018).
- Kellogg, E. H., et al.
- Brotzakis, Z. F., et al. A structural ensemble of a Tau-microtubule complex reveals regulatory Tau phosphorylation and acetylation mechanisms. ACS Central Science. 7 (12), 1986-1995 (2021).
- Kellogg, E. H., et al. Insights into the distinct mechanisms of action of taxane and non-taxane microtubule stabilizers from cryo-EM structures. Journal of Molecular Biology. 429 (5), 633-646 (2017).
- Vallee, R. B. Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments. Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).
- Wloga, D., Joachimiak, E., Louka, P., Gaertig, J.
- Nieuwenhuis, J., Brummelkamp, T. R. The tubulin detyrosination cycle: Function and enzymes. Trends in Cell Biology. 29 (1), 80-92 (2019).
- Nieuwenhuis, J., et al.
- Aillaud, C., et al. Vasohibins/SVBP are tubulin carboxypeptidases (TCPs) that regulate neuron differentiation. Science. 358 (6369), 1448-1453 (2017).
- Landskron, L., et al. Posttranslational modification of microtubules by the MATCAP detyrosinase. Science. 376 (6595), (2022).
- Erck, C., et al. A vital role of tubulin-tyrosine-ligase for neuronal organization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (22), 7853-7858 (2005).
- Pagnamenta, A. T., et al. Defective tubulin detyrosination causes structural brain abnormalities with cognitive deficiency in humans and mice. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3391-3405 (2019).
- Peris, L., et al. Tubulin tyrosination regulates synaptic function and is disrupted in Alzheimer's disease. Brain. 145 (7), 2486-2506 (2022).
- Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nature Protocols. 14 (5), 1634-1660 (2019).
- Gell, C., et al.
- Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Janke, C., Magiera, M. M. Purification of tubulin with controlled posttranslational modifications and isotypes from limited sources by polymerization-depolymerization cycles. Journal of Visualized Experiments. (165), e61826 (2020).
- Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
- Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
- Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue. GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
- Sindelar, C. V., Downing, K. H. The beginning of kinesin's force-generating cycle visualized at 9-Å resolution. Journal of Cell Biology. 177 (3), 377-385 (2007).
- Kellogg, E. H., et al. Near-atomic cryo-EM structure of PRC1 bound to the microtubule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9430-9439 (2016).
- Maurer, S. P., Bieling, P., Cope, J., Hoenger, A., Surrey, T. GTPγS microtubules mimic the growing microtubule end structure recognized by end-binding proteins (EBs). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (10), 3988-3993 (2011).
- Manka, S. W., Moores, C. A. Pseudo-repeats in doublecortin make distinct mechanistic contributions to microtubule regulation. EMBO Reports. 21 (12), 51534 (2020).
