Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Magnetisk pincett med hög hastighet för nanomekaniska mätningar på kraftkänsliga element

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65137
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 2,3, 1,4
1Department of Physics, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 2School of Biological Sciences, Seoul National University, 3Institute for Molecular Biology and Genetics, Seoul National University, 4School of Interdisciplinary Bioscience and Bioengineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH)
* These authors contributed equally

Summary

Här beskriver vi en höghastighetsmagnetisk pincettuppsättning som utför nanomekaniska mätningar på kraftkänsliga biomolekyler med en maximal hastighet av 1,2 kHz. Vi introducerar dess tillämpning på DNA-hårnålar och SNARE-komplex som modellsystem, men det kommer också att vara tillämpligt på andra molekyler som är involverade i mekanobiologiska händelser.

Abstract

Magnetpincett med en molekyl (MT) har fungerat som kraftfulla verktyg för att kraftfullt förhöra biomolekyler, såsom nukleinsyror och proteiner, och är därför redo att vara användbara inom mekanobiologi. Eftersom metoden vanligtvis bygger på bildbaserad spårning av magnetiska pärlor har hastighetsgränsen vid inspelning och analys av bilder, liksom pärlornas termiska fluktuationer, länge hindrat dess tillämpning vid observation av små och snabba strukturella förändringar i målmolekyler. Den här artikeln beskriver detaljerade metoder för konstruktion och drift av en högupplöst MT-installation som kan lösa nanoskala, millisekunddynamik hos biomolekyler och deras komplex. Som applikationsexempel demonstreras experiment med DNA-hårnålar och SNARE-komplex (membranfusionsmaskiner), med fokus på hur deras övergående tillstånd och övergångar kan detekteras i närvaro av pikonewtonskaliga krafter. Vi förväntar oss att höghastighets-MTs kommer att fortsätta att möjliggöra nanomekaniska mätningar med hög precision på molekyler som känner av, överför och genererar krafter i celler och därigenom fördjupar vår molekylära förståelse av mekanobiologi.

Introduction

Celler känner aktivt och svarar på mekaniska stimuli. På så sätt uppvisar många biomolekyler kraftberoende egenskaper som möjliggör dynamiska strukturella förändringar. Väl uppskattade exempel är mekanokänsliga jonkanaler och cytoskeletala element som förser cellerna med viktig mekanisk information från sin omgivande miljö.

Dessutom kan molekyler som visar en unik kraftbärande natur också betraktas som mekanokänsliga i bredare mening. Till exempel spelar lokal bildning och smältning av nukleinsyraduplexer, liksom högre ordningsstrukturer som G-quadruplexes, avgörande roller vid replikering, transkription, rekombination och mer nyligen genomredigering. Dessutom utför vissa neuronala proteiner som är involverade i synaptisk kommunikation sina funktioner genom att generera fysiska krafter som överstiger nivåerna av typiska intermolekylära interaktioner. Oavsett vilket exempel man studerar, kommer undersökning av nanomekanik av de involverade biomolekylerna med hög spatiotemporal precision att visa sig vara mycket användbar för att avslöja molekylära mekanismer för de associerade mekanobiologiska processerna 1,2,3.

Enmolekylära kraftspektroskopimetoder har fungerat som kraftfulla verktyg för att undersöka de mekaniska egenskaperna hos biomolekylerna 2,4,5,6. De kan övervaka strukturella förändringar i nukleinsyror och proteiner samtidigt med tillämpningen av kraft och därigenom undersöka kraftberoende egenskaper. Två välkända inställningar är optisk pincett och magnetisk pincett (MT), som använder mikronstora pärlor för att manipulera molekylerna 5,6,7,8. I dessa plattformar är polystyren (för optisk pincett) eller magnetiska pärlor (för MT) bundna till målmolekyler (t.ex. nukleinsyror och proteiner) via molekylära "handtag", vanligtvis gjorda av korta fragment av dubbelsträngat DNA (dsDNA). Pärlorna flyttas sedan för att utöva kraft och avbildas för att spåra deras platser som rapporterar om strukturella förändringar i målmolekyler. Optisk och magnetisk pincett är i stort sett utbytbara i sina tillämpningar, men det finns viktiga skillnader i deras sätt att kontrollera kraft. Optisk pincett är inneboende positionskläminstrument som fångar pärlor i position, på grund av vilken den applicerade kraften fluktuerar när en målkonstruktion genomgår formförändringar; förlängningsökning, till exempel från utfällning, lossar förbandet och minskar spänningen, och vice versa. Även om aktiv återkoppling kan implementeras för att kontrollera kraften i optiska pincett, fungerar MT däremot naturligt som en kraftklämanordning och utnyttjar stabila, magnetiska krafter långt bort av permanentmagneter, som också kan motstå miljöstörningar.

Trots sin långa historia och enkla design har MT släpat efter optiska pincetter i sina applikationer för mätningar med hög precision, till stor del på grund av tekniska utmaningar inom snabb pärlspårning. Nyligen har dock flera grupper gemensamt lett en mångfacetterad förbättring av både hårdvara och mjukvara för MT-instrument 2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . I detta arbete introducerar vi ett exempel på en sådan uppställning som körs vid 1,2 kHz och beskriver hur man kan använda den för att utföra nanomekaniska mätningar på kraftkänsliga biomolekyler. Som modellsystem använder vi DNA-hårnålar och neuronala SNARE-komplex och undersöker deras snabba, strukturella förändringar i piconewtonregimen. DNA-hårnålar uppvisar enkla tvålägesövergångar i ett väldefinierat kraftområde20,21 och fungerar därför som leksaksmodeller för att verifiera prestandan hos en pincettuppsättning. Eftersom SNARE-proteinerna samlas i ett kraftkänsligt komplex som driver membranfusion22 har de också studerats omfattande med enmolekylär kraftspektroskopi 14,23,24,25. Standardmetoder för att analysera data och extrahera användbar information om termodynamik och kinetik presenteras. Vi hoppas att den här artikeln kan underlätta antagandet av MT med hög precision i mekanobiologiska studier och motivera läsare att utforska sina egna kraftkänsliga system av intresse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla material och all utrustning som beskrivs i detta protokoll är listade i materialförteckningen. LabVIEW-programvaran för att driva höghastighets-MT-installationen som beskrivs nedan, liksom MATLAB-skripten för att analysera exempeldata, deponeras på GitHub (https://github.com/ShonLab/Magnetic-Tweezers) och är offentligt tillgängliga.

1. Konstruktion av apparater

Den allmänna principen för höghastighets MT-konstruktion liknar standard, konventionella MT-system, förutom användningen av en höghastighets komplementär metalloxidhalvledarkamera (CMOS) och en högeffekt, koherent ljuskälla (figur 1). Se andra källor för fler beskrivningar av standard MT-instrument 5,26,27.

  1. Ställ in ett inverterat mikroskop på ett antivibrationsoptiskt bord. Installera en höghastighets CMOS-kamera och en ramgripare.
  2. Bygg ett översättningssteg för att manipulera magneter i 3D. Montera ett motoriserat linjärt steg (>20 mm rörelse) vertikalt ovanpå ett manuellt XY-steg.
    OBS: Den vertikala rörelsen styr kraften, medan XY-steget är för manuell inriktning av magneter till den optiska axeln för den första konstruktionen av installationen.
  3. Installera en roterande stegmotor och ett rem- och remskivsystem för roterande magneter.
    OBS: Remmen överför den roterande rörelsen mellan motoraxeln och magneter som är några centimeter från varandra. Rotationen av magneter är intern för translationell manipulation.
  4. Montera magneterna. Använd en akrylhållare (beställd från ett tillverkningsföretag; se kompletterande figur S1) som tätt kan rymma två identiska magneter parallellt, med ett väldefinierat mellanrum på 1 mm mellan magneterna (figur 1B). För att utnyttja den maximala kraft som kan erhållas med ett givet par magneter, justera översättningsstegets vertikala position så att magneternas bottenyta ligger i linje med provplanet när det flyttas till det lägsta läget.
    OBS: Se Lipfert et al. för mer information om hållarens design och konfiguration av magneter28. Magneternas höjd och orientering styrs av LabVIEW-programvaran i samband med datainsamling.
  5. Om du tittar med en objektivlins med låg förstoring justerar du magneterna mot mitten av synfältet. Kontrollera att rotation av magneterna inte orsakar en stor förskjutning av magnetparets centrum.
    OBS: Om mittpunkten mellan magneterna roterar runt rotationsaxeln är det troligt att magneterna är ocentrerade på grund av en ofullständig hållare. En liten nivå av felinriktning i förhållande till gapstorleken är acceptabel, eftersom magnetrotationen endast är för att kontrollera tjuder och applicera vridmoment i specifika applikationer.
  6. Installera en superluminescerande diod (SLD) för belysning av pärlor. För strålen genom 1 mm mellanrum mellan de två magneterna. Se till att strålen är ordentligt kollimerad för att passa i gapet och belysningen inte skuggas av magneterna.
  7. Installera en piezolinsskanner på nosstycket och montera en 100x objektiv för nedsänkning i olja (numerisk bländare [NA]: 1,45) för pärlspårning. För att undvika potentiella artefakter i spårningsresultat, se till att belysningen bibehålls jämnt när magneterna flyttas. Slutligen justera ljusnivån till maximal ljusstyrka utan att mätta pixlar.
    OBS: För jämförelse av olika ljuskällor för höghastighetsspårning av pärlor, se Dulin et al.29.

2. Kalibrering av magnetisk kraft

  1. Med hjälp av polymeraskedjereaktion (PCR; se tabell 1), förbered 5 kbp dsDNA-fragment (med Primer B, Primer Z_5k och λ-DNA) som är märkta med biotin i ena änden (för ytfästning) och azid i den andra änden (för pärlfästning).
  2. Efter avsnitt 6, förbered en flödescell med 5 kbp-molekylerna.
  3. Efter avsnitt 7, identifiera en bra pärltjuderkonstruktion genom att verifiera dess förlängning och rotation. Se särskilt till att välja en sträng med en minimal rotationsbana (dvs. med en radie <200 nm) för att minimera stränghöjdsförskjutningen på grund av off-centrerad fastsättning30,31. När en bra tjuder har identifierats, starta pärlspårning, med hänvisning till avsnitt 9.
  4. Om installationen är ny, karakterisera dess brus och stabilitet för tillförlitliga högupplösta mätningar. Placera magneten ~ 3 mm från flödescellytan (för att applicera >10 pN och undertrycka en pärlas bruniska rörelse), spåra strängens z-position vid 1,2 kHz och beräkna Allan-avvikelsen (AD) från z-koordinattidsserien32,33 (figur 2C). Kontrollera att AD-värden på några nanometer kan uppnås i höghastighetsregimen (<0,1 s) och att differentiell spårning (magnetisk strängposition i förhållande till en referenspärla) minskar AD på längre tid.
    OBS: Vi får vanligtvis en AD på <3 nm vid maximal hastighet (1,2 kHz eller 0,83 ms upplösning), och AD fortsätter att minska åtminstone upp till 10 s, vilket innebär en minimal drift. Andra har rapporterat liknande värden på liknande inställningar 9,10,11,12,34.
  5. Med magneter i viloläge (F ~ 0 pN), registrera x- och y-koordinaterna för den bundna strängen vid 1,2 kHz. Registrera positionen under en tillräckligt lång period (dvs. tillräckligt längre än den karakteristiska avkopplingstiden för fluktuation35) så att den bruniska rörelsen är tillräckligt samplad.
    OBS: Här är x-riktningen längs magnetfältets riktning, medan rörelsen i y representerar den tvärgående rörelsen vinkelrätt mot fältet.
  6. Flytta magneterna närmare flödescellen och upprepa pärlpositionsmätningarna tills magneterna försiktigt vidrör toppen av flödescellen. Rör dig i stora steg (t.ex. 1-2 mm) när magneterna är mer än 7 mm från provplanet (eftersom den applicerade kraften ökar långsamt i magneternas bortre fält), men minska stegstorleken gradvis (t.ex. 0,1-0,5 mm) när de närmar sig för finare kalibrering vid högre kraftnivåer (figur 2B).
  7. Beräkna kraften vid varje magnetposition, d, med någon av de två alternativa metoderna (ett MATLAB-skript "kraftkalibrering.m" inklusive båda metoderna tillhandahålls; se kompletterande fil 1).
    1. Mät variansen för vulstens y-koordinaterEquation 1 (figur 2D) och pärlans genomsnittliga z-positionEquation 2 i förhållande till den lägsta positionen (figur 2B, nederst). Använd sedan ekvation (1)7,27,36 för att uppskatta kraften (med en fast strängradie R = 1 400 nm och värmeenergi kRT = 4,11 pN∙nm):
      Equation 3(1)
    2. Alternativt kan du beräkna effektspektraldensiteten (PSD) för y-koordinaterna, Sy (figur 2E). Bestäm den applicerade kraften F genom att anpassa en dubbel-Lorentzian modell37 till den uppmätta Sy med hjälp av ekvation (2).
      Equation 4(2)
      Equation 5Här är R pärlradie, γ yoch γφ är translationella respektive rotationsmotståndskoefficienter (uppskattade från Stokes-Einstein-ekvationen), kRT är termisk energi, f + och f- är två karakteristiska frekvenser erhållna med ekvation (3).
      Equation 6 (3)
      OBS: Eftersom förankringsförlängningen L är en funktion av kraft som följer den väletablerade maskliknande kedjemodellen (WLC), lämnar ovanstående uttryck F som den enda passande parametern (vi fixar R till 1 400 nm för enkelhetens skull eftersom den delas över alla kraftnivåer och det exakta värdet påverkar inte resultaten märkbart). Vid behov måste rörelseoskärpa och alias från kamerabaserad bildinsamling betraktas som38,39, men denna effekt är försumbar i våra höghastighetsmätningar över 1 kHz med 5 kbp tjuder.
  8. Upprepa steg 2.4–2.7 för några fler konstruktioner. Sond tre till fem olika pärlor för att medelvärdet av kraftvariationen bland de magnetiska pärlorna.
    OBS: Kraftvariation mellan magnetiska pärlor som används bör övervägas för att bestämma rätt antal konstruktioner för medelvärde. Denna variabilitet är liten men kan leda till mer än 1 pN fel i den uppmätta kraften, även för kommersiella produkter31. För de flesta tillämpningar, där den absoluta bestämningen av de involverade krafterna inte är avgörande, är medelvärdet av kalibreringsresultaten för tre till fem kulor i allmänhet tillräckligt. Ett alternativt tillvägagångssätt för att ta hänsyn till denna variation är att mäta kraften med enskilda tjuder i början av experimentet, vilket kan vara tidskrävande. Ett annat alternativ är att bädda in hårnålsstrukturer som packas upp vid kända kraftnivåer i varje konstruktion31.
  9. Plotta den uppmätta kraften som en funktion av magnetavståndet och anpassa en dubbel exponentiell funktion till data (figur 2F) med ekvation (4).
    Equation 7(4)
    Här är F0 (baslinje), A 1 och A 2 (amplituder) och d 1 och d2 (sönderfallskonstanter) passande parametrar. Se till att kraftvärdena från de två metoderna, liksom de resulterande dubbelexponentiella passningarna, i stort sett överensstämmer (figur 2F, G).
    Anmärkning: För att bekräfta att kraftkalibreringen utförs korrekt, kontrollera förhållandet mellan kraft och förlängning av de sonderade konstruktionerna genom att plotta förlängningen mot den uppmätta kraften.
  10. För att korrigera för stränghöjdsförskjutningen ztill följd av kraftberoende lutning av magnetkulorna30,31, uppskatta z av från sidoförskjutningen x av, med beaktandeav geometrin hos en ocentrerad tjuder med en strängradie med hjälp av ekvation (5), och tillämpa värdena på de uppmätta förlängningsvärdena. Detta steg implementeras i MATLAB-skriptet "force calibration.m" (raderna 252-254).
    Equation 8(5)
    Även om denna korrigering gör små ändringar i förlängningen, särskilt för pärlor med liten rotationsradie (<200 nm), påverkar denna förskjutning ofta kritiskt det elastiska svaret, vilket framgår av förändringen från figur 2H till figur 2I30,31.
  11. Kontrollera persistenslängden Lp genom att anpassa en utökningsbar WLC-modell till data med hjälp av ekvation (6).
    Equation 9(6)
    Här är L 0 konturlängden (1,7 μm för 5 kbp) och K0 är modulen för entalpisk sträckning.
    OBS: Även om L p av dsDNA är väl accepterat att vara 40-50 nm i en typisk buffert såsom fosfatbuffrad saltlösning (PBS), underskattar WLC-formeln som tillämpas på korta molekyler (<5 kbp) systematiskt L p eftersom L0 minskar31,40. Detta beror på att den klassiska WLC-modellen förutsätter en polymer vars kedjelängd är tillräckligt längre än dess persistenslängd. Här erhöll vi L p = 40 ± 3 nm för 5 kbp-konstruktionen (figur 2H), och förlängningskorrigeringen gav ytterligare en homogen K0 på 1 100 ± 200 pN (figur 2I). Tillämpning av en ändlig WLC-modell 31,40, samt en korrigering för icke-gaussianitet i förlängningsfördelning 41, kommer att öka Lp något.
  12. När kraftkalibreringen har verifierats, applicera de erhållna anpassningsparametrarna för den dubbelexponentiella modellen på den medföljande LabVIEW-programvaran (kompletterande fil 2) och vänta tills programvaran beräknar den aktuella kraften i realtid från motoravläsningar (dvs. magnetposition). Eftersom ett analytiskt uttryck för den inversa funktionen d(F) inte är tillgängligt, förbered en uppslagstabell för d kontra F i steg om 0,1 pN genom numerisk uppskattning av för d-målkraftnivåerna. Lagra även denna tabell i programvaran för att styra kraftkontrollen.

3. Syntes av DNA-hårnålar

OBS: DNA-hårnålskonstruktioner för MT-experiment framställs genom PCR-amplifiering av en 510 bp-region i λ-DNA med två anpassade primers, varav en innehåller en hårnålstruktur på dess 5'-ände (figur 3A). På detta sätt placeras ett hårnålsmotiv i ena änden av PCR-produkten.

  1. Förbered primers.
    1. Framåtprimer: Primer B_hp som är 5′-biotinmärkt för glasytfästning och binder till λ-DNA. Denna primer innehåller ett hårnålsmotiv med en 8 bp stam och en 6 nt slinga, 5 ′ till λ-bindande regionen.
    2. Omvänd primer: Primer Z_hp som är 5′-azidmärkt för magnetisk pärlfästning och binder till λ-DNA 1 kbp bort från den främre primern.
  2. Konfigurera och kör PCR med λ-DNA (mall), nTaq-polymeras och standard-PCR-villkor (se tabell 1). Rengör produkten med en kommersiell reningssats.
  3. Mät DNA-koncentrationen genom UV-absorption vid 260 nm (A260) och utför agarosgelelektrofores (2 % gel) (se tabell 2) för att verifiera produktstorleken. Ett typiskt utbyte är ~ 35 μL ~ 600 nM lösning.

4. Beredning av SNARE-proteiner

OBS: Neuronala SNARE-komplex monteras genom att kombinera tre renade råttproteiner uttryckta från E. coli: VAMP2 / synaptobrevin-2, syntaxin-1A och SNAP-25 (figur 3B). För att underlätta deras montering uttrycks syntaxin och SNAP-25 tillsammans med ett VAMP2-fragment (saknar N-terminalregionen; benämnd "ΔN-VAMP2") i en struktur som kallas "ΔN-komplexet" och blandas sedan med VAMP2 i full längd efter DNA-handtagsfäste för att bilda fulla komplex.

  1. Förbered plasmider som innehåller cDNA för uttryck av SNARE-proteiner (DNA-sekvenser för alla plasmider anges i materialtabellen).
    1. Förbered 6×His-taggad VAMP2 som saknar transmembrandomänen (2-97; L32C/I97C för disulfidbindningar) klonad till en pET28a-vektor.
    2. Förbered syntaxin-1A som saknar Habc och transmembrandomänen (191-267, I202C/I266C-substitutioner för disulfidbindningar) klonade tillsammans med 6×His-taggade ΔN-VAMP2 (49-96) till en pETDuet-1-vektor.
    3. Förbered SNAP-25-isoformen b i full längd (2-206, alla C till A) klonad till en pET28a-vektor. Detta kommer att användas för att förbereda ΔN-komplex.
    4. Förbered den 6×His-märkta fullängds SNAP-25-isoformen b (1-206, alla C till A) klonad till en pET28a-vektor för direkt tillägg till MT-analysbufferten för att återmontera SNARE-komplexen efter utfällning.
  2. Förbered två rör av Rosetta (DE3) E. coli-celler. Transforma en grupp med VAMP2-plasmider (från steg 4.1.1), en med både syntaxin-1A/ΔN-VAMP2 och omärkta SNAP-25-plasmider (från steg 4.1.2 och 4.1.3) för att uttrycka ΔN-komplexet, och den andra med hans-taggade SNAP-25-plasmider (från steg 4.1.4).
  3. Överför de transformerade cellerna till Luria-Bertani buljong (LB) med lämpliga antibiotika (här, kanamycin och kloramfenikol för VAMP2 och His-märkta SNAP-25; kanamycin, kloramfenikol och ampicillin för ΔN-komplex). Odla dem vid 37 ° C i en skakande inkubator (220 rpm) tills buljongens optiska densitet (OD) når 0,7-0,9.
  4. Tillsätt 1 mM isopropyl β-d-1-tiogalaktospyranosid (IPTG) för att inducera proteinuttryck och inkubera cellerna i 3-4 timmar vid 37 °C i en skakinkubator (220 rpm).
  5. Pelletera ner cellerna genom att centrifugera kulturen vid 4 500 × g i 15 minuter vid 4 °C.
  6. Förbered buffertar för proteinrening (se tabell 2).
  7. Suspendera SNARE-uttryckande cellpellets i 40 ml iskall lysbuffert och lysera cellerna genom ultraljudsbehandling på is (15% amplitud, 5 s på och 5 s av, 30 min totalt).
  8. Centrifugera lysatet vid 15 000 × g i 30 minuter vid 4 °C för att avlägsna olösliga material.
  9. För supernatanten genom en gravitationskolonn fylld med 1 ml Ni-NTA-harts. Tvätta hartset med tvättbuffert A, sedan med tvättbuffert B och eluera proteinerna med 10 ml elueringsbuffert.
  10. Ta bort tris(2-karboxietyl)fosfin (TCEP) och imidazol från eluenten med hjälp av en avsaltningskolonn (följ tillverkarens anvisningar). Eluera provet med PBS.
  11. Koncentrera proteinerna med centrifugalfilter (10 kDa cutoff) till ~ 70 μM samtidigt som proteinerna bibehålls i PBS (ger vanligtvis 2 ml). Mät proteinkoncentrationen antingen genom ultraviolett (UV) absorption vid 280 nm (A280) eller genom Bradford-testet.
  12. Bered små alikvoter, snabbfrys i flytande kväve och förvara vid -80 °C tills de används.
    OBS: Hela SNARE-komplex kommer att monteras efter konjugering av ΔN-komplex på ett DNA-handtag (se nedan).

5. Fastsättning av DNA-handtag

OBS: Två 510 bp dsDNA-handtag innehållande primära amingrupper i ena änden framställs först med PCR, och amingrupperna omvandlas sedan till maleimidgrupper med hjälp av en bifunktionell tvärbindare, SM (PEG) 2. De två handtagen är sedan kovalent kopplade till SNARE-komplex via deras cysteingrupper för platsspecifik konjugering (figur 3B).

  1. Förbered primers.
    1. Förbered framåtriktade primers: Primer B (för förstärkning av handtag B) som är 5′-biotinmärkt för glasytfästning och binder till λ-DNA; Primer Z (för förstärkning av handtag Z) som är 5′-azidmärkt för magnetisk pärlfästning och har samma sekvens som Primer B.
    2. Förbered en omvänd primer: Primer N (delad för handtag B och handtag Z) som är 5′-aminmärkt för proteinkonjugering och binder till λ-DNA 510 bp bort från den främre primern.
  2. Ställ in och kör två uppsättningar PCR-reaktioner (18 rör med 200 μL-reaktion för varje handtag) med λ-DNA (mall), nTaq-polymeras och standard-PCR-förhållanden (se tabell 1). Rengör produkten med ett PCR-rengöringskit och eluera varje handtag med 45 μL ultrarent vatten. Använd en minimal volym vatten för att få höga koncentrationer av handtag för en effektiv reaktion i senare steg.
  3. Mät DNA-koncentrationen med A260. Det typiska utbytet är ~ 650 μL ~ 2 μM lösning för varje handtag. Håll isär små prover för senare verifiering i agarosgelelektrofores.
  4. Reagera varje handtag (1 μM i PBS) med 5 mM SM (PEG)2. Inkubera vid rumstemperatur med försiktig rotation. Efter 1 timme, använd en DNA-reningssats för att ta bort oreagerad SM (PEG) 2. Eluera varje handtag med 250 μL PBS för att erhålla ~2 μM lösningar.
  5. Blanda lösningarna av handtag B och ΔN-komplex i molförhållandet 1:16 (t.ex. 1 μM handtag B och 16 μM ΔN-komplex) i PBS och inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur under omrörning. Håll isär ett litet prov för agarosgelelektrofores.
  6. Tillsätt en lösning av VAMP2 i ett 2,5-faldigt molärt överskott över ΔN-komplexet som användes i föregående steg. Inkubera blandningen i ytterligare 1 h vid rumstemperatur under omrörning. Hela SNARE-komplex monteras i detta steg.
  7. Avlägsna fria proteiner genom buffertbyte med färsk PBS och ett centrifugalfilter (100 kDa cutoff): centrifugera vid 14 000 × g i 5 minuter vid 4 °C, upprepa minst 6x och kör i 15 minuter under den sista centrifugeringen. Mät ökningen av A260 / A280-förhållandet för att övervaka avlägsnandet av fria proteiner. Håll isär ett litet prov för agarosgelelektrofores.
  8. Tillsätt handtag Z till lösningen i ett 15-faldigt molärt överskott över handtag B. Håll koncentrationen av handtag Z åtminstone över 1 μM för att underlätta reaktionen. Inkubera blandningen över natten vid 4 °C under omrörning.
  9. Kontrollera intermediärerna (handtag B och dess proteinkonjugat) och slutprodukten (SNARE-komplexet med två handtag) med agarosgelelektrofores (figur 3B, infälld) (se tabell 2).
    OBS: Om proteinerna lyckas fästas på handtag B kommer ett mobilitetsskifte att detekteras. I synnerhet kan bildandet av fullständiga SNARE-komplex på DNA-handtag bekräftas av deras resistens mot natriumdodecylsulfat (SDS), till skillnad från ΔN-komplex, som demonteras i SDS och lämnar endast syntaxin bundet till DNA (jämför b och c i figur 3B).
  10. Bered små alikvoter, snabbfrys i flytande kväve och förvara vid -80 °C tills de används.
    OBS: Även om den slutliga lösningen innehåller oreagerade handtag, kommer endast den önskade konstruktionen som är dubbelt märkt med biotin och azid att väljas under provmonteringen i en flödescell.

6. Tillverkning av flödesceller

Flödesceller för MT-mätningar är konstruerade av två glastäckglas som är sammanfogade med dubbelhäftande tejp (figur 3C). Ett täckglas är belagt med en blandning av PEG och biotinylerad polyetylenglykol (PEG) för att undvika ospecifik bindning och för att möjliggöra specifik uppbindning av målmolekyler via biotin-NeutrAvidin-bindning (figur 3D). Därefter infunderas lösningarna av material för MT-experiment sekventiellt i en flödescell med hjälp av en sprutpump (figur 3C, D).

  1. Förbered två glastäckglas, en vardera för den övre (24 mm × 50 mm, nr 1,5 tjocklek) och botten (24 mm × 60 mm, nr 1,5 tjocklek) yta. Rengör täckglasen genom ultraljudsbehandling i 1 M KOH i 30 min. Efter ultraljudsbehandling, skölj täckglasen med destillerat vatten och håll i vatten tills följande steg.
  2. PEGylera bottenlocket, enligt publicerade protokoll42,43. Använd N-[3-(trimetoxisilyl)propyl]etylendiamin för silanisering och en 1:100 (ww) blandning av biotin-PEG-SVA och mPEG-SVA i 100 mM bikarbonatbuffert. Håll de PEGylerade täckglasen torra vid -20 °C och förvara dem i några veckor.
  3. På dagen för experimenten, ta ut de PEGylerade täckglasen och föna dem med en kvävepistol. Inspektera dem visuellt för smuts för att se till att de är rena.
  4. För att göra provkanalerna, förbered ~ 2 mm breda remsor av dubbelhäftande tejp och lägg ner fyra remsor på ett bottentäcke (PEGylerad yta uppåt), parallellt med och separerade från varandra med ~ 5 mm (figur 3C).
    På så sätt kan tre 5 mm breda provkanaler skapas i en enda flödescell.
  5. Placera ett topptäckglas i mitten av bottenlocket, vilket lämnar ~ 5 mm utrymme på kortsidorna för kanalinlopp och utlopp. Tryck försiktigt på baksidan av det övre täckglaset med pincett för att täta kanalerna ordentligt.
  6. För att skapa en inloppsbehållare, trimma kanten på en 200 μL pipettspets. Skär ut ~ 10 mm från den bredare öppningen för att möjliggöra att hålla ~ 200 μL lösning. Gör tre av dem för de tre flödeskanalerna. För att konfigurera utloppen, förbered tre sprutnålar som passar slangen för sprutpumpen.
  7. Limma behållarna och nålnaven till flödescellen med 5 minuters epoxi. Se till att en fullständig tätning bildas för att undvika läckage och att kanalerna inte blockeras med överflödigt lim. Låt det torka i minst 30 minuter.

7. Montering av pärlförankringskonstruktioner

OBS: Materiallösningarna för MT-experiment, inklusive de för pärlförankringskonstruktioner, införs sekventiellt i flödesceller med hjälp av en sprutpump (figur 3C, D).

  1. Förbered magnetiska pärlor. Ta 5 mg M270-epoxipärlor från en stamlösning (~3,3 × 108 pärlor i 167,5 μL dimetylformamid) och ersätt lösningsmedlet med fosfatbuffert (se tabell 2) genom magnetisk separation av pärlorna.
  2. Förbered pärlorna vid ~ 1,1 × 109 pärlor ml-1 i en fosfatbuffert med 1 M ammoniumsulfat och reagera dem med 2 mM dibensocyklooktyn (DBCO) - NH2. Inkubera blandningen i 3 timmar på en roterande mixer vid rumstemperatur. Efter reaktionen, tvätta pärlorna 3x med färsk fosfatbuffert för att avlägsna oreagerade molekyler.
    OBS: De tvättade pärlorna kan förvaras utan extra rotation vid 4 °C i flera veckor före användning.
  3. Anslut en nål på flödescellkanalens utgång till sprutpumpen med polyetenslang. Balansera kanalerna med PBS.
  4. För in följande lösningar sekventiellt i kanalen genom att suga med pumpen: NeutrAvidin, målkonstruktioner (DNA-hårnålar eller SNARE-komplex med DNA-handtag), referenspolystyrenpärlor och DBCO-belagda magnetiska pärlor. Före användning, virvla pärllösningarna noggrant för att sprida potentiella pärlaggregat.
  5. Tvätta bort obundna pärlor medan du applicerar 0,1 pN kraft.
    OBS: Appliceringen av en liten uppåtgående kraft underlättar avlägsnandet av obundna pärlor och hjälper till att undvika bristning av specifikt bundna pärlförankringskonstruktioner.
  6. För experiment med SNARE-komplex, inkludera 1,5 μM SNAP-25 i den slutliga bufferten.
    OBS: De fria SNAP-25-molekylerna kan binda SNARE-komplex efter utveckling och tillåta upprepade mätningar på ett enda komplex.

8. Identifiering av målkonstruktioner

  1. På ytan av en flödescellkanal, sök efter de magnetiska pärlorna som är bundna av enskilda molekyler i målkonstruktionen. Se till att en referenspärla finns i närheten.
  2. Rotera en kandidatpärla och kontrollera att den svänger fritt. Om pärlan är bunden av flera molekyler uppvisar den en begränsad rörelse.
  3. Rotera pärlan i några kompletta varv och ta reda på rotationsradien (den här funktionen implementeras i den medföljande programvaran). Välj helst en pärla med liten rotationsradie.
    OBS: Denna radie anger hur mycket strängen är avcentrerad från förankringsaxeln, vilket bestäms slumpmässigt under pärlförankringsenheten30,31. I alla experiment lindrar minimal avcentrering av en pärla många artefakter som är associerade med det höga pärlradie till förankringsförlängningsförhållandet vi använder.
  4. Öka kraften från 0 till 5 pN för att identifiera bra enkelbundna pärlor. Leta efter en stor förändring i diffraktionsmönstret för en sträng som härrör från sträckningen av en 1 kbp tjuder (eller motsvarande två 510 bp handtag). Om diffraktionsmönstret inte förändras signifikant, sänk kraften till noll och sök efter en annan kandidatpärla.
    OBS: Lyftningen av en pärla på ~ 300 nm kan lätt märkas från de råa bilderna utan att faktiskt starta spårningsprocessen.

9. Pärlspårning för förlängningsmätningar

OBS: Spårning av pärlor utförs genom att analysera pärlbilder i realtid i LabVIEW-programvaran som medföljer den här artikeln. Spårningsmetoden och dess varianter har använts i de flesta konventionella MT-system och förklaras i tidigare litteratur 2,5,7,26. Genom att mäta positionen för en magnetisk sträng i förhållande till en fast referenssträng (dvs. differentiell spårning) blir positionsmätningarna extremt robusta mot en yttre störning.

  1. När en korrekt magnetisk pärla har hittats tillsammans med en referenspärla, klicka på knappen Kalibrera för att börja förbereda för pärlspårning.
  2. Klicka på pärlorna i bilden för att definiera kulornas placering. Bilderna beskärs sedan till intressanta regioner (ROI) (t.ex. 150 x 150 pixlar för en 3 μm pärla) runt pärlorna och analyseras sedan ytterligare för att extrahera de exakta pärlkoordinaterna.
  3. Vänta tills magnetrotationen är klar. Denna process registrerar x- och y-koordinaterna för strängen (genom att beräkna 2D-korskorrelation 44 eller genom att använda radiell symmetri45 av pärlbilderna, med jämförbar prestanda) medan magneterna roteras för att dokumentera den ocentrerade fastsättningen av pärlan31.
  4. För spårning i z-riktningen, vänta tills programvaran genererar en uppslagstabell med diffraktionsbilder av pärlorna på olika avstånd från fokalplanet. Detta utförs genom att stega objektivlinsen med en piezoskanner i lika avlägsna steg och registrera fluktuationsgenomsnittliga pärlbilder vid varje position. Därefter bestäms z-koordinaterna för pärlorna i faktiska experiment genom att jämföra pärlbilderna i realtid med uppslagstabellen med interpolering7.
  5. När genereringen av uppslagstabellen är klar aktiverar du spårning och autofokusering (tryck på spåret ? och AF? Knappar) och klicka på knappen Skaffa för att börja spela in pärlpositioner.
    OBS: Autofokusering är valfritt men rekommenderas för att korrigera för stegavdriften i z under förvärvet.

10. Tvinga fram system för tillämpning

  1. Experiment med kraftramper: För att kontrollera konstruktionens kraft-förlängningsförhållande, anbringa en kraftramp upp och ner med en konstant belastningshastighet (± 1,0 pN s−1) (figur 4A). Använd till exempel tre omgångar av en 0-20-0 pN-cykel för att verifiera konstruktionens totala längd och handtagens kraftförlängningskurva.
  2. Genom att specificera tetherparametrarna i programvaran, lägg över en WLC-kraftförlängningskurva ovanpå mätdata och bestäm om målsträngen är bunden av en äkta provkonstruktion med korrekta DNA-handtag. Använd konstruktionens kända konturlängd (t.ex. ~340 nm för 1 kbp dsDNA) och WLC-persistenslängd (30-45 nm för kort dsDNA31) som utgångspunkt. Använd vid behov den metod för utvidgningskorrigering som beskrivs i steg 2.11.
  3. Om konstruktionen verifieras, undersök kraftförlängningssvaret i detalj för att leta efter ytterligare förlängning som härrör från målmolekylerna-hårnålarna eller SNARE-komplexen.
  4. Experiment med konstant kraft: Variera gradvis den applicerade kraften i diskreta steg för att undersöka målmolekylernas kraftkänslighet (figur 4B).
    MT möjliggör enkla och effektiva experiment med konstant kraft eftersom den applicerade kraften hålls konstant när magneterna hålls stilla.
    1. För DNA-hårnålar, applicera 4-8 pN kraft med 0,2-0,5 pN-steg och mät strängpositionen för ~ 10 s vid varje kraftnivå.
    2. För SNARE-komplex, applicera 14-16 pN kraft med 0,1-0,2 pN-steg och mät strängpositionen för ~ 10 s vid varje kraftnivå.
  5. Krafthoppsexperiment: Observera övergångshändelserna för SNARE-komplex.
    OBS: Krafthoppsexperiment, som experiment med konstant kraft, involverar förändringar i kraftnivåer. Krafthopp använder emellertid mer plötsliga förändringar i den applicerade kraften, vilket möjliggör övervakning av kraftutlösta händelser i de undersökta molekylerna, såsom en plötslig bristning av proteinkomplex. Till exempel, eftersom SNARE-komplex uppvisar strukturell hysteres i kraftcykling23, är det informativt att utföra krafthoppsexperiment och mäta latensen till övergången (figur 4C).
    1. Packa: Avskalning av en VAMP2-molekyl från ett intakt, ternära SNARE-komplex, vilket lämnar ett binärt komplex av syntaxin-1A och SNAP-25.
    2. Rezipping: Zippning av den uppackade VAMP2-molekylen för att regenerera ett intakt SNARE-komplex.
      1. Utspelas: Full demontering av ett SNARE-komplex åtföljt av fullständig dissociation av SNAP-25. Endast VAMP2- och syntaxinmolekyler finns kvar i konstruktionen efter utveckling.
      2. Vikning igen: Regenerering av ett SNARE-komplex vid bindning av en fri SNAP-25-molekyl från bufferten.
  6. Vid 2 pN, inducera sammansättningen av ett intakt SNARE-komplex genom att vänta (~ 30 s) på föreningen av en fri SNAP25-molekyl. En plötslig minskning av förlängningen observeras vid bildandet av ett SNARE-komplex.
  7. För att observera uppackningshändelser, vänta några sekunder vid 10-12 pN och flytta sedan plötsligt till 14-15 pN med maximal motorhastighet. Beroende på målkraften kommer SNARE-komplexet att uppvisa antingen en reversibel övergång mellan delvis uppackade intermediärer (som i experiment med konstant kraft) eller ett ~ 25 nm hopp till ett högre, uppackat tillstånd efter en slumpmässig väntetid (eller latens).
  8. För att observera rezipping-händelser, sänk kraften till 10-12 pN omedelbart efter att uppackning observerats. Återigen uppvisar SNARE-komplexet en stokastisk övergång till det lägre, dragkedjade tillståndet efter en slumpmässig latens. Om utfällning har inträffat efter uppackning kommer komplexet inte att packas om, eftersom en SNAP-25-molekyl saknas.
  9. För att observera händelser som utvecklas, vänta en längre period efter att uppackningen har observerats för att upptäcka en ytterligare ökning av förlängningen (~ 2 nm).

11. Analys av data

Vilka typer av analyser man kan utföra med MT-data beror på målsystemet. Det finns dock vanliga metoder för att extrahera användbar information från respektive experiment som beskrivs i figur 4. Alla analyser utförs med MATLAB (R2021a) med hjälp av de anpassade koder som medföljer denna artikel. Dessa koder genererar diagram med hjälp av samma data som presenteras i den här artikeln. Observera att medan rådata från 100 Hz-spårning togs direkt för analys, var data från 1,2 kHz-spårning vanligtvis medianfiltrerad (med ett fempunkts skjutfönster) före analys för att minska brus (förutom brusanalys).

  1. Experiment med kraftramper: Analysera kraftförlängningsförhållandet (t.ex. polymerers elasticitet) och överföra kraften för att extrahera information om nanomekaniska egenskaper.
  2. Experiment med konstant kraft: Analysera tillståndspopulationer och uppehållstid (eller övergångshastighet) som en funktion av kraft för att extrahera strukturella (t.ex. regioner som är involverade i övergång), termodynamiska (t.ex. fri energiskillnad) och kinetiska (t.ex. energibarriär) parametrar för konformationsförändringarna.
  3. Krafthoppsexperiment: Analysera bristningskinetik (t.ex. protein-proteininteraktioner och receptor-ligandbindning) eller livslängden för övergående intermediärer (t.ex. utveckling av biomolekyler) för att extrahera stabiliteten hos målmolekyler och deras tillstånd.
  4. Som representativa applikationer, analysera provdata för DNA-hårnålar och SNARE-komplex:
    1. Tvåtillståndsövergångar av en DNA-hårnål: uppackningskraft, öppningsavstånd, kraftberoende av befolkningsförskjutning och tillståndstilldelning och övergångshastighetsmätningar med en dold Markov-modell (HMM) (MATLAB-koder tillhandahålls).
    2. Konformationsförändringar av SNARE-komplex: uppackningskraft, kraftberoende av mellanliggande tillstånd och uppackningsfördröjning, hysteres vid rezipping och utveckling / omvikningsbeteende.
      OBS: Kraftförlängningsmodeller för DNA-handtag, DNA-hårnålar och SNARE-komplexa konformationer ges i tidigare referenser 14,31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tvinga kalibrering
Resultaten från de två kraftmätningsmetoderna (pärlornas laterala förskjutningsvarians och effektspektrumanalys) skilde sig åt med 0-2 pN (figur 2G). Enligt resultaten i figur 2F kan vi på ett tillförlitligt sätt nå upp till 30 pN med vanliga neodymmagneter.

Tvåtillståndsövergångar av en 8 bp DNA-hårnål
Vi undersökte först nanomekaniken hos en kort DNA-hårnål (figur 5). DNA-hårnålar har i stor utsträckning karakteriserats av konventionell kraftspektroskopi med en molekyl, och därför finns en stor referenskälla att jämföra med. Att packa upp en kort hårnål är vanligtvis reversibel, så dess rezippningshändelser observeras också i samma kraftområde där uppackning sker (figur 5A). Genom att applicera en kraftramp mellan 0 pN och 20 pN (figur 5B) verifierades den kraftinducerade förlängningen av hårnålskonstruktionen för att följa en WLC-modell, som enbart kan hänföras till elasticiteten hos DNA-handtag (figur 5C, "stängd"). Vid cirka 6 pN visade konstruktionen ytterligare fluktuationer i förlängningen, förknippade med reversibel uppackning av hårnålsstrukturen (figur 5C, infälld). Slutligen, vid ~ 8 pN, försvann övergången så småningom och förlängningen bosatte sig på det övre tillståndet som förlängdes ytterligare med ~ 7 nm. Följaktligen fästes den uppmätta kraftförlängningsprofilen över 8 pN på en ny modellkurva (figur 5C, "öppen") som inkluderar längden på det enkelsträngade området på den öppna hårnålen.

Vi utförde sedan experiment med konstant kraft för att systematiskt undersöka hårnålsövergången. Strängpositionen mättes i kraftområdet 4-8 pN med 0,5 pN steg för ~ 10 s på varje nivå; Därefter samlades förlängningsvärdena in och analyserades för att mäta deras jämviktsfördelning som en funktion av kraft. Resultaten från 100 Hz-spårning föreslog en gradvis övergång till ett mer utökat tillstånd i denna kraftregim (figur 5D), men de erhållna histogrammen för förlängningen var inte tillräckligt tydliga för att lösa distinkta populationer (figur 5E). I skarp kontrast, när samma experiment utfördes vid 1,2 kHz (figur 5F), avslöjade höghastighetsbanorna för förlängningsförändringar efter mild filtrering (fempunkts medianfilter) två distinkta populationer som beskrivs väl av en blandning av två Gaussfördelningar (Figur 5G). Separationen mellan de två populationerna, som indikerar hårnålens öppningsavstånd, förblev oförändrad vid ~ 7 nm i uppackningskraftregimen (figur 5H). Avvikelsen i extremiteterna (4 pN och 8 pN) berodde på felaktig lokalisering av ett tillstånd på grund av dess knapphet.

Data avslöjade att mittkraften för att packa upp övergången (den kraft vid vilken de slutna och öppna populationerna blir lika) F1/2 var ~ 6 pN, och det övre, öppna tillståndet blev gradvis dominerande när vi ökade kraften över 4-8 pN (figur 5I). När de försågs med en Boltzmannrelation för den öppna sannolikheten Equation 10erhölls de exakta värdena F 1/2 = 5,9 pN och Δz = 7,1 nm, i överensstämmelse med ovanstående observationer. Det bör dock noteras att öppningskraften som erhålls från en enda konstruktion kanske inte är korrekt på grund av pärl-till-pärl-variationen i kraftgenerering, som uppmättes till ~ 4% för de kommersiella M270-pärlorna31. Vidare, eftersom stamlängden (8 bp) är kort, kan grundsanningsöppningskraften hos andra 8 bp hårnålar med olika nukleotidkomposition variera mycket20. Slutligen tillämpade vi HMM på förlängningsspåren för att kartlägga tillståndsövergången och mätte därmed övergångshastigheterna (figur 5F, röd spårning). Både uppacknings- och rezippningshastigheterna varierade exponentiellt med applicerad kraft (figur 5J), på ett sådant sätt att kraften främjar uppackning och hämmar rezipping. Vid behov kan man vidare använda det klassiska Bell-uttrycket för att extrahera energilandskapets parametrar (t.ex. barriärhöjd och avstånd)46.

Karakterisering av termiska fluktuationer i förlängningsmätningar
Med hjälp av hårnålskonstruktionen profilerade vi det kraftberoende bruset i förlängningsmätningar. Först beräknades de termiska fluktuationerna för en bunden sträng från ekvationer med hjälp av parametrarna (t.ex. pärlradie, förankringslängd) som är lämpliga för dessa experiment2,5 (figur 5K, fasta kurvor). Vi plottade också standardavvikelsen för förlängning Equation 11 mätt från tidsspåret av en hårnålskonstruktion vid distinkta kraftnivåer. Eftersom denna molekyl hade ett hårnålsmotiv användes dess svar under 4 pN (stängt tillstånd) för mätning av inneboende brus, medan hårnålsdynamiken detekterades ~ 6 pN, som förväntat, och fungerade som en kontroll. Den kraftberoende undertryckandet av fluktuation observerades också efter att hårnålen blev mestadels öppen (jämför 8 pN vs. 4 pN). Jämförelse med den termiska gränsen indikerar att det finns utrymme för förbättringar, men detta återstående brus är ofta förknippat med rotationsfluktuationen hos en magnetisk pärla30, vilket är slumpmässigt och utmanande att lösa. För mer systematisk analys av det bruna bruset över observationstiden används ofta beräkningen av Allan-avvikelsen32,33. Vi beräknade Allan-variansen för hårnålsdata som presenteras i figur 5F, på samma sätt som 5 kbp-mätningarna i figur 2C. Resultaten i figur 5L visar att vi i mellankraftområdet 4-8 pN erhöll 2-3 nm Allan-avvikelse vid maxhastigheten (1,2 kHz), och detta värde sjönk till under 1 nm för observationstiden (τ) längre än 0,1 s. Intressant nog uppstod hårnålsdynamiken runt 5-7 pN för ~ 0,01 s (figur 5L, infälld), i överensstämmelse med den uppmätta övergångskraften och hastigheterna i figur 5I, J.

Konformationsförändringar av neuronala SNARE-komplex
Vi använde sedan neuronala SNARE-komplex som proteinmodell och undersökte deras kraftberoende mekaniska egenskaper. Till skillnad från hårnålskonstruktionen hölls enstaka SNARE-komplex mellan två 510 bp dsDNA-handtag (figur 6A). Det bör noteras att terminerna för syntaxin-1A och VAMP2, distala från handtagen, tvärfästes av en disulfidbindning mellan artificiella cysteinrester för att undvika bristning och möjliggöra flera omgångar pincett av en given konstruktion.

Vi applicerade först en kraftramp, både med ökande och minskande kraftnivåer (± 1 pN s−1) för att sträcka respektive slappna av målkonstruktionen. I låg- till mellankraftregimen (0-10 pN) uppträdde de två handtagen oberoende av varandra som WLC-polymerer, vilket totalt sett formade kraftförlängningskurvan som inte kunde skiljas från den för 1 kbp dsDNA (figur 6B, svart). Men när kraften ökades till över 10 pN avvek förlängningsvärdena avsevärt från WLC-modellen, vilket indikerar att det inbäddade SNARE-komplexet uppvisade en ytterligare ökning av förlängningen. Mer specifikt kan förlängningsökningen sammanfattas i tre distinkta steg: (a) en liten, gradvis ökning av 11-13 pN, (b) snabba och större (~ 10 nm) fluktuationer i 14-16 pN, och (c) den slutliga, irreversibla uppackningen på cirka ~ 20 nm. Dessutom, när kraften sänktes för att slappna av konstruktionen, snäppte förlängningen antingen tillbaka till den ursprungliga kraftförlängningskurvan vid en lägre kraft (<15 pN) eller följde en ny modellkurva med en större förlängning (figur 6B, blå). Den totala utvidgningen återställdes så småningom till de lägre värdena (från blått till svart i figur 6B) under 5 pN och samma kraftrampcykler kunde tillämpas, vilket visade en liknande trend.

Från molekylmodellen för SNARE-komplex konformation kan vi exakt beräkna de möjliga förlängningsvärdena för potentiella intermediärer (figur 6C). Dessutom, förutsatt WLC-beteendet för de olindade polypeptiderna, kan förlängningarna uppskattas som en funktion av kraft, vilket genererar de fullständiga kraftförlängningsmodellerna för de olika konformationerna (figur 6B, prickade linjer). Med dessa värden som referens tolkade vi ovanstående övergångar enligtföljande 14,23: (a) en gradvis övergång från det helt zipperade tillståndet (FZ) till det länköppnande tillståndet (LO) i 11-13 pN, vilket innebär öppningen av länkregionerna syntaxin-1A och VAMP2; b) Snabb övergång mellan LO och halvblixtlåset (HZ), vilket innebär att ett SNARE-komplex öppnas upp till det nollte jonskiktet. och (c) den slutliga övergången till antingen det uppackade (UZ) eller det utfällda tillståndet (UF), vilket innebär en fullständig upplösning av VAMP2 från resten av komplexet. UZ-tillståndet skiljer sig från UF genom att den associerade molekylen i SNAP-25 fortfarande är bunden till syntaxin-1A, vilket upprätthåller ett binärt komplex. När det gäller UF (utan SNAP-25) kan hela SNARE-komplexet regenereras först efter att en fri SNAP-25-molekyl från lösningen rekombineras, där sänkning av den applicerade kraften för att möjliggöra sådan ombindning är kritisk.

För att verifiera konformationsförändringarna av SNARE-komplex på ett mer systematiskt sätt utförde vi sedan krafthoppsexperiment i kraftregimen, där konformationsfluktuationer ofta observerades vid 14-15 pN (figur 6D). Vanligtvis började vi först med att mäta strängpositionen vid 10 pN och kontrollerade för den stabila förlängningen, vilket indikerar frånvaron av SNARE-relaterade förändringar. Därefter ökades kraftnivån plötsligt till 14-15 pN, vid vilken förlängningen övervakades tills uppackning inträffade, om någon. Slutligen reducerades kraften tillbaka till 10 pN för att kontrollera om det fanns någon bestående ökning av förlängningen i samband med utfällning. Vid 14 pN stannade förlängningsspåren mestadels i LO-tillståndet, med enstaka spikar till HZ-tillståndet. Det bör noteras att dessa korta utflykter till HZ-tillståndet sannolikt kommer att missas i 100 Hz-spårning, vilket är medelvärden och nedsamplar pärlbilder med en faktor 12. Trots de tydliga och frekventa besöken i HZ-tillståndet misslyckades komplexet med att göra en fullständig övergång till UZ-tillståndet (figur 6E), vilket tyder på att den yttre kraften inte var tillräckligt stark för att övervinna energibarriären för att packa upp. Däremot gjorde även en liten ökning av kraften (till 14,3 pN) övergången mycket effektiv så att UZ-tillståndet nåddes mestadels inom några sekunder (figur 6F). Konsekvent avslutades uppackningen mestadels inom 1 s när vi applicerade 14,5 pN på komplexet (figur 6G, H). I synnerhet ledde uppackning vid högre krafter ofta till fullständig utveckling av hela komplexet (åtföljt av avlägsnandet av SNAP-25), vilket framgår av den lilla ytterligare ökningen av förlängningen ovanför UZ (figur 6H) och av den omvikningssignatur som observerades vid 2 pN (figur 6I). Sammantaget visar dessa data det klassiska slip-bond-beteendet47 för utvecklingen av SNARE-komplex, i överensstämmelse med tidigare rapporter 14,23,48.

Figure 1
Bild 1: Instrumentinställning. Schematisk (A) och fotografi (B) av en MT-installation med hög hastighet. Magneter som styrs av en linjär och en rotationsmotor är placerade ovanför provsteget i ett inverterat mikroskop utrustat med en 100x oljenedsänkningslins och en höghastighets CMOS-kamera. Ljusstrålen från en superluminescerande diod passerar genom magneterna och belyser fältet. Infälld: Representativa diffraktionsbilder av pärlor som ligger på olika avstånd från fokalplanet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Kraftkalibrering. (A) Schematisk bild av ett kraftkalibreringsprov. Storleken på kraften som utövas av ett antiparallellt par magneter med 1 mm separation mäts som en funktion av magnetavståndet d från förskjutningarna av en magnetisk pärla (M270) bunden av ett 5 kbp dsDNA-fragment. b) Representativa data från kraftkalibreringsförfarandet. Färgade pilar anger områden som är expanderade i (D) (matchande färger). (C) Allanavvikelse för z-positionen för en 5 kbp bunden sträng mätt med 15-20 pN. Kurvor för den magnetiska pärlan z-koordinaterna före (blå) och efter (röd) subtrahering av referenssträngens position visas. (D) Representativa tidsserier för y-läget mätt vid det angivna magnetavståndet d. Motsvarande histogram för y-koordinatfördelning visas till höger med en gaussisk passform (röd). E) Representativt PSD utifrån de data som anges i D. De kraftvärden som erhålls genom att montera en modell (röd) på respektive PSD anges ovanpå. (F) Kalibrering av magnetisk kraft som en funktion av magnetavståndet. Krafterna mättes antingen från variansen (vänster) eller från PSD-metoden (höger). Passningen (röd) indikerar en dubbelexponentiell modell med den kommenterade ekvationen. (G) Skillnad i den uppmätta kraften erhållen från varians och PSD. En röd kurva beräknas för passningarna som visas i (F). (H,I) Verifiering av kraftförlängningsförhållandet för 5 kbp-kalibreringskonstruktionen. De genomsnittliga utvidgningsvärdena vid distinkta kraftnivåer (mätt från varians) användes antingen direkt (H) eller efter korrigering för stränghöjdsförskjutningen (I) på grund av lutningen av en off-centrerad sträng31. Kraftförlängningsdata för n = 5 molekyler anpassades med en utökningsbar WLC-modell och de anpassade parametrarna (persistenslängd Lp och sträckmodul Ko) är noterade ovanpå (medelvärde ± s.d.). Förkortning: PSD = effektspektral densitet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Beredning av prover . (A) Beredning av DNA-hårnålskonstruktioner med 8 bp genom PCR-amplifiering av en 1 kbbp-region av λ-DNA. (B) Beredning av SNARE-komplexa konstruktioner med två 510 bp DNA-handtag. Infälld: Verifiering av DNA-handtag och deras bindning till proteiner genom agarosgelelektrofores (2% gel). Pilar indikerar mobilitetsförskjutning (färgkodad) för produktarter: fria 510 bp-handtag (magenta); Handtag B fäst vid syntaxin (röd), ΔN-komplex (grön) och SNARE-komplex (blå); och det slutliga tvåhanterade SNARE-komplexet (grönt). Tillsatsen av SDS stör ΔN-komplexen (närvarande i b) men inte de fullständiga SNARE-komplexen som bildas av VAMP2 i full längd (närvarande i c). (C) Design och fotografi av en flödescell för MT-experiment. d) Schematisk bild av provlösningarnas sekventiella införande i en flödescellkanal. Förkortning: MT = magnetisk pincett. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Typer av representativa experiment. (A-C) Scheman över kraftramp-, kraftklämma- och krafthoppsexperiment (överst) med representativa tidsspår av förlängning från motsvarande mätningar (mitten). De typer av analyser som kan utföras visas längst ner. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Tvåtillståndsövergång av en 8 bp DNA-hårnål. (A) Schematisk bild av MT-experiment på en DNA-hårnål med förväntad uppackning och rezippningsövergång. (B) Representativt spår av konstruktionsförlängning från kraftrampexperiment med ökande (~ 0,25 pN s−1) kraftnivåer. (C) Representativ kraft-förlängningskurva rekonstruerad från data i (B). Gula kurvor indikerar WLC-modeller för hårnålskonstruktionen med hårnålen i den slutna (fasta) och öppna (streckade) konformationen. (D) Representativa förlängningsspår från experiment med konstant kraft med ökande kraftnivåer, uppmätta vid 100 Hz. (E) Histogram av förlängningsdata i (D). (F,G) Resultat för samma experiment i (D) och (E) men med 1,2 kHz spårning. Den råa 1,2 kHz-tidsserien jämnades ut genom att använda ett fempunkts medianfilter. Röda spår i den utvidgade vyn av (F) erhölls från en HMM. Röda linjer i (G) anger var Gaussiska populationer finns. (H) Avstånd mellan de två populationerna i (G). (I) Sannolikhet i öppet tillstånd som en funktion av den applicerade kraften. Den röda kurvan är en monterad Boltzmann-modell (Equation 10 ) med mittkraften F1/2 = 5,9 pN. (J) Övergångshastigheter för uppackning och rezippning mätt från HMM-resultaten. Heldragna linjer indikerar exponentiellt beroende av kraft. k) Termisk fluktuation i utvidgningsmätningar. Standardavvikelser för hårnålsförlängningsdata (utan filtrering) visas som en funktion av kraften. Gränsen för termisk upplösning som representerar den teoretiska storleken på termiska fluktuationer uppskattades från Eq. 9 i arbetet av Choi et al.2 för en 2,8 μm pärla med en 1 kbp tjuder. (L) Allanavvikelser beräknade utifrån 1,2 kHz hårnålsdata i (F) (utan filtrering). Infälld visar Allan-avvikelsen vid 0,01 s som en funktion av kraft, vilket visar en gradvis ökning och minskning av fluktuationer på grund av hårnålsdynamiken. Förkortning: MT = magnetisk pincett. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Konformationsförändringar av neuronala SNARE-komplex. (A) Schematisk bild av MT-experiment på SNARE-komplex. (B) Representativa kraftförlängningskurvor för SNARE-konstruktionen. Svarta och blå spår (100 Hz) erhölls från sträcknings- respektive avslappningsperioder i kraftrampexperiment. Streckade linjer anger förlängningsmodeller, som redogör för de olika konformationerna av SNARE-komplex som visas i (C). (C) Molekylmodeller av SNARE-komplexa konformationer med motsvarande beräknade utvidgningar. Värdena uppskattades från de geometriska parametrarna för spiralformade buntar och en WLC-modell för polypeptidregionen14. (D) Schematisk bild av krafthoppsexperiment för att undersöka SNARE-komplexa konformationer. (E-H) Representativa förlängningsspår från krafthoppsexperiment utförda vid de angivna kraftnivåerna. I (E) observerades inte uppackning. I (F) och (G) observerades uppackning följt av rezipping vid 10 pN. I (H) följdes uppackningen av ytterligare en händelseutveckling. i) Omvikning av ett SNARE-komplex vid 2 pN. En tydlig minskning av förlängningen från UF till FZ-tillstånd observerades vid 5 pN. Förkortning: MT = magnetisk pincett. Klicka här för att se en större version av denna figur.

PCR-inställning Tillstånd
Material 1,25 μg/ml λ-DNA (mall), 1 μM primrar framåt och bakåt, 0,2 mM dNTP, 0,05 E/μL nTaq, 1x nTaq-buffert
Denaturering 95 °C i 30 s
Glödgning Kalibreringskonstruktion: 55 °C i 30 s
DNA-hårnål: 57 °C i 30 s
DNA-handtag: 50 °C i 30 s
Förlängning DNA-hårnål och handtag: 72 °C i 1 min
Kalibreringskonstruktion: 72 °C i 5 min
Cykel 30–34
Agarosgelelektrofores
Gel 2 % agaros i 0,5x trisborat-EDTA (TBE, pH 8,3) innehållande 1x SYBR Safe
Löpning Full effekt (108 V avg) på Mupid-2plus (Advance), 40-50 min

Tabell 1: Villkor för PCR-reaktioner och agarosgelelektrofores. Reaktionsparametrar för PCR av DNA-konstruktioner, inklusive 5 kbp dsDNA för kraftkalibrering, DNA-hårnålskonstruktion och DNA-handtag för att fästa SNARE. Primersekvenser anges i materialtabellen.

Proteinreningsbuffert Sammansättning
Tvätta buffert A 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 500 mM NaCl, 7 mM β-merkaptoetanol (BME), 10% glycerol och 20 mM imidazol
Tvätta buffert B 50 mM HEPES (pH 7,2), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 10% glycerol och 20 mM imidazol
Lysis buffert Tvättbuffert A kompletterad med 1% Triton X-100, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) och 1x proteashämmarecocktail
Elueringsbuffert Tvättbuffert B kompletterad med 400 mM imidazol
Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) 81 mM natriumfosfatdibasiskt (Na2HPO4), 19 mM monobasiskt natriumfosfat (NaH2PO4)(pH 7,2), 150 mM NaCl
fosfatbuffert 81 mM Na 2 HPO 4, 19 mM NaH2PO 4, pH7,4

Tabell 2: Buffertar och deras sammansättning. Sammansättning av buffertar som används för proteinrening.

Kompletterande figur S1: Ritning av en magnethållare. Mått på en akrylhållare för två 10 mm x 10 mm x 12 mm magneter med 1 mm mellanrum visas. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 1: En zippad fil som innehåller MATLAB-koder. MATLAB-skript för analys av data som produceras av höghastighetsmagnetiska pincettexperiment, inklusive kraftkalibrering, hårnål och SNARE-komplex analys. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 2: LabVIEW-programvarupaketet zippad fil. Ett komplett paket med LabVIEW-koder för att använda en höghastighets magnetisk pincettinställning och hämta data med den. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta arbete introducerade vi en kraftspektroskopi med en molekyl som kan observera strukturella förändringar av biomolekyler med hög spatiotemporal precision. Den använda CMOS-höghastighetskameran får 1 200 bilder s-1 med 1 280 x 1 024 upplösning, vilket möjliggör 1,2 kHz pärlspårning. Mäthastigheten är dock för närvarande begränsad av pärlspårningsprogramvaran, så avkastningen reduceras vanligtvis till mindre områden i höghastighetsmätningar. SLD: s höga effekt ger en stark belysning som är avgörande för snabb pärlavbildning upp till några kHz bandbredd. Dessutom genererar strålens rumsliga koherens koncentriska diffraktionsringar med hög kontrast runt pärlorna (figur 1A, infälld), vilket möjliggör exakt bestämning av strängpositionen baserat på symmetri.

Den magnetiska kraften som utövas på en pärl-tjuderkonstruktion kan bestämmas genom att mäta de bruniska fluktuationerna hos den bundna pärlan35,37,38. Eftersom kraftanalys i realtid är beräkningstung mäts den applicerade kraften vanligtvis i förväg med hjälp av en referenskonstruktion. Till exempel är de magnetiska pärlorna som ska användas bundna av långa (>5 kbp) dsDNA-fragment, och motsvarande termiska fluktuationer i strängposition mäts som en funktion av magnetavståndet (figur 2A). Kraftkalibreringen utförs vanligtvis en gång efter att installationen har byggts, men det är inte nödvändigt att upprepa den regelbundet om inte inställningen ändras, till exempel genom att byta ut magneterna. Eftersom den karakteristiska frekvensen av pärlfluktuation ökar med den applicerade kraften2, är en höghastighetsinställning särskilt användbar för att fånga den snabba dynamiken i en högkraftregim och mäta kraften exakt. Kraftuppskattning från varians är mycket enklare i dess implementering än spektralanalysen i frekvensdomänen, men den är mottaglig för artefakter från drift, kamerabaserad förvärv och förlängningsändringar på grund av off-centrerad pärlfäste31,37,38. Ändå skiljer sig resultaten från de två metoderna endast med 0-2 pN om de erhålls korrekt (figur 2G); Så variansmetoden är tillräckligt tillförlitlig när den absoluta bestämningen av kraft inte är kritisk.

För högre krafter över 30 pN och vid cirka 65 pN (vid vilken dsDNA-översträckning fungerar som riktmärke) måste antingen kommersiellt tillgängliga högkvalitativa (N50-N52) magneter installeras, gapet mellan magneterna måste minskas eller magnetfältet måste konstrueras ytterligare28,49. I denna inställning är den vertikala motorns snabbaste hastighet 30 mm / s, vilket möjliggör ett krafthopp från 0 pN till 20 pN i ~ 0,6 s. Vissa snabba kraftberoende strukturella förändringar kan missas om motorrörelsen begränsar kraftbelastningshastigheten. Beroende på applikationen kan ändringar och ytterligare optimering av hur magneter flyttas vara nödvändiga. Ett exempel är kreativ användning av ett magnetbandhuvud15.

För högupplösta mätningar med MT är det viktigt att utvärdera ljudnivån från olika källor. När de optiska komponenterna (ett mikroskop med en högförstoringslins, stark ljuskälla och snabb kamera) är korrekt konfigurerade kan subnanometerprecision i pärlspårning uppnås. Sedan blir den största ljudkällan den bruna rörelsen hos en pärla, som används för att mäta den applicerade kraften. Den termiska fluktuationen hos en bunden pärla beror på dess radie, förankringslängd och den applicerade kraften. Även om den inneboende fluktuationen i z-riktning (dvs. förlängningsförändringar) enbart beror på termisk energi och förankringsstyvhet, filtrerar pärl-tetherdynamiken och hastigheten för kamerabaserad förvärv pärlans rörelse och därmed övervakningen av målbiomolekyler i sin tur. Därför måste strängstorlek och samplingsfrekvens väljas strategiskt för att uppnå god spatiotemporal upplösning. Som ett alternativ till den 2,8 μm pärla vi använde är mindre 1 μm pärlor också populära och kan vara fördelaktiga för snabba mätningar på grund av deras snabba respons. En kritisk svaghet är dock det lilla magnetiska innehållet, vilket begränsar den maximala kraften som kan genereras (Equation 12 ). Eftersom mindre pärlor fortfarande kan utöva kraft åtminstone upp till 10 pN, kan de vara lämpliga för att studera svaga kraftfenomen, såsom vid DNA-supercoiling. Däremot kräver undersökningar av molekylära motorer, proteinveckning (t.ex. SNARE, visas här) eller cellmekanik50 applicering av högre krafter, i vilket fall man kan överväga att modifiera magnetkonfigurationen (t.ex. minska gapet eller avståndet) för att utöka intervallet för tillämplig kraft 28,51.

Eftersom tekniken undersöker de nanomekaniska svaren hos målmolekyler samtidigt som den applicerar en kraft på den biofysiskt relevanta skalan, är den idealisk för att studera kraftkänsliga element som spelar avgörande roller i mekanobiologiska processer. För att illustrera den breda tillämpligheten av MT-analysen med hög precision använde vi både en nukleinsyra och en proteinmodell som uppvisar dynamiska och snabba konformationsförändringar vid applicering av en pikonewton-skala kraft. En begränsning av tekniken är kravet på renade nukleinsyror och proteiner, vilket särskilt har avskräckt dess breda utvidgning till ett brett spektrum av proteiner. Utvecklingen av in vitro-proteinuttryck och konjugeringsteknik kommer att fortsätta att ge tillgång till mindre studerade proteiner. En relaterad fråga är att a priori-kunskap om målstrukturen ofta är avgörande för designexperiment (t.ex. fastsättning av handtag). Vi förväntar oss att tillkomsten av kryo-EM 52 med en partikel ochAlphaFold2 53 starkt kommer att stödja design och analys av mekaniska mätningar på enskilda proteinmolekyler och frigöra mer kraftfulla tillämpningar av högupplöst MT.

Den uppackande kraften hos DNA-hårnålar beror på många faktorer, inklusive sekvens, struktur och buffertsammansättning, men mest kritiskt på stamlängd och guanin-cytosinhalt (GC)20. För att demonstrera kraften i höghastighetsspårning designade vi avsiktligt en 8 bp-stam (med tre GC-baspar) som förväntades utvecklas med låg kraft med snabb dynamik. Resultaten i figur 5 visar att en sådan snabb dynamik skulle ha varit svår att lösa med standardtekniker med en upplösning på 10 ms eller lägre. Denna aspekt bekräftas ytterligare av övergångshastigheterna uppmätta från HMM-analysen, vars höga hastigheter varierade mellan 100 och 200 s-1 (figur 5J).

Neuronala SNARE tros driva synaptisk vesikelexocytos. I synnerhet katalyserar SNARE-proteinerna membranfusion genom att sänka den associerade energibarriären, såsom elektrostatisk repulsion mellan vesikel och plasmamembran. Följaktligen visar sig konformationsfluktuationer hos SNARE-komplexen inträffa i ett smalt kraftområde på 12-15 pN, vilket motsvarar den förväntade nivån av repulsiva krafter14,23. Med hjälp av höghastighets-MT som beskrivs här sammanfattade vi de viktigaste resultaten om det kraftberoende beteendet hos neuronala SNARE-komplex. Krafthysteresen vid uppackning och rezipping (figur 6B) indikerar att rezipping sker med lägre kraft än unzipping, och därför görs arbete under denna cykel. Sådana icke-jämviktsövergångar närmar sig bättre genom krafthoppsexperiment, där latensen till övergång under belastning (liknande en bindningsbrotthändelse) eller konformationsfluktuationer före uppackning kan mätas. Båda fallen drar nytta av höghastighetsinställningar, vilket illustreras av nyligen genomförda studier om de övergående tillstånden hos biomolekyler och deras komplex 15,17,54,55,56.

Sammantaget överensstämmer dessa resultat med de karakteristiska kraftberoende förändringarna av DNA-hårnålar och neuronala SNARE-komplex som rapporterats med konventionell enmolekylär kraftspektroskopi. Samtidigt understryker de nyttan av mekaniska mätningar med hög precision för att avslöja kraftkänsligheten hos biomolekyler och deras sammansättningar. Vi hoppas att den här artikeln kan locka fler människor från området mekanobiologi, vilket motiverar forskare att använda höghastighets-MT för att undersöka sina unika system av intresse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Research Foundation of Korea (NRF) bidrag finansierat av den koreanska regeringen (MSIT) (NRF-2022R1C1C1012176, NRF-2021R1A4A1031754 och NRF- 2021R1A6A1A10042944). S.-H.R. stöddes av NRF-bidraget (2021R1C1C2009717).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials for construct synthesis
Agarose gel electrophoresis system Advance Mupid-2plus
DNA ladder Bioneer D-1037
nTaq polymerase Enzynomics P050A
PCR purification kit LaboPass CMR0112
PEGylated SMCC crosslinker / SM(PEG)2 ThermoFisher Scientific 22102 For SNARE–DNA coupling
Primer B Bioneer 5'-Biotin/TCGCCACCATCATTTCCA-3' For 5-kbp force calibration construct and DNA handles
Primer B_hp IDT 5'-Biotin/TTTTTTTTTTGTTCTCTATTT
TTTTAGAGAAC /AP site/ /AP site/ TCGCCACCATCATTTCCA-3'		 For hairpin construct
Primer N Bioneer 5'-C6Amine/CATGTGGGTGACGCGAAA-3' For DNA handles
Primer Z Bioneer 5'-Azide/TCGCCACCATCATTTCCA-3' For DNA handles
Primer Z_5k Bioneer 5'-Azide/TTAGAGAGTATGGGTATATGACA
TCG-3'		 For 5-kbp force calibration construct
Primer Z_hp Bioneer 5'-Azide/GTGGCAGCATGACACC-3' For hairpin construct
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoFisher Scientific S33102
λ-DNA Bioneer D-2510 Template strand for PCR
DNA sequences for SNARE proteins
6×His-tagged SNAP-25b (2-206; capitalized) in pET28a homemade tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt
ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggttccg
atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggcctattggtta
aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg
cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttgtttatttttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttgttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct
gtaacatcattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcagacagttttattgttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc
gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg
cacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctat
gagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgagggagcttcca
gggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt
acggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcgg
aagagcgcctgatgcggtattttctccttac
gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg
acacccgccaacacccgctgacgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggttttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga
tttctgttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacagggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg
cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa
ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc
gtattgggcgccagggtggtttttcttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggccctgagagagttgcagcaag
cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa
aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagatatttatgccagc
cagccagacgcagacgcgccgagacagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca
gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac
aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt
tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca
gctccgccatcgccgcttccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacgcgggaaacggtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacgttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc
cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg
atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttgtttaactt
taagaaggagatataccATGGGCAGC
AGCCATCATCATCATCATCACA
GCAGCGGCCTGGTGCCGCGC
GGCAGCCATACTAGCGGAGAT
ATCGCCGAGGACGCAGACAT
GCGCAATGAGCTGGAGGAGA
TGCAGAGGAGGGCTGACCAG
CTGGCTGATGAGTCCCTGGA
AAGCACCCGTCGCATGCTGC
AGCTGGTTGAAGAGAGTAAA
GATGCTGGCATCAGGACTTT
GGTTATGTTGGATGAGCAAG
GCGAACAACTGGAACGCATT
GAGGAAGGGATGGACCAAAT
CAATAAGGACATGAAAGAAG
CAGAAAAGAATTTGACGGAC
CTAGGAAAATTCGCCGGCCT
TGCCGTGGCCCCCGCCAAC
AAGCTTAAATCCAGTGATGC
TTACAAAAAAGCCTGGGGC
AATAATCAGGATGGAGTAGT
GGCCAGCCAGCCTGCCCG
TGTGGTGGATGAACGGGAG
CAGATGGCCATCAGTGGTG
GCTTCATCCGCAGGGTAAC
AAATGATGCCCGGGAAAAT
GAGATGGATGAGAACCTG
GAGCAGGTGAGCGGCATC
ATCGGAAACCTCCGCCAC
ATGGCTCTAGACATGGGCA
ATGAGATTGACACCCAGA
ATCGCCAGATCGACAGGA
TCATGGAGAAGGCTGATT
CCAACAAAACCAGAATTG
ATGAAGCCAACCAACGTG
CAACAAAGATGCTGGGAA
GTGGTTAAggatccgaattcgag
ctccgtcgacaagcttgcggccgcactc
gagcaccaccaccaccaccactgagat
ccggctgctaacaaagcccgaaagga
agctgagttggctgctgccaccgctgag
caataactagcataaccccttggggcct
ctaaacgggtcttgaggggttttttgctga
aaggaggaactatatccggat
6×His-tagged VAMP2 (2-97, L32C/I97C; capitalized) in pET28a homemade tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt
ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggttccg
atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggcctattggtta
aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg
cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttgtttatttttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttgttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct
gtaacatcattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcagacagttttattgttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc
gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg
cacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctatg
agaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgagggagcttcca
gggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt
acggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagc
ggaagagcgcctgatgcggtattttctccttac
gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg
acacccgccaacacccgctgacgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggttttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga
tttctgttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacagggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg
cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa
ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc
gtattgggcgccagggtggtttttcttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggccctgagagagttgcagcaag
cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa
aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagatatttatgccagc
cagccagacgcagacgcgccgagacagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca
gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac
aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt
tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca
gctccgccatcgccgcttccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacgcgggaaacggtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacgttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc
cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg
atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttgtttaactt
taagaaggagatataccATGGGCAGC
AGCCATCATCATCATCATCAC
AGCAGCGGCCTGGTGCCGC
GCGGCAGCCATATGGCAGAT
CTCTCGGCTACCGCTGCCAC
CGTCCCGCCTGCCGCCCCG
GCCGGCGAGGGTGGCCCCC
CTGCACCTCCTCCAAATCTTA
CCAGTAACAGGAGATGCCAG
CAGACCCAGGCCCAGGTGG
ATGAGGTGGTGGACATCATG
AGGGTGAATGTGGACAAGGT
CCTGGAGCGAGACCAGAAG
CTATCGGAACTGGATGATCG
CGCAGATGCCCTCCAGGCA
GGGGCCTCCCAGTTTGAAA
CAAGTGCAGCCAAGCTCAA
GCGCAAATACTGGTGGAAA
AACCTCAAGATGATGTGCTA
Aggatccgaattcgagctccgtcg
acaagcttgcggccgcactcgagcaccacca
ccaccaccactgagatccggctgctaacaaa
gcccgaaaggaagctgagttggctgctgcca
ccgctgagcaataactagcataaccccttgg
ggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg
ctgaaaggaggaactatatccggat
6×His-tagged ΔN-VAMP2 (49–96; capitalized) and Syntaxin-1A (191–267, I202C/I266C; capitalized) in pETDuet-1 homemade ggggaattgtgagcggataacaattcccctc
tagaaataattttgtttaactttaagaagga
gatataccATGGGCAGCAGCCATCA
TCATCATCATCACAGCAGCGG
CCTGGAAGTTCTGTTCCAGGG
GCCCGGTAATGTGGACAAGGT
CCTGGAGCGAGACCAGAAGCT
ATCGGAACTGGATGATCGCGC
AGATGCCCTCCAGGCAGGGGC
CTCCCAGTTTGAAACAAGTGC
AGCCAAGCTCAAGCGCAAATAC
TGGTGGAAAAACCTCAAGATGAT
GTAAgcggccgcataatgcttaagtcgaaca
gaaagtaatcgtattgtacacggccgcataa
tcgaaattaatacgactcactataggggaat
tgtgagcggataacaattccccatcttagta
tattagttaagtataagaaggagatatacat
ATGGCCCTCAGTGAGATCGAGA
CCAGGCACAGTGAGTGCATC
AAGTTGGAGAACAGCATCCG
GGAGCTACACGATATGTTCAT
GGACATGGCCATGCTGGTGG
AGAGCCAGGGGGAGATGATT
GACAGGATCGAGTACAATGTG
GAACACGCTGTGGACTACGTG
GAGAGGGCCGTGTCTGACACC
AAGAAGGCCGTCAAGTACCAG
AGCAAGGCACGCAGGAAGAA
GTGCATGATCTAActcgagtc
tggtaaagaaaccgctgctgcgaaatttgaa
cgccagcacatggactcgtctactagcgcag
cttaattaacctaggctgctgccaccgctga
gcaataactagcataaccccttggggcctct
aaacgggtcttgaggggttttttgctgaaag
gaggaactatatccggattggcgaatgggac
gcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgg
gtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac
acttgccagcgccctagcgcccgctcctttc
gctttcttcccttcctttctcgccacgttcg
ccggctttccccgtcaagctctaaatcgggg
gctccctttagggttccgatttagtgcttta
cggcacctcgaccccaaaaaacttgattagg
gtgatggttcacgtagtgggccatcgccctg
atagacggtttttcgccctttgacgttggag
tccacgttctttaatagtggactcttgttcc
aaactggaacaacactcaaccctatctcggt
ctattcttttgatttataagggattttgccg
atttcggcctattggttaaaaaatgagctga
tttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaa
aatattaacgtttacaatttctggcggcacg
atggcatgagattatcaaaaaggatcttcac
ctagatccttttaaattaaaaatgaagtttt
aaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt
ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtga
ggcacctatctcagcgatctgtctatttcgt
tcatccatagttgcctgactccccgtcgtgt
agataactacgatacgggagggcttaccatc
tggccccagtgctgcaatgataccgcgagac
ccacgctcaccggctccagatttatcagcaa
taaaccagccagccggaagggccgagcgca
gaagtggtcctgcaactttatccgcctccatc
cagtctattaattgttgccgggaagctagag
taagtagttcgccagttaatagtttgcgcaa
cgttgttgccattgctacaggcatcgtggtg
tcacgctcgtcgtttggtatggcttcattca
gctccggttcccaacgatcaaggcgagttac
atgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggtt
agctccttcggtcctccgatcgttgtcagaa
gtaagttggccgcagtgttatcactcatggt
tatggcagcactgcataattctcttactgtc
atgccatccgtaagatgcttttctgtgactg
gtgagtactcaaccaagtcattctgagaata
gtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccg
gcgtcaatacgggataataccgcgccacata
gcagaactttaaaagtgctcatcattggaaa
acgttcttcggggcgaaaactctcaaggatc
ttaccgctgttgagatccagttcgatgtaac
ccactcgtgcacccaactgatcttcagcatc
ttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaa
aacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagg
gaataagggcgacacggaaatgttgaatact
catactcttcctttttcaatcatgattgaag
catttatcagggttattgtctcatgagcgga
tacatatttgaatgtatttagaaaaataaac
aaataggtcatgaccaaaatcccttaacgtg
agttttcgttccactgagcgtcagaccccgt
agaaaagatcaaaggatcttcttgagatcct
ttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaa
caaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttg
tttgccggatcaagagctaccaactcttttt
ccgaaggtaactggcttcagcagagcgcaga
taccaaatactgtccttctagtgtagccgta
gttaggccaccacttcaagaactctgtagca
ccgcctacatacctcgctctgctaatcctgt
taccagtggctgctgccagtggcgataagtc
gtgtcttaccgggttggactcaagacgatag
ttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaa
cggggggttcgtgcacacagcccagcttgga
gcgaacgacctacaccgaactgagataccta
cagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttccc
gaagggagaaaggcggacaggtatccggta
agcggcagggtcggaacaggagagcgcac
gagggagcttccagggggaaacgcctggtatc
tttatagtcctgtcgggtttcgccacctctg
acttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtca
ggggggcggagcctatggaaaaacgccagc
aacgcggcctttttacggttcctggccttttg
ctggccttttgctcacatgttctttcctgcg
ttatcccctgattctgtggataaccgtatta
ccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgc
agccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtg
agcgaggaagcggaagagcgcctgatgcgg
tattttctccttacgcatctgtgcggtatttc
acaccgcatatatggtgcactctcagtacaa
tctgctctgatgccgcatagttaagccagta
tacactccgctatcgctacgtgactgggtca
tggctgcgccccgacacccgccaacacccgc
tgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccg
gcatccgcttacagacaagctgtgaccgtct
ccgggagctgcatgtgtcagaggttttcacc
gtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcgg
taaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgatt
cacagatgtctgcctgttcatccgcgtccag
ctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtc
tggcttctgataaagcgggccatgttaaggg
cggttttttcctgtttggtcactgatgcctc
cgtgtaagggggatttctgttcatgggggta
atgataccgatgaaacgagagaggatgctca
cgatacgggttactgatgatgaacatgcccg
gttactggaacgttgtgagggtaaacaactg
gcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaa
tcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaa
tacagatgtaggtgttccacagggtagccag
cagcatcctgcgatgcagatccggaacataa
tggtgcagggcgctgacttccgcgtttccag
actttacgaaacacggaaaccgaagaccatt
catgttgttgctcaggtcgcagacgttttgc
agcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtat
cggtgattcattctgctaaccagtaaggcaa
ccccgccagcctagccgggtcctcaacgaca
ggagcacgatcatgctagtcatgccccgcgc
ccaccggaaggagctgactgggttgaaggct
ctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcct
aatgagtgagctaacttacattaattgcgtt
gcgctcactgcccgctttccagtcgggaaac
ctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggcc
aacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgg
gcgccagggtggtttttcttttcaccagtga
gacgggcaacagctgattgcccttcaccgcc
tggccctgagagagttgcagcaagcggtcca
cgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctg
tttgatggtggttaacggcgggatataacat
gagctgtcttcggtatcgtcgtatcccacta
ccgagatgtccgcaccaacgcgcagcccgga
ctcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgcc
atctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgg
gaacgatgccctcattcagcatttgcatggt
ttgttgaaaaccggacatggcactccagtcg
ccttcccgttccgctatcggctgaatttgat
tgcgagtgagatatttatgccagccagccag
acgcagacgcgccgagacagaacttaatggg
cccgctaacagcgcgatttgctggtgaccca
atgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgt
accgtcttcatgggagaaaataatactgttg
atgggtgtctggtcagagacatcaagaaata
acgccggaacattagtgcaggcagcttccac
agcaatggcatcctggtcatccagcggatag
ttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcga
gaagattgtgcaccgccgctttacaggcttc
gacgccgcttcgttctaccatcgacaccacc
acgctggcacccagttgatcggcgcgagatt
taatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtg
cagggccagactggaggtggcaacgccaatc
agcaacgactgtttgcccgccagttgttgtg
ccacgcggttgggaatgtaattcagctccgc
catcgccgcttccactttttcccgcgttttc
gcagaaacgtggctggcctggttcaccacgc
gggaaacggtctgataagagacaccggcata
ctctgcgacatcgtataacgttactggtttc
acattcaccaccctgaattgactctcttccg
ggcgctatcatgccataccgcgaaaggtttt
gcgccattcgatggtgtccgggatctcgacg
ctctcccttatgcgactcctgcattaggaag
cagcccagtagtaggttgaggccgttgagca
ccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaagga
gatggcgcccaacagtcccccggccacgggg
cctgccaccatacccacgccgaaacaagcgc
tcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttc
cccatcggtgatgtcggcgatataggcgcca
gcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccgg
ccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagat
cgatctcgatcccgcgaaattaatacgactc
actata
SNAP-25b (1–206, all C to A; capitalized) in pET28a homemade tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt
ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggttccg
atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggcctattggtta
aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg
cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttgtttatttttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttgttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct
gtaacatcattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcagacagttttattgttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc
gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg
cacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctatg
agaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgagggagcttcc
agggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt
acggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagc
ggaagagcgcctgatgcggtattttctccttac
gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg
acacccgccaacacccgctgacgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggttttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga
tttctgttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacagggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg
cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa
ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc
gtattgggcgccagggtggtttttcttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggccctgagagagttgcagcaag
cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa
aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagatatttatgccagc
cagccagacgcagacgcgccgagacagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca
gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac
aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt
tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca
gctccgccatcgccgcttccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacgcgggaaacggtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacgttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc
cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg
atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttgtttaactt
taagaaggagatataccATGGCCGA
GGACGCAGACATGCGCAATG
AGCTGGAGGAGATGCAGAGG
AGGGCTGACCAGCTGGCTGA
TGAGTCCCTGGAAAGCACCC
GTCGCATGCTGCAGCTGGTT
GAAGAGAGTAAAGATGCTGG
CATCAGGACTTTGGTTATGTT
GGATGAGCAAGGCGAACAAC
TGGAACGCATTGAGGAAGGG
ATGGACCAAATCAATAAGGAC
ATGAAAGAAGCAGAAAAGAAT
TTGACGGACCTAGGAAAATTC
GCCGGCCTTGCCGTGGCCCC
CGCCAACAAGCTTAAATCCAG
TGATGCTTACAAAAAAGCCTG
GGGCAATAATCAGGATGGAGT
AGTGGCCAGCCAGCCTGCCC
GTGTGGTGGATGAACGGGAG
CAGATGGCCATCAGTGGTGGC
TTCATCCGCAGGGTAACAAAT
GATGCCCGGGAAAATGAGATG
GATGAGAACCTGGAGCAGGT
GAGCGGCATCATCGGAAACCT
CCGCCACATGGCTCTAGACAT
GGGCAATGAGATTGACACCCA
GAATCGCCAGATCGACAGGAT
CATGGAGAAGGCTGATTCCAA
CAAAACCAGAATTGATGAAGC
CAACCAACGTGCAACAAAGAT
GCTGGGAAGTGGTTAA
ctcgagcaccaccaccaccaccactgag
atccggctgctaacaaagcccgaaagga
agctgagttggctgctgccaccgctgagc
aataactagcataaccccttggggcctc
taaacgggtcttgaggggttttttgctgaa
aggaggaactatatccggat
Materials for protein purificaiton
2-Mercaptoethanol SIGMA M3148-25ML
Agar LPS Solution AGA500
Ampicillin, Sodium salt PLS AC1043-005-00
Chloramphenicol PLS CR1023-050-00
Competent cells (E. coli) Novagen 70956 Rosetta(DE3)pLysS
Glycerol SIGMA G5516-500ML
HEPES SIGMA H4034-100G
Hydrochloric acid / HCl SIGMA 320331-500ML
Imidazole SIGMA I2399-100G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside / IPTG SIGMA 10724815001
Kanamycin Sulfate PLS KC1001-005-02
Luria-Bertani (LB) Broth LPS Solution LB-05
Ni-NTA resin Qiagen 30210
PD MiniTrap G-25 (desalting column) Cytiva GE28-9180-07 For instructions, see: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/chromatography/prepacked-columns/desalting-and-buffer-exchange/pd-minitrap-desalting-columns-with-sephadex-g-25-resin-p-06174
Phenylmethylsulfonyl fluoride / PMSF ThermoFisher Scientific 36978
Plasmids for SNARE proteins cloned in house N/A Available upon request
Protease inhibitor cocktail genDEPOT P3100
Sodium chloride SIGMA S5886-500G
Sodium phosphate dibasic / Na2HPO4 SIGMA S7907-100G
Sodium phosphate monobasic / NaH2PO4 SIGMA S3139-250G
Tris(2-carboxyethyl)phosphine / TCEP SIGMA C4706-2G
Trizma base SIGMA T1503-250G
Materials for sample assembly
Biotin-PEG-SVA LAYSAN BIO BIO-PEG-SVA-5K-100MG & MPEG-SVA-5K-1g For PEGylation
Dibenzocyclooctyne-amine / DBCO-NH2 SIGMA 761540-10MG For bead coating
Double-sided tape 3M 136 For flow cell assembly
Epoxy glue DEVCON S-208 For flow cell assembly
Glass coverslip for bottom surface VWR 48393-251 Rectangular, 60×24 mm, #1.5
Glass coverslip for top surface VWR 48393-241 Rectangular, 50×24 mm, #1.5
Magnetic bead ThermoFisher Scientific 14301 Dynabeads M-270 Epoxy, 2.8 μm
mPEG-SVA LAYSAN BIO mPEG-SVA 1g For PEGylation
N,N-Dimethylformamide / DMF SIGMA D4551-250ML For bead coating
N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine SIGMA 104884-100ML For PEGylation
Neutravidin ThermoFisher Scientific 31000 For sample tethering
Phosphate buffered saline / PBS, pH 7.2 PLS PR2007-100-00
Plastic syringe Norm-ject A5 5 ml, luer tip
Polyethylene Tubing SCI BB31695-PE/4 PE-60
Reference bead SPHEROTECH SVP-30-5 Streptavidin-coated Polystyrene Particles; 3.0-3.4 µm
Syringe needle Kovax 21G-1 1/4'' 21 G
Syringe pump KD SCIENTIFIC 788210
Equipment for magnetic tweezer instrument
1-axis motorized microtranslation stage PI M-126.PD1 For vertical positioning of magnets
2-axis manual translation stage ST1 LEE400 For alignment of magnets to the optical axis
Acrylic holder for magnets DaiKwang Precision custum order Drawing available upon request
Frame grabber Active Silicon AS-FBD-4XCXP6-2PE8
High-speed CMOS camera Mikrotron EoSens 3CXP
Inverted microscope Olympus IX73P2F-1-2
Neodymium magnets LG magnet ND 10x10x12t Dimension: 10 mm × 10 mm × 12 mm; two needed
Objective lens Olympus UPLXAPO100XO Oil-immersion, NA 1.45
Objective lens nanopositioner Mad City Labs Nano-F100S
Rotation stepper motor AUTONICS A3K-S545W For rotating magnets
Superluminescent diode QPHOTONICS QSDM-680-2 680 nm
Software
LabVIEW National Instruments v20.0f1
MATLAB MathWorks v2021a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le, S., Liu, R., Lim, C. T., Yan, J. Uncovering mechanosensing mechanisms at the single protein level using magnetic tweezers. Methods. 94, 13-18 (2016).
  2. Choi, H. -K., Kim, H. G., Shon, M. J., Yoon, T. -Y. High-resolution single-molecule magnetic tweezers. Annual Review of Biochemistry. 91 (1), 33-59 (2022).
  3. Yang, T., Park, C., Rah, S. -H., Shon, M. J. Nano-precision tweezers for mechanosensitive proteins and beyond. Molecules and Cells. 45 (1), 16-25 (2022).
  4. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  5. De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annual Review of Biophysics. 41 (1), 453-472 (2012).
  6. Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. Optical tweezers in single-molecule biophysics. Nature Reviews Methods Primers. 1, 25 (2021).
  7. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophysical Journal. 82 (6), 3314-3329 (2002).
  8. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).
  9. Lansdorp, B. M., Tabrizi, S. J., Dittmore, A., Saleh, O. A. A high-speed magnetic tweezer beyond 10,000 frames per second. Review of Scientific Instruments. 84 (4), 044301 (2013).
  10. Cnossen, J. P., Dulin, D., Dekker, N. H. An optimized software framework for real-time, high-throughput tracking of spherical beads. Review of Scientific Instruments. 85 (10), 103712 (2014).
  11. Dulin, D., et al. High spatiotemporal-resolution magnetic tweezers: calibration and applications for DNA dynamics. Biophysical Journal. 109 (10), 2113-2125 (2015).
  12. Huhle, A., et al. Camera-based three-dimensional real-time particle tracking at kHz rates and Ångström accuracy. Nature Communications. 6 (1), 5885 (2015).
  13. Popa, I., et al. A HaloTag anchored ruler for week-long studies of protein dynamics. Journal of the American Chemical Society. 138 (33), 10546-10553 (2016).
  14. Shon, M. J., Kim, H., Yoon, T. -Y. Focused clamping of a single neuronal SNARE complex by complexin under high mechanical tension. Nature Communications. 9 (1), 3639 (2018).
  15. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (16), 7873-7878 (2019).
  16. Löf, A., et al. Multiplexed protein force spectroscopy reveals equilibrium protein folding dynamics and the low-force response of von Willebrand factor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (38), 18798-18807 (2019).
  17. Tapia-Rojo, R., Alonso-Caballero, A., Fernandez, J. M. Direct observation of a coil-to-helix contraction triggered by vinculin binding to talin. Science Advances. 6 (21), (2020).
  18. Rieu, M., et al. Parallel, linear, and subnanometric 3D tracking of microparticles with Stereo Darkfield Interferometry. Science Advances. 7 (6), (2021).
  19. Rieu, M., Valle-Orero, J., Ducos, B., Allemand, J. -F., Croquette, V. Single-molecule kinetic locking allows fluorescence-free quantification of protein/nucleic-acid binding. Communications Biology. 4 (1), 1083 (2021).
  20. Woodside, M. T., et al. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (16), 6190-6195 (2006).
  21. Camunas-Soler, J., Ribezzi-Crivellari, M., Ritort, F. Elastic properties of nucleic acids by single-molecule force spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 45 (1), 65-84 (2016).
  22. Südhof, T. C., Rothman, J. E. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. Science. 323 (5913), 474-477 (2009).
  23. Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337 (6100), 1340-1343 (2012).
  24. Zorman, S., et al. Common intermediates and kinetics, but different energetics, in the assembly of SNARE proteins. eLife. 3, e03348 (2014).
  25. Zhang, Y., Hughson, F. M. Chaperoning SNARE folding and assembly. Annual Review of Biochemistry. 90 (1), 581-603 (2021).
  26. Vilfan, I. D., Lipfert, J., Koster, D. A., Lemay, S. G., Dekker, N. H. Magnetic tweezers for single-molecule experiments. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , Springer. New York, NY. 371-395 (2009).
  27. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule manipulation of G-quadruplexes by magnetic tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328 (2017).
  28. Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophysical Journal. 96 (12), 5040-5049 (2009).
  29. Dulin, D., Barland, S., Hachair, X., Pedaci, F. Efficient illumination for microsecond tracking microscopy. PLoS One. 9 (9), e107335 (2014).
  30. Klaue, D., Seidel, R. Torsional stiffness of single superparamagnetic microspheres in an external magnetic field. Physical Review Letters. 102 (2), 028302 (2009).
  31. Shon, M. J., Rah, S. -H., Yoon, T. -Y. Submicrometer elasticity of double-stranded DNA revealed by precision force-extension measurements with magnetic tweezers. Science Advances. 5 (6), 1697 (2019).
  32. Czerwinski, F., Richardson, A. C., Oddershede, L. B. Quantifying noise in optical tweezers by Allan variance. Optics Express. 17 (15), 13255-13269 (2009).
  33. Lansdorp, B. M., Saleh, O. A. Power spectrum and Allan variance methods for calibrating single-molecule video-tracking instruments. Review of Scientific Instruments. 83 (2), 025115 (2012).
  34. Ostrofet, E., Papini, F. S., Dulin, D. High spatiotemporal resolution data from a custom magnetic tweezers instrument. Data in Brief. 30, 105397 (2020).
  35. Yu, Z., et al. A force calibration standard for magnetic tweezers. Review of Scientific Instruments. 85 (12), 123114 (2014).
  36. Strick, T. R., Allemand, J. -F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. Science. 271 (5257), 1835-1837 (1996).
  37. Daldrop, P., Brutzer, H., Huhle, A., Kauert, D. J., Seidel, R. Extending the range for force calibration in magnetic tweezers. Biophysical Journal. 108 (10), 2550-2561 (2015).
  38. te Velthuis, A. J. W., Kerssemakers, J. W. J., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative guidelines for force calibration through spectral analysis of magnetic tweezers data. Biophysical Journal. 99 (4), 1292-1302 (2010).
  39. Ostrofet, E., Papini, F. S., Dulin, D. Correction-free force calibration for magnetic tweezers experiments. Scientific Reports. 8 (1), 15920 (2018).
  40. Seol, Y., Li, J., Nelson, P. C., Perkins, T. T., Betterton, M. D. Elasticity of short DNA molecules: theory and experiment for contour lengths of 0.6-7 µm. Biophysical Journal. 93 (12), 4360-4373 (2007).
  41. Burnham, D. R., Vlaminck, I. D., Henighan, T., Dekker, C. Skewed Brownian fluctuations in single-molecule magnetic tweezers. PLoS One. 9 (9), 108271 (2014).
  42. Paul, T., Myong, S. Protocol for generation and regeneration of PEG-passivated slides for single-molecule measurements. STAR Protocols. 3 (1), 101152 (2022).
  43. Lee, H. -W., et al. Profiling of protein-protein interactions via single-molecule techniques predicts the dependence of cancers on growth-factor receptors. Nature Biomedical Engineering. 2 (4), 239-253 (2018).
  44. Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles. Biophysical Journal. 81 (4), 2378-2388 (2001).
  45. Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nature Methods. 9 (7), 724-726 (2012).
  46. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43 (1), 19-39 (2014).
  47. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophysical Journal. 72 (4), 1541-1555 (1997).
  48. Zhang, Y. Energetics, kinetics, and pathway of SNARE folding and assembly revealed by optical tweezers. Protein Science. 26 (7), 1252-1265 (2017).
  49. Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophysical Journal. 100 (2), 517-523 (2011).
  50. Cho, S., et al. Tension exerted on cells by magnetic nanoparticles regulates differentiation of human mesenchymal stem cells. Biomaterials Advances. 139, 213028 (2022).
  51. Shon, M. J., Cohen, A. E. Nano-mechanical measurements of protein-DNA interactions with a silicon nitride pulley. Nucleic Acids Research. 44 (1), 7 (2016).
  52. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  53. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  54. Neupane, K., et al. Direct observation of transition paths during the folding of proteins and nucleic acids. Science. 352 (6282), 239-242 (2016).
  55. Choi, H. -K., et al. Watching helical membrane proteins fold reveals a common N-to-C-terminal folding pathway. Science. 366 (6469), 1150-1156 (2019).
  56. Kim, C., et al. Extreme parsimony in ATP consumption by 20S complexes in the global disassembly of single SNARE complexes. Nature Communications. 12 (1), 3206 (2021).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 195 höghastighetsmagnetisk pincett enmolekylär kraftspektroskopi DNA-hårnål SNARE-komplex
Magnetisk pincett med hög hastighet för nanomekaniska mätningar på kraftkänsliga element
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, C., Yang, T., Rah, S. H., Kim, … More

Park, C., Yang, T., Rah, S. H., Kim, H. G., Yoon, T. Y., Shon, M. J. High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements. J. Vis. Exp. (195), e65137, doi:10.3791/65137 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter