Summary
Metanol kan användas som ett extra fast medium för retinala helmonteringspreparat och långvarig lagring, vilket är användbart för undersökning av retinala ganglionceller.
Abstract
Retinala ganglionceller (RGCs), som är näthinnans projektionsneuroner, sprider extern visuell information till hjärnan. Patologiska förändringar i RGC har ett nära samband med många retinala degenerativa sjukdomar. Helmonterad retinal immunfärgning används ofta i experimentella studier på RGC för att utvärdera näthinnans utvecklings- och patologiska tillstånd. Under vissa omständigheter kan vissa värdefulla näthinneprover, såsom de från transgena möss, behöva behållas under en lång period utan att påverka morfologin eller antalet RGC. För trovärdiga och reproducerbara experimentella resultat är det viktigt att använda ett effektivt konserveringsmedium. Här beskriver vi effekten av metanol som ett extra fast medium för retinala helmonteringspreparat och långtidsförvaring. Kort sagt, under isoleringsprocessen pipetteras kall metanol (−20 °C) på näthinnans yta för att hjälpa till att fixera vävnaderna och underlätta deras permeabilitet, och sedan kan näthinnorna förvaras i kall metanol (−20 °C) innan de immunfärgas. Detta protokoll beskriver arbetsflödet för näthinneisolering och lagringsprotokoll för vävnadsprov, vilket är användbart och praktiskt för undersökning av RGC.
Introduction
Retinala ganglieceller (RGCs) är de enda projektionsneuronerna i näthinnan, och de integrerar och överför extern visuell information till hjärnan1. Många neurodegenerativa sjukdomar som glaukom och traumatisk optisk neuropati kännetecknas av irreversibel skada och förlust av RGC 2,3. Att analysera de morfologiska och kvantitativa förändringarna av RGC är ett avgörande steg för att bestämma hur neurodegenerativa sjukdomar utvecklas och avancerar 4,5.
Indirekt immunofluorescensanalys är en allmänt accepterad metod för att övervaka fördelningen av proteiner och cellräkning. I laboratoriet används helmonterad retinal immunfärgning ofta i experimentella studier på RGC för att utvärdera de fysiologiska och patologiska tillstånden i näthinnan6. De vanligaste markörerna som används för RGC-kvantifiering i hela näthinnan inkluderar Brn3a, RNA-bindande protein med multipel splitsning (RBPMS) och så vidare 7,8. Att karakterisera mängden och fördelningen av RGC kräver högkvalitativ helmonterad retinal immunfärgning. I allmänhet, i immunfärgningsprotokoll, nedsänks näthinnan i kemiska fixeringsmedel innan den inkuberas i antikroppar. Idealiska fixeringsmedel bör inte ändra cellernas form, tillgängligheten eller affiniteten hos epitoperna för antikroppar eller vävnadens linjära dimensioner 9,10.
På grund av näthinnans komplexa struktur är problem som retinal bräcklighet och vikning, liksom några vanliga svårigheter inklusive cellkrympning och oklara kärnor, benägna att uppstå när man gör en helmonterad retinalplåster, vilket har en negativ inverkan på experimentell forskning. Dessutom är inte alla näthinnor immunfärgade omedelbart, särskilt när det gäller näthinnorna hos transgena möss med dyra priser som är av värdefullt ursprung, vilket kräver bevarande av de extra retinalproverna för vidare användning.
Den lämpliga fixativa lösningen kan fixera vävnaden snabbt, undvika vävnadsautolys, bevara vävnadscellernas normala morfologi och struktur och behålla antigeniciteten hos proteiner och andra ämnen10. För närvarande har formaldehydbaserad fixering använts i stor utsträckning i olika vävnader, inklusive separerade näthinnor, hemisected ögonmusslor och hela ögonbollar10. Vävnadskrympning och morfologisk förändring av celler är de två kritiska utmaningarna som uppstår efter nedsänkning i formaldehyd11. Dessutom framträder modifierade fixeringsformuleringar alltmer för att maximera bibehållandet av näthinnans och målcellernas ursprungliga egenskaper 9,10. Olika retinala fixeringsbehandlingar kan påverka retinalstrukturen, proteinimmunogeniciteten, fluorescensexcitationen och dämpningssläckningscykeln olika12,13. Näthinnor fixerade med Davidsons lösning är mer morfologiskt intakta jämfört med de som fixerats med formalin, men Davidsons lösning är mindre kompatibel med vissa antikroppar, såsom mikroglialmarkörjoniserad kalciumbindningsadaptermolekyl 112. Med tanke på näthinnans bräckliga natur skulle forskare naturligtvis undra om näthinnans integritet, liksom målcellernas egenskaper och morfologi, kommer att förändras efter långvarig lagring. De möjliga effekterna av fixeringslösning på retinal och RGC-cellmorfologi efter lagring i flera månader har dock sällan rapporterats. Optimeringen av retinal fixering är avgörande för utvärdering och bevarande av RGCs.
Vi ger en detaljerad beskrivning av en pålitlig och tekniskt enkel metod som vi använder för helmonterad murin retinal färgning. Vår metod betonar korrekt förberedelse och lagring av näthinnor för RGC-undersökning, med hänsyn till behovet av långvarig lagring av retinal vävnad samt specifika aspekter av fluoroforbildning eller nedbrytning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla steg utförs vid rumstemperatur om inget annat anges. Alla C57BL / 6J-möss som användes erhölls från Laboratory Animal Center vid Wuhan University, och alla relaterade experiment godkändes av kommittén för etik för djurförsök vid Wuhan University. Alla ansträngningar gjordes för att minimera mössens lidande.
1. Enukleation och fixering av ögonen
- Avliva mössen med koldioxidkvävning och enukleera ögongloben försiktigt med tandlös pincett.
- Skölj ögongloben en gång i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Punktera ögongloben med en sprutnål vid hornhinnan under ett mikroskop (okular WF: 10x/22; kontinuerligt förstoringsmål: 0,67x-4,5x) för att påskynda fixeringen i ögongloben och förbättra fixeringseffektiviteten.
- Överför till en platta med 24 brunnar innehållande 4% paraformaldehyd (PFA).
- Fixera ögongloben i 4% PFA i 45 minuter och överför den sedan till 1x PBS för att ta bort överskott av PFA (tvätta tre gånger, 5 min / gång) omedelbart.
2. Näthinnan isolering och utplattning
- Överför ögongloben till en glasskiva och placera den under ett dissekerande mikroskop (okular WF: 10x/22; kontinuerligt förstoringsmål: 0,67x-4,5x).
- Håll pincetten i ena handen och använd den för att klämma fast hornhinnans marginal för att förhindra ögonglobsrörelse. Använd den andra handen för att hålla dissekeringssaxen och skär runt hornhinnan på cirka 1 mm djup genom corneoscleral limbus. Ta bort linsen och glaskroppen.
- Håll den optiska skivan i mitten och skär näthinnan radiellt längs de fyra kvadranterna med hjälp av dissekeringssax och når ungefär 2/3 av näthinnans radie.
- Kläm fast en av sklerala kanter med tandade pincett. Håll å andra sidan kanten på sclera med otandad pincett och flytta från där sclera fixeras av de tandade pincetten mot basen av sclera. Skala försiktigt näthinnan.
- Rita av PBS med en pipett (200 μL) för att spola och blöta näthinnan och ta sedan bort eventuellt överskott av PBS med en liten bit absorberande papper. Om det behövs, platta försiktigt näthinnan med en liten borste.
- Pipettera långsamt kall metanol (förkyld i en -20 ° C frys) droppe för droppe på näthinnans inre yta (volymen metanol är inte fixerad, så länge näthinnan kan täckas helt av metanolen). Näthinnan blir vit och utvecklar ökad uthållighet.
- Platta försiktigt näthinnan och ta bort orenheter som kvarvarande pigmentmembran och glaskroppen med små borstar. Invertera näthinnan med små borstborstar och upprepa ovan nämnda process.
- Överför den metanolbehandlade näthinnan till en brunn på en 24-brunnsplatta och håll den blöt i metanol.
- Förvara den vid −20 ° C i 1-2 timmar för omedelbar immunfärgning, eller lämna näthinnan i metanol och förvara den vid −20 ° C för långvarig lagring.
- Ta bort metanolen från 24-brunnsplattan och skölj näthinnan med 1x PBS.
3. Immunofluorescerande färgning av RGC
- Överför försiktigt näthinnan till en 24-brunns hemagglutinationsplatta med en plastpasteurpipett och blockera i 5% PBS-TX-BSA (5 g bovint serumalbuminpulver upplöst i 100 ml 1x PBST-lösning; PBST bildas genom tillsats av 10 ml Triton X-100 till 2,000 ml 1 x PBS) vid rumstemperatur i 4 timmar eller över natten vid 4 ° C. Håll ganglionsidan uppåt.
- Ta bort PBS-TX-BSA och inkubera näthinnan vid 4 °C i 48–96 timmar, tillsätt 100 μL av den valda primära antikroppen (marsvinsanti-RBPMS-antikroppen) med en spädning på 1:400.
- Ta bort den primära antikroppen och skölj näthinnan tre gånger (20 min vardera) med 1x PBS, skaka vid rumstemperatur.
- Inkubera näthinnan med försiktig skakning över natten vid 4 °C med 100 μl av motsvarande sekundära antikropp (se Materialtabell), cyanin Cy3 affiniPure donkey anti-marsvin IgG (H+L), med en spädning på 1:400.
- Skölj näthinnan med 1x PBS tre gånger (20 min vardera).
- Lägg näthinnan platt på objektglaset med gangliecellskiktet vänt uppåt, släpp en lämplig mängd antifluorescenssläckningsmedel runt näthinnan med en pipett och täck glaset med ett täckglas (var försiktig så att du inte har bubblor).
OBS: För att bestämma lämplig mängd antifluorescenssläckare, se till att den täcker hela näthinnan. Därefter täcker du bilden utan att näthinnan flyter och rör sig lätt. - Försegla glaset runt med ett tätningsmedel för att förhindra att det rör sig. Förvara proverna vid -20 ° C och skydda dem från ljus.
- Avbilda näthinnan med hjälp av ett fluorescens/konfokalmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter dissektion ska näthinnan se ut som en platt fyrklöver. I denna studie, genom att använda protokollet som beskrivs ovan, blev näthinnan vit efter att metanol tillsattes (figur 1). Under tiden förändrades näthinnan från mjuk till smidig och platt. Därefter märktes RGC med anti-RBPMS8. Fyra bildfält togs i den helmonterade näthinnan (n = 3) med hjälp av ett konfokalmikroskop (okular: 10x; mål: 40x). Representativa vyer av visualiserade RGC av näthinnor före metanolbearbetning och efter 12 månaders långtidskonservering i metanol visas i figur 2. Fluorescensintensiteten visade inga signifikanta förändringar. Metanolkonservering påverkade inte RGC-immunfärgningen.
Figur 1: Näthinneförändringar efter metanolbehandling. (A) Före metanolbehandling. b) Efter metanolbehandling. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Effekt av metanol på retinal ganglioncell (RGC) immunfärgning. (A) Näthinnan utan metanolbehandling. (B) Näthinnan med 12 månaders lagring i metanol. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fixering är ett viktigt steg för att bevara näthinnan, vilket kan påverka eventuella efterföljande RGC-undersökningar baserade på morfologi. Framgångsrik fixering fångar snabbt näthinnans struktur och tillstånd vid tidpunkten för att exponera dem för fixeringsmediet, vilket är avgörande för vidare analys. Även om formaldehyd har ansetts vara ett av de vanligaste fixeringsmedlen för fixering och konservering av vävnader och celler, fungerar formaldehyd ensam inte alltid bra som det optimala kemiska fixeringsmedlet för vissa undersökningar10,14. Olika typer av fixeringsmedel har varierande kapacitet att fälla ut aminosyror och nukleotider, stabilisera proteiner och upprätthålla cellmorfologi15. Genom att använda blandningar av båda typerna av fixeringsmedel kan styrkorna hos var och en utnyttjas fullt ut16,17. Metanol används ofta i många fixeringsprocedurer innan vävnaden är nyfryst eller inbäddad i ideala skärmaterial16,18. För helmonterade experiment används 100% kall (−20 ° C) metanol för att uppnå retinal provfixering, vilket hjälper provpermeabiliseringen för den efterföljande fluorescensbaserade avbildningen19.
En viktig fördel med metanolfixering är att det möjliggör enkel konservering. I detta protokoll tillsätts metanol till näthinnans fram- och baksida gradvis vid −20 °C efter att näthinnan har plattats till. Det kan lätt observeras att näthinnans färg snabbt förändras från genomskinlig till mjölkvit och föroreningarna blir tydligare. Det bör noteras att näthinnan ska försiktigt plattas med en borste för att förhindra krullning runt den under metanoldroppningsprocessen. Efter metanolbehandlingen ökar näthinnans totala seghet, vilket minskar svårigheten att avlägsna föroreningarna och överföra näthinnan. Efterfixering med metanol är bekvämare för att bevara näthinnor som har fixerats något med PFA. Men när näthinnans hållfasthet förbättras kommer uthålligheten hos glaskroppen och andra föroreningar sannolikt också att öka i enlighet därmed. Man kan försöka försiktigt ta bort vissa föroreningar som är lätta att ta bort innan man använder metanol, och sedan ta bort de återstående föroreningarna efter dropptillsatt metanol, vilket är lättare att utföra. Tidigt avlägsnande av föroreningar kräver tillräckligt med övning och erfarenhet. Det rekommenderas att försiktigt borsta den återstående glaskroppen på näthinnan radiellt utåt från optisk skiva.
I detta protokoll, efter behandlingen, blötläggs näthinnan i metanol och placeras i en -20 ° C frys under en tid före efterföljande tätning, och andra behandlingar kan ytterligare öka näthinnans seghet. Det är dock svårt att ange en exakt tidsperiod som skulle vara universellt optimal för nedsänkningsfixering. Vid behov kan näthinnan förvaras i kall metanol under långa perioder.
I detta arbete, med den presenterade metodiken, undersöktes effekten av lagring i metanol på RGC-färgning - en avgörande teknik i retinala kvalitativa och kvantitativa utvärderingar - undersöktes. med användning av metanol förändrades inte fluorescensintensiteten hos RGCs, vilket skulle påverka resultaten av kvalitativ och kvantitativ testning, under immunfärgning. Näthinnan kunde förvaras på obestämd tid i en konserverande lösning, kall (−20 ° C) metanol, i minst 12 månader före färgning. Dessutom avslöjade vår tidigare studie ingen signifikant skillnad i RGC-överlevnad i synnervkrossmusmodellen efter långvarig lagring i metanol, och metanolkonservering hade också liten inverkan på den kvantitativa analysen av retinal vaskulatur och retinal hypoxi i den syreinducerade retinopatimodellen20. Vi rekommenderar att du använder 4% PFA och kall (−20 ° C) metanol sekventiellt för provberedning, samt att anta metanolfixering för lagringsstrategier i laboratoriet. En begränsning är att analyserna inte fullt ut visar subtila morfologiska förändringar på dendrit- eller axonal nivå, även om tätheten hos RGC och morfologin hos soma inte verkar förändras21,22. Det bör noteras att vi i detta protokoll endast testade RBPMS för RGC. Ytterligare verifiering av olika RGC-proteiner (t.ex. Brn3a, neuronala kärnor, neurofilament-L) skulle ge ett mer robust resultat. Dessutom har protokollet också potential att tillämpas på någon annan celltyp i näthinnan som behöver ytterligare forskning. Långvarig inandning eller direkt kutan exponering för metanol kan dock orsaka toxiska effekter på människokroppen. Därför är det nödvändigt att vidta goda försiktighetsåtgärder vid användning av metanol.
Vår metod lägger stor vikt vid att använda metanolfixering för lagring av näthinnor för RGC-undersökningar och belyser viktiga överväganden avseende RGC-kvantifiering och fluorescensintensitet. Detta protokoll ger en enkel och praktisk metod för att tillgodose behovet av att bevara näthinneprover för vidare användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna känner inte till några anknytningar, medlemskap, finansiering eller finansiella innehav som kan påverka objektiviteten i denna studie.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av Hubei Key Laboratories Opening Project (bidrag nr 2021KFY055), Natural Science Foundation of Hubei Province (bidrag nr 2020CFB240) och Fundamental Research Funds for the Central Universities (grant no. 2042020kf0065).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
| 24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
| Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
| Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
| BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
| Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
| Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
| Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
| Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
| Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
| Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
| Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
References
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).
- Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy. Frontiers in Immunology. 13, 860070 (2022).
- Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).
- Vidal-Sanz, M., et al. Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).
- Kole, C., et al. Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 31 (2020).
- Nadal-Nicolás, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
- Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives. Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).
- Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pflüger, H. J. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).
- Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson's solution and formalin as fixatives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin's fluid or Davidson's fluid. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).
- Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible. Environmental Health. 11, 59 (2012).
- Tang, M., et al. An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway. Immunobiology. 227 (6), 152260 (2022).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
- Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method. Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).
- Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).
- Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. Using methanol to preserve retinas for immunostaining. Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).
- Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).
- Parrilla-Reverter, G., et al. Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study. Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).
