Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Magnetisk højhastighedspincet til nanomekaniske målinger på kraftfølsomme elementer

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65137
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 2,3, 1,4
1Department of Physics, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 2School of Biological Sciences, Seoul National University, 3Institute for Molecular Biology and Genetics, Seoul National University, 4School of Interdisciplinary Bioscience and Bioengineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH)
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi en højhastigheds magnetisk pincetopsætning, der udfører nanomekaniske målinger på kraftfølsomme biomolekyler med den maksimale hastighed på 1,2 kHz. Vi introducerer dets anvendelse på DNA-hårnåle og SNARE-komplekser som modelsystemer, men det vil også være anvendeligt for andre molekyler, der er involveret i mekanobiologiske begivenheder.

Abstract

Enkeltmolekyle magnetisk pincet (MT'er) har tjent som kraftfulde værktøjer til kraftigt at forhøre biomolekyler, såsom nukleinsyrer og proteiner, og er derfor klar til at være nyttige inden for mekanobiologi. Da metoden almindeligvis er afhængig af billedbaseret sporing af magnetiske perler, har hastighedsgrænsen ved optagelse og analyse af billeder samt perlernes termiske udsving længe hæmmet dens anvendelse til observation af små og hurtige strukturelle ændringer i målmolekyler. Denne artikel beskriver detaljerede metoder til konstruktion og drift af en MT-opsætning med høj opløsning, der kan løse nanoskala, millisekunddynamik af biomolekyler og deres komplekser. Som anvendelseseksempler demonstreres eksperimenter med DNA-hårnåle og SNARE-komplekser (membranfusionsmaskiner) med fokus på, hvordan deres forbigående tilstande og overgange kan detekteres i nærvær af piconewton-skalakræfter. Vi forventer, at højhastigheds-MT'er fortsat vil muliggøre nanomekaniske målinger med høj præcision på molekyler, der sanser, transmitterer og genererer kræfter i celler, og dermed uddybe vores molekylære forståelse af mekanobiologi.

Introduction

Celler fornemmer aktivt og reagerer på mekaniske stimuli. Dermed viser mange biomolekyler kraftafhængige egenskaber, der muliggør dynamiske strukturelle ændringer. Velovervejede eksempler omfatter mekanofølsomme ionkanaler og cytoskeletale elementer, der giver cellerne vigtige mekaniske oplysninger fra deres omgivende miljø.

Derudover kan molekyler, der viser en unik kraftbærende natur, også betragtes som mekanofølsomme i bredere forstand. For eksempel spiller lokal dannelse og smeltning af nukleinsyreduplekser såvel som højere ordensstrukturer såsom G-quadruplexer afgørende roller i replikation, transkription, rekombination og for nylig genomredigering. Desuden udfører nogle neuronale proteiner involveret i synaptisk kommunikation deres funktioner ved at generere fysiske kræfter, der overstiger niveauerne af typiske intermolekylære interaktioner. Uanset hvilket eksempel man studerer, vil undersøgelse af nanomekanik af de involverede biomolekyler med høj rumlig tidsmæssig præcision vise sig yderst nyttig til at afsløre molekylære mekanismer i de associerede mekanobiologiske processer 1,2,3.

Enkeltmolekyle kraftspektroskopimetoder har fungeret som kraftfulde værktøjer til at undersøge de mekaniske egenskaber af biomolekyler 2,4,5,6. De kan overvåge strukturelle ændringer i nukleinsyrer og proteiner samtidig med anvendelsen af kraft og derved undersøge kraftafhængige egenskaber. To velkendte opsætninger er optisk pincet og magnetisk pincet (MT'er), der anvender mikronstore perler til at manipulere molekyler 5,6,7,8. I disse platforme bindes polystyren (til optisk pincet) eller magnetiske perler (til MT'er) til målmolekyler (f.eks. Nukleinsyrer og proteiner) via molekylære "håndtag", typisk lavet af korte fragmenter af dobbeltstrenget DNA (dsDNA). Perlerne flyttes derefter for at udøve kraft og afbildes for at spore deres placeringer, der rapporterer om strukturelle ændringer i målmolekyler. Optisk og magnetisk pincet er stort set udskiftelige i deres applikationer, men der findes vigtige forskelle i deres tilgange til styring af kraft. Optisk pincet er iboende positionsklemmeinstrumenter, der fanger perler i position, på grund af hvilken den påførte kraft svinger, når en målkonstruktion gennemgår formændringer; forlængelsesforøgelse, såsom fra udfoldning, løsner tøjret og reducerer spændinger og omvendt. Selvom aktiv feedback kan implementeres for at kontrollere kraften i optisk pincet, fungerer MT'er derimod naturligt som en kraftklemmeanordning, der udnytter stabile, langtrækkende magnetiske kræfter af permanente magneter, som også kan modstå miljøforstyrrelser.

På trods af deres lange historie og enkle design har MT'er haltet bagefter optiske pincetter i deres applikationer til højpræcisionsmålinger, hovedsageligt på grund af tekniske udfordringer inden for hurtig perlesporing. På det seneste har flere grupper imidlertid i fællesskab stået i spidsen for en mangesidet forbedring af både hardware og software til MT-instrumenter 2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . I dette arbejde introducerer vi et eksempel på et sådant setup, der kører ved 1,2 kHz og beskriver, hvordan man kan bruge det til at udføre nanomekaniske målinger på kraftfølsomme biomolekyler. Som modelsystemer anvender vi DNA-hårnåle og neuronale SNARE-komplekser og undersøger deres hurtige, strukturelle ændringer i piconewton-regimet. DNA-hårnåle udviser enkle to-tilstandsovergange i et veldefineret kraftområde20,21 og fungerer derfor som legetøjsmodeller til at verificere ydeevnen af en pincetopsætning. Da SNARE-proteinerne samles i et kraftfølsomt kompleks, der driver membranfusion22, er de også blevet grundigt undersøgt ved enkeltmolekylekraftspektroskopi 14,23,24,25. Standardmetoder til analyse af data og udtrækning af nyttige oplysninger om termodynamik og kinetik præsenteres. Vi håber, at denne artikel kan lette vedtagelsen af MT'er med høj præcision i mekanobiologiske undersøgelser og motivere læserne til at udforske deres egne kraftfølsomme systemer af interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle materialer og udstyr, der er beskrevet i denne protokol, er anført i materialetabellen. LabVIEW-software til betjening af MT-opsætningen med høj hastighed, der er beskrevet nedenfor, samt MATLAB-scripts til analyse af eksempeldata deponeres på GitHub (https://github.com/ShonLab/Magnetic-Tweezers) og er offentligt tilgængelige.

1. Konstruktion af apparater

BEMÆRK: Det generelle princip for højhastigheds-MT-konstruktionen svarer til standard, konventionelle MT-systemer, bortset fra brugen af et højhastighedskamera med komplementær metaloxidhalvleder (CMOS) og en sammenhængende lyskilde med høj effekt (figur 1). Se andre kilder for flere beskrivelser af standard MT-instrumenter 5,26,27.

  1. Opsæt et omvendt mikroskop på et optisk bord mod vibrationer. Installer et højhastigheds CMOS-kamera og en rammegriber.
  2. Byg en oversættelsesfase til manipulation af magneter i 3D. Monter et motoriseret lineært trin (>20 mm vandring) lodret oven på et manuelt XY-trin.
    BEMÆRK: Den lodrette bevægelse styrer kraften, mens XY-trinnet er til manuel justering af magneter til den optiske akse til den indledende konstruktion af opsætningen.
  3. Installer en roterende stepmotor og et bælte- og remskivesystem til roterende magneter.
    BEMÆRK: Bæltet overfører den roterende bevægelse mellem motorakslen og magneter, der er et par centimeter fra hinanden. Rotationen af magneter er intern i den translationelle manipulation.
  4. Monter magneterne. Brug en akrylholder (bestilt fra en produktionsvirksomhed; se supplerende figur S1), der tæt kan rumme to identiske magneter parallelt med et veldefineret mellemrum på 1 mm mellem magneterne (figur 1B). For at udnytte den maksimale kraft, der kan opnås med et givet par magneter, skal du justere den lodrette position af oversættelsestrinnet, så magneternes bundoverflade flugter med prøveplanet, når den flyttes til den laveste position.
    BEMÆRK: Se Lipfert et al. for mere information om holderens design og konfiguration af magneter28. Magneternes højde og orientering styres af LabVIEW-softwaren i forbindelse med dataindsamling.
  5. Visning med en objektivlinse med lav forstørrelse, juster magneterne til midten af synsfeltet. Kontroller, at rotation af magneterne ikke forårsager en stor forskydning af midten af magnetparret.
    BEMÆRK: Hvis midtpunktet mellem magneterne roterer om rotationsaksen, er det sandsynligt, at magneterne er off-centreret på grund af en ufuldkommen holder. Et lille niveau af forskydning i forhold til mellemrumsstørrelsen er acceptabelt, da magnetrotationen kun er til kontrol af tøjler og anvendelse af drejningsmomenter i specifikke applikationer.
  6. Installer en superluminescerende diode (SLD) til belysning af perler. Før strålen gennem afstanden på 1 mm mellem de to magneter. Sørg for, at strålen er korrekt kollimeret, så den passer ind i mellemrummet, og at belysningen ikke skygges af magneterne.
  7. Installer en piezo-linsescanner på næsestykket, og monter en 100x objektivlinse til nedsænkning af olie (numerisk blænde [NA]: 1,45) til perlesporing. For at undgå potentielle artefakter i sporingsresultater skal du sørge for, at belysningen opretholdes ensartet, når magneterne flyttes. Til sidst skal du justere lysniveauet til den maksimale lysstyrke uden at mætte pixels.
    BEMÆRK: For sammenligning af forskellige lyskilder til højhastighedssporing af perler henvises til Dulin et al.29.

2. Kalibrering af magnetisk kraft

  1. Ved hjælp af polymerasekædereaktion (PCR; se tabel 1) fremstilles 5 kbp dsDNA-fragmenter (ved hjælp af Primer B, Primer Z_5k og λ-DNA), der er mærket med biotin i den ene ende (til overfladefastgørelse) og azid i den anden ende (til perlefastgørelse).
  2. Efter afsnit 6 fremstilles en flowcelle med 5 kbp-molekylerne.
  3. Efter afsnit 7 identificeres en god perle-tether konstruktion ved at verificere dens forlængelse og rotation. Sørg især for at vælge en perle med en minimal rotationsbane (dvs. med en radius <200 nm) for at minimere perlehøjdeforskydningen på grund af off-centreret fastgørelse30,31. Når en god tøjring er identificeret, skal du starte perlesporing med henvisning til afsnit 9.
  4. Hvis opsætningen er ny, skal du karakterisere dens støj og stabilitet for pålidelige målinger i høj opløsning. Placer magneten ~3 mm fra flowcelleoverfladen (for at anvende >10 pN og undertrykke den brownske bevægelse af en perle), spor perlens z-position ved 1,2 kHz, og beregn Allan-afvigelsen (AD) fra z-koordinattidsserien32,33 (figur 2C). Kontroller, at AD-værdier på nogle få nanometer kan opnås i højhastighedsregimet (<0,1 s), og at differentiel sporing (magnetisk perleposition i forhold til en referenceperle) reducerer AD på længere tid.
    BEMÆRK: Vi opnår typisk en AD på <3 nm ved den maksimale hastighed (1,2 kHz eller 0,83 ms opløsning), og AD'en fortsætter med at falde mindst op til 10 s, hvilket indebærer en minimal drift. Andre har rapporteret lignende værdier på lignende opsætninger 9,10,11,12,34.
  5. Med magneter i hvileposition (F ~ 0 pN) registreres x- og y-koordinaterne for den tøjrede perle ved 1,2 kHz. Optag positionen i en tilstrækkelig lang periode (dvs. tilstrækkelig længere end den karakteristiske afslapningstid for udsving35), så den brownske bevægelse er tilstrækkeligt samplet.
    BEMÆRK: Her er x-retningen langs magnetfeltets retning, mens bevægelsen i y repræsenterer den tværgående bevægelse vinkelret på feltet.
  6. Flyt magneterne tættere på flowcellen, og gentag perlepositionsmålingerne, indtil magneterne forsigtigt rører toppen af flowcellen. Bevæg dig i store trin (f.eks. 1-2 mm), når magneterne er mere end 7 mm væk fra prøveplanet (da den påførte kraft stiger langsomt i magneternes fjerne felt), men reducer trinstørrelsen gradvist (f.eks. 0,1-0,5 mm), når de nærmer sig tættere for finere kalibrering ved højere kraftniveauer (figur 2B).
  7. Beregn kraften ved hver magnetposition, d, ved hjælp af en af de to alternative metoder (et MATLAB-script "force calibration.m" inklusive begge metoder er tilvejebragt; se supplerende fil 1).
    1. Variansen af perlens y-koordinater Equation 1 (figur 2D) og perlens gennemsnitlige z-position i forhold til den laveste position Equation 2 (figur 2B, nederst). Brug derefter ligning (1)7,27,36 til at estimere kraften (med en fast perleradius R = 1,400 nm og termisk energi kRT = 4,11 pN∙nm):
      Equation 3(1)
    2. Alternativt beregnes effektspektraltætheden (PSD) for y-koordinaterne, Sy(figur 2E). Den påførte kraft F bestemmes ved at montere en dobbelt-Lorentzian model37 på den målte Sy ved hjælp af ligning (2).
      Equation 4(2)
      Equation 5Her er , R perleradius, γ yog γφ er henholdsvis translationelle og roterende trækkoefficienter (estimeret ud fra Stokes-Einstein-ligningen), kRT er den termiske energi, f + og f- er to karakteristiske frekvenser opnået ved hjælp af ligning (3).
      Equation 6 (3)
      BEMÆRK: Da tetherforlængelsen L er en funktion af kraft, der følger den veletablerede ormlignende kædemodel (WLC), efterlader ovenstående udtryk F som den eneste tilpasningsparameter (vi fastsætter R til at være 1.400 nm for enkelhedens skyld, fordi den deles på tværs af alle kraftniveauer, og den nøjagtige værdi ikke påvirker resultaterne mærkbart). Når det er nødvendigt, skal bevægelsessløring og aliasing fra kamerabaseret billedoptagelse betragtes som38,39, men denne effekt er ubetydelig i vores højhastighedsmålinger over 1 kHz med 5 kbp tethers.
  8. Gentag trin 2.4-2.7 for at få flere konstruktioner. Undersøg tre til fem forskellige perler for at udligne kraftvariationen blandt de magnetiske perler.
    BEMÆRK: Kraftvariation blandt de anvendte magnetperler bør overvejes for at bestemme det korrekte antal konstruktioner til gennemsnit. Denne variabilitet er lille, men kan føre til mere end 1 pN fejl i den målte kraft, selv for kommercielle produkter31. For de fleste applikationer, hvor den absolutte bestemmelse af de involverede kræfter ikke er afgørende, er gennemsnittet af kalibreringsresultaterne for tre til fem perler generelt tilstrækkeligt. En alternativ tilgang til at tage højde for denne variation er at måle kraften med individuelle tøjler i begyndelsen af eksperimentet, hvilket kan være tidskrævende. En anden mulighed er at indlejre hårnålestrukturer, der lynes ud ved kendte kraftniveauer i hver konstruktion31.
  9. Den målte kraft afbildes som funktion af magnetafstanden, og dataene tilpasses en dobbelt eksponentiel funktion (figur 2F) ved hjælp af ligning (4).
    Equation 7(4)
    Her er F0 (baseline), A 1 og A 2 (amplituder) og d 1 og d2 (henfaldskonstanter) passende parametre. Sørg for, at kraftværdierne fra de to metoder såvel som de resulterende dobbelteksponentielle tilpasninger stort set stemmer overens (figur 2F, G).
    BEMÆRK: For at bekræfte, at kraftkalibrering udføres korrekt, skal du kontrollere kraftforlængelsesforholdet mellem sondens konstruktioner ved at plotte forlængelsen versus den målte kraft.
  10. For at korrigere for perlehøjdeforskydningen z off som følge af kraftafhængig hældning af magnetperlerne30,31 estimeres z off fra lateral offset x off, idet geometrien af en off-centreret tether med en perleradius ved hjælp af ligning (5) estimeres, og værdierne anvendes på de målte forlængelsesværdier. Dette trin implementeres i MATLAB-scriptet "force calibration.m" (linjer 252-254).
    Equation 8(5)
    BEMÆRK: Selvom denne korrektion foretager små ændringer i forlængelsen, især for perler med en lille rotationsradius (<200 nm), påvirker denne forskydning ofte den elastiske respons kritisk, som det ses i ændringen fra figur 2H til figur 2I30,31.
  11. Kontroller persistenslængden Lp ved at montere en WLC-model, der kan udvides, på dataene ved hjælp af ligning (6).
    Equation 9(6)
    Her er L 0 konturlængden (1,7 μm for 5 kbp) og K0 er modulet for entalpisk strækning.
    BEMÆRK: Selvom L p af dsDNA er velaccepteret at være 40-50 nm i en typisk buffer såsom fosfatbufret saltvand (PBS), undervurderer WLC-formlen anvendt på korte molekyler (<5 kbp) systematisk L p, da L0 falder31,40. Dette skyldes, at den klassiske WLC-model antager en polymer, hvis kædelængde er tilstrækkelig længere end dens persistenslængde. Her opnåede vi L p = 40 ± 3 nm for 5 kbp-konstruktionen (figur 2H), og forlængelseskorrektionen gav yderligere en homogen K0 på 1.100 ± 200 pN (figur 2I). Anvendelse af en endelig WLC-model 31,40 samt en korrektion for ikke-gaussianitet i udvidelsesfordeling 41 vil øge Lp lidt.
  12. Når kraftkalibreringen er verificeret, skal du anvende de opnåede tilpasningsparametre for den dobbelteksponentielle model på den medfølgende LabVIEW-software (supplerende fil 2) og vente på, at softwaren beregner den aktuelle kraft i realtid fra motoraflæsninger (dvs. magnetposition). Da et analytisk udtryk for den inverse funktion d(F) ikke er tilgængeligt, skal du udarbejde en opslagstabel med d versus F i trin på 0,1 pN ved numerisk estimering af for d-målkraftniveauerne. Gem også denne tabel i softwaren for at kommandere kraftkontrollen.

3. Syntese af DNA-hårnåle

BEMÆRK: DNA-hårnålekonstruktioner til MT-eksperimenter fremstilles ved PCR-amplifikation af en 510 bp-region i λ-DNA med to brugerdefinerede primere, hvoraf den ene indeholder en hårnålestruktur på dens 5′-ende (figur 3A). På denne måde placeres et hårnålemotiv i den ene ende af PCR-produktet.

  1. Forbered primerne.
    1. Fremadgående primer: Primer B_hp, der er 5′-biotinmærket til fastgørelse af glasoverflade og binder til λ-DNA. Denne primer indeholder et hårnålemotiv med en 8 bp stilk og en 6 nt løkke, 5′ til λ-bindingsområdet.
    2. Omvendt primer: Primer Z_hp, der er 5′-azidmærket til magnetisk perlefastgørelse og binder til λ-DNA 1 kbp væk fra den forreste primer.
  2. Opsæt og kør PCR med λ-DNA (skabelon), nTaq polymerase og standard PCR-betingelser (se tabel 1). Ryd produktet op med et kommercielt rensningssæt.
  3. DNA-koncentrationen måles ved UV-absorption ved 260 nm (A260), og agarosegelelektroforese (2 % gel) (se tabel 2) udføres for at kontrollere produktstørrelsen. Et typisk udbytte er ~35 μL ~600 nM opløsning.

4. Fremstilling af SNARE-proteiner

BEMÆRK: Neuronale SNARE-komplekser samles ved at kombinere tre oprensede rotteproteiner udtrykt fra E. coli: VAMP2/synaptobrevin-2, syntaxin-1A og SNAP-25 (figur 3B). For at lette deres samling udtrykkes syntaxin og SNAP-25 sammen med et VAMP2-fragment (mangler det N-terminale område; kaldet "ΔN-VAMP2") i en struktur kaldet "ΔN-komplekset" og blandes derefter med VAMP2 i fuld længde efter DNA-håndtagsbinding for at danne fulde komplekser.

  1. Forbered plasmider indeholdende cDNA til ekspression af SNARE-proteiner (DNA-sekvenser for alle plasmider er angivet i materialetabellen).
    1. Forbered 6×His-tagget VAMP2, der mangler transmembrandomænet (2-97; L32C/I97C for disulfidforbindelser) klonet til en pET28a-vektor.
    2. Forbered syntaxin-1A, der mangler Habc og transmembrandomænet (191-267, I202C / I266C substitutioner for disulfidbindinger) klonet sammen med 6×His-tagged ΔN-VAMP2 (49-96) til en pETDuet-1 vektor.
    3. Forbered SNAP-25 isoform b i fuld længde (2-206, alle C til A) klonet til en pET28a-vektor. Dette vil blive brugt til fremstilling af ΔN-komplekser.
    4. Forbered den 6×his-mærkede SNAP-25 isoform b i fuld længde (1-206, alle C til A) klonet til en pET28a-vektor til direkte tilsætning til MT-analysebufferen for at samle SNARE-komplekserne igen efter udfoldning.
  2. Forbered to rør Rosetta (DE3) E. coli-celler. Transformér en gruppe med VAMP2-plasmider (fra trin 4.1.1), en med både syntaxin-1A/ΔN-VAMP2 og umærkede SNAP-25-plasmider (fra trin 4.1.2 og 4.1.3) til ekspression af ΔN-komplekset og den anden med His-mærkede SNAP-25-plasmider (fra trin 4.1.4).
  3. Overfør de transformerede celler til Luria-Bertani bouillon (LB) med passende antibiotika (her kanamycin og chloramphenicol til VAMP2 og His-tagged SNAP-25; kanamycin, chloramphenicol og ampicillin til ΔN-kompleks). Vok dem ved 37 ° C i en rystende inkubator (220 o / min), indtil bouillonens optiske densitet (OD) når 0,7-0,9.
  4. Der tilsættes 1 mM isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) for at inducere proteinekspression og inkubere cellerne i 3-4 timer ved 37 °C i en rysteinkubator (220 omdr./min.).
  5. Pellet cellerne ned ved centrifugering af kulturen ved 4.500 × g i 15 minutter ved 4 °C.
  6. Forbered buffere til proteinrensning (se tabel 2).
  7. Suspender SNARE-ekspressive cellepellets i 40 ml iskold lysisbuffer og lys cellerne ved sonikering på is (15% amplitude, 5 s på og 5 s slukket, 30 min i alt).
  8. Lysatet centrifugeres ved 15.000 × g i 30 minutter ved 4 °C for at fjerne uopløselige materialer.
  9. Supernatanten ledes gennem en tyngdekraftssøjle fyldt med 1 ml Ni-NTA-harpiks. Harpiksen vaskes med vaskebuffer A, derefter med vaskebuffer B, og eluerer proteinerne med 10 ml elueringsbuffer.
  10. Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) og imidazol fjernes fra elueringsmidlet ved hjælp af en afsaltningskolonne (følg producentens anvisninger). Eluer prøven med PBS.
  11. Koncentrer proteinerne med centrifugalfiltre (10 kDa cutoff) til ~70 μM, mens proteinerne bevares i PBS (typisk giver 2 ml). Proteinkoncentrationen måles enten ved ultraviolet (UV) absorption ved 280 nm (A280) eller ved Bradford-assay.
  12. Forbered små alikvoter, lynfrys i flydende nitrogen og opbevar ved -80 °C indtil brug.
    BEMÆRK: Fulde SNARE-komplekser samles efter konjugering af ΔN-kompleks på et DNA-håndtag (se nedenfor).

5. Fastgørelse af DNA-håndtag

BEMÆRK: To 510 bp dsDNA-håndtag indeholdende primære amingrupper i den ene ende fremstilles først ved PCR, og amingrupperne omdannes derefter til maleimidgrupper ved hjælp af en bifunktionel tværbinding, SM (PEG) 2. De to håndtag er derefter kovalent forbundet med SNARE-komplekser via deres cysteingrupper til stedspecifik konjugering (figur 3B).

  1. Forbered primere.
    1. Forbered fremadrettede primere: Primer B (til forstærkning af håndtag B), der er 5′-biotinmærket til fastgørelse af glasoverflade og binder til λ-DNA; Primer Z (til forstærkning af håndtag Z), der er 5′-azidmærket til magnetisk perlefastgørelse og har samme sekvens som Primer B.
    2. Forbered en omvendt primer: Primer N (delt for håndtag B og håndtag Z), der er 5′-aminmærket til proteinkonjugering og binder til λ-DNA 510 bp væk fra den fremadgående primer.
  2. Opsæt og kør to sæt PCR-reaktioner (18 rør med 200 μL reaktion for hvert håndtag) med λ-DNA (skabelon), nTaq-polymerase og standard PCR-betingelser (se tabel 1). Rens produktet op med et PCR-oprydningssæt, og eluer hvert håndtag med 45 μL ultrarent vand. Brug en minimal mængde vand til at opnå høje koncentrationer af håndtag til en effektiv reaktion i senere trin.
  3. Mål DNA-koncentrationen med A260. Det typiske udbytte er ~650 μL ~2 μM opløsning for hvert håndtag. Hold små prøver adskilt til senere verifikation i agarosegelelektroforese.
  4. Reager hvert håndtag (1 μM i PBS) med 5 mM SM(PEG)2. Inkuber ved stuetemperatur med forsigtig rotation. Efter 1 time skal du bruge et DNA-rensningssæt til at fjerne ureageret SM(PEG)2. Eluer hvert håndtag med 250 μL PBS for at opnå ~2 μM-opløsninger.
  5. Opløsningerne af håndtag B og ΔN-kompleks blandes i et molært forhold på 1:16 (f.eks. 1 μM håndtag B og 16 μM ΔN-kompleks) i PBS og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur med omrøring. Hold en lille prøve adskilt for agarosegelelektroforese.
  6. Tilsæt en opløsning af VAMP2 i et 2,5 gange molært overskud over ΔN-komplekset, der blev anvendt i det foregående trin. Inkuber blandingen i yderligere 1 time ved stuetemperatur med omrøring. Fuld SNARE-komplekser samles i dette trin.
  7. Frie proteiner fjernes ved bufferbytning med frisk PBS og et centrifugalfilter (100 kDa cutoff): centrifuger ved 14.000 × g i 5 minutter ved 4 °C, gentag mindst 6x, og kør i 15 minutter til sidste centrifugering. Mål stigningen i A260/A280-forholdet for at overvåge fjernelsen af frie proteiner. Hold en lille prøve adskilt for agarosegelelektroforese.
  8. Tilsæt håndtag Z til opløsningen i et 15 gange molært overskud over håndtag B. Hold koncentrationen af håndtag Z mindst over 1 μM for at lette reaktionen. Blandingen inkuberes natten over ved 4 °C med omrøring.
  9. Intermediaterne (håndtag B og dets proteinkonjugater) og slutproduktet (SNARE-kompleks med to håndtag) kontrolleres ved agarosegelelektroforese (figur 3B, indsat) (se tabel 2).
    BEMÆRK: Hvis proteinerne er fastgjort til håndtag B, detekteres et mobilitetsskift. Især kan dannelsen af fulde SNARE-komplekser på DNA-håndtag bekræftes af deres resistens over for natriumdodecylsulfat (SDS), i modsætning til ΔN-komplekser, der adskilles i SDS og kun efterlader syntaxin bundet til DNA (sammenlign b og c i figur 3B).
  10. Forbered små alikvoter, lynfrys i flydende nitrogen og opbevar ved -80 °C indtil brug.
    BEMÆRK: Selvom den endelige opløsning indeholder ureagerede håndtag, vælges kun den ønskede konstruktion, der er dobbelt mærket med biotin og azid, under prøvesamlingen i en flowcelle.

6. Fremstilling af flowceller

BEMÆRK: Flowceller til MT-målinger er konstrueret af to glasdæksler, der er bundet sammen med dobbeltklæbende tape (figur 3C). En dæksel er belagt med en blanding af PEG og biotinyleret polyethylenglycol (PEG) for at undgå uspecifik binding og for at muliggøre specifik tethering af målmolekyler via biotin-NeutrAvidin-binding (figur 3D). Derefter infunderes opløsningerne af materialer til MT-eksperimenter sekventielt i en flowcelle ved hjælp af en sprøjtepumpe (figur 3C, D).

  1. Forbered to glasdæksler, en hver til toppen (24 mm × 50 mm, nr. 1,5 tykkelse) og bunden (24 mm × 60 mm, nr. 1,5 tykkelse) overflade. Rengør dækslerne ved sonikering i 1 M KOH i 30 min. Efter sonikering skylles dækslerne med destilleret vand og opbevares i vand indtil følgende trin.
  2. PEGylate bunddækslet efter offentliggjorte protokoller42,43. Brug N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylendiamin til silanisering og en 1:100 (ww) blanding af biotin-PEG-SVA og mPEG-SVA i 100 mM bicarbonatbuffer. Hold PEGylerede dæksler tørre ved -20 °C og opbevar dem i et par uger.
  3. På forsøgsdagen skal du tage PEGylated coverslips ud og føntørre dem med en nitrogenpistol. Undersøg dem visuelt for snavs for at sikre, at de er rene.
  4. For at fremstille prøvekanalerne skal du forberede ~2 mm brede strimler dobbeltklæbende tape og lægge fire strimler på et bunddæksel (PEGyleret overflade opad), parallelt med og adskilt fra hinanden med ~5 mm (figur 3C).
    BEMÆRK: På denne måde kan der oprettes tre 5 mm brede prøvekanaler i en enkelt flowcelle.
  5. Placer et topdæksel i midten af bunddækslet, så der er ~ 5 mm plads på de korte kanter til kanalindløb og udløb. Tryk forsigtigt på bagsiden af topdækslet med en pincet for at forsegle kanalerne ordentligt.
  6. For at lave et indløbsreservoir skal du trimme kanten af en 200 μL pipettespids. Skær ~10 mm ud af den bredere åbning for at give mulighed for at holde ~200 μL opløsning. Lav tre af dem til de tre flowkanaler. For at konfigurere udløbene skal du forberede tre sprøjtenåle, der passer til slangen til sprøjtepumpen.
  7. Lim reservoirerne og nålenavene på flowcellen med 5 min epoxy. Sørg for, at der dannes en komplet tætning for at undgå lækage, og at kanalerne ikke blokeres med overskydende lim. Lad det tørre i mindst 30 min.

7. Samling af perle-tether konstruktioner

BEMÆRK: Materialernes opløsninger til MT-forsøg, herunder dem til perle-tether-konstruktioner, indføres sekventielt i flowceller ved hjælp af en sprøjtepumpe (figur 3C, D).

  1. Forbered magnetiske perler. Der udtages 5 mg M270-epoxyperler fra en stamopløsning (~3,3 × 108 perler i 167,5 μL dimethylformamid), og solvensen erstattes med fosfatbuffer (se tabel 2) ved magnetisk adskillelse af perlerne.
  2. Forbered perlerne ved ~ 1,1 × 109 perler ml-1 i en fosfatbuffer med 1 M ammoniumsulfat og reaktion dem med 2 mM dibenzocyclooctyne (DBCO) - NH2. Inkuber blandingen i 3 timer på en roterende mixer ved stuetemperatur. Efter reaktionen vaskes perlerne 3x med frisk fosfatbuffer for at fjerne ureagerede molekyler.
    BEMÆRK: De vaskede perler kan opbevares uden ekstra rotation ved 4 °C i flere uger før brug.
  3. Tilslut en nål på flowcellekanaludgangen til sprøjtepumpen med polyethylenslange. Ligevægt kanalerne med PBS.
  4. Følgende opløsninger indføres sekventielt i kanalen ved at suge med pumpen: NeutrAvidin, målkonstruktioner (DNA-hårnåle eller SNARE-komplekser med DNA-håndtag), referencepolystyrenperler og DBCO-coatede magnetiske perler. Før brug hvirvel perleopløsningerne grundigt for at sprede potentielle perleaggregater.
  5. Vask ubundne perler væk, mens du påfører 0,1 pN kraft.
    BEMÆRK: Anvendelsen af en lille opadgående kraft letter fjernelsen af ubundne perler og hjælper med at undgå brud på specifikt bundne perle-tether-konstruktioner.
  6. Til eksperimenter med SNARE-komplekser indbefatter 1,5 μM SNAP-25 i den endelige buffer.
    BEMÆRK: De frie SNAP-25-molekyler kan binde SNARE-komplekser igen efter udfoldning og tillade gentagne målinger på et enkelt kompleks.

8. Identifikation af målkonstruktioner

  1. På overfladen af en flowcellekanal skal du søge efter de magnetiske perler, der er bundet af enkelte molekyler i målkonstruktionen. Sørg for, at der er en referenceperle i nærheden.
  2. Drej en kandidatperle og kontroller, at den drejer frit. Hvis perlen er bundet af flere molekyler, udviser den en begrænset bevægelse.
  3. Drej perlen i et par komplette drejninger og find ud af rotationsradius (denne funktion er implementeret i den medfølgende software). Vælg helst en perle med en lille rotationsradius.
    BEMÆRK: Denne radius angiver, hvor meget perlen er forskudt fra tøjreaksen, som bestemmes tilfældigt under perle-tether-samlingen30,31. I alle eksperimenter lindrer minimal off-centrering af en perle mange artefakter, der er forbundet med det høje perleradius til tether forlængelsesforhold, vi bruger.
  4. Forøg kraften fra 0 til 5 pN for at identificere gode enkeltbundne perler. Se efter en stor ændring i diffraktionsmønsteret for en perle som følge af strækningen af en 1 kbp tether (eller de tilsvarende to 510 bp håndtag). Hvis diffraktionsmønsteret ikke ændres væsentligt, sænkes kraften til nul og scannes efter en anden kandidatperle.
    BEMÆRK: ~ 300 nm løft af en perle kan let bemærkes fra de rå billeder uden faktisk at starte sporingsprocessen.

9. Perlesporing til forlængelsesmålinger

BEMÆRK: Sporing af perler udføres ved at analysere perlebilleder i realtid i LabVIEW-softwaren, der følger med denne artikel. Sporingsmetoden og dens varianter er blevet brugt i de fleste af de konventionelle MT-systemer og er forklaret i tidligere litteratur 2,5,7,26. Ved at måle positionen af en magnetisk perle i forhold til en fast referenceperle (dvs. differentiel sporing) bliver positionsmålingerne ekstremt robuste over for en ekstern forstyrrelse.

  1. Når en korrekt magnetisk perle er placeret sammen med en referenceperle, skal du klikke på knappen Kalibrer for at begynde at forberede sig på perlesporing.
  2. Klik på perlerne i billedet for at definere perlernes placering. Billederne beskæres derefter til interesseområder (ROI'er) (f.eks. 150 x 150 pixels for en 3 μm perle) omkring perlerne og analyseres derefter yderligere for at udtrække de præcise perlekoordinater.
  3. Vent på, at magnetrotationen er afsluttet. Denne proces registrerer x- og y-koordinaterne for perlen (ved at beregne 2D krydskorrelation 44 eller ved at bruge radial symmetri45 af perlebillederne med sammenlignelig ydeevne), mens magneterne roteres for at dokumentere den off-centrerede fastgørelse af perlen31.
  4. For at spore i z-retningen skal du vente på, at softwaren genererer en opslagstabel med diffraktionsbilleder af perlerne i forskellige afstande fra brændplanet. Dette udføres ved at træde objektivlinsen med en piezoscanner i lige store trin og optage svingende gennemsnitlige perlebilleder på hver position. Derefter bestemmes z-koordinaterne for perlerne i faktiske eksperimenter ved at sammenligne perlebillederne i realtid med opslagstabellen med interpolation7.
  5. Når genereringen af opslagstabellen er færdig, skal du aktivere sporing og autofokus (tryk på Spor ? og AF? Knapper), og klik på knappen Erhverv for at begynde at registrere perlepositioner.
    BEMÆRK: Autofokus er valgfrit, men anbefales at korrigere for faseforskydningen i z under anskaffelsen.

10. Tving ansøgningsordninger

  1. Force-rampe eksperimenter: For at verificere konstruktionens kraftforlængelsesforhold skal du anvende en kraftrampe op og ned med en konstant belastningshastighed (± 1,0 pN s−1) (figur 4A). Anvend f.eks. tre runder af en pN-cyklus på 0-20-0 for at kontrollere konstruktionens samlede længde og håndtagenes kraftforlængelseskurve.
  2. Ved at specificere tetherparametrene i softwaren skal du overlejre en WLC-kraftforlængelseskurve oven på de målte data og bestemme, om målperlen er bundet af en ægte prøvekonstruktion med korrekte DNA-håndtag. Brug konstruktionens kendte konturlængde (f.eks. ~340 nm for 1 kbp dsDNA) og WLC-persistenslængde (30-45 nm for kort dsDNA31) som udgangspunkt. Anvend om nødvendigt udvidelseskorrektionsmetoden beskrevet i trin 2.11.
  3. Hvis konstruktionen verificeres, skal du undersøge kraftforlængelsesresponsen i detaljer for at se efter yderligere forlængelse som følge af målmolekylerne-hårnåle eller SNARE-komplekser.
  4. Eksperimenter med konstant kraft: Den påførte kraft varierer gradvist i diskrete trin for at undersøge målmolekylernes kraftfølsomhed (figur 4B).
    BEMÆRK: MT'er muliggør enkle og effektive konstantkrafteksperimenter, fordi den påførte kraft holdes konstant, når magneterne holdes stille.
    1. For DNA-hårnåle skal du anvende 4-8 pN kraft med 0,2-0,5 pN-trin og måle perlepositionen for ~ 10 s ved hvert kraftniveau.
    2. For SNARE-komplekser skal du anvende 14-16 pN kraft med 0,1-0,2 pN-trin og måle perlepositionen for ~ 10 s på hvert kraftniveau.
  5. Force-jump eksperimenter: Overhold overgangsbegivenhederne i SNARE-komplekser.
    BEMÆRK: Force-jump-eksperimenter, som konstantkrafteksperimenter, involverer ændringer i kraftniveauer. Imidlertid anvender kraftspring mere pludselige ændringer i den påførte kraft, hvilket muliggør overvågning af kraftudløste begivenheder i de undersøgte molekyler, såsom et pludseligt brud på proteinkomplekser. For eksempel, da SNARE-komplekser udviser strukturel hysterese i kraftcykling23, er det informativt at udføre kraftspringeksperimenter og måle latenstiden til overgang (figur 4C).
    1. Unzipping: Afskalning af et VAMP2-molekyle fra et intakt, ternært SNARE-kompleks, hvilket efterlader et binært kompleks af syntaxin-1A og SNAP-25.
    2. Genoppakning: Lynlåsning af det udpakkede VAMP2-molekyle for at regenerere et intakt SNARE-kompleks.
      1. Udfolder sig: Fuld demontering af et SNARE-kompleks ledsaget af fuldstændig dissociation af SNAP-25. Kun VAMP2- og syntaxinmolekyler forbliver i konstruktionen efter udfoldning.
      2. Foldning igen: Regenerering af et SNARE-kompleks ved binding af et frit SNAP-25-molekyle fra bufferen.
  6. Ved 2 pN induceres samlingen af et intakt SNARE-kompleks ved at vente (~ 30 s) på foreningen af et frit SNAP25-molekyle. Et pludseligt fald i forlængelse observeres ved dannelsen af et SNARE-kompleks.
  7. For at observere udpakningshændelser skal du vente et par sekunder ved 10-12 pN og derefter flytte til 14-15 pN brat med den maksimale motorhastighed, der er mulig. Afhængigt af målkraften vil SNARE-komplekset udvise enten en reversibel overgang mellem delvist udpakkede mellemprodukter (som i konstantkrafteksperimenter) eller et ~ 25 nm spring til en højere, udpakket tilstand efter en tilfældig ventetid (eller latenstid).
  8. For at observere rezipping-hændelser skal du sænke kraften til 10-12 pN umiddelbart efter udpakning er observeret. Igen udviser SNARE-komplekset en stokastisk overgang til den lavere, lynlåstilstand efter en tilfældig latenstid. Hvis udfoldning har fundet sted efter udpakning, vil komplekset ikke kunne zippes, da et SNAP-25-molekyle mangler.
  9. For at observere udfoldelsesbegivenheder skal du vente i længere tid efter udpakning er observeret for at opdage en yderligere stigning i forlængelse (~ 2 nm).

11. Analyse af data

BEMÆRK: De typer analyser, man kan udføre med MT-data, afhænger af målsystemet. Der er dog almindelige tilgange til at udtrække nyttige oplysninger fra de respektive eksperimenter, der er beskrevet i figur 4. Alle analyser udføres med MATLAB (R2021a) ved hjælp af de brugerdefinerede koder, der følger med denne artikel. Disse koder genererer afbildninger ved hjælp af de samme data, som præsenteres i denne artikel. Bemærk, at mens rådata fra 100 Hz-sporing blev taget direkte til analyse, blev data fra 1,2 kHz-sporing typisk medianfiltreret (med et fempunkts glidende vindue) før analyse for at reducere støj (undtagen støjanalyse).

  1. Force-rampe eksperimenter: Analyser kraftforlængelsesforholdet (f.eks. Elasticitet af polymerer) og overfør kraften til at udtrække information om nanomekaniske egenskaber.
  2. Eksperimenter med konstant kraft: Analyser tilstandspopulationer og opholdstid (eller overgangshastighed) som en funktion af kraft til at udtrække strukturelle (f.eks. Regioner involveret i overgang), termodynamiske (f.eks. Fri energiforskel) og kinetiske (f.eks. Energibarriere) parametre for konformationsændringerne.
  3. Force-jump eksperimenter: Analyser brudkinetik (f.eks. protein-proteininteraktioner og receptor-ligandbinding) eller levetiden for forbigående mellemprodukter (f.eks. udfoldning af biomolekyler) for at ekstrahere stabiliteten af målmolekyler og deres tilstande.
  4. Som repræsentative applikationer skal du analysere prøvedataene for DNA-hårnåle og SNARE-komplekser:
    1. To-tilstandsovergange af en DNA-hårnål: udpakningskraft, åbningsafstand, kraftafhængighed af befolkningsskift og tilstandstildeling og overgangshastighedsmålinger med en skjult Markov-model (HMM) (MATLAB-koder leveres).
    2. Konformationelle ændringer af SNARE-komplekser: udpakningskraft, kraftafhængighed af mellemtilstande og udpakning af latenstid, hysterese ved rezipping og udfoldning / omfoldningsadfærd.
      BEMÆRK: Force-extension modeller for DNA-håndtag, DNA-hårnåle og SNARE komplekse konformationer er givet i tidligere referencer14,31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kraftkalibrering
Resultaterne fra de to kraftmålingsmetoder (perlernes laterale forskydningsvarians og effektspektrumanalyse) adskilte sig med 0-2 pN (figur 2G). Ifølge resultaterne i figur 2F kan vi pålideligt nå op til 30 pN med almindelige neodymmagneter.

To-tilstands overgange af en 8 bp DNA-hårnål
Vi undersøgte først nanomekanikken i en kort DNA-hårnål (figur 5). DNA-hårnåle er i vid udstrækning blevet karakteriseret ved konventionel enkeltmolekylekraftspektroskopi, og derfor er der en stor referencekilde at sammenligne med. Udpakning af en kort hårnål er normalt reversibel, så dens rezipping-begivenheder observeres også i det samme kraftområde, hvor udpakning forekommer (figur 5A). Ved at anvende en kraftrampe mellem 0 pN og 20 pN (figur 5B) blev den kraftinducerede forlængelse af hårnålekonstruktionen verificeret til at følge en WLC-model, som udelukkende kan tilskrives elasticiteten af DNA-håndtag (figur 5C, "lukket"). Ved omkring 6 pN viste konstruktionen yderligere udsving i forlængelse, forbundet med reversibel udpakning af hårnålestrukturen (figur 5C, indsats). Endelig, ved ~ 8 pN, forsvandt overgangen til sidst, og forlængelsen satte sig på den øvre tilstand, der blev yderligere forlænget med ~ 7 nm. Derfor klikkede den målte kraftforlængelsesprofil over 8 pN på en ny modelkurve (figur 5C, "åben"), der inkluderer længden af det enkeltstrengede område af den udpakkede hårnål.

Vi udførte derefter konstantkrafteksperimenter for systematisk at undersøge hårnåleovergangen. Perlepositionen blev målt i kraftområdet 4-8 pN med 0,5 pN-trin for ~ 10 s på hvert niveau; Derefter blev forlængelsesværdierne indsamlet og analyseret for at måle deres ligevægtsfordeling som en funktion af kraft. Resultaterne fra 100 Hz sporing antydede et gradvist skift mod en mere udvidet tilstand i dette kraftregime (figur 5D), men de opnåede histogrammer for forlængelsen var ikke klare nok til at løse forskellige populationer (figur 5E). I skarp kontrast, når de samme eksperimenter blev udført ved 1,2 kHz (figur 5F), afslørede højhastighedsbanerne for forlængelsesændringer efter blid filtrering (fempunkts medianfilter) to forskellige populationer, der er godt beskrevet ved en blanding af to gaussiske fordelinger (figur 5G). Adskillelsen mellem de to populationer, der angiver hårnålens åbningsafstand, forblev uændret ved ~ 7 nm i udpakningskraftregimet (figur 5H). Afvigelsen i ekstremiteterne (4 pN og 8 pN) skyldtes den unøjagtige lokalisering af en tilstand på grund af dens knaphed.

Dataene afslørede, at midtkraften til udpakning af overgang (den kraft, hvormed de lukkede og åbne populationer bliver ens) F1/2 var ~ 6 pN, og den øvre, åbne tilstand blev gradvist dominerende, da vi øgede kraften over 4-8 pN (figur 5I). Når de blev udstyret med en Boltzmann-relation for den åbne sandsynlighed, Equation 10blev de nøjagtige værdier af F 1/2 = 5,9 pN og Δz = 7,1 nm opnået i overensstemmelse med ovenstående observationer. Det skal dog bemærkes, at åbningskraften opnået fra en enkelt konstruktion muligvis ikke er nøjagtig på grund af perle-til-perle-variabiliteten i kraftgenerering, som blev målt til at være ~ 4% for de kommercielle M270-perler31. Da stængellængden (8 bp) er kort, kan grund-sandhedsåbningskraften for andre 8 bp hårnåle med forskellig nukleotidsammensætning variere meget20. Endelig anvendte vi HMM på forlængelsessporene for at kortlægge tilstandsovergangen og målte derved overgangshastighederne (figur 5F, rødt spor). Både udpaknings- og rezipping-hastigheder varierede eksponentielt med anvendt kraft (figur 5J) på en sådan måde, at kraften fremmer udpakning og hæmmer rezipping. Om nødvendigt kan man yderligere bruge det klassiske Bell-udtryk til at udtrække energilandskabets parametre (f.eks. barrierehøjde og afstand)46.

Karakterisering af termiske udsving i forlængelsesmålinger
Ved hjælp af hårnålekonstruktionen profilerede vi den kraftafhængige støj i forlængelsesmålinger. Først blev de termiske udsving i en tøjret perle beregnet ud fra ligninger ved hjælp af parametrene (f.eks. perleradius, tøjrelængde), der var passende for disse eksperimenter2,5 (figur 5K, faste kurver). Vi plottede også standardafvigelsen for forlængelse Equation 11 målt fra tidssporet af en hårnålekonstruktion ved forskellige kraftniveauer. Da dette molekyle havde et hårnålemotiv, blev dets respons under 4 pN (lukket tilstand) brugt til måling af indre støj, mens hårnåledynamikken blev detekteret ~ 6 pN som forventet og tjente som en kontrol. Den kraftafhængige undertrykkelse af udsving blev også observeret, efter at hårnålen blev for det meste åben (sammenlign 8 pN vs. 4 pN). Sammenligning med den termiske grænse indikerer, at der er plads til forbedring, men denne resterende støj er ofte forbundet med rotationsudsving i en magnetisk perle30, som er tilfældig og udfordrende at løse. For mere systematisk analyse af den brownske støj over observationstid anvendes beregning af Allan-afvigelsen ofte32,33. Vi beregnede Allan-variansen for hårnålenåledataene vist i figur 5F, svarende til 5 kbp-målingerne i figur 2C. Resultaterne i figur 5L viser, at vi i det mellemliggende kraftområde på 4-8 pN opnåede 2-3 nm Allan-afvigelse ved den maksimale hastighed (1,2 kHz), og denne værdi faldt til under 1 nm for observationstiden (τ) længere end 0,1 s. Interessant nok opstod hårnåledynamikken omkring 5-7 pN for ~ 0,01 s (figur 5L, indsat), i overensstemmelse med den målte overgangskraft og hastigheder i figur 5I, J.

Konformationelle ændringer af neuronale SNARE-komplekser
Vi anvendte derefter neuronale SNARE-komplekser som proteinmodel og undersøgte deres kraftafhængige mekaniske egenskaber. I modsætning til hårnålekonstruktionen blev enkelte SNARE-komplekser holdt mellem to 510 bp dsDNA-håndtag (figur 6A). Det skal bemærkes, at terminerne for syntaxin-1A og VAMP2, distale fra håndtagene, blev krydsbundet af en disulfidbinding mellem kunstige cysteinrester for at undgå brud og muliggøre flere pincetrunder af en given konstruktion.

Vi anvendte først en kraftrampe, både med stigende og faldende kraftniveauer (± 1 pN s−1) for henholdsvis at strække og slappe af målkonstruktionen. I lav- til mellemkraftregimet (0-10 pN) opførte de to håndtag sig uafhængigt som WLC-polymerer, hvilket generelt formede kraftforlængelseskurven, der ikke kunne skelnes fra 1 kbp dsDNA (figur 6B, sort). Men når kraften blev øget til over 10 pN, afveg udvidelsesværdierne betydeligt fra WLC-modellen, hvilket indikerer, at det indlejrede SNARE-kompleks viste en yderligere stigning i forlængelse. Mere specifikt kan forlængelsesforøgelsen opsummeres i tre forskellige faser: (a) en lille, gradvis stigning i 11-13 pN, (b) hurtige og større (~ 10 nm) udsving i 14-16 pN og (c) den endelige, irreversible udpakning på ca. ~ 20 nm. Når kraften blev sænket for at slappe af konstruktionen, knækkede forlængelsen enten tilbage til den oprindelige kraftforlængelseskurve ved en lavere kraft (<15 pN) eller fulgte en ny modelkurve med en større forlængelse (figur 6B, blå). Den totale udvidelse blev til sidst genoprettet til de lavere værdier (fra blå til sort i figur 6B) under 5 pN, og de samme kraftrampecyklusser kunne anvendes, hvilket viste en lignende tendens.

Fra molekylmodellen af SNARE-kompleks konformation kan vi præcist beregne de mulige forlængelsesværdier for potentielle mellemprodukter (figur 6C). Hvis man antager WLC-adfærden for de uoprullede polypeptider, kan forlængelserne desuden estimeres som en funktion af kraft, hvilket genererer de fulde kraftforlængelsesmodeller for de forskellige konformationer (figur 6B, stiplede linjer). Med disse værdier som reference fortolkede vi ovenstående overgange som følger 14,23: (a) et gradvist skift fra tilstanden med fuld lynlås (FZ) til linkeråben tilstand (LO) i 11-13 pN, hvilket indebærer åbningen af linkerregionerne i syntaxin-1A og VAMP2; b) hurtig overgang mellem LO og halvlynlåstilstanden (HZ), hvilket indebærer åbning af et SNARE-kompleks op til det nulte ioniske lag og (c) den endelige overgang til enten den udpakkede (UZ) eller den udfoldede tilstand (UF), hvilket indebærer en fuldstændig optrævling af VAMP2 fra resten af komplekset. UZ-tilstanden er forskellig fra UF, idet det associerede molekyle af SNAP-25 stadig er bundet til syntaxin-1A og opretholder et binært kompleks. I tilfælde af UF (uden SNAP-25) kan det fulde SNARE-kompleks kun regenereres, når et frit SNAP-25-molekyle fra opløsningen rekombineres, hvor sænkning af den påførte kraft for at tillade en sådan genbinding er kritisk.

For at verificere konformationsændringerne af SNARE-komplekser på en mere systematisk måde udførte vi derefter kraftspringeksperimenter i kraftregimet, hvor konformationelle udsving ofte blev observeret ved 14-15 pN (figur 6D). Typisk startede vi først med at måle perlepositionen ved 10 pN og kontrollerede for den stabile forlængelse, hvilket indikerer fraværet af SNARE-relaterede ændringer. Derefter blev kraftniveauet brat øget til 14-15 pN, hvor forlængelsen blev overvåget, indtil der opstod udpakning, hvis nogen. Endelig blev kraften reduceret tilbage til 10 pN for at kontrollere for enhver vedvarende stigning i forlængelse forbundet med udfoldning. Ved 14 pN forblev udvidelsessporene for det meste i LO-tilstanden, med lejlighedsvise pigge til HZ-tilstanden. Det skal bemærkes, at disse korte udflugter til HZ-tilstanden sandsynligvis vil blive savnet i 100 Hz sporing, som gennemsnit og nedprøver perlebilleder med en faktor på 12. På trods af de klare og hyppige besøg i HZ-staten undlod komplekset at foretage en fuldstændig overgang til UZ-tilstanden (figur 6E), hvilket tyder på, at den eksterne kraft ikke var stærk nok til at overvinde energibarrieren for udpakning. I modsætning hertil gjorde selv en lille stigning i kraft (til 14,3 pN) overgangen meget effektiv, så UZ-tilstanden blev nået for det meste inden for få sekunder (figur 6F). Konsekvent blev udpakningen afsluttet for det meste inden for 1 s, da vi påførte 14,5 pN på komplekset (figur 6G, H). Især udpakning ved højere kræfter førte ofte til fuldstændig udfoldelse af hele komplekset (ledsaget af fjernelse af SNAP-25), som det fremgår af den lille yderligere stigning i forlængelse over UZ (figur 6H) og af den omfoldende signatur observeret ved 2 pN (figur 6I). Samlet set viser disse data den klassiske slip-bond-adfærd47 for udfoldelsen af SNARE-komplekser, i overensstemmelse med tidligere rapporter 14,23,48.

Figure 1
Figur 1: Opsætning af instrument. Skematisk (A) og fotografi (B) af en MT-opsætning med høj hastighed. Magneter styret af en lineær og en rotationsmotor er placeret over prøvetrinnet i et omvendt mikroskop udstyret med en 100x olienedsænkningslinse og et højhastigheds CMOS-kamera. Lysstrålen fra en superluminescerende diode passerer gennem magneterne og belyser feltet. Indsat: Repræsentative diffraktionsbilleder af perler placeret i forskellige afstande fra brændplanet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Kraftkalibrering. (A) Skematisk oversigt over en kraftkalibreringsprøve. Størrelsen af den kraft, der udøves af et antiparallelt magnetpar med 1 mm adskillelse, måles som en funktion af magnetafstanden d fra forskydningerne af en magnetisk perle (M270) bundet af et 5 kbp dsDNA-fragment. B) Repræsentative data fra kraftkalibreringsproceduren. Farvede pile angiver områder, der er udvidet i (D) (matchende farver). (C) Allan-afvigelse for z-positionen af en 5 kbp tøjret perle målt med 15-20 pN. Kurver for magnetperlens z-koordinater før (blå) og efter (rød) fratrukket referenceperlens position vises. (D) Repræsentative tidsserier for y-positionen målt ved den angivne magnetafstand d. Det tilsvarende histogram for y-koordinatfordelingen vises til højre med en gaussisk pasform (rød). E) Repræsentativ PSD ud fra dataene i litra D). De kraftværdier, der opnås ved at montere en model (rød) på de respektive PSD'er, er angivet øverst. (F) Kalibrering af magnetisk kraft som funktion af magnetafstanden. Kræfterne blev målt enten fra variansen (venstre) eller fra PSD-metoden (højre). Pasformen (rød) angiver en dobbelteksponentiel model med den kommenterede ligning. (G) Forskel i den målte kraft opnået ved varians og PSD. Der beregnes en rød kurve for de tilpasninger, der er vist i (F). (H,I) Verifikation af kraftforlængelsesforholdet mellem 5 kbp-kalibreringskonstruktionen. De gennemsnitlige forlængelsesværdier ved forskellige kraftniveauer (målt fra varians) blev brugt enten direkte (H) eller efter korrektion for perlehøjdeforskydningen (I) på grund af hældningen af en off-centreret perle31. Kraftforlængelsesdataene for n = 5 molekyler blev monteret af en udvidelig WLC-model, og de tilpassede parametre (persistenslængde Lp og strækmodul Ko) er kommenteret øverst (gennemsnit ± s.d.). Forkortelse: PSD = effektspektraltæthed. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Forberedelse af prøven . (A) Fremstilling af 8 bp DNA-hårnålekonstruktioner ved PCR-amplifikation af en 1 kbp-region af λ-DNA. (B) Fremstilling af SNARE komplekse konstruktioner med to 510 bp DNA-håndtag. Indsat: Verifikation af DNA-håndtag og deres binding til proteiner ved agarosegelelektroforese (2% gel). Pile angiver mobilitetsskiftet (farvekodet) af produktarter: frie 510 bp håndtag (magenta); Håndtag B fastgjort til syntaxin (rød), til ΔN-kompleks (grøn) og til SNARE-kompleks (blå); og det sidste to-håndtagede SNARE-kompleks (grøn). Tilføjelsen af SDS forstyrrer ΔN-komplekserne (til stede i b), men ikke de fulde SNARE-komplekser dannet af VAMP2 i fuld længde (til stede i c). C) Design og fotografi af en flowcelle til MT-forsøg. D) Skematisk oversigt over sekventiel indførelse af prøveopløsninger i en flowcellekanal. Forkortelse: MT = magnetisk pincet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Typer af repræsentative eksperimenter. (A-C) Skemaer over kraftrampe-, kraftklemme- og kraftspringeksperimenter (øverst) med repræsentative tidsspor af forlængelse fra de tilsvarende målinger (midten). De typer analyser, der kan udføres, vises nederst. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: To-tilstands overgang af en 8 bp DNA-hårnål. (A) Skematisk oversigt over MT-eksperimenter på en DNA-hårnål med den forventede udpakning og rezipping-overgang. (B) Repræsentativt spor af konstruktionsforlængelse fra kraftrampeeksperimenter med stigende (~ 0,25 pN s-1) kraftniveauer. C) Repræsentativ kraftforlængelseskurve rekonstrueret ud fra dataene i (B). Gule kurver angiver WLC-modeller for hårnålekonstruktionen med hårnålen i den lukkede (faste) og åbne (stiplede) konformation. (D) Repræsentativt forlængelsesspor fra konstantkrafteksperimenter med stigende kraftniveauer, målt ved 100 Hz. (E) Histogrammer af udvidelsesdata i (D). (F,G) Resultater for de samme eksperimenter i (D) og (E), men med 1,2 kHz sporing. Den rå 1,2 kHz tidsserie blev udjævnet ved at anvende et fempunkts medianfilter. Røde spor i den udvidede visning af (F) blev hentet fra en HMM. Røde linjer i (G) angiver placeringen af gaussiske befolkninger. (H) Afstanden mellem de to populationer i (G). (I) Sandsynlighed i åben tilstand som funktion af den anvendte kraft. Den røde kurve er en monteret Boltzmann-model (Equation 10 ) med mellemkraften F1/2 = 5,9 pN. (J) Udpakning og rezipping overgangshastigheder målt fra HMM-resultaterne. Faste linjer indikerer eksponentiel afhængighed af kraft. (K) Termiske udsving i forlængelsesmålinger. Standardafvigelser af hårnåleforlængelsesdata (uden filtrering) vises som en funktion af kraft. Den termiske opløsningsgrænse, der repræsenterer den teoretiske størrelse af termiske udsving, blev estimeret fra eq. 9 i arbejdet af Choi et al.2 for en 2,8 μm perle med en 1 kbp tøjring. (L) Allan-afvigelser beregnet ud fra 1,2 kHz hårnålenåledata i (F) (uden filtrering). Indsats viser Allan-afvigelsen ved 0,01 s som funktion af kraft, hvilket viser en gradvis stigning og fald i udsving på grund af hårnåledynamikken. Forkortelse: MT = magnetisk pincet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Konformationelle ændringer af neuronale SNARE-komplekser. (A) Skematisk oversigt over MT-eksperimenter på SNARE-komplekser. (B) Repræsentative kraftforlængelseskurver for SNARE-konstruktionen. Sorte og blå spor (100 Hz) blev opnået fra stræknings- og afslapningsperioder i henholdsvis kraftrampeforsøg. Stiplede linjer angiver forlængelsesmodeller, der tager højde for de forskellige konformationer af SNARE-komplekser vist i (C). (C) Molekylære modeller af SNARE-komplekse konformationer med de tilsvarende beregnede udvidelser. Værdierne blev estimeret ud fra de geometriske parametre for spiralbundter og en WLC-model for polypeptidregionen14. (D) Skematisk oversigt over force-jump eksperimenter til undersøgelse af SNARE komplekse konformationer. (E-H) Repræsentative forlængelsesspor fra kraftspringseksperimenter udført på de angivne kraftniveauer. I (E) blev udpakning ikke observeret. I (F) og (G) blev der observeret udpakning efterfulgt af rezipping ved 10 pN. I (H) blev udpakningen efterfulgt af en yderligere udfoldelsesbegivenhed. (I) Omfoldning af et SNARE-kompleks ved 2 pN. En klar reduktion i forlængelse fra UF til FZ-tilstand blev observeret ved 5 pN. Forkortelse: MT = magnetisk pincet. Klik her for at se en større version af denne figur.

PCR-indstilling Betingelse
Materialer 1,25 μg/ml λ-DNA (skabelon), 1 μM fremadgående og omvendte primere, 0,2 mM dNTP, 0,05 U/μL nTaq, 1x nTaq buffer
Denaturering 95 °C i 30 s
Udglødning Kalibreringskonstruktion: 55 °C i 30 s
DNA-hårnål: 57 °C i 30 s
DNA-håndtag: 50 °C i 30 s
Forlængelse DNA-hårnål og håndtag: 72 °C i 1 min
Kalibreringskonstruktion: 72 °C i 5 min
Cykle 30–34
Agarose gel elektroforese
Gel 2% agarose i 0,5x tris-borat-EDTA (TBE, pH 8,3) indeholdende 1x SYBR Safe
Løb Fuld effekt (108 V gns.) på Mupid-2plus (Advance), 40-50 min

Tabel 1: Betingelser for PCR-reaktioner og agarosegelelektroforese. Reaktionsparametre for PCR af DNA-konstruktioner, herunder 5 kbp dsDNA til kraftkalibrering, DNA-hårnålekonstruktion og DNA-håndtag til fastgørelse af SNARE'er. Primersekvenser er angivet i materialetabellen.

Buffer til proteinrensning Sammensætning
Vask buffer A 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 500 mM NaCl, 7 mM β-mercaptoethanol (BME), 10% glycerol og 20 mM imidazol
Vask buffer B 50 mM HEPES (pH 7,2), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 10% glycerol og 20 mM imidazol
Lysis Buffer Wash Buffer A suppleret med 1% Triton X-100, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) og 1x proteasehæmmercocktail
Elueringsbuffer Vaskebuffer B suppleret med 400 mM imidazol
Fosfatbufret saltvand (PBS) 81 mM natriumphosphatdibasisk (Na2HPO4), 19 mM monobasisk natriumphosphat (NaH 2 PO4) (pH7,2), 150 mM NaCl
fosfatbuffer 81 mM Na 2 HPO4, 19 mM NaH2PO 4, pH7,4

Tabel 2: Buffere og deres sammensætning. Sammensætning af buffere anvendt til proteinrensning.

Supplerende figur S1: Tegning af en magnetholder. Dimensioner på en akrylholder til to 10 mm x 10 mm x 12 mm magneter med et mellemrum på 1 mm vises. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 1: En zip-fil, der indeholder MATLAB-koder. MATLAB-scripts til analyse af data produceret af højhastigheds magnetisk pinceteksperimenter, herunder kraftkalibrering, hårnål og SNARE-kompleks analyse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: LabVIEW-softwarepakke zip-fil. En komplet pakke med LabVIEW-koder til betjening af en højhastigheds magnetisk pincetopsætning og hentning af data med den. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette arbejde introducerede vi en enkeltmolekyle kraftspektroskopiopsætning, der kan observere strukturelle ændringer af biomolekyler med høj rumlig tidsmæssig præcision. Det anvendte højhastigheds CMOS-kamera får 1.200 billeder s-1 ved 1.280 x 1.024 opløsning, hvilket muliggør 1.2 kHz perlesporing. Imidlertid er målehastigheden i øjeblikket begrænset af perlesporingssoftwaren, så ROI reduceres typisk til mindre områder i højhastighedsmålinger. SLD'ens høje effekt giver en lys belysning, der er afgørende for hurtig perlebilleddannelse op til et par kHz båndbredde. Desuden genererer strålens rumlige kohærens koncentriske diffraktionsringe med høj kontrast omkring perlerne (figur 1A, indsats), som muliggør præcis bestemmelse af perlepositionen baseret på symmetri.

Den magnetiske kraft, der udøves på en perle-tether konstruktion, kan bestemmes ved at måle de brune fluktuationer af den tøjrede perle35,37,38. Da kraftanalyse i realtid er beregningstung, måles den anvendte kraft typisk på forhånd ved hjælp af en referencekonstruktion. For eksempel er de magnetiske perler, der skal bruges, bundet af lange (>5 kbp) dsDNA-fragmenter, og de tilsvarende termiske udsving i perleposition måles som en funktion af magnetafstanden (figur 2A). Kraftkalibreringen udføres typisk én gang efter opsætningen er opbygget, men det er ikke nødvendigt at gentage den regelmæssigt, medmindre opsætningen ændres, f.eks. ved udskiftning af magneterne. Da den karakteristiske frekvens af perleudsving stiger med den påførte kraft2, er en højhastighedsopsætning særlig nyttig til at fange den hurtige dynamik i et højkraftregime og måle kraften nøjagtigt. Kraftestimering fra varians er meget enklere i implementeringen end spektralanalysen i frekvensdomænet, men den er modtagelig for artefakter fra drift, kamerabaseret erhvervelse, og udvidelsesændringerne på grund af off-centreret perlevedhæftning31,37,38. Alligevel adskiller resultaterne fra de to metoder sig kun med 0-2 pN, hvis de opnås korrekt (figur 2G); Så variansmetoden er pålidelig nok, når den absolutte bestemmelse af kraft ikke er kritisk.

For højere kræfter over 30 pN og ved omkring 65 pN (hvor dsDNA-overstrækning tjener som benchmark), skal der enten installeres kommercielt tilgængelige højkvalitetsmagneter (N50-N52), afstanden mellem magneterne skal reduceres, eller magnetfeltet skal konstrueres yderligere28,49. I denne opsætning er den hurtigste hastighed for den lodrette motor 30 mm / s, hvilket tillader et kraftspring fra 0 pN til 20 pN i ~ 0.6 s. Nogle hurtige kraftafhængige strukturelle ændringer kan gå glip af, hvis motorbevægelsen begrænser kraftbelastningshastigheden. Afhængigt af applikationen kan det være nødvendigt at ændre og yderligere optimere den måde, hvorpå magneter flyttes. Et eksempel involverer kreativ brug af et magnetbåndhoved15.

Ved målinger med høj opløsning med MT'er er det vigtigt at evaluere støjniveauet fra forskellige kilder. Når de optiske komponenter (et mikroskop med en linse med høj forstørrelse, skarp lyskilde og hurtigt kamera) er korrekt konfigureret, kan subnanometerpræcision i perlesporing opnås. Derefter bliver den største støjkilde den brune bevægelse af en perle, som bruges til at måle den påførte kraft. De termiske udsving i en tøjret perle afhænger af dens radius, tøjringslængde og den påførte kraft. Selvom de indre udsving i z-retning (dvs. forlængelsesændringer) udelukkende afhænger af termisk energi og tøjringsstivhed, filtrerer perle-tether-dynamikken og hastigheden af kamerabaseret erhvervelse perlens bevægelse og dermed overvågningen af målbiomolekyler igen. Derfor skal perlestørrelsen og prøveudtagningshastigheden vælges strategisk for at opnå god rumlig tidsmæssig opløsning. Som et alternativ til den 2,8 μm perle, vi anvendte, er mindre 1 μm perler også populære og kan være fordelagtige til hurtige målinger på grund af deres hurtige respons. En kritisk svaghed er imidlertid det lille magnetiske indhold, som begrænser den maksimale kraft, der kan genereres (Equation 12 ). Da mindre perler stadig kan udøve kraft mindst op til 10 pN, kan de være egnede til at studere svage kraftfænomener, såsom i DNA-supercoiling. I modsætning hertil kræver undersøgelser af molekylære motorer, proteinfoldning (f.eks. SNARE'er, vist her) eller cellemekanik50 anvendelse af højere kræfter, i hvilket tilfælde man kan overveje at ændre magnetkonfigurationen (f.eks. reducere afstanden eller afstanden) for at udvide rækkevidden af gældende kraft 28,51.

Fordi teknikken undersøger målmolekylernes nanomekaniske reaktioner, mens den anvender en kraft på den biofysisk relevante skala, er den ideel til at studere kraftfølsomme elementer, der spiller afgørende roller i mekanobiologiske processer. For at illustrere den brede anvendelighed af MT-analysen med høj præcision anvendte vi både en nukleinsyre og en proteinmodel, der udviser dynamiske og hurtige konformationelle ændringer ved anvendelse af en piconewton-skalakraft. En begrænsning ved teknikken er kravet om oprensede nukleinsyrer og proteiner, hvilket især har afskrækket dens brede udvidelse til en bred vifte af proteiner. Udviklingen af in vitro-proteinekspressions- og konjugationsteknologier vil fortsat give adgang til mindre undersøgte proteiner. Et beslægtet problem er, at a priori viden om målstrukturen ofte er afgørende for at designe eksperimenter (f.eks. Fastgørelse af håndtag). Vi forventer, at fremkomsten af enkeltpartikelkryo-EM 52 ogAlphaFold2 53 i høj grad vil understøtte design og analyse af mekaniske målinger på enkelte proteinmolekyler og frigøre mere kraftfulde anvendelser af MT med høj opløsning.

Udpakningskraften af DNA-hårnåle afhænger af mange faktorer, herunder sekvens, struktur og buffersammensætning, men mest kritisk af stammelængde og guanin-cytosin (GC) indhold20. For at demonstrere kraften i højhastighedssporing designede vi bevidst en 8 bp frempind (med tre GC-basepar), der forventedes at udfolde sig med lav kraft med hurtig dynamik. Resultaterne i figur 5 viser faktisk, at en sådan hurtig dynamik ville have været vanskelig at løse med standardteknikker med en opløsning på 10 ms eller lavere. Dette aspekt bekræftes yderligere af overgangshastighederne målt fra HMM-analysen, hvis høje hastigheder varierede mellem 100 og 200 s−1 (figur 5J).

Neuronale SNARE'er menes at drive synaptisk vesikelexocytose. Især katalyserer SNARE-proteinerne membranfusion ved at sænke den tilhørende energibarriere, såsom elektrostatisk frastødning mellem vesikel og plasmamembraner. Følgelig findes konformationelle udsving i SNARE-komplekserne at forekomme i et snævert kraftområde på 12-15 pN, hvilket svarer til det forventede niveau af frastødende kræfter14,23. Ved hjælp af højhastigheds-MT'erne, der er beskrevet her, rekapitulerede vi de vigtigste fund om den kraftafhængige opførsel af neuronale SNARE-komplekser. Krafthysteresen ved udpakning og rezipping (figur 6B) indikerer, at rezipping sker med en lavere kraft end udpakning, og derfor udføres arbejde i løbet af denne cyklus. Sådanne ikke-ligevægtsovergange nærmer sig bedre ved kraftspringeksperimenter, hvor latenstiden til overgang under belastning (svarende til en bindingsbrudsbegivenhed) eller konformationelle udsving før udpakning kan måles. Begge tilfælde drager fordel af højhastighedsopsætninger, som illustreret af nylige undersøgelser af biomolekylers forbigående tilstande og deres komplekser 15,17,54,55,56.

Samlet set stemmer disse resultater overens med de karakteristiske kraftafhængige ændringer af DNA-hårnåle og neuronale SNARE-komplekser, der rapporteres med konventionel enkeltmolekylekraftspektroskopi. Samtidig understreger de nytten af mekaniske målinger med høj præcision til at afsløre kraftfølsomheden af biomolekyler og deres samlinger. Vi håber, at denne artikel kan tiltrække flere mennesker fra mekanobiologiområdet og motivere forskere til at anvende højhastigheds-MT'er til at undersøge deres unikke systemer af interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Research Foundation of Korea (NRF) tilskud finansieret af den koreanske regering (MSIT) (NRF-2022R1C1C1012176, NRF-2021R1A4A1031754 og NRF- 2021R1A6A1A10042944). S.-H.R. blev støttet af NRF-tilskuddet (2021R1C1C2009717).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials for construct synthesis
Agarose gel electrophoresis system Advance Mupid-2plus
DNA ladder Bioneer D-1037
nTaq polymerase Enzynomics P050A
PCR purification kit LaboPass CMR0112
PEGylated SMCC crosslinker / SM(PEG)2 ThermoFisher Scientific 22102 For SNARE–DNA coupling
Primer B Bioneer 5'-Biotin/TCGCCACCATCATTTCCA-3' For 5-kbp force calibration construct and DNA handles
Primer B_hp IDT 5'-Biotin/TTTTTTTTTTGTTCTCTATTT
TTTTAGAGAAC /AP site/ /AP site/ TCGCCACCATCATTTCCA-3'		 For hairpin construct
Primer N Bioneer 5'-C6Amine/CATGTGGGTGACGCGAAA-3' For DNA handles
Primer Z Bioneer 5'-Azide/TCGCCACCATCATTTCCA-3' For DNA handles
Primer Z_5k Bioneer 5'-Azide/TTAGAGAGTATGGGTATATGACA
TCG-3'		 For 5-kbp force calibration construct
Primer Z_hp Bioneer 5'-Azide/GTGGCAGCATGACACC-3' For hairpin construct
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoFisher Scientific S33102
λ-DNA Bioneer D-2510 Template strand for PCR
DNA sequences for SNARE proteins
6×His-tagged SNAP-25b (2-206; capitalized) in pET28a homemade tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt
ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggttccg
atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggcctattggtta
aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg
cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttgtttatttttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttgttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct
gtaacatcattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcagacagttttattgttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc
gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg
cacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctat
gagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgagggagcttcca
gggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt
acggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcgg
aagagcgcctgatgcggtattttctccttac
gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg
acacccgccaacacccgctgacgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggttttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga
tttctgttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacagggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg
cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa
ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc
gtattgggcgccagggtggtttttcttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggccctgagagagttgcagcaag
cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa
aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagatatttatgccagc
cagccagacgcagacgcgccgagacagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca
gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac
aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt
tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca
gctccgccatcgccgcttccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacgcgggaaacggtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacgttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc
cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg
atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttgtttaactt
taagaaggagatataccATGGGCAGC
AGCCATCATCATCATCATCACA
GCAGCGGCCTGGTGCCGCGC
GGCAGCCATACTAGCGGAGAT
ATCGCCGAGGACGCAGACAT
GCGCAATGAGCTGGAGGAGA
TGCAGAGGAGGGCTGACCAG
CTGGCTGATGAGTCCCTGGA
AAGCACCCGTCGCATGCTGC
AGCTGGTTGAAGAGAGTAAA
GATGCTGGCATCAGGACTTT
GGTTATGTTGGATGAGCAAG
GCGAACAACTGGAACGCATT
GAGGAAGGGATGGACCAAAT
CAATAAGGACATGAAAGAAG
CAGAAAAGAATTTGACGGAC
CTAGGAAAATTCGCCGGCCT
TGCCGTGGCCCCCGCCAAC
AAGCTTAAATCCAGTGATGC
TTACAAAAAAGCCTGGGGC
AATAATCAGGATGGAGTAGT
GGCCAGCCAGCCTGCCCG
TGTGGTGGATGAACGGGAG
CAGATGGCCATCAGTGGTG
GCTTCATCCGCAGGGTAAC
AAATGATGCCCGGGAAAAT
GAGATGGATGAGAACCTG
GAGCAGGTGAGCGGCATC
ATCGGAAACCTCCGCCAC
ATGGCTCTAGACATGGGCA
ATGAGATTGACACCCAGA
ATCGCCAGATCGACAGGA
TCATGGAGAAGGCTGATT
CCAACAAAACCAGAATTG
ATGAAGCCAACCAACGTG
CAACAAAGATGCTGGGAA
GTGGTTAAggatccgaattcgag
ctccgtcgacaagcttgcggccgcactc
gagcaccaccaccaccaccactgagat
ccggctgctaacaaagcccgaaagga
agctgagttggctgctgccaccgctgag
caataactagcataaccccttggggcct
ctaaacgggtcttgaggggttttttgctga
aaggaggaactatatccggat
6×His-tagged VAMP2 (2-97, L32C/I97C; capitalized) in pET28a homemade tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt
ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggttccg
atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggcctattggtta
aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg
cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttgtttatttttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttgttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct
gtaacatcattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcagacagttttattgttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc
gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg
cacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctatg
agaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgagggagcttcca
gggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt
acggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagc
ggaagagcgcctgatgcggtattttctccttac
gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg
acacccgccaacacccgctgacgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggttttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga
tttctgttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacagggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg
cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa
ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc
gtattgggcgccagggtggtttttcttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggccctgagagagttgcagcaag
cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa
aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagatatttatgccagc
cagccagacgcagacgcgccgagacagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca
gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac
aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt
tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca
gctccgccatcgccgcttccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacgcgggaaacggtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacgttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc
cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg
atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttgtttaactt
taagaaggagatataccATGGGCAGC
AGCCATCATCATCATCATCAC
AGCAGCGGCCTGGTGCCGC
GCGGCAGCCATATGGCAGAT
CTCTCGGCTACCGCTGCCAC
CGTCCCGCCTGCCGCCCCG
GCCGGCGAGGGTGGCCCCC
CTGCACCTCCTCCAAATCTTA
CCAGTAACAGGAGATGCCAG
CAGACCCAGGCCCAGGTGG
ATGAGGTGGTGGACATCATG
AGGGTGAATGTGGACAAGGT
CCTGGAGCGAGACCAGAAG
CTATCGGAACTGGATGATCG
CGCAGATGCCCTCCAGGCA
GGGGCCTCCCAGTTTGAAA
CAAGTGCAGCCAAGCTCAA
GCGCAAATACTGGTGGAAA
AACCTCAAGATGATGTGCTA
Aggatccgaattcgagctccgtcg
acaagcttgcggccgcactcgagcaccacca
ccaccaccactgagatccggctgctaacaaa
gcccgaaaggaagctgagttggctgctgcca
ccgctgagcaataactagcataaccccttgg
ggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg
ctgaaaggaggaactatatccggat
6×His-tagged ΔN-VAMP2 (49–96; capitalized) and Syntaxin-1A (191–267, I202C/I266C; capitalized) in pETDuet-1 homemade ggggaattgtgagcggataacaattcccctc
tagaaataattttgtttaactttaagaagga
gatataccATGGGCAGCAGCCATCA
TCATCATCATCACAGCAGCGG
CCTGGAAGTTCTGTTCCAGGG
GCCCGGTAATGTGGACAAGGT
CCTGGAGCGAGACCAGAAGCT
ATCGGAACTGGATGATCGCGC
AGATGCCCTCCAGGCAGGGGC
CTCCCAGTTTGAAACAAGTGC
AGCCAAGCTCAAGCGCAAATAC
TGGTGGAAAAACCTCAAGATGAT
GTAAgcggccgcataatgcttaagtcgaaca
gaaagtaatcgtattgtacacggccgcataa
tcgaaattaatacgactcactataggggaat
tgtgagcggataacaattccccatcttagta
tattagttaagtataagaaggagatatacat
ATGGCCCTCAGTGAGATCGAGA
CCAGGCACAGTGAGTGCATC
AAGTTGGAGAACAGCATCCG
GGAGCTACACGATATGTTCAT
GGACATGGCCATGCTGGTGG
AGAGCCAGGGGGAGATGATT
GACAGGATCGAGTACAATGTG
GAACACGCTGTGGACTACGTG
GAGAGGGCCGTGTCTGACACC
AAGAAGGCCGTCAAGTACCAG
AGCAAGGCACGCAGGAAGAA
GTGCATGATCTAActcgagtc
tggtaaagaaaccgctgctgcgaaatttgaa
cgccagcacatggactcgtctactagcgcag
cttaattaacctaggctgctgccaccgctga
gcaataactagcataaccccttggggcctct
aaacgggtcttgaggggttttttgctgaaag
gaggaactatatccggattggcgaatgggac
gcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgg
gtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac
acttgccagcgccctagcgcccgctcctttc
gctttcttcccttcctttctcgccacgttcg
ccggctttccccgtcaagctctaaatcgggg
gctccctttagggttccgatttagtgcttta
cggcacctcgaccccaaaaaacttgattagg
gtgatggttcacgtagtgggccatcgccctg
atagacggtttttcgccctttgacgttggag
tccacgttctttaatagtggactcttgttcc
aaactggaacaacactcaaccctatctcggt
ctattcttttgatttataagggattttgccg
atttcggcctattggttaaaaaatgagctga
tttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaa
aatattaacgtttacaatttctggcggcacg
atggcatgagattatcaaaaaggatcttcac
ctagatccttttaaattaaaaatgaagtttt
aaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt
ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtga
ggcacctatctcagcgatctgtctatttcgt
tcatccatagttgcctgactccccgtcgtgt
agataactacgatacgggagggcttaccatc
tggccccagtgctgcaatgataccgcgagac
ccacgctcaccggctccagatttatcagcaa
taaaccagccagccggaagggccgagcgca
gaagtggtcctgcaactttatccgcctccatc
cagtctattaattgttgccgggaagctagag
taagtagttcgccagttaatagtttgcgcaa
cgttgttgccattgctacaggcatcgtggtg
tcacgctcgtcgtttggtatggcttcattca
gctccggttcccaacgatcaaggcgagttac
atgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggtt
agctccttcggtcctccgatcgttgtcagaa
gtaagttggccgcagtgttatcactcatggt
tatggcagcactgcataattctcttactgtc
atgccatccgtaagatgcttttctgtgactg
gtgagtactcaaccaagtcattctgagaata
gtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccg
gcgtcaatacgggataataccgcgccacata
gcagaactttaaaagtgctcatcattggaaa
acgttcttcggggcgaaaactctcaaggatc
ttaccgctgttgagatccagttcgatgtaac
ccactcgtgcacccaactgatcttcagcatc
ttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaa
aacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagg
gaataagggcgacacggaaatgttgaatact
catactcttcctttttcaatcatgattgaag
catttatcagggttattgtctcatgagcgga
tacatatttgaatgtatttagaaaaataaac
aaataggtcatgaccaaaatcccttaacgtg
agttttcgttccactgagcgtcagaccccgt
agaaaagatcaaaggatcttcttgagatcct
ttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaa
caaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttg
tttgccggatcaagagctaccaactcttttt
ccgaaggtaactggcttcagcagagcgcaga
taccaaatactgtccttctagtgtagccgta
gttaggccaccacttcaagaactctgtagca
ccgcctacatacctcgctctgctaatcctgt
taccagtggctgctgccagtggcgataagtc
gtgtcttaccgggttggactcaagacgatag
ttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaa
cggggggttcgtgcacacagcccagcttgga
gcgaacgacctacaccgaactgagataccta
cagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttccc
gaagggagaaaggcggacaggtatccggta
agcggcagggtcggaacaggagagcgcac
gagggagcttccagggggaaacgcctggtatc
tttatagtcctgtcgggtttcgccacctctg
acttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtca
ggggggcggagcctatggaaaaacgccagc
aacgcggcctttttacggttcctggccttttg
ctggccttttgctcacatgttctttcctgcg
ttatcccctgattctgtggataaccgtatta
ccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgc
agccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtg
agcgaggaagcggaagagcgcctgatgcgg
tattttctccttacgcatctgtgcggtatttc
acaccgcatatatggtgcactctcagtacaa
tctgctctgatgccgcatagttaagccagta
tacactccgctatcgctacgtgactgggtca
tggctgcgccccgacacccgccaacacccgc
tgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccg
gcatccgcttacagacaagctgtgaccgtct
ccgggagctgcatgtgtcagaggttttcacc
gtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcgg
taaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgatt
cacagatgtctgcctgttcatccgcgtccag
ctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtc
tggcttctgataaagcgggccatgttaaggg
cggttttttcctgtttggtcactgatgcctc
cgtgtaagggggatttctgttcatgggggta
atgataccgatgaaacgagagaggatgctca
cgatacgggttactgatgatgaacatgcccg
gttactggaacgttgtgagggtaaacaactg
gcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaa
tcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaa
tacagatgtaggtgttccacagggtagccag
cagcatcctgcgatgcagatccggaacataa
tggtgcagggcgctgacttccgcgtttccag
actttacgaaacacggaaaccgaagaccatt
catgttgttgctcaggtcgcagacgttttgc
agcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtat
cggtgattcattctgctaaccagtaaggcaa
ccccgccagcctagccgggtcctcaacgaca
ggagcacgatcatgctagtcatgccccgcgc
ccaccggaaggagctgactgggttgaaggct
ctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcct
aatgagtgagctaacttacattaattgcgtt
gcgctcactgcccgctttccagtcgggaaac
ctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggcc
aacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgg
gcgccagggtggtttttcttttcaccagtga
gacgggcaacagctgattgcccttcaccgcc
tggccctgagagagttgcagcaagcggtcca
cgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctg
tttgatggtggttaacggcgggatataacat
gagctgtcttcggtatcgtcgtatcccacta
ccgagatgtccgcaccaacgcgcagcccgga
ctcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgcc
atctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgg
gaacgatgccctcattcagcatttgcatggt
ttgttgaaaaccggacatggcactccagtcg
ccttcccgttccgctatcggctgaatttgat
tgcgagtgagatatttatgccagccagccag
acgcagacgcgccgagacagaacttaatggg
cccgctaacagcgcgatttgctggtgaccca
atgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgt
accgtcttcatgggagaaaataatactgttg
atgggtgtctggtcagagacatcaagaaata
acgccggaacattagtgcaggcagcttccac
agcaatggcatcctggtcatccagcggatag
ttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcga
gaagattgtgcaccgccgctttacaggcttc
gacgccgcttcgttctaccatcgacaccacc
acgctggcacccagttgatcggcgcgagatt
taatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtg
cagggccagactggaggtggcaacgccaatc
agcaacgactgtttgcccgccagttgttgtg
ccacgcggttgggaatgtaattcagctccgc
catcgccgcttccactttttcccgcgttttc
gcagaaacgtggctggcctggttcaccacgc
gggaaacggtctgataagagacaccggcata
ctctgcgacatcgtataacgttactggtttc
acattcaccaccctgaattgactctcttccg
ggcgctatcatgccataccgcgaaaggtttt
gcgccattcgatggtgtccgggatctcgacg
ctctcccttatgcgactcctgcattaggaag
cagcccagtagtaggttgaggccgttgagca
ccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaagga
gatggcgcccaacagtcccccggccacgggg
cctgccaccatacccacgccgaaacaagcgc
tcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttc
cccatcggtgatgtcggcgatataggcgcca
gcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccgg
ccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagat
cgatctcgatcccgcgaaattaatacgactc
actata
SNAP-25b (1–206, all C to A; capitalized) in pET28a homemade tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt
ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggttccg
atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggcctattggtta
aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg
cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttgtttatttttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttgttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct
gtaacatcattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcagacagttttattgttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc
gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg
cacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctatg
agaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgagggagcttcc
agggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt
acggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagc
ggaagagcgcctgatgcggtattttctccttac
gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg
acacccgccaacacccgctgacgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggttttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga
tttctgttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacagggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg
cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa
ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc
gtattgggcgccagggtggtttttcttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggccctgagagagttgcagcaag
cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa
aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagatatttatgccagc
cagccagacgcagacgcgccgagacagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca
gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac
aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt
tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca
gctccgccatcgccgcttccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacgcgggaaacggtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacgttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc
cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg
atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttgtttaactt
taagaaggagatataccATGGCCGA
GGACGCAGACATGCGCAATG
AGCTGGAGGAGATGCAGAGG
AGGGCTGACCAGCTGGCTGA
TGAGTCCCTGGAAAGCACCC
GTCGCATGCTGCAGCTGGTT
GAAGAGAGTAAAGATGCTGG
CATCAGGACTTTGGTTATGTT
GGATGAGCAAGGCGAACAAC
TGGAACGCATTGAGGAAGGG
ATGGACCAAATCAATAAGGAC
ATGAAAGAAGCAGAAAAGAAT
TTGACGGACCTAGGAAAATTC
GCCGGCCTTGCCGTGGCCCC
CGCCAACAAGCTTAAATCCAG
TGATGCTTACAAAAAAGCCTG
GGGCAATAATCAGGATGGAGT
AGTGGCCAGCCAGCCTGCCC
GTGTGGTGGATGAACGGGAG
CAGATGGCCATCAGTGGTGGC
TTCATCCGCAGGGTAACAAAT
GATGCCCGGGAAAATGAGATG
GATGAGAACCTGGAGCAGGT
GAGCGGCATCATCGGAAACCT
CCGCCACATGGCTCTAGACAT
GGGCAATGAGATTGACACCCA
GAATCGCCAGATCGACAGGAT
CATGGAGAAGGCTGATTCCAA
CAAAACCAGAATTGATGAAGC
CAACCAACGTGCAACAAAGAT
GCTGGGAAGTGGTTAA
ctcgagcaccaccaccaccaccactgag
atccggctgctaacaaagcccgaaagga
agctgagttggctgctgccaccgctgagc
aataactagcataaccccttggggcctc
taaacgggtcttgaggggttttttgctgaa
aggaggaactatatccggat
Materials for protein purificaiton
2-Mercaptoethanol SIGMA M3148-25ML
Agar LPS Solution AGA500
Ampicillin, Sodium salt PLS AC1043-005-00
Chloramphenicol PLS CR1023-050-00
Competent cells (E. coli) Novagen 70956 Rosetta(DE3)pLysS
Glycerol SIGMA G5516-500ML
HEPES SIGMA H4034-100G
Hydrochloric acid / HCl SIGMA 320331-500ML
Imidazole SIGMA I2399-100G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside / IPTG SIGMA 10724815001
Kanamycin Sulfate PLS KC1001-005-02
Luria-Bertani (LB) Broth LPS Solution LB-05
Ni-NTA resin Qiagen 30210
PD MiniTrap G-25 (desalting column) Cytiva GE28-9180-07 For instructions, see: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/chromatography/prepacked-columns/desalting-and-buffer-exchange/pd-minitrap-desalting-columns-with-sephadex-g-25-resin-p-06174
Phenylmethylsulfonyl fluoride / PMSF ThermoFisher Scientific 36978
Plasmids for SNARE proteins cloned in house N/A Available upon request
Protease inhibitor cocktail genDEPOT P3100
Sodium chloride SIGMA S5886-500G
Sodium phosphate dibasic / Na2HPO4 SIGMA S7907-100G
Sodium phosphate monobasic / NaH2PO4 SIGMA S3139-250G
Tris(2-carboxyethyl)phosphine / TCEP SIGMA C4706-2G
Trizma base SIGMA T1503-250G
Materials for sample assembly
Biotin-PEG-SVA LAYSAN BIO BIO-PEG-SVA-5K-100MG & MPEG-SVA-5K-1g For PEGylation
Dibenzocyclooctyne-amine / DBCO-NH2 SIGMA 761540-10MG For bead coating
Double-sided tape 3M 136 For flow cell assembly
Epoxy glue DEVCON S-208 For flow cell assembly
Glass coverslip for bottom surface VWR 48393-251 Rectangular, 60×24 mm, #1.5
Glass coverslip for top surface VWR 48393-241 Rectangular, 50×24 mm, #1.5
Magnetic bead ThermoFisher Scientific 14301 Dynabeads M-270 Epoxy, 2.8 μm
mPEG-SVA LAYSAN BIO mPEG-SVA 1g For PEGylation
N,N-Dimethylformamide / DMF SIGMA D4551-250ML For bead coating
N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine SIGMA 104884-100ML For PEGylation
Neutravidin ThermoFisher Scientific 31000 For sample tethering
Phosphate buffered saline / PBS, pH 7.2 PLS PR2007-100-00
Plastic syringe Norm-ject A5 5 ml, luer tip
Polyethylene Tubing SCI BB31695-PE/4 PE-60
Reference bead SPHEROTECH SVP-30-5 Streptavidin-coated Polystyrene Particles; 3.0-3.4 µm
Syringe needle Kovax 21G-1 1/4'' 21 G
Syringe pump KD SCIENTIFIC 788210
Equipment for magnetic tweezer instrument
1-axis motorized microtranslation stage PI M-126.PD1 For vertical positioning of magnets
2-axis manual translation stage ST1 LEE400 For alignment of magnets to the optical axis
Acrylic holder for magnets DaiKwang Precision custum order Drawing available upon request
Frame grabber Active Silicon AS-FBD-4XCXP6-2PE8
High-speed CMOS camera Mikrotron EoSens 3CXP
Inverted microscope Olympus IX73P2F-1-2
Neodymium magnets LG magnet ND 10x10x12t Dimension: 10 mm × 10 mm × 12 mm; two needed
Objective lens Olympus UPLXAPO100XO Oil-immersion, NA 1.45
Objective lens nanopositioner Mad City Labs Nano-F100S
Rotation stepper motor AUTONICS A3K-S545W For rotating magnets
Superluminescent diode QPHOTONICS QSDM-680-2 680 nm
Software
LabVIEW National Instruments v20.0f1
MATLAB MathWorks v2021a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le, S., Liu, R., Lim, C. T., Yan, J. Uncovering mechanosensing mechanisms at the single protein level using magnetic tweezers. Methods. 94, 13-18 (2016).
  2. Choi, H. -K., Kim, H. G., Shon, M. J., Yoon, T. -Y. High-resolution single-molecule magnetic tweezers. Annual Review of Biochemistry. 91 (1), 33-59 (2022).
  3. Yang, T., Park, C., Rah, S. -H., Shon, M. J. Nano-precision tweezers for mechanosensitive proteins and beyond. Molecules and Cells. 45 (1), 16-25 (2022).
  4. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  5. De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annual Review of Biophysics. 41 (1), 453-472 (2012).
  6. Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. Optical tweezers in single-molecule biophysics. Nature Reviews Methods Primers. 1, 25 (2021).
  7. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophysical Journal. 82 (6), 3314-3329 (2002).
  8. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).
  9. Lansdorp, B. M., Tabrizi, S. J., Dittmore, A., Saleh, O. A. A high-speed magnetic tweezer beyond 10,000 frames per second. Review of Scientific Instruments. 84 (4), 044301 (2013).
  10. Cnossen, J. P., Dulin, D., Dekker, N. H. An optimized software framework for real-time, high-throughput tracking of spherical beads. Review of Scientific Instruments. 85 (10), 103712 (2014).
  11. Dulin, D., et al. High spatiotemporal-resolution magnetic tweezers: calibration and applications for DNA dynamics. Biophysical Journal. 109 (10), 2113-2125 (2015).
  12. Huhle, A., et al. Camera-based three-dimensional real-time particle tracking at kHz rates and Ångström accuracy. Nature Communications. 6 (1), 5885 (2015).
  13. Popa, I., et al. A HaloTag anchored ruler for week-long studies of protein dynamics. Journal of the American Chemical Society. 138 (33), 10546-10553 (2016).
  14. Shon, M. J., Kim, H., Yoon, T. -Y. Focused clamping of a single neuronal SNARE complex by complexin under high mechanical tension. Nature Communications. 9 (1), 3639 (2018).
  15. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (16), 7873-7878 (2019).
  16. Löf, A., et al. Multiplexed protein force spectroscopy reveals equilibrium protein folding dynamics and the low-force response of von Willebrand factor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (38), 18798-18807 (2019).
  17. Tapia-Rojo, R., Alonso-Caballero, A., Fernandez, J. M. Direct observation of a coil-to-helix contraction triggered by vinculin binding to talin. Science Advances. 6 (21), (2020).
  18. Rieu, M., et al. Parallel, linear, and subnanometric 3D tracking of microparticles with Stereo Darkfield Interferometry. Science Advances. 7 (6), (2021).
  19. Rieu, M., Valle-Orero, J., Ducos, B., Allemand, J. -F., Croquette, V. Single-molecule kinetic locking allows fluorescence-free quantification of protein/nucleic-acid binding. Communications Biology. 4 (1), 1083 (2021).
  20. Woodside, M. T., et al. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (16), 6190-6195 (2006).
  21. Camunas-Soler, J., Ribezzi-Crivellari, M., Ritort, F. Elastic properties of nucleic acids by single-molecule force spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 45 (1), 65-84 (2016).
  22. Südhof, T. C., Rothman, J. E. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. Science. 323 (5913), 474-477 (2009).
  23. Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337 (6100), 1340-1343 (2012).
  24. Zorman, S., et al. Common intermediates and kinetics, but different energetics, in the assembly of SNARE proteins. eLife. 3, e03348 (2014).
  25. Zhang, Y., Hughson, F. M. Chaperoning SNARE folding and assembly. Annual Review of Biochemistry. 90 (1), 581-603 (2021).
  26. Vilfan, I. D., Lipfert, J., Koster, D. A., Lemay, S. G., Dekker, N. H. Magnetic tweezers for single-molecule experiments. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , Springer. New York, NY. 371-395 (2009).
  27. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule manipulation of G-quadruplexes by magnetic tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328 (2017).
  28. Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophysical Journal. 96 (12), 5040-5049 (2009).
  29. Dulin, D., Barland, S., Hachair, X., Pedaci, F. Efficient illumination for microsecond tracking microscopy. PLoS One. 9 (9), e107335 (2014).
  30. Klaue, D., Seidel, R. Torsional stiffness of single superparamagnetic microspheres in an external magnetic field. Physical Review Letters. 102 (2), 028302 (2009).
  31. Shon, M. J., Rah, S. -H., Yoon, T. -Y. Submicrometer elasticity of double-stranded DNA revealed by precision force-extension measurements with magnetic tweezers. Science Advances. 5 (6), 1697 (2019).
  32. Czerwinski, F., Richardson, A. C., Oddershede, L. B. Quantifying noise in optical tweezers by Allan variance. Optics Express. 17 (15), 13255-13269 (2009).
  33. Lansdorp, B. M., Saleh, O. A. Power spectrum and Allan variance methods for calibrating single-molecule video-tracking instruments. Review of Scientific Instruments. 83 (2), 025115 (2012).
  34. Ostrofet, E., Papini, F. S., Dulin, D. High spatiotemporal resolution data from a custom magnetic tweezers instrument. Data in Brief. 30, 105397 (2020).
  35. Yu, Z., et al. A force calibration standard for magnetic tweezers. Review of Scientific Instruments. 85 (12), 123114 (2014).
  36. Strick, T. R., Allemand, J. -F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. Science. 271 (5257), 1835-1837 (1996).
  37. Daldrop, P., Brutzer, H., Huhle, A., Kauert, D. J., Seidel, R. Extending the range for force calibration in magnetic tweezers. Biophysical Journal. 108 (10), 2550-2561 (2015).
  38. te Velthuis, A. J. W., Kerssemakers, J. W. J., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative guidelines for force calibration through spectral analysis of magnetic tweezers data. Biophysical Journal. 99 (4), 1292-1302 (2010).
  39. Ostrofet, E., Papini, F. S., Dulin, D. Correction-free force calibration for magnetic tweezers experiments. Scientific Reports. 8 (1), 15920 (2018).
  40. Seol, Y., Li, J., Nelson, P. C., Perkins, T. T., Betterton, M. D. Elasticity of short DNA molecules: theory and experiment for contour lengths of 0.6-7 µm. Biophysical Journal. 93 (12), 4360-4373 (2007).
  41. Burnham, D. R., Vlaminck, I. D., Henighan, T., Dekker, C. Skewed Brownian fluctuations in single-molecule magnetic tweezers. PLoS One. 9 (9), 108271 (2014).
  42. Paul, T., Myong, S. Protocol for generation and regeneration of PEG-passivated slides for single-molecule measurements. STAR Protocols. 3 (1), 101152 (2022).
  43. Lee, H. -W., et al. Profiling of protein-protein interactions via single-molecule techniques predicts the dependence of cancers on growth-factor receptors. Nature Biomedical Engineering. 2 (4), 239-253 (2018).
  44. Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles. Biophysical Journal. 81 (4), 2378-2388 (2001).
  45. Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nature Methods. 9 (7), 724-726 (2012).
  46. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43 (1), 19-39 (2014).
  47. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophysical Journal. 72 (4), 1541-1555 (1997).
  48. Zhang, Y. Energetics, kinetics, and pathway of SNARE folding and assembly revealed by optical tweezers. Protein Science. 26 (7), 1252-1265 (2017).
  49. Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophysical Journal. 100 (2), 517-523 (2011).
  50. Cho, S., et al. Tension exerted on cells by magnetic nanoparticles regulates differentiation of human mesenchymal stem cells. Biomaterials Advances. 139, 213028 (2022).
  51. Shon, M. J., Cohen, A. E. Nano-mechanical measurements of protein-DNA interactions with a silicon nitride pulley. Nucleic Acids Research. 44 (1), 7 (2016).
  52. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  53. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  54. Neupane, K., et al. Direct observation of transition paths during the folding of proteins and nucleic acids. Science. 352 (6282), 239-242 (2016).
  55. Choi, H. -K., et al. Watching helical membrane proteins fold reveals a common N-to-C-terminal folding pathway. Science. 366 (6469), 1150-1156 (2019).
  56. Kim, C., et al. Extreme parsimony in ATP consumption by 20S complexes in the global disassembly of single SNARE complexes. Nature Communications. 12 (1), 3206 (2021).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 195 højhastighedsmagnetisk pincet enkeltmolekylekraftspektroskopi DNA-hårnål SNARE-kompleks
Magnetisk højhastighedspincet til nanomekaniske målinger på kraftfølsomme elementer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, C., Yang, T., Rah, S. H., Kim, … More

Park, C., Yang, T., Rah, S. H., Kim, H. G., Yoon, T. Y., Shon, M. J. High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements. J. Vis. Exp. (195), e65137, doi:10.3791/65137 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter