Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

High-speed magnetisch pincet voor nanomechanische metingen aan krachtgevoelige elementen

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65137
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 2,3, 1,4
1Department of Physics, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 2School of Biological Sciences, Seoul National University, 3Institute for Molecular Biology and Genetics, Seoul National University, 4School of Interdisciplinary Bioscience and Bioengineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH)
* These authors contributed equally

Summary

Hier beschrijven we een snelle magnetische pincetopstelling die nanomechanische metingen uitvoert op krachtgevoelige biomoleculen met de maximale snelheid van 1,2 kHz. We introduceren de toepassing ervan op DNA-haarspelden en SNARE-complexen als modelsystemen, maar het zal ook van toepassing zijn op andere moleculen die betrokken zijn bij mechanobiologische gebeurtenissen.

Abstract

Magnetisch pincet met één molecuul (MT's) heeft gediend als krachtig hulpmiddel om biomoleculen, zoals nucleïnezuren en eiwitten, krachtig te ondervragen en is daarom klaar om nuttig te zijn op het gebied van mechanobiologie. Omdat de methode vaak afhankelijk is van beeldgebaseerde tracking van magnetische kralen, heeft de snelheidslimiet bij het opnemen en analyseren van afbeeldingen, evenals de thermische fluctuaties van de kralen, de toepassing ervan lang belemmerd bij het observeren van kleine en snelle structurele veranderingen in doelmoleculen. Dit artikel beschrijft gedetailleerde methoden voor de constructie en werking van een MT-opstelling met hoge resolutie die nanoschaal, millisecondedynamiek van biomoleculen en hun complexen kan oplossen. Als toepassingsvoorbeelden worden experimenten met DNA-haarspelden en SNARE-complexen (membraanfusiemachines) gedemonstreerd, waarbij de nadruk ligt op hoe hun voorbijgaande toestanden en overgangen kunnen worden gedetecteerd in de aanwezigheid van piconewton-schaalkrachten. We verwachten dat snelle MT's zeer nauwkeurige nanomechanische metingen mogelijk zullen blijven maken op moleculen die krachten in cellen waarnemen, overbrengen en genereren, en daardoor ons begrip van mechanobiologie op moleculair niveau verdiepen.

Introduction

Cellen voelen en reageren actief op mechanische prikkels. Daarbij vertonen veel biomoleculen krachtafhankelijke eigenschappen die dynamische structurele veranderingen mogelijk maken. Bekende voorbeelden zijn mechanosensitieve ionkanalen en cytoskeletelementen die de cellen voorzien van belangrijke mechanische informatie uit hun omgeving.

Daarnaast kunnen moleculen die een unieke krachtdragende aard vertonen ook in bredere zin als mechanosensitief worden beschouwd. Lokale vorming en smelten van nucleïnezuurduplexen, evenals hogere-ordestructuren zoals G-quadruplexen, spelen bijvoorbeeld een cruciale rol bij replicatie, transcriptie, recombinatie en meer recent genoombewerking. Bovendien voeren sommige neuronale eiwitten die betrokken zijn bij synaptische communicatie hun functies uit door fysieke krachten te genereren die de niveaus van typische intermoleculaire interacties overschrijden. Het maakt niet uit welk voorbeeld men bestudeert, het onderzoeken van nanomechanica van de betrokken biomoleculen met hoge spatiotemporale precisie zal zeer nuttig blijken te zijn bij het onthullen van moleculaire mechanismen van de bijbehorende mechanobiologische processen 1,2,3.

Single-molecule krachtspectroscopiemethoden hebben gediend als krachtige hulpmiddelen om de mechanische eigenschappen van biomoleculen 2,4,5,6 te onderzoeken. Ze kunnen structurele veranderingen in nucleïnezuren en eiwitten gelijktijdig met de toepassing van kracht volgen, waardoor krachtafhankelijke eigenschappen worden onderzocht. Twee bekende opstellingen zijn optische pincetten en magnetische pincetten (MT's), die kralen ter grootte van een micron gebruiken om moleculen 5,6,7,8 te manipuleren. In deze platforms worden polystyreen (voor optische pincetten) of magnetische kralen (voor MT's) vastgebonden aan doelmoleculen (bijv. Nucleïnezuren en eiwitten) via moleculaire "handvatten", meestal gemaakt van korte fragmenten van dubbelstrengs DNA (dsDNA). De kralen worden vervolgens verplaatst om kracht uit te oefenen en in beeld gebracht om hun locaties te volgen die rapporteren over structurele veranderingen in doelmoleculen. Optische en magnetische pincetten zijn grotendeels uitwisselbaar in hun toepassingen, maar er zijn belangrijke verschillen in hun benaderingen van het regelen van kracht. Optische pincetten zijn intrinsiek positiekleminstrumenten die kralen in positie vangen, waardoor de uitgeoefende kracht fluctueert wanneer een doelconstructie vormveranderingen ondergaat; Extensieverhoging, zoals door het uitvouwen, maakt de tether los en vermindert de spanning, en vice versa. Hoewel actieve feedback kan worden geïmplementeerd om de kracht in optische pincetten te regelen, werken MT's daarentegen van nature als een krachtklemapparaat, waarbij gebruik wordt gemaakt van stabiele, verafgelegen magnetische krachten door permanente magneten, die ook bestand zijn tegen omgevingsverstoring.

Ondanks hun lange geschiedenis en eenvoudige ontwerp zijn MT's achtergebleven bij optische pincetten in hun toepassingen voor zeer nauwkeurige metingen, grotendeels vanwege technische uitdagingen bij het volgen van snelle kralen. Onlangs hebben verschillende groepen echter gezamenlijk leiding gegeven aan een veelzijdige verbetering van zowel hardware als software voor MT-instrumenten 2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . In dit werk introduceren we een voorbeeld van een dergelijke opstelling die op 1,2 kHz draait en beschrijven we hoe deze kan worden gebruikt om nanomechanische metingen uit te voeren op krachtgevoelige biomoleculen. Als modelsystemen gebruiken we DNA-haarspelden en neuronale SNARE-complexen en onderzoeken we hun snelle, structurele veranderingen in het piconewton-regime. DNA-haarspelden vertonen eenvoudige tweetoestandsovergangen in een goed gedefinieerd krachtbereik van20,21 en dienen daarom als speelgoedmodellen om de prestaties van een pincetopstelling te verifiëren. Terwijl de SNARE-eiwitten zich samenvoegen tot een krachtgevoelig complex dat membraanfusie22 aandrijft, zijn ze ook uitgebreid bestudeerd door krachtspectroscopie met één molecuul 14,23,24,25. Standaardbenaderingen voor het analyseren van gegevens en het extraheren van nuttige informatie over thermodynamica en kinetiek worden gepresenteerd. We hopen dat dit artikel de toepassing van zeer nauwkeurige MT's in mechanobiologische studies kan vergemakkelijken en lezers kan motiveren om hun eigen krachtgevoelige interessesystemen te verkennen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle materialen en apparatuur die in dit protocol worden beschreven, worden vermeld in de materiaaltabel. LabVIEW-software om de hieronder beschreven snelle MT-installatie te bedienen, evenals de MATLAB-scripts om voorbeeldgegevens te analyseren, worden gedeponeerd op GitHub (https://github.com/ShonLab/Magnetic-Tweezers) en openbaar beschikbaar.

1. Constructie van apparatuur

OPMERKING: Het algemene principe van de high-speed MT-constructie is vergelijkbaar met standaard, conventionele MT-systemen, met uitzondering van het gebruik van een high-speed complementaire metaaloxide halfgeleider (CMOS) camera en een krachtige, coherente lichtbron (figuur 1). Raadpleeg andere bronnen voor meer beschrijvingen van standaard MT-instrumenten 5,26,27.

  1. Plaats een omgekeerde microscoop op een optische antitrillingstafel. Installeer een high-speed CMOS-camera en een frame grabber.
  2. Bouw een vertaalfase voor het manipuleren van magneten in 3D. Monteer een gemotoriseerde lineaire trap (>20 mm veerweg) verticaal bovenop een handmatige XY-trap.
    OPMERKING: De verticale beweging regelt de kracht, terwijl de XY-trap is voor de handmatige uitlijning van magneten op de optische as voor de initiële constructie van de opstelling.
  3. Installeer een roterende stappenmotor en een riem- en katrolsysteem voor roterende magneten.
    OPMERKING: De riem geeft de roterende beweging door tussen de motoras en magneten die een paar centimeter van elkaar verwijderd zijn. De rotatie van magneten is intern in de translatiemanipulatie.
  4. Monteer de magneten. Gebruik een acrylhouder (besteld bij een productiebedrijf; zie aanvullende figuur S1) die twee identieke magneten strak parallel kan huisvesten, met een goed gedefinieerde opening van 1 mm tussen de magneten (figuur 1B). Om de maximale kracht te gebruiken die met een bepaald paar magneten kan worden verkregen, past u de verticale positie van de translatietrap zo aan dat het onderste oppervlak van de magneten wordt uitgelijnd met het monstervlak wanneer het naar de laagste positie wordt verplaatst.
    OPMERKING: Raadpleeg Lipfert et al. voor meer informatie over het ontwerp en de configuratie van magneten28. De hoogte en oriëntatie van magneten worden geregeld door de LabVIEW-software in combinatie met data-acquisitie.
  5. Als u met een objectief objectief met lage vergroting kijkt, lijnt u de magneten uit op het midden van het gezichtsveld. Controleer of het draaien van de magneten geen grote verplaatsing van het midden van het magneetpaar veroorzaakt.
    OPMERKING: Als het middelpunt tussen de magneten om de rotatieas draait, is het waarschijnlijk dat de magneten uit het midden zijn gecentreerd vanwege een onvolmaakte houder. Een klein niveau van verkeerde uitlijning ten opzichte van de spleetgrootte is aanvaardbaar, omdat de magneetrotatie alleen is voor het controleren van tethers en het toepassen van koppels in specifieke toepassingen.
  6. Installeer een superluminescente diode (SLD) voor de verlichting van kralen. Laat de bundel door de opening van 1 mm tussen de twee magneten lopen. Zorg ervoor dat de bundel goed gecollimeerd is om in de opening te passen en dat de verlichting niet wordt overschaduwd door de magneten.
  7. Installeer een piëzolensscanner op het neusstuk en monteer een 100x olie-immersie objectieflens (numeriek diafragma [NA]: 1.45) voor het volgen van kralen. Om potentiële artefacten in trackingresultaten te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de verlichting gelijkmatig wordt gehandhaafd wanneer de magneten worden verplaatst. Pas ten slotte het lichtniveau aan op de maximale helderheid zonder pixels te verzadigen.
    OPMERKING: Voor de vergelijking van verschillende lichtbronnen voor het snel volgen van kralen, zie Dulin et al.29.

2. Kalibratie van magnetische kracht

  1. Bereid met behulp van polymerasekettingreactie (PCR; zie tabel 1) 5 kbp dsDNA-fragmenten (met primer B, primer Z_5k en λ-DNA) die aan het ene uiteinde zijn gelabeld met biotine (voor oppervlaktebevestiging) en azide aan het andere uiteinde (voor kralenaanhechting).
  2. Bereid na rubriek 6 een stroomcel voor met de 5 kbp-moleculen.
  3. Identificeer volgens paragraaf 7 een goede kraal-tetherconstructie door de extensie en rotatie ervan te verifiëren. Zorg er in het bijzonder voor dat u een kraal kiest met een minimaal rotatietraject (d.w.z. met een straal < 200 nm) om de verschuiving van de kraalhoogte te minimaliseren als gevolg van een niet-gecentreerde bevestiging30,31. Zodra een goede tether is geïdentificeerd, begint u met het volgen van kralen, verwijzend naar sectie 9.
  4. Als de opstelling nieuw is, karakteriseer dan de ruis en stabiliteit voor betrouwbare metingen met hoge resolutie. Plaats de magneet ~3 mm van het oppervlak van de stromingscel (om >10 pN toe te passen en de Brownse beweging van een kraal te onderdrukken), volg de z-positie van de kraal op 1,2 kHz en bereken de Allan-afwijking (AD) van de z-coördinaat tijdreeks32,33 (figuur 2C). Controleer of AD-waarden van enkele nanometers haalbaar zijn in het hogesnelheidsregime (<0,1 s) en of differentiële tracking (magnetische kraalpositie ten opzichte van een referentiekraal) AD in de langere tijdschaal vermindert.
    OPMERKING: We verkrijgen meestal een AD van <3 nm met de maximale snelheid (1,2 kHz of 0,83 ms resolutie), en de AD blijft ten minste tot 10 s dalen, wat een minimale drift impliceert. Anderen hebben vergelijkbare waarden gemeld op vergelijkbare opstellingen 9,10,11,12,34.
  5. Noteer met magneten in de ruststand (F ~ 0 pN) de x- en y-coördinaten van de vastgebonden kraal op 1,2 kHz. Noteer de positie gedurende een voldoende lange periode (dat wil zeggen voldoende langer dan de karakteristieke relaxatietijd van fluctuatie35) zodat de Brownse beweging voldoende wordt bemonsterd.
    OPMERKING: Hier is de x-richting langs de richting van het magnetisch veld, terwijl de beweging in y de transversale beweging loodrecht op het veld vertegenwoordigt.
  6. Beweeg de magneten dichter bij de stroomcel en herhaal de kraalpositiemetingen totdat de magneten de bovenkant van de stroomcel zachtjes raken. Beweeg in grote stappen (bijv. 1-2 mm) wanneer de magneten zich op meer dan 7 mm afstand van het monstervlak bevinden (omdat de uitgeoefende kracht langzaam toeneemt in het verre veld van magneten), maar verklein de stapgrootte geleidelijk (bijv. 0,1-0,5 mm) naarmate ze dichterbij komen voor fijnere kalibratie bij hogere krachtniveaus (figuur 2B).
  7. Bereken de kracht op elke magneetpositie, d, met behulp van een van de twee alternatieve methoden (een MATLAB-script "force calibration.m" inclusief beide methoden wordt verstrekt; zie Aanvullend bestand 1).
    1. Meet de variantie van de y-coördinaten Equation 1 van de kraal (figuur 2D) en de gemiddelde z-positie van de kraal ten opzichte van de laagste positie Equation 2 (figuur 2B, onder). Gebruik vervolgens vergelijking (1)7,27,36 om de kracht te schatten (met een vaste kralenstraal R = 1.400 nm en thermische energie kRT = 4,11 pN∙nm):
      Equation 3(1)
    2. U kunt ook de vermogensspectrale dichtheid (PSD) van de y-coördinaten, Sy(figuur 2E) berekenen. Bepaal de uitgeoefende kracht F door een dubbel-Lorentzisch model37 op de gemeten Sy te monteren met behulp van vergelijking (2).
      Equation 4(2)
      Equation 5Hier is , R de kralenstraal, γ yen γφ zijn respectievelijk de translatie- en rotatieweerstandscoëfficiënten (geschat op basis van de Stokes-Einsteinvergelijking), kRT is de thermische energie, f + en f- zijn twee karakteristieke frequenties verkregen met behulp van vergelijking (3).
      Equation 6 (3)
      OPMERKING: Aangezien de tether-extensie L een functie van kracht is die het gevestigde wormachtige ketenmodel (WLC) volgt, laten de bovenstaande uitdrukkingen F als de enige passende parameter (we stellen R vast op 1.400 nm voor eenvoud omdat het wordt gedeeld over alle krachtniveaus en de exacte waarde de resultaten niet merkbaar beïnvloedt). Indien nodig moeten bewegingsonscherpte en aliasing van cameragebaseerde beeldacquisitie worden beschouwd als38,39, maar dit effect is verwaarloosbaar in onze hogesnelheidsmetingen boven 1 kHz met 5 kbp tethers.
  8. Herhaal stap 2.4-2.7 voor nog een paar constructies. Onderzoek drie tot vijf verschillende kralen om de krachtvariabiliteit tussen de magnetische kralen te berekenen.
    OPMERKING: Krachtvariatie tussen de gebruikte magnetische kralen moet worden overwogen om het juiste aantal constructies voor middeling te bepalen. Deze variabiliteit is klein, maar kan leiden tot meer dan 1 pN fout in de gemeten kracht, zelfs voor commerciële producten31. Voor de meeste toepassingen, waar de absolute bepaling van de betrokken krachten niet cruciaal is, is het gemiddelde van de kalibratieresultaten van drie tot vijf kralen over het algemeen voldoende. Een alternatieve benadering om deze variatie te verklaren is om de kracht te meten met individuele tethers aan het begin van het experiment, wat tijdrovend kan zijn. Een andere optie is om haarspeldstructuren in te bedden die op bekende krachtniveaus in elke constructie31 worden uitgepakt.
  9. Plot de gemeten kracht als een functie van de magneetafstand en pas een dubbele exponentiële functie toe aan de gegevens (figuur 2F) met behulp van vergelijking (4).
    Equation 7(4)
    Hier zijn F0 (basislijn), A 1 en A 2 (amplitudes) en d 1 en d2 (vervalconstanten) passende parameters. Zorg ervoor dat de krachtwaarden van de twee methoden, evenals de resulterende dubbele exponentiële aanvallen, grotendeels overeenkomen (figuur 2F, G).
    OPMERKING: Om te bevestigen dat de krachtkalibratie correct wordt uitgevoerd, controleert u de kracht-uitbreidingsrelatie van de sondeconstructies door de extensie uit te zetten ten opzichte van de gemeten kracht.
  10. Om te corrigeren voor de kraalhoogte offset z off als gevolg van krachtafhankelijke kanteling van de magnetische kralen30,31, schat z off van de laterale offset x off, rekening houdend met de geometrie van een off-centered tether met een kralenstraal met behulp van vergelijking (5), en past u de waarden toe op de gemeten extensiewaarden. Deze stap is geïmplementeerd in het MATLAB-script "force calibration.m" (regels 252-254).
    Equation 8(5)
    OPMERKING: Hoewel deze correctie kleine wijzigingen aanbrengt in de extensie, vooral voor de kralen met een kleine rotatieradius (<200 nm), heeft deze verschuiving vaak een kritische invloed op de elastische respons, zoals te zien is in de verandering van figuur 2H naar figuur 2I 30,31.
  11. Controleer de persistentielengte Lp door een uitbreidbaar WLC-model aan de gegevens toe te passen met behulp van vergelijking (6).
    Equation 9(6)
    Hier is L 0 de contourlengte (1,7 μm voor 5 kbp) en K0 de modulus voor enthalpische stretching.
    OPMERKING: Hoewel de L p van dsDNA algemeen wordt geaccepteerd als 40-50 nm in een typische buffer zoals fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), onderschat de WLC-formule toegepast op korte moleculen (<5 kbp) systematisch L p als L0 31,40 afneemt. Dit komt omdat het klassieke WLC-model uitgaat van een polymeer waarvan de ketenlengte voldoende langer is dan de persistentielengte. Hier verkregen we L p = 40 ± 3 nm voor de 5 kbp-constructie (figuur 2H), en de extensiecorrectie leverde verder een homogene K0 op van 1.100 ± 200 pN (figuur 2I). Het toepassen van een eindig WLC-model 31,40, evenals een correctie voor niet-Gaussianiteit in extensieverdeling 41, zal Lp licht verhogen.
  12. Zodra de krachtkalibratie is geverifieerd, past u de verkregen aanpassingsparameters van het dubbel-exponentiële model toe op de meegeleverde LabVIEW-software (aanvullend bestand 2) en wacht u tot de software de huidige kracht in realtime berekent op basis van motormetingen (d.w.z. magneetpositie). Aangezien er geen analytische expressie voor de inverse functie d(F) beschikbaar is, stelt u een opzoektabel van d versus F voor in stappen van 0,1 pN door numerieke schatting van voor de d-doelkrachtniveaus. Sla deze tabel ook op in de software om de krachtcontrole te regelen.

3. Synthese van DNA-haarspelden

OPMERKING: DNA-haarspeldconstructies voor MT-experimenten worden voorbereid door PCR-amplificatie van een 510 bp-gebied in λ-DNA met twee aangepaste primers, waarvan er één een haarspeldstructuur bevat op het 5′-uiteinde (figuur 3A). Op deze manier wordt aan het ene uiteinde van het PCR-product een haarspeldmotief geplaatst.

  1. Bereid de primers voor.
    1. Voorwaartse primer: Primer B_hp die 5′-biotine-gelabeld is voor bevestiging van het glasoppervlak en bindt aan λ-DNA. Deze primer bevat een haarspeldmotief met een steel van 8 bp en een lus van 6 nt, 5′ naar het λ-bindende gebied.
    2. Omgekeerde primer: Primer Z_hp die 5′-azide-gelabeld is voor magnetische kraalbevestiging en bindt aan λ-DNA 1 kbp verwijderd van de voorwaartse primer.
  2. Stel de PCR in en voer deze uit met λ-DNA (sjabloon), nTaq-polymerase en standaard PCR-condities (zie tabel 1). Reinig het product met een commerciële zuiveringskit.
  3. Meet de DNA-concentratie door UV-absorptie bij 260 nm (A260) en voer agarosegel-elektroforese (2% gel) uit (zie tabel 2) om de productgrootte te controleren. Een typische opbrengst is ~35 μL van ~600 nM oplossing.

4. Bereiding van SNARE-eiwitten

OPMERKING: Neuronale SNARE-complexen worden samengesteld door drie gezuiverde ratteneiwitten te combineren die tot expressie komen uit E. coli: VAMP2 / synaptobrevine-2, syntaxine-1A en SNAP-25 (figuur 3B). Om hun assemblage te vergemakkelijken, worden syntaxine en SNAP-25 samen uitgedrukt met een VAMP2-fragment (zonder het N-terminale gebied; genaamd "ΔN-VAMP2") in een structuur die het "ΔN-complex" wordt genoemd, en vervolgens gemengd met VAMP2 over de volledige lengte na DNA-handgreepaanhechting om volledige complexen te vormen.

  1. Bereid plasmiden die cDNA bevatten voor de expressie van SNARE-eiwitten voor (DNA-sequenties voor alle plasmiden worden gegeven in de tabel met materialen).
    1. Bereid 6×His-tagged VAMP2 voor zonder het transmembraandomein (2-97; L32C/I97C voor disulfidekoppelingen) gekloond tot een pET28a-vector.
    2. Bereid syntaxine-1A voor zonder de Habc en het transmembraandomein (191-267, I202C/I266C-substituties voor disulfidekoppelingen) gekloond samen met 6×His-tagged ΔN-VAMP2 (49-96) in een pETDuet-1-vector.
    3. Bereid de volledige lengte SNAP-25 isovorm b (2-206, alle C tot A) gekloond in een pET28a vector. Dit zal worden gebruikt voor het voorbereiden van ΔN-complexen.
    4. Bereid de 6×His-tagged full-length SNAP-25 isoform b (1-206, alle C tot A) gekloond in een pET28a vector voor voor directe toevoeging aan de MT assay buffer om de SNARE complexen na het ontvouwen weer samen te stellen.
  2. Bereid twee buisjes Rosetta (DE3) E. coli cellen. Transformeer één groep met VAMP2-plasmiden (uit stap 4.1.1), één met zowel syntaxine-1A/ΔN-VAMP2 als niet-gelabelde SNAP-25-plasmiden (uit stappen 4.1.2 en 4.1.3) voor het tot expressie brengen van het ΔN-complex, en de andere met His-tagged SNAP-25-plasmiden (uit stap 4.1.4).
  3. Breng de getransformeerde cellen over in Luria-Bertani-bouillon (LB) met geschikte antibiotica (hier kanamycine en chlooramfenicol voor VAMP2 en His-tagged SNAP-25; kanamycine, chlooramfenicol en ampicilline voor ΔN-complex). Kweek ze bij 37 °C in een schudincubator (220 rpm) totdat de optische dichtheid (OD) van de bouillon 0,7-0,9 bereikt.
  4. Voeg 1 mM isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toe om eiwitexpressie te induceren en incubeer de cellen gedurende 3-4 uur bij 37 °C in een schudincubator (220 rpm).
  5. Pellet de cellen door de cultuur gedurende 15 minuten bij 4 °C bij 4.500 × g te centrifugeren.
  6. Bereid buffers voor eiwitzuivering voor (zie tabel 2).
  7. Suspensie SNARE-tot expressie brengende celpellets in 40 ml ijskoude lysisbuffer en lyseer de cellen door ultrasoonapparaat op ijs (15% amplitude, 5 s aan en 5 s uit, 30 minuten totaal).
  8. Centrifugeer het lysaat bij 15.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C om onoplosbare materialen te verwijderen.
  9. Passeer het supernatant door een zwaartekrachtkolom gevuld met 1 ml Ni-NTA-hars. Was de hars met wasbuffer A, vervolgens met wasbuffer B en elueer de eiwitten met 10 ml elutiebuffer.
  10. Verwijder tris(2-carboxyethyl)fosfine (TCEP) en imidazool uit het eluent met behulp van een ontzoutingskolom (volg de instructies van de fabrikant). Elueer het monster met PBS.
  11. Concentreer de eiwitten met centrifugaalfilters (10 kDa cutoff) tot ~ 70 μM met behoud van de eiwitten in PBS (meestal met een opbrengst van 2 ml). Meet de eiwitconcentratie door ultraviolette (UV) absorptie bij 280 nm (A280) of door de Bradford-test.
  12. Bereid kleine aliquots, vries in vloeibare stikstof in en bewaar bij -80 °C tot gebruik.
    OPMERKING: Volledige SNARE-complexen worden geassembleerd na conjugatie van ΔN-complex op een DNA-handvat (zie hieronder).

5. Bevestiging van DNA-handgrepen

OPMERKING: Twee 510 bp dsDNA-handgrepen met primaire aminegroepen aan het ene uiteinde worden eerst bereid door PCR en de aminegroepen worden vervolgens omgezet in maleimidegroepen met behulp van een bifunctionele crosslinker, SM (PEG) 2. De twee handvatten worden vervolgens covalent gekoppeld aan SNARE-complexen via hun cysteïnegroepen voor plaatsspecifieke conjugatie (figuur 3B).

  1. Bereid primers voor.
    1. Bereid voorwaartse primers voor: Primer B (voor het versterken van handvat B) die 5′-biotine-gelabeld is voor bevestiging van het glasoppervlak en bindt aan λ-DNA; Primer Z (voor het versterken van Handle Z) die 5′-azide-gelabeld is voor magnetische kraalbevestiging en dezelfde volgorde heeft als Primer B.
    2. Bereid een omgekeerde primer voor: Primer N (gedeeld voor Handle B en Handle Z) die 5′-amine-gelabeld is voor eiwitconjugatie en bindt aan λ-DNA 510 bp weg van de voorwaartse primer.
  2. Stel twee sets PCR-reacties in (18 buisjes met een reactie van 200 μL voor elk handvat) met λ-DNA (sjabloon), nTaq-polymerase en standaard PCR-condities (zie tabel 1). Reinig het product met een PCR-reinigingskit en elueer elk handvat met 45 μL ultrapuur water. Gebruik een minimaal volume water om hoge concentraties handgrepen te verkrijgen voor een effectieve reactie in latere stappen.
  3. Meet de DNA-concentratie met A260. De typische opbrengst is ~650 μL ~2 μM oplossing voor elk handvat. Houd kleine monsters uit elkaar voor latere verificatie bij agarosegel-elektroforese.
  4. Reageer elke handgreep (1 μM in PBS) met 5 mM SM(PEG)2. Incubeer bij kamertemperatuur met zachte rotatie. Gebruik na 1 uur een DNA-zuiveringskit om niet-gereageerde SM(PEG)2 te verwijderen. Elueer elk handvat met 250 μL PBS om ~2 μM oplossingen te verkrijgen.
  5. Meng de oplossingen van handvat B en ΔN-complex in een molaire verhouding van 1:16 (bijv. 1 μM handvat B en 16 μM ΔN-complex) in PBS en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met roeren. Houd een klein monster apart voor agarosegel-elektroforese.
  6. Voeg een oplossing van VAMP2 toe in een 2,5-voudige molaire overmaat over het ΔN-complex dat in de vorige stap is gebruikt. Incubeer het mengsel gedurende nog eens 1 uur bij kamertemperatuur met roeren. In deze stap worden volledige SNARE-complexen geassembleerd.
  7. Verwijder vrije eiwitten door bufferuitwisseling met verse PBS en een centrifugaalfilter (100 kDa-afsnijding): centrifugeer bij 14.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C, herhaal ten minste 6x en laat 15 minuten draaien voor de laatste spin. Meet de toename van de A260/A280-verhouding om de verwijdering van vrije eiwitten te controleren. Houd een klein monster apart voor agarosegel-elektroforese.
  8. Voeg handvat Z toe aan de oplossing in een 15-voudige kiesovermaat boven handvat B. Houd de concentratie van handvat Z ten minste boven 1 μM om de reactie te vergemakkelijken. Incubeer het mengsel een nacht bij 4 °C met roeren.
  9. Controleer de tussenproducten (handvat B en de eiwitconjugaten daarvan) en het eindproduct (SNARE-complex met twee handvatten) door agarosegel-elektroforese (figuur 3B, inzet) (zie tabel 2).
    OPMERKING: Als de eiwitten met succes aan handvat B zijn bevestigd, wordt een mobiliteitsverschuiving gedetecteerd. In het bijzonder kan de vorming van volledige SNARE-complexen op DNA-handgrepen worden bevestigd door hun resistentie tegen natriumdodecylsulfaat (SDS), in tegenstelling tot ΔN-complexen, die in SDS worden gedemonteerd en alleen syntaxine aan DNA gebonden laten (vergelijk b en c in figuur 3B).
  10. Bereid kleine aliquots, vries in vloeibare stikstof in en bewaar bij -80 °C tot gebruik.
    OPMERKING: Hoewel de uiteindelijke oplossing niet-gereageerde handgrepen bevat, wordt alleen het gewenste construct dat dubbel is gelabeld met biotine en azide geselecteerd tijdens de monsterassemblage in een stroomcel.

6. Fabricage van flowcellen

OPMERKING: Flowcellen voor MT-metingen zijn opgebouwd uit twee glazen afdekplaten die met dubbelzijdige tape aan elkaar zijn verbonden (figuur 3C). Eén coverslip is gecoat met een mengsel van PEG en gebiotinyleerde polyethyleenglycol (PEG) om niet-specifieke binding te voorkomen en om specifieke tethering van doelmoleculen via biotine-NeutrAvidin-koppeling mogelijk te maken (figuur 3D). Vervolgens worden de oplossingen van materialen voor MT-experimenten sequentieel in een stroomcel toegediend met behulp van een spuitpomp (figuur 3C, D).

  1. Bereid twee glazen afdekplaten voor, elk één voor het oppervlak aan de bovenkant (24 mm × 50 mm, nr. 1,5 dikte) en het onderste (24 mm × 60 mm, nr. 1,5 dikte). Reinig de coverslips door sonicatie in 1 M KOH gedurende 30 minuten. Spoel na het ultrasoonapparaat de afdekstroken af met gedestilleerd water en bewaar in water tot de volgende stap.
  2. PEGylateer de onderste coverslip volgens gepubliceerde protocollen42,43. Gebruik N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethyleendiamine voor silanisatie en een 1:100 (ww) mengsel van biotine-PEG-SVA en mPEG-SVA in 100 mM bicarbonaatbuffer. Houd de PEGylated coverslips droog bij -20 °C en bewaar ze enkele weken.
  3. Haal op de dag van de experimenten de PEGylated coverslips eruit en föhn ze met een stikstofpistool. Inspecteer ze visueel op vuil om er zeker van te zijn dat ze schoon zijn.
  4. Om de monsterkanalen te maken, bereidt u ~ 2 mm brede stroken dubbelzijdige tape voor en legt u vier stroken neer op een bodemafdekplaat (PEGylated surface up), evenwijdig aan en van elkaar gescheiden door ~ 5 mm (figuur 3C).
    OPMERKING: Op deze manier kunnen drie 5 mm brede monsterkanalen worden gemaakt in een enkele stroomcel.
  5. Plaats een bovenste coverslip in het midden van de onderste coverslip, waardoor ~ 5 mm ruimte overblijft aan de korte randen voor kanaalinlaten en -uitlaten. Druk voorzichtig met een pincet op de achterkant van de bovenste coverslip om de kanalen stevig af te sluiten.
  6. Om een inlaatreservoir te maken, snijdt u de rand van een pipetpunt van 200 μL af. Snijd ~ 10 mm uit de bredere opening om ~ 200 μL oplossing vast te houden. Maak er drie voor de drie stroomkanalen. Om de uitlaten te configureren, bereidt u drie spuitnaalden voor die passen op de slang voor de spuitpomp.
  7. Lijm met behulp van 5 minuten epoxy de reservoirs en naaldnaven op de stroomcel. Zorg ervoor dat een volledige afdichting wordt gevormd om lekkage te voorkomen en dat de kanalen niet worden geblokkeerd met overtollige lijm. Laat het minstens 30 minuten drogen.

7. Montage van kralen-tether constructies

OPMERKING: De oplossingen van materialen voor MT-experimenten, inclusief die voor bead-tether-constructen, worden sequentieel in stroomcellen gebracht met behulp van een spuitpomp (figuur 3C, D).

  1. Bereid magnetische kralen voor. Neem 5 mg M270-epoxykorrels uit een stamoplossing (~3,3 × 108 kralen in 167,5 μL dimethylformamide) en vervang het oplosmiddel door fosfaatbuffer (zie tabel 2) door magnetische scheiding van de kralen.
  2. Bereid de kralen op ~1,1 × 109 kralen ml−1 in een fosfaatbuffer met 1 M ammoniumsulfaat en reageer ze met 2 mM dibenzocyclooctyne (DBCO)-NH2. Incubeer het mengsel gedurende 3 uur op een roterende mixer bij kamertemperatuur. Was na de reactie de kralen 3x met verse fosfaatbuffer om niet-gereageerde moleculen te verwijderen.
    OPMERKING: De gewassen kralen kunnen zonder extra rotatie bij 4 °C enkele weken voor gebruik worden bewaard.
  3. Sluit een naald op de uitgang van het stroomcelkanaal aan op de spuitpomp met polyethyleenslang. Breng de kanalen in evenwicht met PBS.
  4. Introduceer de volgende oplossingen sequentieel in het kanaal door met de pomp te zuigen: NeutrAvidin, doelconstructies (DNA-haarspelden of SNARE-complexen met DNA-handgrepen), referentiepolystyreenparels en DBCO-gecoate magnetische kralen. Draai voor gebruik de kraaloplossingen grondig om potentiële kralenaggregaten te verspreiden.
  5. Was ongebonden kralen weg terwijl je 0,1 pN kracht uitoefent.
    OPMERKING: De toepassing van een kleine opwaartse kracht vergemakkelijkt het verwijderen van ongebonden kralen en helpt het scheuren van specifiek gebonden kralen-tetherconstructies te voorkomen.
  6. Neem voor experimenten met SNARE-complexen 1,5 μM SNAP-25 op in de uiteindelijke buffer.
    OPMERKING: De vrije SNAP-25-moleculen kunnen SNARE-complexen na het ontvouwen opnieuw binden en herhaalde metingen op een enkel complex mogelijk maken.

8. Identificatie van doelconstructies

  1. Zoek op het oppervlak van een stroomcelkanaal naar de magnetische kralen die zijn vastgebonden door afzonderlijke moleculen van het doelconstruct. Zorg ervoor dat een referentiekraal zich in de buurt bevindt.
  2. Draai een kandidaat-kraal en controleer of deze vrij kan draaien. Als de kraal door meerdere moleculen is vastgebonden, vertoont deze een beperkte beweging.
  3. Draai de kraal een paar volledige beurten en ontdek de rotatiestraal (deze functie is geïmplementeerd in de meegeleverde software). Kies bij voorkeur een kraal met een kleine draaicirkel.
    OPMERKING: Deze straal geeft aan hoeveel de kraal niet gecentreerd is van de tether-as, die willekeurig wordt bepaald tijdens de kraal-tether-assemblage30,31. In alle experimenten verlicht minimale off-centering van een kraal veel artefacten die verband houden met de hoge verhouding tussen kraalstraal en tether-extensie die we gebruiken.
  4. Verhoog de kracht van 0 tot 5 pN om goede enkel-gebonden kralen te identificeren. Zoek naar een grote verandering in het diffractiepatroon van een kraal als gevolg van het uitrekken van een 1 kbp-tether (of de equivalente twee handgrepen van 510 bp). Als het diffractiepatroon niet significant verandert, verlaagt u de kracht tot nul en scant u naar een andere kandidaat-kraal.
    OPMERKING: Het ~ 300 nm optillen van een kraal kan gemakkelijk worden opgemerkt aan de hand van de onbewerkte afbeeldingen zonder het trackingproces daadwerkelijk te starten.

9. Kraal tracking voor uitbreidingsmetingen

OPMERKING: Het volgen van kralen wordt uitgevoerd door kralenafbeeldingen in realtime te analyseren in de LabVIEW-software die bij dit artikel wordt geleverd. De trackingmethode en zijn varianten zijn gebruikt in de meeste conventionele MT-systemen en worden uitgelegd in eerdere literatuur 2,5,7,26. Door de positie van een magnetische kraal ten opzichte van een vaste referentiekraal te meten (d.w.z. differentiële tracking), worden de positiemetingen extreem robuust voor een externe verstoring.

  1. Zodra een goede magnetische kraal zich samen met een referentiekraal bevindt, klikt u op de knop Kalibreren om te beginnen met de voorbereidingen voor het volgen van kralen.
  2. Klik op de kralen in de afbeelding om de locaties van de kralen te definiëren. De afbeeldingen worden vervolgens bijgesneden tot interessante regio's (ROI's) (bijvoorbeeld 150 x 150 pixels voor een kraal van 3 μm) rond de kralen en vervolgens verder geanalyseerd om de precieze kraalcoördinaten te extraheren.
  3. Wacht tot de magneetrotatie is voltooid. Dit proces registreert de x- en y-coördinaten van de kraal (door 2D-kruiscorrelatie 44 te berekenen of door radiale symmetrie 45 van de kraalafbeeldingen te gebruiken, met vergelijkbare prestaties) terwijl de magneten worden gedraaid om de niet-gecentreerde bevestiging van de kraal31 te documenteren.
  4. Voor het volgen in de z-richting, wacht tot de software een opzoektabel met diffractiebeelden van de kralen op verschillende afstanden van het brandpuntsvlak genereert. Dit wordt uitgevoerd door de objectieflens met een piëzoscanner in equidistante stappen te stappen en fluctuatiegemiddelde kraalbeelden op elke positie vast te leggen. Vervolgens worden de z-coördinaten van de kralen in daadwerkelijke experimenten bepaald door de real-time kralenafbeeldingen te vergelijken met de opzoektabel met interpolatie7.
  5. Wanneer het genereren van de opzoektabel is voltooid, schakelt u tracking en autofocus in (druk op track? en AF? Knoppen) en klik op de knop Verkrijgen om te beginnen met het opnemen van kraalposities.
    OPMERKING: Autofocus is optioneel, maar wordt aanbevolen om te corrigeren voor de faseafwijking in z tijdens de acquisitie.

10. Regelingen voor gedwongen toepassing

  1. Force-ramp experimenten: Om de kracht-uitbreidingsrelatie van de constructie te controleren, past u een krachtverhoging op en neer toe met een constante belastingssnelheid (± 1,0 pN s−1) (figuur 4A). Pas bijvoorbeeld drie rondes van een 0-20-0 pN-cyclus toe om de totale lengte van de constructie en de krachtuitbreidingscurve van de handgrepen te controleren.
  2. Door de tether-parameters in de software op te geven, legt u een WLC-krachtuitbreidingscurve over de gemeten gegevens en bepaalt u of de doelkraal is vastgebonden door een echte monsterconstructie met de juiste DNA-handgrepen. Gebruik de bekende contourlengte (bijvoorbeeld ~340 nm voor 1 kbp dsDNA) en WLC-persistentielengte (30-45 nm voor kortweg dsDNA31) van het construct als uitgangspunt. Pas indien nodig de extensiecorrectiemethode toe die wordt beschreven in stap 2.11.
  3. Als het construct is geverifieerd, onderzoekt u de krachtuitbreidingsrespons in detail om te zoeken naar extra uitbreiding als gevolg van de doelmoleculen-haarspelden of SNARE-complexen.
  4. Experimenten met constante kracht: Varieer geleidelijk de uitgeoefende kracht in discrete stappen om de krachtgevoeligheid van de doelmoleculen te onderzoeken (figuur 4B).
    OPMERKING: MT's maken eenvoudige en effectieve experimenten met constante kracht mogelijk omdat de uitgeoefende kracht constant wordt gehouden wanneer de magneten stil worden gehouden.
    1. Voor DNA-haarspelden past u 4-8 pN kracht toe met stappen van 0,2-0,5 pN en meet u de kraalpositie gedurende ~ 10 s op elk krachtniveau.
    2. Voor SNARE-complexen past u 14-16 pN kracht toe met stappen van 0,1-0,2 pN en meet u de kraalpositie gedurende ~ 10 s op elk krachtniveau.
  5. Force-jump experimenten: Observeer de overgangsgebeurtenissen van SNARE-complexen.
    OPMERKING: Force-jump experimenten, zoals constante-kracht experimenten, omvatten veranderingen in krachtniveaus. Krachtsprongen maken echter gebruik van meer abrupte veranderingen in de toegepaste kracht, waardoor de door kracht veroorzaakte gebeurtenissen in de onderzochte moleculen kunnen worden gevolgd, zoals een plotselinge breuk van eiwitcomplexen. Omdat SNARE-complexen bijvoorbeeld structurele hysterese vertonen in krachtcycli23, is het informatief om force-jump-experimenten uit te voeren en de latentie naar overgang te meten (figuur 4C).
    1. Uitpakken: Afpellen van een VAMP2-molecuul van een intact, ternair SNARE-complex, waardoor een binair complex van syntaxine-1A en SNAP-25 overblijft.
    2. Rezippen: Ritsen van het uitgepakte VAMP2-molecuul om een intact SNARE-complex te regenereren.
      1. Ontvouwen: Volledige demontage van een SNARE-complex vergezeld van volledige dissociatie van SNAP-25. Alleen VAMP2- en syntaxinemoleculen blijven na ontvouwen in het construct.
      2. Opnieuw vouwen: Regeneratie van een SNARE-complex bij binding van een vrij SNAP-25-molecuul uit de buffer.
  6. Induceer bij 2 pN de assemblage van een intact SNARE-complex door te wachten (~ 30 s) op de associatie van een vrij SNAP25-molecuul. Een plotselinge afname van de extensie wordt waargenomen bij de vorming van een SNARE-complex.
  7. Om unzipping-gebeurtenissen te observeren, wacht u een paar seconden bij 10-12 pN en gaat u vervolgens abrupt naar 14-15 pN met de maximaal mogelijke motorsnelheid. Afhankelijk van de doelkracht zal het SNARE-complex een omkeerbare overgang vertonen tussen gedeeltelijk uitgepakte tussenproducten (zoals in experimenten met constante kracht) of een sprong van ~ 25 nm naar een hogere, uitgepakte toestand na een willekeurige wachttijd (of latentie).
  8. Om rezipping-gebeurtenissen te observeren, verlaagt u de kracht tot 10-12 pN onmiddellijk nadat het uitpakken is waargenomen. Nogmaals, het SNARE-complex vertoont een stochastische overgang naar de lagere, ritstoestand na enige willekeurige latentie. Als het uitvouwen is opgetreden na het uitpakken, zal het complex niet opnieuw kunnen worden uitgevouwen, omdat een SNAP-25-molecuul ontbreekt.
  9. Om zich ontvouwende gebeurtenissen te observeren, wacht u een langere periode nadat het uitpakken is waargenomen om een verdere toename van de extensie (~ 2 nm) te detecteren.

11. Data-analyse

OPMERKING: De soorten analyses die men kan uitvoeren met MT-gegevens zijn afhankelijk van het doelsysteem. Er zijn echter gemeenschappelijke benaderingen voor het extraheren van nuttige informatie uit de respectieve experimenten die in figuur 4 worden beschreven. Alle analyses worden uitgevoerd met MATLAB (R2021a) met behulp van de aangepaste codes die bij dit artikel worden geleverd. Deze codes genereren plots met behulp van dezelfde gegevens die in dit artikel worden gepresenteerd. Merk op dat terwijl ruwe gegevens van 100 Hz-tracking rechtstreeks voor analyse werden genomen, gegevens van 1,2 kHz-tracking meestal mediaan-gefilterd waren (met een vijfpunts schuifvenster) voorafgaand aan de analyse om ruis te verminderen (behalve voor ruisanalyse).

  1. Force-ramp experimenten: Analyseer de kracht-uitbreidingsrelatie (bijv. Elasticiteit van polymeren) en schakel de kracht over om informatie over nanomechanische eigenschappen te extraheren.
  2. Experimenten met constante kracht: Analyseer staatspopulaties en verblijftijd (of overgangssnelheid) als een functie van kracht om structurele (bijv. Regio's die betrokken zijn bij de overgang), thermodynamische (bijv. Vrije energieverschil) en kinetische (bijv. Energiebarrière) parameters van de conformatieveranderingen te extraheren.
  3. Force-jump experimenten: Analyseer de breukkinetiek (bijv. eiwit-eiwitinteracties en receptor-ligandbinding) of de levensduur van voorbijgaande tussenproducten (bijv. Ontvouwen van biomoleculen) om de stabiliteit van doelmoleculen en hun toestanden te extraheren.
  4. Analyseer als representatieve toepassingen de monstergegevens voor DNA-haarspelden en SNARE-complexen:
    1. Twee-toestandsovergangen van een DNA-haarspeld: unzipping force, openingsafstand, krachtafhankelijkheid van bevolkingsverschuiving en toestandstoewijzing en overgangssnelheidsmetingen met een verborgen Markov-model (HMM) (MATLAB-codes meegeleverd).
    2. Conformatieveranderingen van SNARE-complexen: unzipping force, force afhankelijkheid van tussenliggende toestanden en unzipping latency, hysterese in rezipping en unfolding/refolding gedrag.
      OPMERKING: Krachtuitbreidingsmodellen voor DNA-handgrepen, DNA-haarspelden en SNARE-complexe conformaties worden gegeven in eerdere referenties14,31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Krachtkalibratie
De resultaten van de twee krachtmeetmethoden (laterale verplaatsingsvariantie van kralen en vermogensspectrumanalyse) verschilden met 0-2 pN (figuur 2G). Volgens de resultaten in figuur 2F kunnen we betrouwbaar tot 30 pN bereiken met gewone neodymiummagneten.

Twee-toestandsovergangen van een 8 bp DNA-haarspeld
We onderzochten eerst de nanomechanica van een korte DNA-haarspeld (figuur 5). DNA-haarspelden zijn uitgebreid gekarakteriseerd door conventionele krachtspectroscopie met één molecuul en daarom is er een enorme bron van referenties beschikbaar om mee te vergelijken. Het uitpakken van een korte haarspeld is meestal omkeerbaar, dus de rezipping-gebeurtenissen worden ook waargenomen in hetzelfde krachtbereik waarin unzipping plaatsvindt (figuur 5A). Door een krachthelling tussen 0 pN en 20 pN toe te passen (figuur 5B), werd de door kracht geïnduceerde uitbreiding van het haarspeldconstruct geverifieerd om een WLC-model te volgen, dat uitsluitend kan worden toegeschreven aan de elasticiteit van DNA-handgrepen (figuur 5C, "gesloten"). Bij ongeveer 6 pN vertoonde de constructie extra fluctuaties in extensie, geassocieerd met omkeerbare uitritsing van de haarspeldstructuur (figuur 5C, inzet). Uiteindelijk, bij ~ 8 pN, verdween de overgang uiteindelijk en vestigde de extensie zich op de bovenste toestand die verder werd verlengd met ~ 7 nm. Bijgevolg klikte het gemeten krachtuitbreidingsprofiel boven 8 pN op een nieuwe modelcurve (figuur 5C, "open") die de lengte van het enkelstrengsgebied van de uitgepakte haarspeld omvat.

Vervolgens voerden we experimenten met constante kracht uit om de haarspeldovergang systematisch te onderzoeken. De kraalpositie werd gemeten in het krachtbereik van 4-8 pN met stappen van 0,5 pN voor ~ 10 s op elk niveau; Vervolgens werden de uitbreidingswaarden verzameld en geanalyseerd om hun evenwichtsverdeling te meten als functie van kracht. De resultaten van 100 Hz-tracking suggereerden een geleidelijke verschuiving naar een meer uitgebreide toestand in dit krachtregime (figuur 5D), maar de verkregen histogrammen van de extensie waren niet duidelijk genoeg om verschillende populaties op te lossen (figuur 5E). In schril contrast, toen dezelfde experimenten werden uitgevoerd bij 1,2 kHz (figuur 5F), onthulden de hogesnelheidstrajecten van extensieveranderingen na zachte filtering (vijfpunts mediaanfilter) twee verschillende populaties die goed worden beschreven door een mengsel van twee Gaussische verdelingen (figuur 5G). De scheiding tussen de twee populaties, die de openingsafstand van de haarspeld aangeeft, bleef onveranderd op ~7 nm in het unzipping force regime (figuur 5H). De afwijking in de extremiteiten (4 pN en 8 pN) was te wijten aan de onnauwkeurige lokalisatie van één toestand vanwege de schaarste.

De gegevens onthulden dat de mid-force voor unzipping overgang (de kracht waarbij de gesloten en open populaties gelijk worden) F1/2 ~ 6 pN was, en de bovenste, open toestand werd geleidelijk dominant naarmate we de kracht over 4-8 pN verhoogden (Figuur 5I). Uitgerust met een Boltzmann-relatie voor de open kans, werden de exacte waarden van F 1/2 = 5,9 pN en Δz = 7,1 nm verkregen, Equation 10in overeenstemming met de bovenstaande waarnemingen. Er moet echter worden opgemerkt dat de openingskracht verkregen uit een enkele constructie mogelijk niet nauwkeurig is vanwege de kraal-tot-kraalvariabiliteit in krachtgeneratie, die werd gemeten als ~ 4% voor de commerciële M270-kralen31. Verder, omdat de steellengte (8 bp) kort is, kan de ground-truth openingskracht van andere 8 bp haarspelden met verschillende nucleotidesamenstelling veel variëren20. Ten slotte hebben we de HMM toegepast op de extensiesporen om de toestandsovergang in kaart te brengen en daarmee de overgangssnelheden gemeten (figuur 5F, rood spoor). Zowel de uitrits- als de rezipping-snelheid varieerden exponentieel met de uitgeoefende kracht (figuur 5J), op zo'n manier dat de kracht het uitpakken bevordert en het opnieuw uitpakken remt. Indien nodig kan men de klassieke Bell-expressie verder gebruiken om de parameters van het energielandschap (bijv. Barrièrehoogte en -afstand) te extraheren46.

Karakterisering van thermische fluctuatie bij extensiemetingen
Met behulp van de haarspeldconstructie hebben we de krachtafhankelijke ruis in extensiemetingen geprofileerd. Ten eerste werden de thermische fluctuaties van een vastgebonden kraal berekend uit vergelijkingen met behulp van de parameters (bijv. kraalstraal, tetherlengte) die geschikt zijn voor deze experimenten2,5 (figuur 5K, vaste krommen). We hebben ook de standaarddeviatie van extensie Equation 11 uitgezet, gemeten vanaf het tijdspoor van een haarspeldconstructie bij verschillende krachtniveaus. Omdat dit molecuul een haarspeldmotief had, werd de respons onder 4 pN (gesloten toestand) gebruikt voor de meting van intrinsieke ruis, terwijl de haarspelddynamiek ~ 6 pN werd gedetecteerd, zoals verwacht, en diende als een controle. De krachtafhankelijke onderdrukking van fluctuatie werd ook waargenomen nadat de haarspeld grotendeels open werd (vergelijk 8 pN versus 4 pN). Vergelijking met de thermische limiet geeft aan dat er ruimte is voor verbetering, maar deze resterende ruis wordt vaak geassocieerd met de rotatiefluctuatie van een magnetische kraal30, die willekeurig en moeilijk op te lossen is. Voor een meer systematische analyse van de Brownse ruis over de waarnemingstijd wordt vaak gebruik gemaakt van de berekening van de Allan-afwijking32,33. We berekenden de Allan-variantie voor de haarspeldgegevens in figuur 5F, vergelijkbaar met de 5 kbp-metingen in figuur 2C. De resultaten in figuur 5L laten zien dat we in het tussenliggende krachtbereik van 4-8 pN 2-3 nm Allan-afwijking verkregen bij de maximale snelheid (1,2 kHz), en deze waarde daalde tot onder 1 nm voor de waarnemingstijd (τ) langer dan 0,1 s. Interessant is dat de haarspelddynamiek ontstond rond 5-7 pN voor ~ 0,01 s (figuur 5L, inzet), consistent met de gemeten overgangskracht en snelheden in figuur 5I, J.

Conformatieveranderingen van neuronale SNARE-complexen
Vervolgens gebruikten we neuronale SNARE-complexen als een eiwitmodel en onderzochten we hun krachtafhankelijke mechanische eigenschappen. In tegenstelling tot de haarspeldconstructie werden enkele SNARE-complexen tussen twee 510 bp dsDNA-handgrepen gehouden (figuur 6A). Opgemerkt moet worden dat de termini van syntaxine-1A en VAMP2, distaal van de handgrepen, werden gekruist door een disulfidebinding tussen kunstmatige cysteïneresiduen om breuk te voorkomen en meerdere rondes van tweezing van een bepaald construct mogelijk te maken.

We pasten eerst een krachthelling toe, zowel met toenemende als afnemende krachtniveaus (± 1 pN s−1) om respectievelijk de doelconstructie uit te rekken en te ontspannen. In het lage- tot middenkrachtregime (0-10 pN) gedroegen de twee handvatten zich onafhankelijk van elkaar als WLC-polymeren, waardoor de kracht-uitbreidingscurve over het algemeen niet te onderscheiden was van die van 1 kbp dsDNA (figuur 6B, zwart). Wanneer de kracht echter werd verhoogd tot boven 10 pN, weken de uitbreidingswaarden aanzienlijk af van het WLC-model, wat aangeeft dat het ingebedde SNARE-complex een extra toename in extensie vertoonde. Meer specifiek kan de uitbreidingstoename worden samengevat in drie verschillende fasen: (a) een lichte, geleidelijke toename van 11-13 pN, (b) snelle en grotere (~ 10 nm) fluctuaties in 14-16 pN, en (c) de laatste, onomkeerbare uitpakking van ongeveer ~ 20 nm. Bovendien, wanneer de kracht werd verlaagd om de constructie te ontspannen, knapte de extensie terug naar de oorspronkelijke kracht-uitbreidingscurve met een lagere kracht (<15 pN) of volgde een nieuwe modelcurve met een grotere extensie (figuur 6B, blauw). De totale uitbreiding werd uiteindelijk hersteld naar de lagere waarden (van blauw naar zwart in figuur 6B) onder 5 pN en dezelfde krachthellingscycli konden worden toegepast, wat een vergelijkbare trend liet zien.

Uit het moleculaire model van SNARE complexe conformatie kunnen we de mogelijke uitbreidingswaarden van potentiële tussenproducten nauwkeurig berekenen (figuur 6C). Bovendien, uitgaande van het WLC-gedrag voor de ongecoileerde polypeptiden, kunnen de uitbreidingen worden geschat als een functie van kracht, waardoor de volledige krachtuitbreidingsmodellen voor de verschillende conformaties worden gegenereerd (figuur 6B, stippellijnen). Uitgaande van deze waarden als referentie, interpreteerden we de bovenstaande overgangen als volgt 14,23: (a) een geleidelijke verschuiving van de volledig ritstoestand (FZ) naar de linker-open toestand (LO) in 11-13 pN, wat de opening van de linkergebieden van syntaxine-1A en VAMP2 impliceert; b) snelle overgang tussen LO en de halfritstoestand (HZ), wat de opening van een SNARE-complex tot aan de nulde ionische laag impliceert; en (c) de uiteindelijke overgang naar de uitgepakte (UZ) of de uitgevouwen toestand (UF), wat een volledige ontrafeling van VAMP2 van de rest van het complex impliceert. De UZ-toestand verschilt van UF doordat het bijbehorende molecuul SNAP-25 nog steeds gebonden is aan syntaxis-1A, waardoor een binair complex behouden blijft. In het geval van UF (zonder SNAP-25) kan het volledige SNARE-complex alleen worden geregenereerd nadat een vrij SNAP-25-molecuul uit de oplossing recombineert, waarbij het verlagen van de uitgeoefende kracht om een dergelijke herbinding mogelijk te maken van cruciaal belang is.

Om de conformatieveranderingen van SNARE-complexen op een meer systematische manier te verifiëren, voerden we vervolgens krachtsprongexperimenten uit in het krachtregime, waarbij conformatiefluctuaties vaak werden waargenomen bij 14-15 pN (figuur 6D). Meestal begonnen we eerst met het meten van de kraalpositie bij 10 pN en controleerden we op de stabiele extensie, wat de afwezigheid van SNARE-gerelateerde veranderingen aangeeft. Vervolgens werd het krachtniveau abrupt verhoogd tot 14-15 pN, waarbij de extensie werd gecontroleerd totdat het uitpakken plaatsvond, indien aanwezig. Ten slotte werd de kracht teruggebracht tot 10 pN om te controleren op een aanhoudende toename van de extensie in verband met het ontvouwen. Bij 14 pN bleven de extensiesporen meestal in de LO-toestand, met af en toe pieken naar de HZ-toestand. Opgemerkt moet worden dat deze korte excursies naar de HZ-toestand waarschijnlijk worden gemist in 100 Hz-tracking, die kralenbeelden met een factor 12 gemiddeld en down-samples. Ondanks de duidelijke en frequente bezoeken aan de HZ-toestand, slaagde het complex er niet in om een volledige overgang naar de UZ-toestand te maken (figuur 6E), wat suggereert dat de externe kracht niet sterk genoeg was om de energiebarrière voor het uitpakken te overwinnen. Daarentegen maakte zelfs een kleine toename van de kracht (tot 14,3 pN) de overgang zeer efficiënt, zodat de UZ-toestand meestal binnen enkele seconden werd bereikt (figuur 6F). Consequent was het uitpakken meestal binnen 1 s voltooid toen we 14,5 pN op het complex toepasten (figuur 6G, H). Met name het uitpakken bij hogere krachten leidde vaak tot de volledige ontplooiing van het hele complex (vergezeld van de verwijdering van SNAP-25), zoals blijkt uit de kleine extra toename van de extensie boven UZ (figuur 6H) en door de hervouwende handtekening waargenomen bij 2 pN (figuur 6I). Over het algemeen tonen deze gegevens het klassieke slip-bond gedrag47 voor het ontvouwen van SNARE-complexen, consistent met eerdere rapporten 14,23,48.

Figure 1
Figuur 1: Instrumentopstelling. Schematische (A) en foto (B) van een high-speed MT setup. Magneten bestuurd door een lineaire en een rotatiemotor bevinden zich boven de monstertrap van een omgekeerde microscoop uitgerust met een 100x olie-immersielens en een high-speed CMOS-camera. De lichtbundel van een superluminescente diode gaat door de magneten en verlicht het veld. Inzet: Representatieve diffractiebeelden van kralen op verschillende afstanden van het brandpuntsvlak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Krachtkalibratie . (A) Schema van een krachtkalibratiemonster. De grootte van de kracht die wordt uitgeoefend door een antiparallel paar magneten met een afstand van 1 mm wordt gemeten als een functie van de magneetafstand d tot de verplaatsingen van een magnetische kraal (M270) vastgebonden door een 5 kbp dsDNA-fragment. B) Representatieve gegevens van de krachtkalibratieprocedure. Gekleurde pijlen geven gebieden aan die zijn uitgevouwen in (D) (overeenkomende kleuren). (C) Allanafwijking voor de z-positie van een 5 kbp aangebonden kraal gemeten met 15-20 pN. Curven voor de magnetische kraal z-coördinaten voor (blauw) en na (rood) die de referentiekraalpositie aftrekken, worden weergegeven. (D) Representatieve tijdreeksen van de y-positie gemeten op de aangegeven magneetafstand d. Het overeenkomstige histogram van de y-coördinatenverdeling wordt rechts weergegeven met een Gaussische fit (rood). E) Representatieve PSD op basis van de onder D) vermelde gegevens. De krachtwaarden die worden verkregen door een model (rood) op de respectieve PSD's aan te brengen, worden bovenaan vermeld. (F) Kalibratie van de magnetische kracht als functie van de magneetafstand. Krachten werden gemeten aan de hand van de variantie (links) of van de PSD-methode (rechts). De fit (rood) geeft een dubbel-exponentieel model aan met de geannoteerde vergelijking. (G) Verschil in de gemeten kracht verkregen uit variantie en PSD. Er wordt een rode curve berekend voor de passen onder (F). (H,I) Verificatie van de kracht-uitbreidingsrelatie van de kalibratieconstructie van 5 kbp. De gemiddelde uitbreidingswaarden bij verschillende krachtniveaus (gemeten aan de hand van variantie) werden ofwel direct (H) ofwel na correctie voor de verplaatsing van de kraalhoogte (I) gebruikt als gevolg van het kantelen van een niet-gecentreerde kraal31. De krachtuitbreidingsgegevens voor n = 5 moleculen werden aangebracht door een uitbreidbaar WLC-model en de aangebrachte parameters (persistentielengte Lp en rekmodulus Ko) zijn bovenop geannoteerd (gemiddelde ± s.d.). Afkorting: PSD = power spectral density. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Monstervoorbereiding . (A) Bereiding van 8 bp DNA haarspeldconstructies door PCR-amplificatie van een 1 kbp-gebied van λ-DNA. (B) Voorbereiding van SNARE-complexconstructies met twee 510 bp DNA-handgrepen. Inzet: Verificatie van DNA-handgrepen en hun hechting aan eiwitten door agarosegel-elektroforese (2% gel). Pijlen geven de mobiliteitsverschuiving (kleurgecodeerd) van productsoorten aan: vrije handgrepen van 510 bp (magenta); Handvat B bevestigd aan syntaxine (rood), aan ΔN-complex (groen) en aan SNARE-complex (blauw); en het laatste SNARE-complex met twee handgrepen (groen). De toevoeging van SDS verstoort de ΔN-complexen (aanwezig in b) maar niet de volledige SNARE-complexen gevormd door de volledige lengte VAMP2 (aanwezig in c). (C) Ontwerp en foto van een stroomcel voor MT-experimenten. D) Schema van de opeenvolgende introductie van monsteroplossingen in een stroomcelkanaal. Afkorting: MT = magnetisch pincet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Soorten representatieve experimenten. (A-C) Schema's van force-ramp, force-clamp en force-jump experimenten (boven) met representatieve tijdsporen van extensie van de overeenkomstige metingen (midden). De soorten analyses die kunnen worden uitgevoerd, worden onderaan weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Twee-toestanden overgang van een 8 bp DNA haarspeld. (A) Schematische weergave van MT-experimenten op een DNA-haarspeld met de verwachte overgang naar uitpakken en opnieuw uitpakken. (B) Representatief spoor van constructuitbreiding van krachthellingexperimenten met toenemende (~0,25 pN s−1) krachtniveaus. (C) Representatieve kracht-uitbreidingscurve gereconstrueerd aan de hand van de gegevens onder (B). Gele curven geven WLC-modellen aan voor de haarspeldconstructie met de haarspeldbocht in de gesloten (effen) en open (onderbroken) conformatie. (D) Representatief uitbreidingsspoor van experimenten met constante kracht met toenemende krachtniveaus, gemeten bij 100 Hz. (E) Histogrammen van uitbreidingsgegevens in (D). (F,G) Resultaten voor dezelfde experimenten in (D) en (E) maar met 1,2 kHz tracking. De ruwe 1,2 kHz-tijdreeks werd afgevlakt door een vijfpunts mediaanfilter toe te passen. Rode sporen in de uitgebreide weergave van (F) werden verkregen van een HMM. Rode lijnen in (G) geven de locaties van Gaussische populaties aan. (H) Afstand tussen de twee populaties in (G). (I) Waarschijnlijkheid in de open toestand als functie van de uitgeoefende kracht. De rode curve is een gemonteerd Boltzmann-model (Equation 10 ) met de middenkracht F1/2 = 5,9 pN. (J) Overgangssnelheden voor uitpakken en opnieuw uitpakken, gemeten aan de hand van de HMM-resultaten. Ononderbroken lijnen duiden op exponentiële afhankelijkheid van kracht. (K) Thermische fluctuatie bij uitbreidingsmetingen. Standaardafwijkingen van haarspeldextensiegegevens (zonder filtering) worden weergegeven als een functie van kracht. De thermische resolutielimiet die de theoretische omvang van thermische fluctuaties vertegenwoordigt, werd geschat op basis van Eq. 9 in het werk van Choi et al.2 voor een kraal van 2,8 μm met een tether van 1 kbp. (L) Allan-afwijkingen berekend op basis van de 1,2 kHz haarspeldgegevens in (F) (zonder filtering). Inzet toont de Allan-afwijking op 0,01 s als functie van kracht, wat een geleidelijke toename en afname van fluctuatie als gevolg van de haarspelddynamiek laat zien. Afkorting: MT = magnetisch pincet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Conformatieveranderingen van neuronale SNARE-complexen. (A) Schematische weergave van MT-experimenten op SNARE-complexen. (B) Representatieve krachtverlengingscurven voor de SNARE-constructie. Zwarte en blauwe sporen (100 Hz) werden verkregen uit rek- en ontspanningsperioden in respectievelijk kracht-ramp-experimenten. Onderbroken lijnen geven uitbreidingsmodellen aan, rekening houdend met de verschillende conformaties van SNARE-complexen die in (C) worden weergegeven. (C) Moleculaire modellen van SNARE complexe conformaties met de overeenkomstige berekende uitbreidingen. De waarden werden geschat op basis van de geometrische parameters van spiraalvormige bundels en een WLC-model voor het polypeptidegebied14. (D) Schema van force-jump experimenten om SNARE complexe conformaties te onderzoeken. (E-H) Representatieve uitbreidingssporen van krachtsprongexperimenten uitgevoerd op de aangegeven krachtniveaus. In (E) werd unzipping niet waargenomen. In (F) en (G) werd unzipping waargenomen gevolgd door rezipping bij 10 pN. In (H) werd het uitpakken gevolgd door een zich verder ontvouwende gebeurtenis. (I) Hervouwen van een SNARE-complex bij 2 pN. Een duidelijke vermindering van de extensie van UF naar FZ-toestand werd waargenomen bij 5 pN. Afkorting: MT = magnetisch pincet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

PCR-instelling Conditie
Materiaal 1,25 μg/ml λ-DNA (sjabloon), 1 μM voorwaartse en omgekeerde primers, 0,2 mM dNTP, 0,05 U/μL nTaq, 1x nTaq buffer
Denaturatie 95 °C gedurende 30 s
Annealing Kalibratieconstructie: 55 °C gedurende 30 s
DNA haarspeld: 57 °C gedurende 30 s
DNA-handgrepen: 50 °C gedurende 30 s
Extensie DNA haarspeld en handgrepen: 72 °C gedurende 1 min
Kalibratieconstructie: 72 °C gedurende 5 min
Cyclus 30–34
Agarose gel elektroforese
Gel 2% agarose in 0,5x tris-boraat-EDTA (TBE, pH 8,3) met 1x SYBR Safe
Lopend Volledig vermogen (108 V gem) op Mupid-2plus (Advance), 40-50 min

Tabel 1: Voorwaarden voor PCR-reacties en agarosegel-elektroforese. Reactieparameters voor PCR van DNA-constructen, waaronder 5 kbp dsDNA voor krachtkalibratie, DNA-haarspeldconstructie en DNA-handgrepen voor het bevestigen van SNAREs. Primersequenties worden gegeven in de materiaalopgave.

Eiwitzuiveringsbuffer Compositie
Wasbuffer A 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 500 mM NaCl, 7 mM β-mercaptoethanol (BME), 10% glycerol en 20 mM imidazool
Wasbuffer B 50 mM HEPES (pH 7,2), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 10% glycerol en 20 mM imidazool
Lysis Buffer Wasbuffer A aangevuld met 1% Triton X-100, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) en 1x proteaseremmercocktail
Elution Buffer Wasbuffer B aangevuld met 400 mM imidazool
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) 81 mM natriumfosfaat dibasisch (Na 2 HPO 4), 19 mM natriumfosfaat monobasisch (NaH 2 PO4) (pH7,2), 150 mM NaCl
fosfaatbuffer 81 mM Na 2 HPO 4, 19 mM NaH2PO 4, pH7,4

Tabel 2: Buffers en hun samenstelling. Samenstelling van buffers die worden gebruikt voor eiwitzuivering.

Aanvullende figuur S1: Tekening van een magneethouder. De afmetingen van een acrylhouder voor twee magneten van 10 mm x 10 mm x 12 mm met een opening van 1 mm worden weergegeven. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Een gezipt bestand met MATLAB-codes. MATLAB-scripts voor het analyseren van gegevens die worden geproduceerd door de snelle magnetische pincetexperimenten, waaronder krachtkalibratie, haarspeld en SNARE-complexe analyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: LabVIEW-softwarepakket gezipt bestand. Een volledig pakket LabVIEW-codes voor het bedienen van een snelle magnetische pincetopstelling en het verkrijgen van gegevens ermee. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit werk introduceerden we een single-molecule krachtspectroscopie-opstelling die structurele veranderingen van biomoleculen met hoge spatiotemporale precisie kan waarnemen. De gebruikte high-speed CMOS-camera verkrijgt 1.200 frames s−1 met een resolutie van 1.280 x 1.024, waardoor 1,2 kHz kralentracking mogelijk is. De snelheid van metingen wordt momenteel echter beperkt door de kraalvolgsoftware, dus de ROI wordt meestal teruggebracht tot kleinere gebieden bij metingen met hoge snelheid. Het hoge vermogen van de SLD zorgt voor een heldere verlichting die van cruciaal belang is voor snelle kralenbeeldvorming tot een paar kHz bandbreedte. Bovendien genereert de ruimtelijke samenhang van de bundel contrastrijke, concentrische diffractieringen rond de kralen (figuur 1A, inzet), die een nauwkeurige bepaling van de kraalpositie op basis van symmetrie mogelijk maken.

De magnetische kracht die wordt uitgeoefend op een kraal-tether constructie kan worden bepaald door de Brownse fluctuaties van de vastgebonden kraal35,37,38 te meten. Omdat real-time krachtanalyse rekenintensief is, wordt de toegepaste kracht meestal vooraf gemeten met behulp van een referentieconstruct. De te gebruiken magnetische kralen worden bijvoorbeeld vastgebonden door lange (>5 kbp) dsDNA-fragmenten en de overeenkomstige thermische fluctuaties in de kraalpositie worden gemeten als functie van de magneetafstand (figuur 2A). De krachtkalibratie wordt meestal één keer uitgevoerd nadat de installatie is gebouwd, maar het is niet nodig om deze regelmatig te herhalen, tenzij de opstelling wordt gewijzigd, bijvoorbeeld door de magneten te vervangen. Omdat de karakteristieke frequentie van kraalfluctuatie toeneemt met de toegepaste kracht2, is een snelle opstelling bijzonder nuttig om de snelle dynamiek in een regime met hoge kracht vast te leggen en de kracht nauwkeurig te meten. Krachtschatting van variantie is veel eenvoudiger in zijn implementatie dan de spectrale analyse in het frequentiedomein, maar het is gevoelig voor artefacten van drift, camera-gebaseerde acquisitie en de uitbreidingsveranderingen als gevolg van off-centered bead attachment31,37,38. Toch verschillen de resultaten van de twee methoden slechts met 0-2 pN als ze op de juiste manier worden verkregen (figuur 2G); De variantiemethode is dus betrouwbaar genoeg wanneer de absolute bepaling van kracht niet kritisch is.

Voor hogere krachten boven 30 pN en bij ongeveer 65 pN (waarbij dsDNA-overstretching als benchmark dient), moeten ofwel in de handel verkrijgbare hoogwaardige (N50-N52) magneten worden geïnstalleerd, moet de opening tussen de magneten worden verkleind of moet het magnetisch veld verder worden ontwikkeld28,49. In deze opstelling is de hoogste snelheid van de verticale motor 30 mm / s, wat een krachtsprong van 0 pN naar 20 pN in ~ 0,6 s mogelijk maakt. Sommige snelle krachtafhankelijke structurele veranderingen kunnen worden gemist als de motorbeweging de krachtbelasting beperkt. Afhankelijk van de toepassing kunnen wijzigingen in en verdere optimalisatie van de manier waarop magneten worden verplaatst nodig zijn. Een voorbeeld is het creatieve gebruik van een magneetbandkop15.

Voor metingen met hoge resolutie met MT's is het belangrijk om het geluidsniveau van verschillende bronnen te evalueren. Zodra de optische componenten (een microscoop met een lens met hoge vergroting, een heldere lichtbron en een snelle camera) correct zijn geconfigureerd, kan subnanometerprecisie bij het volgen van kralen worden bereikt. Dan wordt de belangrijkste bron van ruis de Brownse beweging van een kraal, die wordt gebruikt om de uitgeoefende kracht te meten. De thermische fluctuatie van een vastgebonden kraal is afhankelijk van de straal, de lengte van de tether en de uitgeoefende kracht. Hoewel de intrinsieke fluctuatie in z-richting (d.w.z. extensieveranderingen) uitsluitend afhankelijk is van thermische energie en tetherstijfheid, filtert de bead-tetherdynamiek en de snelheid van camera-gebaseerde acquisitie de beweging van de kraal en dus de monitoring van doelbiomoleculen op zijn beurt. Daarom moeten de kraalgrootte en bemonsteringssnelheid strategisch worden gekozen om een goede spatiotemporele resolutie te bereiken. Als alternatief voor de 2,8 μm kraal die we gebruikten, zijn kleinere kralen van 1 μm ook populair en kunnen ze voordelig zijn voor snelle metingen vanwege hun snelle respons. Een kritieke zwakte is echter de kleine magnetische inhoud, die de maximale kracht beperkt die kan worden gegenereerd (Equation 12 ). Omdat kleinere kralen nog steeds kracht kunnen uitoefenen tot ten minste 10 pN, kunnen ze geschikt zijn voor het bestuderen van zwakke-krachtverschijnselen, zoals bij DNA-supercoiling. Daarentegen vereisen onderzoeken van moleculaire motoren, eiwitvouwing (bijv. SNAREs, hier afgebeeld) of celmechanica50 de toepassing van hogere krachten, in welk geval men kan overwegen de magneetconfiguratie te wijzigen (bijvoorbeeld de opening of afstand verkleinen) om het bereik van de toepasselijke kracht 28,51 uit te breiden.

Omdat de techniek de nanomechanische reacties van doelmoleculen onderzoekt terwijl een kracht op de biofysisch relevante schaal wordt uitgeoefend, is het bij uitstek geschikt voor het bestuderen van krachtgevoelige elementen die een cruciale rol spelen in mechanobiologische processen. Om de brede toepasbaarheid van de zeer nauwkeurige MT-test te illustreren, gebruikten we zowel een nucleïnezuur- als een eiwitmodel dat dynamische en snelle conformatieveranderingen vertoont bij de toepassing van een piconewton-schaalkracht. Een beperking van de techniek is de behoefte aan gezuiverde nucleïnezuren en eiwitten, wat met name de brede uitbreiding ervan naar een breed scala aan eiwitten heeft ontmoedigd. De vooruitgang van in vitro eiwitexpressie- en conjugatietechnologieën zal toegang blijven bieden tot minder bestudeerde eiwitten. Een gerelateerd probleem is dat a priori kennis van de doelstructuur vaak van cruciaal belang is voor ontwerpexperimenten (bijvoorbeeld bevestiging van handgrepen). We verwachten dat de komst van single-particle cryo-EM 52 enAlphaFold2 53 het ontwerp en de analyse van mechanische metingen aan enkelvoudige eiwitmoleculen sterk zal ondersteunen en krachtigere toepassingen van MT met hoge resolutie zal ontketenen.

De uitritskracht van DNA-haarspelden hangt af van vele factoren, waaronder sequentie, structuur en buffersamenstelling, maar het meest kritisch op stengellengte en guanine-cytosine (GC) -gehalte20. Om de kracht van high-speed tracking te demonstreren, hebben we opzettelijk een 8 bp stuurpen ontworpen (met drie GC-basisparen) die naar verwachting zich zou ontvouwen met een lage kracht met een snelle dynamiek. De resultaten in figuur 5 laten inderdaad zien dat een dergelijke snelle dynamiek moeilijk op te lossen zou zijn geweest met standaardtechnieken met een resolutie van 10 ms of lager. Dit aspect wordt verder bevestigd door de overgangssnelheden gemeten uit de HMM-analyse , waarvan de hoge snelheden varieerden tussen 100 en 200 s−1 (figuur 5J).

Neuronale SNAREs worden verondersteld synaptische vesikel exocytose te stimuleren. In het bijzonder katalyseren de SNARE-eiwitten membraanfusie door de bijbehorende energiebarrière te verlagen, zoals elektrostatische afstoting tussen blaasjes en plasmamembranen. Dienovereenkomstig blijken conformatiefluctuaties van de SNARE-complexen op te treden in een smal krachtbereik van 12-15 pN, dat overeenkomt met het verwachte niveau van afstotende krachten14,23. Met behulp van de hier beschreven hogesnelheids-MT's hebben we de belangrijkste bevindingen over het krachtafhankelijke gedrag van neuronale SNARE-complexen samengevat. De krachthysterese bij unzipping en rezipping (figuur 6B) geeft aan dat rezipping met een lagere kracht optreedt dan unzipping, en daarom wordt er tijdens deze cyclus gewerkt. Dergelijke niet-evenwichtsovergangen kunnen beter worden benaderd door force-jump-experimenten, waarbij de latentie naar overgang onder belasting (vergelijkbaar met een bindingsbreukgebeurtenis) of conformatiefluctuaties vóór het uitpakken kan worden gemeten. Beide gevallen profiteren van snelle opstellingen, zoals geïllustreerd door recente studies over de voorbijgaande toestanden van biomoleculen en hun complexen 15,17,54,55,56.

Gezamenlijk komen deze resultaten overeen met de karakteristieke krachtafhankelijke veranderingen van DNA-haarspelden en neuronale SNARE-complexen die zijn gerapporteerd met conventionele krachtspectroscopie met één molecuul. Tegelijkertijd onderstrepen ze het nut van zeer nauwkeurige mechanische metingen om de krachtgevoeligheid van biomoleculen en hun assemblages te onthullen. We hopen dat dit artikel meer mensen uit het veld van mechanobiologie kan aantrekken en onderzoekers kan motiveren om snelle MT's te gebruiken bij het onderzoeken van hun unieke interessesystemen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de National Research Foundation of Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT) (NRF-2022R1C1C1012176, NRF-2021R1A4A1031754 en NRF- 2021R1A6A1A10042944). S.-H.R. werd ondersteund door de NRF-subsidie (2021R1C1C2009717).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials for construct synthesis
Agarose gel electrophoresis system Advance Mupid-2plus
DNA ladder Bioneer D-1037
nTaq polymerase Enzynomics P050A
PCR purification kit LaboPass CMR0112
PEGylated SMCC crosslinker / SM(PEG)2 ThermoFisher Scientific 22102 For SNARE–DNA coupling
Primer B Bioneer 5'-Biotin/TCGCCACCATCATTTCCA-3' For 5-kbp force calibration construct and DNA handles
Primer B_hp IDT 5'-Biotin/TTTTTTTTTTGTTCTCTATTT
TTTTAGAGAAC /AP site/ /AP site/ TCGCCACCATCATTTCCA-3'		 For hairpin construct
Primer N Bioneer 5'-C6Amine/CATGTGGGTGACGCGAAA-3' For DNA handles
Primer Z Bioneer 5'-Azide/TCGCCACCATCATTTCCA-3' For DNA handles
Primer Z_5k Bioneer 5'-Azide/TTAGAGAGTATGGGTATATGACA
TCG-3'		 For 5-kbp force calibration construct
Primer Z_hp Bioneer 5'-Azide/GTGGCAGCATGACACC-3' For hairpin construct
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoFisher Scientific S33102
λ-DNA Bioneer D-2510 Template strand for PCR
DNA sequences for SNARE proteins
6×His-tagged SNAP-25b (2-206; capitalized) in pET28a homemade tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt
ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggttccg
atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggcctattggtta
aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg
cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttgtttatttttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttgttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct
gtaacatcattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcagacagttttattgttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc
gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg
cacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctat
gagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgagggagcttcca
gggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt
acggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcgg
aagagcgcctgatgcggtattttctccttac
gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg
acacccgccaacacccgctgacgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggttttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga
tttctgttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacagggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg
cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa
ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc
gtattgggcgccagggtggtttttcttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggccctgagagagttgcagcaag
cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa
aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagatatttatgccagc
cagccagacgcagacgcgccgagacagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca
gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac
aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt
tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca
gctccgccatcgccgcttccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacgcgggaaacggtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacgttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc
cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg
atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttgtttaactt
taagaaggagatataccATGGGCAGC
AGCCATCATCATCATCATCACA
GCAGCGGCCTGGTGCCGCGC
GGCAGCCATACTAGCGGAGAT
ATCGCCGAGGACGCAGACAT
GCGCAATGAGCTGGAGGAGA
TGCAGAGGAGGGCTGACCAG
CTGGCTGATGAGTCCCTGGA
AAGCACCCGTCGCATGCTGC
AGCTGGTTGAAGAGAGTAAA
GATGCTGGCATCAGGACTTT
GGTTATGTTGGATGAGCAAG
GCGAACAACTGGAACGCATT
GAGGAAGGGATGGACCAAAT
CAATAAGGACATGAAAGAAG
CAGAAAAGAATTTGACGGAC
CTAGGAAAATTCGCCGGCCT
TGCCGTGGCCCCCGCCAAC
AAGCTTAAATCCAGTGATGC
TTACAAAAAAGCCTGGGGC
AATAATCAGGATGGAGTAGT
GGCCAGCCAGCCTGCCCG
TGTGGTGGATGAACGGGAG
CAGATGGCCATCAGTGGTG
GCTTCATCCGCAGGGTAAC
AAATGATGCCCGGGAAAAT
GAGATGGATGAGAACCTG
GAGCAGGTGAGCGGCATC
ATCGGAAACCTCCGCCAC
ATGGCTCTAGACATGGGCA
ATGAGATTGACACCCAGA
ATCGCCAGATCGACAGGA
TCATGGAGAAGGCTGATT
CCAACAAAACCAGAATTG
ATGAAGCCAACCAACGTG
CAACAAAGATGCTGGGAA
GTGGTTAAggatccgaattcgag
ctccgtcgacaagcttgcggccgcactc
gagcaccaccaccaccaccactgagat
ccggctgctaacaaagcccgaaagga
agctgagttggctgctgccaccgctgag
caataactagcataaccccttggggcct
ctaaacgggtcttgaggggttttttgctga
aaggaggaactatatccggat
6×His-tagged VAMP2 (2-97, L32C/I97C; capitalized) in pET28a homemade tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt
ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggttccg
atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggcctattggtta
aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg
cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttgtttatttttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttgttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct
gtaacatcattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcagacagttttattgttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc
gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg
cacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctatg
agaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgagggagcttcca
gggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt
acggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagc
ggaagagcgcctgatgcggtattttctccttac
gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg
acacccgccaacacccgctgacgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggttttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga
tttctgttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacagggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg
cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa
ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc
gtattgggcgccagggtggtttttcttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggccctgagagagttgcagcaag
cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa
aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagatatttatgccagc
cagccagacgcagacgcgccgagacagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca
gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac
aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt
tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca
gctccgccatcgccgcttccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacgcgggaaacggtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacgttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc
cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg
atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttgtttaactt
taagaaggagatataccATGGGCAGC
AGCCATCATCATCATCATCAC
AGCAGCGGCCTGGTGCCGC
GCGGCAGCCATATGGCAGAT
CTCTCGGCTACCGCTGCCAC
CGTCCCGCCTGCCGCCCCG
GCCGGCGAGGGTGGCCCCC
CTGCACCTCCTCCAAATCTTA
CCAGTAACAGGAGATGCCAG
CAGACCCAGGCCCAGGTGG
ATGAGGTGGTGGACATCATG
AGGGTGAATGTGGACAAGGT
CCTGGAGCGAGACCAGAAG
CTATCGGAACTGGATGATCG
CGCAGATGCCCTCCAGGCA
GGGGCCTCCCAGTTTGAAA
CAAGTGCAGCCAAGCTCAA
GCGCAAATACTGGTGGAAA
AACCTCAAGATGATGTGCTA
Aggatccgaattcgagctccgtcg
acaagcttgcggccgcactcgagcaccacca
ccaccaccactgagatccggctgctaacaaa
gcccgaaaggaagctgagttggctgctgcca
ccgctgagcaataactagcataaccccttgg
ggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg
ctgaaaggaggaactatatccggat
6×His-tagged ΔN-VAMP2 (49–96; capitalized) and Syntaxin-1A (191–267, I202C/I266C; capitalized) in pETDuet-1 homemade ggggaattgtgagcggataacaattcccctc
tagaaataattttgtttaactttaagaagga
gatataccATGGGCAGCAGCCATCA
TCATCATCATCACAGCAGCGG
CCTGGAAGTTCTGTTCCAGGG
GCCCGGTAATGTGGACAAGGT
CCTGGAGCGAGACCAGAAGCT
ATCGGAACTGGATGATCGCGC
AGATGCCCTCCAGGCAGGGGC
CTCCCAGTTTGAAACAAGTGC
AGCCAAGCTCAAGCGCAAATAC
TGGTGGAAAAACCTCAAGATGAT
GTAAgcggccgcataatgcttaagtcgaaca
gaaagtaatcgtattgtacacggccgcataa
tcgaaattaatacgactcactataggggaat
tgtgagcggataacaattccccatcttagta
tattagttaagtataagaaggagatatacat
ATGGCCCTCAGTGAGATCGAGA
CCAGGCACAGTGAGTGCATC
AAGTTGGAGAACAGCATCCG
GGAGCTACACGATATGTTCAT
GGACATGGCCATGCTGGTGG
AGAGCCAGGGGGAGATGATT
GACAGGATCGAGTACAATGTG
GAACACGCTGTGGACTACGTG
GAGAGGGCCGTGTCTGACACC
AAGAAGGCCGTCAAGTACCAG
AGCAAGGCACGCAGGAAGAA
GTGCATGATCTAActcgagtc
tggtaaagaaaccgctgctgcgaaatttgaa
cgccagcacatggactcgtctactagcgcag
cttaattaacctaggctgctgccaccgctga
gcaataactagcataaccccttggggcctct
aaacgggtcttgaggggttttttgctgaaag
gaggaactatatccggattggcgaatgggac
gcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgg
gtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac
acttgccagcgccctagcgcccgctcctttc
gctttcttcccttcctttctcgccacgttcg
ccggctttccccgtcaagctctaaatcgggg
gctccctttagggttccgatttagtgcttta
cggcacctcgaccccaaaaaacttgattagg
gtgatggttcacgtagtgggccatcgccctg
atagacggtttttcgccctttgacgttggag
tccacgttctttaatagtggactcttgttcc
aaactggaacaacactcaaccctatctcggt
ctattcttttgatttataagggattttgccg
atttcggcctattggttaaaaaatgagctga
tttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaa
aatattaacgtttacaatttctggcggcacg
atggcatgagattatcaaaaaggatcttcac
ctagatccttttaaattaaaaatgaagtttt
aaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt
ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtga
ggcacctatctcagcgatctgtctatttcgt
tcatccatagttgcctgactccccgtcgtgt
agataactacgatacgggagggcttaccatc
tggccccagtgctgcaatgataccgcgagac
ccacgctcaccggctccagatttatcagcaa
taaaccagccagccggaagggccgagcgca
gaagtggtcctgcaactttatccgcctccatc
cagtctattaattgttgccgggaagctagag
taagtagttcgccagttaatagtttgcgcaa
cgttgttgccattgctacaggcatcgtggtg
tcacgctcgtcgtttggtatggcttcattca
gctccggttcccaacgatcaaggcgagttac
atgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggtt
agctccttcggtcctccgatcgttgtcagaa
gtaagttggccgcagtgttatcactcatggt
tatggcagcactgcataattctcttactgtc
atgccatccgtaagatgcttttctgtgactg
gtgagtactcaaccaagtcattctgagaata
gtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccg
gcgtcaatacgggataataccgcgccacata
gcagaactttaaaagtgctcatcattggaaa
acgttcttcggggcgaaaactctcaaggatc
ttaccgctgttgagatccagttcgatgtaac
ccactcgtgcacccaactgatcttcagcatc
ttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaa
aacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagg
gaataagggcgacacggaaatgttgaatact
catactcttcctttttcaatcatgattgaag
catttatcagggttattgtctcatgagcgga
tacatatttgaatgtatttagaaaaataaac
aaataggtcatgaccaaaatcccttaacgtg
agttttcgttccactgagcgtcagaccccgt
agaaaagatcaaaggatcttcttgagatcct
ttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaa
caaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttg
tttgccggatcaagagctaccaactcttttt
ccgaaggtaactggcttcagcagagcgcaga
taccaaatactgtccttctagtgtagccgta
gttaggccaccacttcaagaactctgtagca
ccgcctacatacctcgctctgctaatcctgt
taccagtggctgctgccagtggcgataagtc
gtgtcttaccgggttggactcaagacgatag
ttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaa
cggggggttcgtgcacacagcccagcttgga
gcgaacgacctacaccgaactgagataccta
cagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttccc
gaagggagaaaggcggacaggtatccggta
agcggcagggtcggaacaggagagcgcac
gagggagcttccagggggaaacgcctggtatc
tttatagtcctgtcgggtttcgccacctctg
acttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtca
ggggggcggagcctatggaaaaacgccagc
aacgcggcctttttacggttcctggccttttg
ctggccttttgctcacatgttctttcctgcg
ttatcccctgattctgtggataaccgtatta
ccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgc
agccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtg
agcgaggaagcggaagagcgcctgatgcgg
tattttctccttacgcatctgtgcggtatttc
acaccgcatatatggtgcactctcagtacaa
tctgctctgatgccgcatagttaagccagta
tacactccgctatcgctacgtgactgggtca
tggctgcgccccgacacccgccaacacccgc
tgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccg
gcatccgcttacagacaagctgtgaccgtct
ccgggagctgcatgtgtcagaggttttcacc
gtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcgg
taaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgatt
cacagatgtctgcctgttcatccgcgtccag
ctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtc
tggcttctgataaagcgggccatgttaaggg
cggttttttcctgtttggtcactgatgcctc
cgtgtaagggggatttctgttcatgggggta
atgataccgatgaaacgagagaggatgctca
cgatacgggttactgatgatgaacatgcccg
gttactggaacgttgtgagggtaaacaactg
gcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaa
tcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaa
tacagatgtaggtgttccacagggtagccag
cagcatcctgcgatgcagatccggaacataa
tggtgcagggcgctgacttccgcgtttccag
actttacgaaacacggaaaccgaagaccatt
catgttgttgctcaggtcgcagacgttttgc
agcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtat
cggtgattcattctgctaaccagtaaggcaa
ccccgccagcctagccgggtcctcaacgaca
ggagcacgatcatgctagtcatgccccgcgc
ccaccggaaggagctgactgggttgaaggct
ctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcct
aatgagtgagctaacttacattaattgcgtt
gcgctcactgcccgctttccagtcgggaaac
ctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggcc
aacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgg
gcgccagggtggtttttcttttcaccagtga
gacgggcaacagctgattgcccttcaccgcc
tggccctgagagagttgcagcaagcggtcca
cgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctg
tttgatggtggttaacggcgggatataacat
gagctgtcttcggtatcgtcgtatcccacta
ccgagatgtccgcaccaacgcgcagcccgga
ctcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgcc
atctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgg
gaacgatgccctcattcagcatttgcatggt
ttgttgaaaaccggacatggcactccagtcg
ccttcccgttccgctatcggctgaatttgat
tgcgagtgagatatttatgccagccagccag
acgcagacgcgccgagacagaacttaatggg
cccgctaacagcgcgatttgctggtgaccca
atgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgt
accgtcttcatgggagaaaataatactgttg
atgggtgtctggtcagagacatcaagaaata
acgccggaacattagtgcaggcagcttccac
agcaatggcatcctggtcatccagcggatag
ttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcga
gaagattgtgcaccgccgctttacaggcttc
gacgccgcttcgttctaccatcgacaccacc
acgctggcacccagttgatcggcgcgagatt
taatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtg
cagggccagactggaggtggcaacgccaatc
agcaacgactgtttgcccgccagttgttgtg
ccacgcggttgggaatgtaattcagctccgc
catcgccgcttccactttttcccgcgttttc
gcagaaacgtggctggcctggttcaccacgc
gggaaacggtctgataagagacaccggcata
ctctgcgacatcgtataacgttactggtttc
acattcaccaccctgaattgactctcttccg
ggcgctatcatgccataccgcgaaaggtttt
gcgccattcgatggtgtccgggatctcgacg
ctctcccttatgcgactcctgcattaggaag
cagcccagtagtaggttgaggccgttgagca
ccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaagga
gatggcgcccaacagtcccccggccacgggg
cctgccaccatacccacgccgaaacaagcgc
tcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttc
cccatcggtgatgtcggcgatataggcgcca
gcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccgg
ccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagat
cgatctcgatcccgcgaaattaatacgactc
actata
SNAP-25b (1–206, all C to A; capitalized) in pET28a homemade tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt
ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggttccg
atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggcctattggtta
aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg
cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttgtttatttttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttgttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct
gtaacatcattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcagacagttttattgttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc
gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg
cacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctatg
agaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgagggagcttcc
agggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt
acggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagc
ggaagagcgcctgatgcggtattttctccttac
gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg
acacccgccaacacccgctgacgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggttttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga
tttctgttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacagggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg
cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa
ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc
gtattgggcgccagggtggtttttcttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggccctgagagagttgcagcaag
cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa
aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagatatttatgccagc
cagccagacgcagacgcgccgagacagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca
gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac
aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt
tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca
gctccgccatcgccgcttccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacgcgggaaacggtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacgttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc
cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg
atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttgtttaactt
taagaaggagatataccATGGCCGA
GGACGCAGACATGCGCAATG
AGCTGGAGGAGATGCAGAGG
AGGGCTGACCAGCTGGCTGA
TGAGTCCCTGGAAAGCACCC
GTCGCATGCTGCAGCTGGTT
GAAGAGAGTAAAGATGCTGG
CATCAGGACTTTGGTTATGTT
GGATGAGCAAGGCGAACAAC
TGGAACGCATTGAGGAAGGG
ATGGACCAAATCAATAAGGAC
ATGAAAGAAGCAGAAAAGAAT
TTGACGGACCTAGGAAAATTC
GCCGGCCTTGCCGTGGCCCC
CGCCAACAAGCTTAAATCCAG
TGATGCTTACAAAAAAGCCTG
GGGCAATAATCAGGATGGAGT
AGTGGCCAGCCAGCCTGCCC
GTGTGGTGGATGAACGGGAG
CAGATGGCCATCAGTGGTGGC
TTCATCCGCAGGGTAACAAAT
GATGCCCGGGAAAATGAGATG
GATGAGAACCTGGAGCAGGT
GAGCGGCATCATCGGAAACCT
CCGCCACATGGCTCTAGACAT
GGGCAATGAGATTGACACCCA
GAATCGCCAGATCGACAGGAT
CATGGAGAAGGCTGATTCCAA
CAAAACCAGAATTGATGAAGC
CAACCAACGTGCAACAAAGAT
GCTGGGAAGTGGTTAA
ctcgagcaccaccaccaccaccactgag
atccggctgctaacaaagcccgaaagga
agctgagttggctgctgccaccgctgagc
aataactagcataaccccttggggcctc
taaacgggtcttgaggggttttttgctgaa
aggaggaactatatccggat
Materials for protein purificaiton
2-Mercaptoethanol SIGMA M3148-25ML
Agar LPS Solution AGA500
Ampicillin, Sodium salt PLS AC1043-005-00
Chloramphenicol PLS CR1023-050-00
Competent cells (E. coli) Novagen 70956 Rosetta(DE3)pLysS
Glycerol SIGMA G5516-500ML
HEPES SIGMA H4034-100G
Hydrochloric acid / HCl SIGMA 320331-500ML
Imidazole SIGMA I2399-100G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside / IPTG SIGMA 10724815001
Kanamycin Sulfate PLS KC1001-005-02
Luria-Bertani (LB) Broth LPS Solution LB-05
Ni-NTA resin Qiagen 30210
PD MiniTrap G-25 (desalting column) Cytiva GE28-9180-07 For instructions, see: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/chromatography/prepacked-columns/desalting-and-buffer-exchange/pd-minitrap-desalting-columns-with-sephadex-g-25-resin-p-06174
Phenylmethylsulfonyl fluoride / PMSF ThermoFisher Scientific 36978
Plasmids for SNARE proteins cloned in house N/A Available upon request
Protease inhibitor cocktail genDEPOT P3100
Sodium chloride SIGMA S5886-500G
Sodium phosphate dibasic / Na2HPO4 SIGMA S7907-100G
Sodium phosphate monobasic / NaH2PO4 SIGMA S3139-250G
Tris(2-carboxyethyl)phosphine / TCEP SIGMA C4706-2G
Trizma base SIGMA T1503-250G
Materials for sample assembly
Biotin-PEG-SVA LAYSAN BIO BIO-PEG-SVA-5K-100MG & MPEG-SVA-5K-1g For PEGylation
Dibenzocyclooctyne-amine / DBCO-NH2 SIGMA 761540-10MG For bead coating
Double-sided tape 3M 136 For flow cell assembly
Epoxy glue DEVCON S-208 For flow cell assembly
Glass coverslip for bottom surface VWR 48393-251 Rectangular, 60×24 mm, #1.5
Glass coverslip for top surface VWR 48393-241 Rectangular, 50×24 mm, #1.5
Magnetic bead ThermoFisher Scientific 14301 Dynabeads M-270 Epoxy, 2.8 μm
mPEG-SVA LAYSAN BIO mPEG-SVA 1g For PEGylation
N,N-Dimethylformamide / DMF SIGMA D4551-250ML For bead coating
N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine SIGMA 104884-100ML For PEGylation
Neutravidin ThermoFisher Scientific 31000 For sample tethering
Phosphate buffered saline / PBS, pH 7.2 PLS PR2007-100-00
Plastic syringe Norm-ject A5 5 ml, luer tip
Polyethylene Tubing SCI BB31695-PE/4 PE-60
Reference bead SPHEROTECH SVP-30-5 Streptavidin-coated Polystyrene Particles; 3.0-3.4 µm
Syringe needle Kovax 21G-1 1/4'' 21 G
Syringe pump KD SCIENTIFIC 788210
Equipment for magnetic tweezer instrument
1-axis motorized microtranslation stage PI M-126.PD1 For vertical positioning of magnets
2-axis manual translation stage ST1 LEE400 For alignment of magnets to the optical axis
Acrylic holder for magnets DaiKwang Precision custum order Drawing available upon request
Frame grabber Active Silicon AS-FBD-4XCXP6-2PE8
High-speed CMOS camera Mikrotron EoSens 3CXP
Inverted microscope Olympus IX73P2F-1-2
Neodymium magnets LG magnet ND 10x10x12t Dimension: 10 mm × 10 mm × 12 mm; two needed
Objective lens Olympus UPLXAPO100XO Oil-immersion, NA 1.45
Objective lens nanopositioner Mad City Labs Nano-F100S
Rotation stepper motor AUTONICS A3K-S545W For rotating magnets
Superluminescent diode QPHOTONICS QSDM-680-2 680 nm
Software
LabVIEW National Instruments v20.0f1
MATLAB MathWorks v2021a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le, S., Liu, R., Lim, C. T., Yan, J. Uncovering mechanosensing mechanisms at the single protein level using magnetic tweezers. Methods. 94, 13-18 (2016).
  2. Choi, H. -K., Kim, H. G., Shon, M. J., Yoon, T. -Y. High-resolution single-molecule magnetic tweezers. Annual Review of Biochemistry. 91 (1), 33-59 (2022).
  3. Yang, T., Park, C., Rah, S. -H., Shon, M. J. Nano-precision tweezers for mechanosensitive proteins and beyond. Molecules and Cells. 45 (1), 16-25 (2022).
  4. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  5. De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annual Review of Biophysics. 41 (1), 453-472 (2012).
  6. Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. Optical tweezers in single-molecule biophysics. Nature Reviews Methods Primers. 1, 25 (2021).
  7. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophysical Journal. 82 (6), 3314-3329 (2002).
  8. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).
  9. Lansdorp, B. M., Tabrizi, S. J., Dittmore, A., Saleh, O. A. A high-speed magnetic tweezer beyond 10,000 frames per second. Review of Scientific Instruments. 84 (4), 044301 (2013).
  10. Cnossen, J. P., Dulin, D., Dekker, N. H. An optimized software framework for real-time, high-throughput tracking of spherical beads. Review of Scientific Instruments. 85 (10), 103712 (2014).
  11. Dulin, D., et al. High spatiotemporal-resolution magnetic tweezers: calibration and applications for DNA dynamics. Biophysical Journal. 109 (10), 2113-2125 (2015).
  12. Huhle, A., et al. Camera-based three-dimensional real-time particle tracking at kHz rates and Ångström accuracy. Nature Communications. 6 (1), 5885 (2015).
  13. Popa, I., et al. A HaloTag anchored ruler for week-long studies of protein dynamics. Journal of the American Chemical Society. 138 (33), 10546-10553 (2016).
  14. Shon, M. J., Kim, H., Yoon, T. -Y. Focused clamping of a single neuronal SNARE complex by complexin under high mechanical tension. Nature Communications. 9 (1), 3639 (2018).
  15. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (16), 7873-7878 (2019).
  16. Löf, A., et al. Multiplexed protein force spectroscopy reveals equilibrium protein folding dynamics and the low-force response of von Willebrand factor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (38), 18798-18807 (2019).
  17. Tapia-Rojo, R., Alonso-Caballero, A., Fernandez, J. M. Direct observation of a coil-to-helix contraction triggered by vinculin binding to talin. Science Advances. 6 (21), (2020).
  18. Rieu, M., et al. Parallel, linear, and subnanometric 3D tracking of microparticles with Stereo Darkfield Interferometry. Science Advances. 7 (6), (2021).
  19. Rieu, M., Valle-Orero, J., Ducos, B., Allemand, J. -F., Croquette, V. Single-molecule kinetic locking allows fluorescence-free quantification of protein/nucleic-acid binding. Communications Biology. 4 (1), 1083 (2021).
  20. Woodside, M. T., et al. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (16), 6190-6195 (2006).
  21. Camunas-Soler, J., Ribezzi-Crivellari, M., Ritort, F. Elastic properties of nucleic acids by single-molecule force spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 45 (1), 65-84 (2016).
  22. Südhof, T. C., Rothman, J. E. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. Science. 323 (5913), 474-477 (2009).
  23. Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337 (6100), 1340-1343 (2012).
  24. Zorman, S., et al. Common intermediates and kinetics, but different energetics, in the assembly of SNARE proteins. eLife. 3, e03348 (2014).
  25. Zhang, Y., Hughson, F. M. Chaperoning SNARE folding and assembly. Annual Review of Biochemistry. 90 (1), 581-603 (2021).
  26. Vilfan, I. D., Lipfert, J., Koster, D. A., Lemay, S. G., Dekker, N. H. Magnetic tweezers for single-molecule experiments. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , Springer. New York, NY. 371-395 (2009).
  27. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule manipulation of G-quadruplexes by magnetic tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328 (2017).
  28. Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophysical Journal. 96 (12), 5040-5049 (2009).
  29. Dulin, D., Barland, S., Hachair, X., Pedaci, F. Efficient illumination for microsecond tracking microscopy. PLoS One. 9 (9), e107335 (2014).
  30. Klaue, D., Seidel, R. Torsional stiffness of single superparamagnetic microspheres in an external magnetic field. Physical Review Letters. 102 (2), 028302 (2009).
  31. Shon, M. J., Rah, S. -H., Yoon, T. -Y. Submicrometer elasticity of double-stranded DNA revealed by precision force-extension measurements with magnetic tweezers. Science Advances. 5 (6), 1697 (2019).
  32. Czerwinski, F., Richardson, A. C., Oddershede, L. B. Quantifying noise in optical tweezers by Allan variance. Optics Express. 17 (15), 13255-13269 (2009).
  33. Lansdorp, B. M., Saleh, O. A. Power spectrum and Allan variance methods for calibrating single-molecule video-tracking instruments. Review of Scientific Instruments. 83 (2), 025115 (2012).
  34. Ostrofet, E., Papini, F. S., Dulin, D. High spatiotemporal resolution data from a custom magnetic tweezers instrument. Data in Brief. 30, 105397 (2020).
  35. Yu, Z., et al. A force calibration standard for magnetic tweezers. Review of Scientific Instruments. 85 (12), 123114 (2014).
  36. Strick, T. R., Allemand, J. -F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. Science. 271 (5257), 1835-1837 (1996).
  37. Daldrop, P., Brutzer, H., Huhle, A., Kauert, D. J., Seidel, R. Extending the range for force calibration in magnetic tweezers. Biophysical Journal. 108 (10), 2550-2561 (2015).
  38. te Velthuis, A. J. W., Kerssemakers, J. W. J., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative guidelines for force calibration through spectral analysis of magnetic tweezers data. Biophysical Journal. 99 (4), 1292-1302 (2010).
  39. Ostrofet, E., Papini, F. S., Dulin, D. Correction-free force calibration for magnetic tweezers experiments. Scientific Reports. 8 (1), 15920 (2018).
  40. Seol, Y., Li, J., Nelson, P. C., Perkins, T. T., Betterton, M. D. Elasticity of short DNA molecules: theory and experiment for contour lengths of 0.6-7 µm. Biophysical Journal. 93 (12), 4360-4373 (2007).
  41. Burnham, D. R., Vlaminck, I. D., Henighan, T., Dekker, C. Skewed Brownian fluctuations in single-molecule magnetic tweezers. PLoS One. 9 (9), 108271 (2014).
  42. Paul, T., Myong, S. Protocol for generation and regeneration of PEG-passivated slides for single-molecule measurements. STAR Protocols. 3 (1), 101152 (2022).
  43. Lee, H. -W., et al. Profiling of protein-protein interactions via single-molecule techniques predicts the dependence of cancers on growth-factor receptors. Nature Biomedical Engineering. 2 (4), 239-253 (2018).
  44. Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles. Biophysical Journal. 81 (4), 2378-2388 (2001).
  45. Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nature Methods. 9 (7), 724-726 (2012).
  46. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43 (1), 19-39 (2014).
  47. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophysical Journal. 72 (4), 1541-1555 (1997).
  48. Zhang, Y. Energetics, kinetics, and pathway of SNARE folding and assembly revealed by optical tweezers. Protein Science. 26 (7), 1252-1265 (2017).
  49. Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophysical Journal. 100 (2), 517-523 (2011).
  50. Cho, S., et al. Tension exerted on cells by magnetic nanoparticles regulates differentiation of human mesenchymal stem cells. Biomaterials Advances. 139, 213028 (2022).
  51. Shon, M. J., Cohen, A. E. Nano-mechanical measurements of protein-DNA interactions with a silicon nitride pulley. Nucleic Acids Research. 44 (1), 7 (2016).
  52. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  53. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  54. Neupane, K., et al. Direct observation of transition paths during the folding of proteins and nucleic acids. Science. 352 (6282), 239-242 (2016).
  55. Choi, H. -K., et al. Watching helical membrane proteins fold reveals a common N-to-C-terminal folding pathway. Science. 366 (6469), 1150-1156 (2019).
  56. Kim, C., et al. Extreme parsimony in ATP consumption by 20S complexes in the global disassembly of single SNARE complexes. Nature Communications. 12 (1), 3206 (2021).

Tags

Deze maand in JoVE nummer 195 high-speed magnetisch pincet single-molecule krachtspectroscopie DNA-haarspeld SNARE-complex
High-speed magnetisch pincet voor nanomechanische metingen aan krachtgevoelige elementen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, C., Yang, T., Rah, S. H., Kim, … More

Park, C., Yang, T., Rah, S. H., Kim, H. G., Yoon, T. Y., Shon, M. J. High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements. J. Vis. Exp. (195), e65137, doi:10.3791/65137 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter