Summary
Methanol kan anvendes som et ekstra fast medium til retinale helmonterede præparater og langtidsopbevaring, hvilket er nyttigt til undersøgelse af retinale ganglionceller.
Abstract
Retinale ganglionceller (RGC'er), som er projektionsneuroner i nethinden, formerer ekstern visuel information til hjernen. Patologiske ændringer i RGC'er har et tæt forhold til adskillige retinale degenerative sygdomme. Helmonteret retinal immunfarvning anvendes ofte i eksperimentelle undersøgelser af RGC'er til evaluering af udviklingsmæssige og patologiske tilstande i nethinden. Under nogle omstændigheder kan det være nødvendigt at opbevare nogle værdifulde nethindeprøver, såsom dem fra transgene mus, i lang tid uden at påvirke morfologien eller antallet af RGC'er. For troværdige og reproducerbare eksperimentelle resultater er det vigtigt at bruge et effektivt konserveringsmedium. Her beskriver vi effekten af methanol som et ekstra fast medium til retinale helmonterede præparater og langtidsopbevaring. Kort sagt, under isolationsprocessen pipetteres kold methanol (-20 ° C) på overfladen af nethinden for at hjælpe med at fikse vævene og lette deres permeabilitet, og derefter kan nethinden opbevares i kold methanol (-20 ° C), før de bliver immunfarvede. Denne protokol beskriver retina-isolationsarbejdsgangen og vævsprøvelagringsprotokollen, som er nyttig og praktisk til undersøgelse af RGC'er.
Introduction
Retinale ganglionceller (RGC'er) er de eneste projektionsneuroner i nethinden, og de integrerer og transmitterer ekstern visuel information til hjernen1. Mange neurodegenerative sygdomme såsom glaukom og traumatisk optisk neuropati er karakteriseret ved irreversibel skade og tab af RGC'er 2,3. Analyse af de morfologiske og kvantitative ændringer af RGC'er er et afgørende skridt i bestemmelsen af, hvordan neurodegenerative sygdomme udvikler sig og fremmer 4,5.
Indirekte immunofluorescensanalyse er en bredt accepteret metode til overvågning af fordelingen af proteiner og celletælling. I laboratoriet anvendes helmonteret retinal immunfarvning almindeligvis i eksperimentelle undersøgelser af RGC'er for at evaluere de fysiologiske og patologiske tilstande i nethinden6. De mest almindelige markører, der anvendes til RGC-kvantificering i hele nethinden, inkluderer Brn3a, RNA-bindende protein med multipel splejsning (RBPMS) og så videre 7,8. Karakterisering af mængden og fordelingen af RGC'er kræver højkvalitets helmonteret retinal immunfarvning. Generelt er nethinden i immunfarvningsprotokoller nedsænket i kemiske fikseringsmidler, før den inkuberes i antistoffer. Ideelle fikseringsmidler bør ikke ændre cellernes form, epitopernes tilgængelighed eller affinitet for antistoffer eller vævets lineære dimensioner 9,10.
På grund af den komplekse struktur af nethinden er problemer som retinal skrøbelighed og foldning samt nogle almindelige vanskeligheder, herunder cellekrympning og uklare kerner, tilbøjelige til at opstå, når man laver en helmonteret retinal patch, hvilket har en negativ indvirkning på eksperimentel forskning. Derudover er ikke alle nethinden immunfarvede med det samme, især når det kommer til nethinden hos transgene mus med dyre priser, der er af dyrebar oprindelse, hvilket nødvendiggør bevarelse af de ekstra retinale prøver til videre brug.
Den passende fikseringsopløsning kan fiksere vævet hurtigt, undgå vævsautolyse, bevare vævscellernes normale morfologi og struktur og bevare antigeniciteten af proteiner og andre stoffer10. På nuværende tidspunkt er formaldehydbaseret fiksering blevet anvendt i vid udstrækning i forskellige væv, herunder adskilte nethinder, halverede øjenkopper og hele øjenkugler10. Vævssvind og den morfologiske ændring af celler er de to kritiske udfordringer, der opstår efter nedsænkning i formaldehyd11. Derudover dukker modificerede fikseringsformuleringer i stigende grad op for at maksimere tilbageholdelsen af de oprindelige egenskaber af nethinden og målcellerne 9,10. Forskellige retinale fikseringsbehandlinger kan påvirke retinal struktur, proteinimmunogenicitet, fluorescensexcitation og dæmpningsslukningscyklus forskelligt12,13. Nethinder, der er fikseret med Davidsons opløsning, er mere morfologisk intakte sammenlignet med dem, der er fastgjort med formalin, men Davidsons opløsning er mindre kompatibel med nogle antistoffer, såsom mikroglial markør-ioniseret calciumbindingsadaptermolekyle 112. I betragtning af nethindernes skrøbelige natur vil forskere naturligvis undre sig over, om retinal integritet såvel som målcellernes egenskaber og morfologi vil ændre sig efter langvarig opbevaring. Imidlertid er de mulige virkninger af fikseringsopløsning på retinal og RGC-cellemorfologi efter opbevaring i flere måneder sjældent blevet rapporteret. Optimering af retinal fiksering er afgørende for evaluering og bevarelse af RGC'er.
Vi giver en detaljeret beskrivelse af en pålidelig og teknisk ligetil metode, som vi bruger til helmonteret murin retinal farvning. Vores metode lægger vægt på korrekt forberedelse og opbevaring af nethinden til RGC-undersøgelse under hensyntagen til behovet for langtidsopbevaring af nethindevæv samt specifikke aspekter af fluorofordannelse eller nedbrydning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle trin udføres ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet. Alle anvendte C57BL/6J-mus blev fremstillet af Laboratory Animal Center ved Wuhan Universitet, og alle relaterede forsøg blev godkendt af Committee on the Ethics of Animal Experiments ved Wuhan University. Alle bestræbelser blev gjort for at minimere musenes lidelse.
1. Enucleation og fiksering af øjnene
- Aflive musene med kuldioxidkvælning, og enukleer øjeæblet forsigtigt ved hjælp af tandløs pincet.
- Skyl øjeæblet en gang i fosfatbufret saltvand (PBS).
- Punktering af øjeæblet med en sprøjtenål ved hornhinden under et mikroskop (okular WF: 10x/22; kontinuerligt forstørrelsesmål: 0,67x-4,5x) for at fremskynde fikseringen i øjeæblet og forbedre fikseringseffektiviteten.
- Overfør til en plade med 24 brønde indeholdende 4% paraformaldehyd (PFA).
- Fastgør øjeæblet i 4% PFA i 45 min, og overfør det derefter til 1x PBS for at fjerne overskydende PFA (vask tre gange, 5 min/tid) med det samme.
2. Nethindeisolering og udfladning
- Overfør øjeæblet til et glasglas, og placer det under et dissekerende mikroskop (okular WF: 10x / 22; kontinuerligt forstørrelsesmål: 0,67x-4,5x).
- Hold tangen i den ene hånd, og brug den til at klemme hornhindens margen for at forhindre øjeæblebevægelse. Brug den anden hånd til at holde dissekersaksen og skær rundt om hornhinden i ca. 1 mm dybde gennem hornhindens limbus. Fjern linsen og glaslegemet.
- Hold den optiske skive i midten, og skær nethinden radialt langs de fire kvadranter ved hjælp af dissekersaks og når ca. 2/3 af nethinden.
- Klem en af scleralkanterne ved hjælp af tandpincet. Med den anden hånd skal du holde kanten af sclera med utandede tang og bevæge dig fra hvor sclera er fastgjort af de tandede tang mod bunden af sclera. Skræl forsigtigt nethinden.
- Træk PBS af ved hjælp af en pipette (200 μL) for at skylle og våde nethinden, og fjern derefter overskydende PBS med et lille stykke absorberende papir. Flad om nødvendigt forsigtigt nethinden med en lille børste.
- Langsomt pipette kold methanol (forkølet i en -20 ° C fryser) dråbe for dråbe på den indre overflade af nethinden (mængden af methanol er ikke fast, så længe nethinden kan dækkes fuldstændigt af methanol). Nethinden bliver hvid og udvikler øget vedholdenhed.
- Flad forsigtigt nethinden, og fjern urenheder såsom resterende pigmentmembraner og glaslegemet med små børstehår. Vend nethinden ved hjælp af små børstehårbørster, og gentag ovennævnte proces.
- Overfør den methanolbehandlede nethinden til en brønd med en plade med 24 brønde, og hold den gennemblødt i methanol.
- Opbevar det ved -20 ° C i 1-2 timer til øjeblikkelig immunfarvning, eller lad nethinden være i methanol, og opbevar det ved -20 ° C til langtidsopbevaring.
- Fjern methanol fra pladen med 24 brønde, og skyl nethinden med 1x PBS.
3. Immunofluorescerende farvning af RGC'erne
- Overfør forsigtigt nethinden til en 24-brønds hæmagglutinationsplade med en plastik Pasteur-pipette, og bloker 5% PBS-TX-BSA (5 g bovint serumalbuminpulver opløst i 100 ml 1x PBST-opløsning; PBST dannes ved at tilsætte 10 ml Triton X-100 til 2.000 ml 1 x PBS) ved stuetemperatur i 4 timer eller natten over ved 4 °C. Hold ganglionsiden opad.
- PBS-TX-BSA, og inkuber nethinden ved 4 °C i 48-96 timer, idet der tilsættes 100 μL af det valgte primære antistof (marsvineanti-RBPMS-antistof) ved hjælp af en 1:400 fortynding.
- Fjern det primære antistof, og skyl nethinden tre gange (20 min hver) med 1x PBS, omryst ved stuetemperatur.
- Der inkuberes nethinden med forsigtig omrystning natten over ved 4 °C med 100 μL af det tilsvarende sekundære antistof (se materialetabel), cyanin Cy3 affiniPure æsel antimarsvin IgG (H+L), ved hjælp af en 1:400 fortynding.
- Skyl nethinden med 1x PBS tre gange (20 min hver).
- Læg nethinden fladt på objektglasset med ganglioncellelaget opad, slip en passende mængde antifluorescensdæmpningsmiddel rundt om nethinden med en pipette, og dæk diaset med et dæksel (pas på ikke at have bobler).
BEMÆRK: For at bestemme den passende mængde antifluorescensdæmper skal du sikre dig, at den dækker hele nethinden. Derefter skal du dække diaset uden at lade nethinden flyde og bevæge sig let. - Forsegl glideren rundt med et tætningsmiddel for at forhindre det i at bevæge sig. Opbevar prøverne ved -20 °C, og beskyt dem mod lys.
- Billede nethinden ved hjælp af et fluorescens / konfokalmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter dissektion skal nethinden ligne en flad firkløver. I denne undersøgelse, ved hjælp af protokollen skitseret ovenfor, blev nethinden hvid efter tilsætning af methanol (figur 1). I mellemtiden ændrede nethinden sig fra blød til bøjelig og flad. Dernæst blev RGC'erne mærket med anti-RBPMS8. Fire billedfelter blev taget i helmonteret nethinden (n = 3) ved hjælp af et konfokalmikroskop (okular: 10x; mål: 40x). Repræsentative visninger af visualiserede RGC'er af nethinden før methanolbehandling og efter 12 måneders langvarig konservering i methanol er vist i figur 2. Fluorescensintensiteten viste ingen signifikante ændringer. Konservering af methanol påvirkede ikke RGC-immunfarvningen.
Figur 1: Retinale ændringer efter methanolbehandling. (A) Før methanolbehandling. B) Efter methanolbehandling. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Effekt af methanol på retinal ganglioncelle (RGC) immunfarvning . (A) Nethinden uden methanolbehandling. (B) Nethinden med 12 måneders opbevaring i methanol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fiksering er et vigtigt skridt for at bevare nethinden, hvilket kan påvirke eventuelle efterfølgende RGC-undersøgelser baseret på morfologi. Vellykket fiksering fanger hurtigt nethinden struktur og tilstand i det øjeblik, de udsættes for fikseringsmediet, hvilket er afgørende for yderligere analyse. Selvom formaldehyd er blevet betragtet som et af de mest almindelige fikseringsmidler til vævs- og cellefiksering og konservering, fungerer formaldehyd alene ikke altid godt som det optimale kemiske fikseringsmiddel til nogle undersøgelser10,14. Forskellige former for fikseringsmidler har varierende kapacitet til at udfælde aminosyrer og nukleotider, stabilisere proteiner og opretholde cellemorfologi15. Ved at anvende blandinger af begge typer fikseringsmidler kan styrken af hver udnyttes fuldt ud16,17. Methanol anvendes ofte i mange fikseringsprocedurer, før vævet er friskfrosset eller indlejret i ideelle skærematerialer16,18. Til helmonterede eksperimenter anvendes 100% kold (-20 °C) methanol til at opnå retinal prøvefiksering, hvilket hjælper prøvepermeabiliseringen til den efterfølgende fluorescensbaserede billeddannelse19.
En vigtig fordel ved methanolfiksering er, at det giver mulighed for nem konservering. I denne protokol tilsættes methanol gradvist til forsiden og bagsiden af nethinden ved -20 ° C, efter at nethinden er blevet fladtrykt. Det kan let observeres, at nethinden hurtigt skifter fra gennemskinnelig til mælkehvid, og urenhederne bliver klarere. Det skal bemærkes, at nethinden forsigtigt skal flades med en børste for at forhindre krølle rundt om den under methanol-drypningsprocessen. Efter methanolbehandlingen øges nethindens generelle sejhed, hvilket reducerer vanskeligheden ved at fjerne urenhederne og overføre nethinden. Postfiksering med methanol er mere praktisk til konservering af nethinder, der er blevet lidt præfikseret med PFA. Men når nethindens fasthed forbedres, vil styrken af glaslegemet og andre urenheder sandsynligvis også stige tilsvarende. Man kan forsøge forsigtigt at fjerne nogle urenheder, der er lette at fjerne, før man bruger methanol, og derefter fjerne de resterende urenheder efter dryptilsætning af methanol, hvilket er lettere at udføre. Den tidlige fjernelse af urenheder kræver tilstrækkelig praksis og erfaring. Det anbefales forsigtigt at børste det resterende glaslegeme på nethinden radialt udad fra synsskiven.
I denne protokol gennemblødes nethinden efter behandlingen i methanol og placeres i en -20 ° C fryser i nogen tid før den efterfølgende forsegling, og andre behandlinger kan yderligere øge nethindens sejhed. Det er imidlertid vanskeligt at angive en præcis tid, der ville være universelt optimal til nedsænkningsfiksering. Hvis det er nødvendigt, kan nethinden opbevares i kold methanol i lange perioder.
I dette arbejde blev virkningen af lagring i methanol på RGC-farvning - en afgørende teknik i retinale kvalitative og kvantitative evalueringer - undersøgt med den præsenterede metode. ved anvendelse af methanol blev fluorescensintensiteten af RGC'erne, som ville påvirke resultaterne af kvalitativ og kvantitativ testning, ikke ændret under immunfarvning. Nethinderne kunne opbevares på ubestemt tid i en konserveringsopløsning, kold (-20 ° C) methanol, i mindst 12 måneder før farvning. Derudover afslørede vores tidligere undersøgelse ingen signifikant forskel i RGC-overlevelsesraten i den optiske nerveknusningsmusemodel efter langtidsopbevaring i methanol, og methanolkonservering havde også ringe indflydelse på den kvantitative analyse af retinal vaskulatur og retinal hypoxi i den iltinducerede retinopati model20. Vi anbefaler at bruge 4% PFA og kold (-20 °C) methanol sekventielt til prøveforberedelse samt at vedtage methanolfiksering til opbevaringsstrategier i laboratoriet. En begrænsning er, at analyserne ikke fuldt ud viser subtile morfologiske ændringer på dendrit- eller aksonalt niveau, selvom tætheden af RGC'erne og somas morfologi ikke synes at ændre sig21,22. Det skal bemærkes, at vi i denne protokol kun testede RBPMS for RGC'er. Yderligere verifikation af forskellige RGC-proteiner (f.eks. Brn3a, neuronale kerner, neurofilament-L) ville give et mere robust resultat. Desuden har protokollen også potentialet til at blive anvendt på enhver anden celletype i nethinden, der kræver yderligere forskning. Imidlertid kan langvarig indånding eller direkte kutan eksponering for methanol forårsage toksiske virkninger på menneskekroppen. Derfor er det nødvendigt at tage gode forholdsregler i processen med at bruge methanol.
Vores metode lægger stor vægt på at bruge methanolfiksering til opbevaring af nethinden til RGC-undersøgelser og fremhæver vigtige overvejelser vedrørende RGC-kvantificering og fluorescensintensitet. Denne protokol giver en ligetil og praktisk metode til at tilfredsstille nødvendigheden af at bevare retinale prøver til videre brug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne er ikke bekendt med nogen tilknytninger, medlemskaber, finansiering eller økonomiske beholdninger, der kan påvirke objektiviteten af denne undersøgelse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Hubei Key Laboratories Opening Project (bevilling nr. 2021KFY055), Natural Science Foundation of Hubei-provinsen (bevilling nr. 2020CFB240) og Fundamental Research Funds for the Central Universities (bevilling nr. 2042020kf0065).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
| 24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
| Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
| Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
| BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
| Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
| Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
| Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
| Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
| Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
| Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
| Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
References
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).
- Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy. Frontiers in Immunology. 13, 860070 (2022).
- Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).
- Vidal-Sanz, M., et al. Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).
- Kole, C., et al. Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 31 (2020).
- Nadal-Nicolás, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
- Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives. Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).
- Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pflüger, H. J. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).
- Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson's solution and formalin as fixatives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin's fluid or Davidson's fluid. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).
- Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible. Environmental Health. 11, 59 (2012).
- Tang, M., et al. An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway. Immunobiology. 227 (6), 152260 (2022).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
- Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method. Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).
- Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).
- Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. Using methanol to preserve retinas for immunostaining. Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).
- Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).
- Parrilla-Reverter, G., et al. Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study. Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).
