Summary
Anvendelsen af støttelag på kryogene elektronmikroskopigitter (cryoEM) kan øge partikeltætheden, begrænse interaktioner med luft-vand-grænsefladen, reducere stråleinduceret bevægelse og forbedre fordelingen af partikelorienteringer. Dette papir beskriver en robust protokol til belægning af kryoEM-gitre med et monolag grafen for forbedret kryoprøveforberedelse.
Abstract
I kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) påføres oprensede makromolekyler på et gitter, der bærer en hullet carbonfolie; Molekylerne blottes derefter for at fjerne overskydende væske og fryses hurtigt i et ca. 20-100 nm tykt lag glasagtig is, suspenderet over ca. 1 μm brede foliehuller. Den resulterende prøve afbildes ved anvendelse af kryogen transmissionselektronmikroskopi, og efter billedbehandling ved hjælp af passende software kan næratomopløsningsstrukturer bestemmes. På trods af cryoEM's udbredte anvendelse er prøveforberedelse fortsat en alvorlig flaskehals i cryoEM-arbejdsgange, hvor brugerne ofte støder på udfordringer i forbindelse med prøver, der opfører sig dårligt i den suspenderede glasagtige is. For nylig er der udviklet metoder til at modificere kryoEM-gitre med et enkelt kontinuerligt lag grafen, der fungerer som en støtteoverflade, der ofte øger partikeltætheden i det afbildede område og kan reducere interaktioner mellem partikler og luft-vand-grænsefladen. Her leverer vi detaljerede protokoller til anvendelse af grafen på kryoEM-gitre og til hurtig vurdering af den relative hydrofilicitet af de resulterende gitre. Derudover beskriver vi en EM-baseret metode til at bekræfte tilstedeværelsen af grafen ved at visualisere dets karakteristiske diffraktionsmønster. Endelig demonstrerer vi nytten af disse grafenunderstøtninger ved hurtigt at rekonstruere et 2,7 Å opløsningstæthedskort over et Cas9-kompleks ved hjælp af en ren prøve ved en relativt lav koncentration.
Introduction
Enkeltpartikelkryogenelektronmikroskopi (cryoEM) har udviklet sig til en udbredt metode til visualisering af biologiske makromolekyler1. Drevet af fremskridt inden for direkte elektrondetektion 2,3,4, dataindsamling5 og billedbehandlingsalgoritmer 6,7,8,9,10 er cryoEM nu i stand til at producere næsten atomopløselige 3D-strukturer af et hurtigt voksende antal makromolekyler11. Desuden kan brugerne ved at udnytte tilgangens enkeltmolekylekarakter bestemme flere strukturer fra en enkelt prøve 12,13,14,15, hvilket fremhæver løftet om at bruge de genererede data til at forstå heterogene strukturelle ensembler 16,17. På trods af disse fremskridt er der fortsat flaskehalse i forberedelsen af kryoprøvegitteret.
Til strukturel karakterisering ved kryoEM skal biologiske prøver være godt dispergeret i vandig opløsning og derefter flashfryses gennem en proces kaldet vitrifikation18,19. Målet er at fange partikler i et ensartet tyndt lag forglasset is suspenderet over regelmæssigt fordelte huller, der typisk skæres i et lag af amorft kulstof. Denne mønstrede amorfe kulstoffolie understøttes af et TEM-gitter med et net af kobber- eller guldstøttestænger. I standardarbejdsgange gengives gitre hydrofile ved hjælp af en plasmabehandling med glødudladning inden påføring af prøven. Overskydende væske blottes med filterpapir, hvilket gør det muligt for proteinopløsningen at danne en tynd flydende film over hullerne, der let kan forglases under nedfrysning. Almindelige udfordringer omfatter partikellokalisering til luft-vand-grænsefladen (AWI) og efterfølgende denaturering20,21,22 eller vedtagelse af foretrukne orienteringer 23,24,25, partikelvedhæftning til kulstoffolien snarere end at migrere ind i hullerne og klyngedannelse og aggregering af partiklerne i hullerne26. Uensartet istykkelse er en anden bekymring; Tyk is kan resultere i højere niveauer af baggrundsstøj i mikrografierne på grund af øget elektronspredning, mens ekstremt tynd is kan udelukke større partikler27.
For at løse disse udfordringer er en række tynde støttefilm blevet brugt til at belægge gitteroverflader, så partikler kan hvile på disse understøtninger og ideelt set undgå interaktioner med luft-vand-grænsefladen. Grafenstøtter har vist stort løfte, dels på grund af deres høje mekaniske styrke kombineret med deres minimale spredningstværsnit, hvilket reducerer baggrundssignalet tilføjet af støttelaget28. Ud over sit minimale bidrag til baggrundsstøj udviser grafen også bemærkelsesværdig elektrisk og termisk ledningsevne29. Grafen- og grafenoxidbelagte gitre har vist sig at give højere partikeltæthed, mere ensartet partikelfordeling30 og reduceret lokalisering til AWI22. Derudover giver grafen en støtteoverflade, der kan modificeres yderligere til: 1) indstille gitteroverfladens fysiokemiske egenskaber gennem funktionalisering 31,32,33; eller 2) parforbindelsesmidler, der letter affinitetsoprensning af proteiner af interesse 34,35,36.
I denne artikel har vi ændret en eksisterende procedure til belægning af kryoEM-gitre med et enkelt ensartet lag grafen30. Ændringerne sigter mod at minimere nethåndtering i hele protokollen med det formål at øge udbyttet og reproducerbarheden. Derudover diskuterer vi vores tilgang til at evaluere effektiviteten af forskellige UV / ozonbehandlinger i gengivelsesgitter hydrofile inden nedkastning. Dette trin i kryoEM-prøveforberedelse ved hjælp af grafenbelagte gitre er kritisk, og vi har fundet vores enkle metode til at kvantificere den relative hydrofilicitet af de resulterende gitre nyttig. Ved hjælp af denne protokol demonstrerer vi nytten af at anvende grafenbelagte gitre til strukturbestemmelse ved at generere en højopløselig 3D-rekonstruktion af katalytisk inaktive S. pyogenes Cas9 i kompleks med guide-RNA og mål-DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af CVD-grafen
- Forbered grafenætsningsopløsning som beskrevet nedenfor.
- 4,6 g ammoniumpersulfat (APS) opløses i 20 ml vand af molekylær kvalitet i et 50 ml bægerglas til en 1 M-opløsning og dækkes med aluminiumsfolie. Lad APS opløses helt, mens du fortsætter til trin 1.2.
- Forbered et afsnit af CVD-grafen til methylmethacrylat (MMA) belægning. Skær forsigtigt en firkantet sektion af CVD-grafen. Overfør firkanten til en dæksel (50 mm x 24 mm) i en ren petriskål og dæk under transport til spincoateren.
BEMÆRK: En firkant på 18 mm x 18 mm skal give 25-36 grafenbelagte gitre.
2. Belægning af CVD-grafen med MMA
- Indstil spincoaterindstillingerne til en 60 s højhastighedsspin ved 2.500 o / min. Placer forsigtigt CVD-grafen på borepatronen i passende størrelse.
BEMÆRK: Ideelt set vil CVD-grafen strække sig 1-2 mm over kanten af den valgte borepatron for at forhindre aspiration af MMA i vakuumsystemet. - Tryk på knappen Tag/absorber for at aktivere vakuumpumpen og fastgør CVD-grafen på borepatronen. Påfør MMA på midten af CVD-grafenfirkanten, luk låget, og tryk straks på Start / Stop-knappen . For en 18 mm x 18 mm firkant CVD-grafen er 40 μL MMA tilstrækkelig.
- Når centrifugeringen er stoppet, frakobles vakuumpumpen, og den MMA-belagte CVD-grafen med pincet hentes forsigtigt frem. Vend CVD-grafen, så den MMA-belagte side vender nedad, og læg den tilbage på glasdækslet.
3. Plasmaætsning af grafenbagsiden
- Overfør CVD-grafen på dækslet ind i glødeudladeren og glødafladning i 30 s ved 25 mA ved hjælp af en pincet med flad spids.
- Sæt CVD-grafen på dæksedlen tilbage i petriskålen og dæk under transporten til kobberætsningsområdet. MMA-belægning beskytter topsidegrafenlaget mod plasmaætsning.
4. Skæring af MMA-belagte CVD-grafenfirkanter i gitterstørrelse
- Brug to par pincet til at understøtte CVD-grafenfirkanten. Vær opmærksom på retningen af CVD-grafenfirkanten, hold MMA-siden opad, mens den er fastgjort til pincetten (CRITICAL).
- Skær CVD-grafen i kvadrater på ca. 3 mm x 3 mm. Brug to sæt omvendt virkende tang til dette trin til at holde CVD-grafenkvadratet med højre side opad og forankre det på plads, og også til at holde kanten af en 3 mm x 3 mm firkant efter at have skåret den væk fra resten af firkanten.
5. Opløsning af kobbersubstrat fra MMA-belagt CVD-grafen
- Flyd forsigtigt hver 3 mm x 3 mm firkant i APS-opløsningen. Tag kontakt til overfladen af APS-opløsningen, inden du frigiver hver firkant. Vip bægerglasset, så hvert kvadrat kan placeres i opløsningen i en lav vinkel; Dette sikrer, at pladsen ikke synker.
- Bægerglasset dækkes med aluminiumsfolie og inkuberes natten over ved 25 °C.
6. Fjernelse af MMA / grafenfilm fra APS
- Brug et glasdæksel med dimensionerne 12 mm x 50 mm, og udtræk MMA / grafenfirkanterne fra APS ved forsigtigt at kaste dækslet lodret ind i APS og derefter flytte dækslet sideværts, så det støder op til en flydende MMA / grafenfirkant.
- Fjern forsigtigt dæksedlen, og sørg for, at firkanten klæber helt til siden af dæksedlen, når den fjernes.
- Overfør MMA/grafenkvadrater til et rent 50 ml bægerglas fyldt med vand af molekylær kvalitet i 20 minutter. Dyk forsigtigt dækselsedlen med en MMA / grafenfirkant fastgjort lodret i vandet, og sørg for, at firkanten løsner sig fra dækslet ved interaktion med vandets overflade. Gentag for alle MMA/grafen-firkanter.
7. Klæbende grafen til gitre
- Brug pincet til negativ handling og dypp forsigtigt et gitter lodret i vandet med kulstofsiden vendt mod en flydende MMA / grafenfirkant. Når du er i kontakt med firkanten, skal du forsigtigt fjerne gitteret og sikre, at firkanten klæber helt til kulstofsiden af gitteret ved fjernelse. Minimer lateral bevægelse af gitteret, når det er nedsænket i vand for at forhindre beskadigelse af gitterkvadrater (CRITICAL).
- Placer gitre på en ren dæksel MMA / grafen side opad og lufttør i 1 til 2 min. Overfør grafen-/MMA-belagte gitre til en varmeplade, der er indstillet til 130 °C, med en pincet med flad spids.
- Dæk med toppen af et glas petriskål og inkuber i 20 min. Fjern fra varmen og afkøl til stuetemperatur i 1 til 2 min.
FORSIGTIG: Vær forsigtig, da petriskålen bliver ekstremt varm.
8. Opløsning af MMA med acetone
- Overfør hele dækslet til en petriskål fyldt med 15 ml acetone. Inkuber i 30 min.
- Brug en ren glasserologisk pipette til at overføre acetone, hvori gitterene blev inkuberet, til en affaldsbeholder. Tilsæt forsigtigt 15 ml frisk acetone til petriskålen ved hjælp af en ren glasserologisk pipette. Inkuber i 30 min.
- Gentag disse vasketrin for i alt 3 acetonevaske.
9. Fjernelse af resterende acetone med isopropanol
- Efter 3 acetonevaske fjernes acetone og erstattes med 15 ml isopropanol ved hjælp af en ren serologisk pipette af glas. Inkuber i 20 min.
- Gentag 3x for i alt 4 isopropanolvaske. Fjern forsigtigt gitter fra isopropanol og lufttør på et rent dæksel ved hjælp af pincet.
BEMÆRK: Resterende isopropanol kan gøre det vanskeligt at frigive gitter fra pincet. At komme i kontakt mellem gitteret og det rene dæksel, inden gitteret frigøres fra pincetten, kan afhjælpe dette problem. - Resterende organiske stoffer inddampes ved at overføre dæksedlen med grafenbelagte gitre til en kogeplade, der er indstillet til 100 °C i 10 minutter. Afkøles til stuetemperatur og opbevares under vakuum indtil brug.
10. UV/ozonbehandling af grafenbelagte net
- Brug omvendt virkende pincet til forsigtigt at placere gitre i et rent belysningsområde på et UV/ozon-rengøringsmiddel med grafenbelagt side opad.
- Skub belysningsområdet lukket, og tænd for maskinen. Drej tidsvælgeren til den angivne behandlingstid for at begynde UV/ozonbehandling af gitterene.
BEMÆRK: Behandlingsvarighed er en justerbar parameter, hvor overskydende behandling potentielt kan beskadige nettet. Han et al.30 anbefaler 10 minutters UV/ozonbehandling, og vi har også fundet en 10 min behandling tilstrækkelig. Se trin 12 for vejledning i indstilling af denne behandlingstid. - Fortsæt direkte med at kaste en kryoEM-prøve på de behandlede gitter ved at følge kastetrin som beskrevet i Koh et al.37.
BEMÆRK: Atmosfæriske kulbrinter kan akkumulere på gitteroverfladen efter UV/ozonbehandling og øge grafenoverfladens hydrofobicitet38,39. For at undgå dette skal du straks kaste de UV/ozonbehandlede gitre. Det kan være en fordel at UV/ozonbehandle riste i batches, f.eks. UV/ozon behandle seks riste og straks kaste disse seks gitre ned, derefter UV/ozon behandle en anden batch af gitre efterfulgt af at kaste den anden batch.
11. Optagelse af et diffraktionsbillede
- Sørg for, at mikroskopet er godt indstillet med parallel belysning etableret, og indstil endelig defokusering til -0,2 μm.
- Indsæt den fluorescerende skærm, og strålestoppet helt. Gå ind i diffraktionstilstand for tydeligt at visualisere diffraktionspunkter.
- Få et billede ved hjælp af et CCD-kamera og evaluer det ved hjælp af billedanalysesoftware.
BEMÆRK: De lettest observerede og identificerbare diffraktionspunkter genereret af et grafenmonolag er 6 pletter svarende til en rumlig frekvens på 2,13 Å. Brug et måleværktøj til at estimere afstanden fra midten af den diffrakterede stråle til et af disse diffraktionspunkter i gensidige enheder. Især 2,13 Å
0,47 Å-1.
0,47 Å-1.12. Vurdering af nettets hydrofilicitet
- Forbered billedopsætningen. Find et telefonstativ, en billedbehandlingsoverflade på bordpladen, telefon med kamera, glasdæksel og paraffinfilm. De billeder, der vises her, blev taget ved hjælp af et telefonstativ og en billedoverflade, der blev 3D-printet ved hjælp af de medfølgende .stl-filer, hvilket resulterede i lettere reproducerbare og kvantificerbare kontaktvinkelmålinger (supplerende figur 1A).
- Læg et glasdæksel på den flade overflade, skær derefter en 1 cm x 1 cm firkant paraffinfilm og læg den på glasdækslet. Placer telefonen på telefonholderen, og vend telefonen, så kameraet er i plan med glasdækslet. Fastgør telefonen i denne position ved hjælp af elastikker (supplerende figur 1B). Tag et prøvebillede for at kontrollere, at kameraet er justeret i forhold til billedoverfladen.
- Umiddelbart efter UV/ozonbehandling af grafenbelagte riste anbringes et enkelt gitter på kvadratet af paraffinfilm på glasdækslet. Sørg for, at grafensiden vender opad. Tilsæt en 2 μL vanddråbe på midten af gitteroverfladen med en pipette og tag straks et billede.
BEMÆRK: Gentag dette trin efter: i) ønskede intervaller af UV/ozonbehandling for at bestemme en tilstrækkelig behandlingsvarighed; eller ii) ønskede tidsintervaller efter UV/ozonbehandling for at måle, hvor længe netoverfladen efter behandlingen bevarer sin hydrofile karakter. - Beregn kontaktvinkler fra fotos ved at importere dem til ImageJ43 og bruge kontaktvinkelpluginet.
13. Enkelt partikelanalyse af det komplekse dCas9-datasæt
BEMÆRK: Al billedbehandling beskrevet i denne protokol blev udført ved hjælp af cryoSPARC version 4.2.1.
- Forbehandle film ved hjælp af Patch Motion Correction og Patch CTF Estimation-job. Udfør partikelplukning ved hjælp af Blob picker-jobbet ved hjælp af en sfærisk klat i diameter fra 115 Å til 135 Å.
- Uddrag partikler ved hjælp af jobbet Uddrag fra mikrografer ved hjælp af normaliseret korrelationskoefficient (NCC) og effekttærskler, hvilket resulterer i ca. 200-300 partikler pr. mikrograf. Bemærk, at passende tærskler og deraf følgende partikeltal kan variere, og brugerne bør inspicere plukkekvaliteten på tværs af en række mikrografier for at identificere passende forhold.
- Udfør indledende rekonstruktioner i flere klasser ved hjælp af Ab-initio-rekonstruktionsjobbet, der kræver tre klasser. To af de tre klasser vil sandsynligvis indeholde ikke-Cas9-partikler, herunder overfladeforurenende stoffer. Vælg klassen, der ligner dCas9 til videre behandling.
BEMÆRK: Yderligere runder af multiclass Ab-initio rekonstruktion eller heterogen raffinement kan anvendes til yderligere at forfine partikelstakken. - Udfør 3D-finjustering ved hjælp af jobbet Ikke-ensartet forbedring ved at vælge standardparametre. Anslå opløsningen af rekonstruktionen ved hjælp af validerings- (FSC) og ThreeDFSC-job ved hjælp af kortene og masken fra den endelige 3D-forbedring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En vellykket fremstilling af grafenbelagte kryoEM-gitre ved hjælp af udstyret (figur 1) og protokollen (figur 2), der er skitseret her, vil resultere i et monolag grafen, der dækker foliehullerne, der kan bekræftes af dets karakteristiske diffraktionsmønster. For at fremme proteinadsorption til grafenoverfladen kan UV / ozonbehandling bruges til at gøre overfladen hydrofil ved at installere iltholdige funktionelle grupper. Imidlertid kan kulbrintekontaminanter i luften adsorbere på grafenoverfladen så tidligt som 5 min efter UV/ozonbehandling og modvirke denne effekt38,39. Det er vigtigt, at både varigheden af UV/ozonbehandlingen og den tid, der går mellem behandling og dykkning, kan påvirke prøvekvaliteten. Vi demonstrerer disse effekter ved hjælp af en simpel metode til vurdering af det coatede gitters hydrofile karakter baseret på overfladens kontaktvinkel (figur 3; se trin 12).
For at demonstrere brugen af grafenstøtter i enkelt partikelkryoEM anvendte vi en katalytisk inaktiv RNA-guidet DNA-endonuklease S. pyogenes Cas9 (H10A; C80'ERNE; C574S; H840A)40 i kompleks med sgRNA og mål-DNA til grafenbelagte gitre, indsamlede et kryoEM-datasæt fra disse gitre og udførte enkeltpartikelanalyse7. Grafenbelagte gitre indeholdt konsekvent ~ 300 partikler pr. mikrograf ved 0,654 Å / pix forstørrelse ved hjælp af et 300 keV mikroskop udstyret med en K3 direkte elektrondetektor (figur 4A-E). En 8 timers dataindsamlingssession med en +18° scenehældning gav 2.963 film og 324.439 partikler i en endelig kurateret stak. Ved hjælp af disse partikler genererede vi en 3D-rekonstruktion, som efter forfining gav et densitetskort med en estimeret opløsning på 2,7 Å og tilstrækkelig vinkelprøveudtagning for at undgå anisotrope artefakter (figur 5). En atommodel (PDB 6o0z)41 blev docket ind i dette kort og raffineret ved hjælp af ISOLDE42. Rester R63-L82 af denne monterede atommodel vises med det raffinerede kryoEM-densitetskort, der fremhæver den opløste sidekædetæthed (figur 5B). Ved sammenligning af den samme prøve og koncentration (250 ng/μL) anvendt på identiske gitre, der manglede grafen, blev der ikke observeret partikler (figur 4F,G). Denne observation fremhæver effektiviteten af grafenunderstøttelsen til at muliggøre visualisering af partikler fra prøver med lav koncentration.
Figur 1: Nødvendigt udstyr. Laboratorieudstyr og værktøjer, der er nødvendige til fremstilling af grafengitter ved hjælp af protokollen beskrevet i denne artikel. Varer og deres antal vises og mærkes i overensstemmelse hermed. Nødvendige reagenser, der ikke er vist, inkluderer: CVD-grafen, methylmethacrylat EL-6 (MMA), ammoniumpersulfat (APS), acetone, isopropanol, ethanol, vand af molekylær kvalitet. Nødvendige instrumenter, der ikke er vist, inkluderer: spincoater, glødeudladning, kogeplade, vakuumekssikkator og termometer. Alle nødvendige elementer er beskrevet i materialefortegnelsen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skematisk oversigt over grafengitterfremstillingsprocessen. Grafen er belagt med et tyndt lag methylmethacrylat EL-6 (MMA) ved hjælp af en spincoater (trin 2). Grafen på den modsatte side af kobberfolien fjernes via plasmaætsning (trin 3). Ammoniumpersulfat (APS) bruges derefter til at ætse kobberet væk (trin 4-5). MMA-grafenfilmen placeres på gitteroverfladen (trin 6-7). Endelig opløses MMA under en række vaske med organiske opløsningsmidler (trin 8-9). Trin angivet ovenfor pile svarer til nummererede trin beskrevet i protokolafsnittet. Denne metode er blevet tilpasset fra Han et al.30. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Vurdering af nettets overfladehydrofilicitet som funktion af varigheden af UV/ozonbehandlingen og den tid, der er gået efter behandlingen. (A) Målte kontaktvinkler plottet som funktion af behandlingens varighed. Reducerede kontaktvinkler er i overensstemmelse med øget hydrofilicitet (ubehandlet gitter: 78°; 20 min: 37°). Kontaktvinkler målt ved hjælp af ImageJ43. (B) Målte kontaktvinkler plottet som funktion af tid, efterbehandling (0 min: 45°; 60 min: 74°). Gitter målt i efterbehandlingsforløbet var UV/ozonbehandlet i 12 minutter som angivet med asterisk. Hver efterbehandlingsmåling blev udført på det samme gitter, hvor prøven blev fjernet ved transportering mellem målingerne. Specifikke kontaktvinkler, der måles, forventes at variere som en funktion af laboratoriemiljøforhold, og vi anbefaler, at brugerne udfører lignende eksperimenter i deres laboratorier for at identificere passende forhold. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative billeder af grafenbelagte gitter og ubelagte kontrolgitre. (A-C) Repræsentative atlas-, gitterkvadrat- og foliehulsbilleder af grafenbelagte hullede kulstofnet taget på et 300 keV mikroskop udstyret med en K3 direkte elektrondetektor. (D) KryoEM-mikrografi af S. pyogenes dCas9 i kompleks med sgRNA og mål-DNA (kompleks ved 250 ng/μL koncentration) på grafenbelagt hult kulstofgitter. (E) Diffraktionsbillede fra gitter afbildet i paneler (A-D). Orange pil angiver en position svarende til en rumlig frekvens på 2,13 Å. En prøve, der var identisk med prøven i panel D, blev anvendt til F) UV/ozonbehandling, og (G) glød udledte hullede kulstofnet uden grafen. De viste CryoEM-mikrografier er repræsentative for hvert gitter og viser ingen partikler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: KryoEM-rekonstruktion af et Cas9-kompleks fra grafenbelagte gitre. (A) CryoEM-tæthedskort fra 3D-rekonstruktion af S. pyogenes dCas9 i kompleks med sgRNA og mål-DNA. (B) Rester R63-L82 fra en monteret model er afbildet inden for den halvgennemsigtige kryoEM-tæthed med en delmængde af synlige sidekæder mærket. (C) Fourier Shell Correlation (FSC) kurver af de umaskerede, løst og tæt maskerede kort. D) Histogram og retningsbestemt FSC-plot baseret på 3DFSC-metode23. Se supplerende figur 2 og trin 13 for yderligere oplysninger. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Stativ til kontaktvinkelbilleddannelse. (A) Et 3D-printet kamerastativ og bordbilledholder til sikring af kameraet i en position, der flugter kameraet i plan med dæksedlen. (B) Gitteret anbringes på dæksedlen oven på et 1 cm x 1 cm kvadratisk stykke paraffinfilm. Den afbildede billedholder blev 3D-printet ved hjælp af de medfølgende .stl-filer (Supplementary Coding File 1 og Supplementary Coding File 2) og kan let ændres, så den passer til de fleste enheder. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Billedbehandlingsarbejdsgang. Behandling af arbejdsgang for dCas9-kompleks. Jobnavne, joboplysninger og ikke-standardparametre (kursiveret) er angivet. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 1: Stereolitografi CAD-filer i STL-format leveres for at lette 3D-udskrivning af kamerastativ (camera_stand_v1.stl). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 2: Stereolitografi CAD-filer i STL-format leveres for at lette 3D-udskrivning af bordpladen billedholderen (slide_mount_v1.stl) og Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forberedelse af CryoEM-prøver indebærer en lang række tekniske udfordringer, hvor de fleste arbejdsgange kræver, at forskere manuelt manipulerer skrøbelige gitre med ekstrem omhu for at undgå at beskadige dem. Derudover er enhver prøves modtagelighed for forglasning uforudsigelig; Partikler interagerer ofte med luft-vand-grænsefladen eller med den faste støttefolie, der ligger over gitterene, hvilket kan føre til, at partikler vedtager foretrukne retninger eller ikke kommer ind i billeddannelseshullerne, medmindre der anvendes meget høje proteinkoncentrationer24. Overlejring af hullede kryoEM-gitre med et kontinuerligt monolag af grafen har vist et enormt løfte om at forbedre partikelfordelingen på mikrografier, øge partikelantallet ved lave koncentrationer og reducere foretrukne orienteringer drevet af interaktioner ved luft-vand-grænsefladen30.
En begrænsning af eksisterende grafenbelægningsprotokoller for cryoEM-gitre er de omfattende manuelle manipulationer, der kræves til belægningsprocessen, hvilket kan kompromittere kvaliteten og øge grid-to-grid-variabiliteten. I dette arbejde beskriver vi små ændringer af en eksisterende protokol til belægning af kryoEM-gitter med et monolag af grafen30.
Kritiske trin inden for denne protokol inkluderer belægning af CVD-grafen med MMA, opløsning af CVD-grafenkobbersubstratet i APS og anvendelse af grafen på kryoEM-gitre. Vi ændrede den oprindelige protokol for at minimere manuelle manipulationer af de coatede riste ved at udskifte opløsningsmidler i den samme petriskål i stedet for individuelt at håndtere og overføre riste til en ny opløsningsmiddelbeholder for hvert vasketrin og derved sigte mod at øge udbyttet af intakte grafenbelagte riste af høj kvalitet. Selvom vi bestræbte os på at reducere manipulationer af grafenbelagte gitre til et minimum, anerkender vi, at manuel anvendelse af individuelle grafenkvadrater på kryoEM-gitre i sagens natur er udfordrende, og at der forventes en vis grid-to-grid-variation.
Grafenbelagte gitter kræver typisk UV / ozonbehandling for at gøre overfladen hydrofil til prøveanvendelse. Varigheden af UV/ozonbehandlingen og den tid, der er gået efter behandlingen og før dykket, kan påvirke nettets hydrofilicitet og i sidste ende prøvekvaliteten. Ud over gitterfabrikationsprotokollen beskriver vi en teknik til vurdering af nethydrofilicitet efter UV/ozonbehandling. I proceduren anvendes overfladekontaktvinklen for en påført prøve som indikator for den hydrofile karakter af det coatede gitter20,44. Design leveres til billigt 3D-print en brugerdefineret gitterbilledholder, der bruger et simpelt mobiltelefonkamera til at estimere overfladens kontaktvinkel.
Endelig beskriver vi resultater opnået ved at anvende denne protokol til at bestemme 2,7 Å kryoEM-strukturen af den katalytisk inaktive RNA-guidede DNA-endonuklease, S. pyogenes Cas9 i kompleks med sgRNA og mål-DNA40. I fravær af grafen blev der ikke observeret partikler i foliehuller ved de anvendte komplekse koncentrationer (250 ng/μL). I modsætning hertil bar grafenbelagte gitre partikler med høj densitet, hvilket muliggjorde let 3D-rekonstruktion af et kort med høj opløsning fra 2.961 mikrografier. Samlet set fremhæver disse data værdien af at anvende grafenmonolag på kryoEM-gitre til enkeltpartikelanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter at afsløre.
Acknowledgments
Prøver blev forberedt og afbildet på CryoEM-faciliteten i MIT.nano på mikroskoper erhvervet takket være Arnold og Mabel Beckman Foundation. Kontaktvinkelbilleddannelsesenheder blev trykt på MIT Metropolis Maker Space. Vi takker laboratorierne Nieng Yan og Yimo Han og personalet på MIT.nano for deres støtte gennem vedtagelsen af denne metode. Vi takker især Dr. Guanhui Gao og Sarah Sterling for deres indsigtsfulde diskussioner og feedback. Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud R01-GM144542, 5T32-GM007287 og NSF-CAREER-tilskud 2046778. Forskning i Davis-laboratoriet støttes af Alfred P. Sloan Foundation, James H. Ferry Fund, MIT J-Clinic og Whitehead-familien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 mL beaker (3x) | Fisher | 02-555-25B | |
| 50 mL beaker (2x) | Corning | 1000-50 | |
| Acetone | Fisher | A949-4 | |
| Aluminum foil | Fisher | 15-078-292 | |
| Ammonium persulfate | Fisher | (I17874 | |
| Coverslips 50 mm x 24 mm | Mattek | PCS-1.5-5024 | |
| CVD graphene | Graphene Supermarket | CVD-Cu-2x2 | |
| easiGlow discharger | Ted-Pella | 91000S | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | 1.11727 | |
| Flat-tip tweezers | Fisher | 50-239-60 | |
| Glass cutter | Grainger | 21UE26 | |
| Glass petri plate and cover | VWR | 75845-544 | |
| Glass serological pipette | Fisher | 13-676-34D | |
| Grid Storage Case | EMS | 71146-02 | |
| Hot plate | Fisher | 07-770-108 | |
| Isopropanol | Sigma | W292907 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| Lab scissors | Fisher | 13-806-2 | |
| Methyl-Methacrylate EL-6 | Kayaku | MMA M310006 0500L1GL | |
| Molecular grade water | Corning | 46-000-CM | |
| Negative action tweezers (2x) | Fisher | 50-242-78 | |
| P20 pipette | Rainin | 17014392 | |
| P200 pipette | Rainin | 17008652 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| Pipette tips | Rainin | 30389291 | |
| Quantifoil grids with holey carbon | EMS | Q2100CR1 | |
| Spin coater | SetCas | KW-4A | with chuck SCA-19-23 |
| Straightedge | ULINE | H-6560 | |
| Thermometer | Grainger | 3LRD1 | |
| UV/Ozone cleaner | BioForce | SKU: PC440 | |
| Vacuum desiccator | Thomas Scientific | 1159X11 | |
| Whatman paper | VWR | 28297-216 |
References
- Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461 (2013).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Sci. 30 (1), 136-150 (2021).
- Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
- Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
- Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
- Kinman, L. F., Powell, B., Zhong, E., Berger, B., Davis, J. H. Uncovering structural ensembles from single particle cryo-EM data using cryoDRGN. Nat Protoc. 18 (2), 319-339 (2022).
- Zhong, E. D., Bepler, T., Berger, B., Davis, J. H. CryoDRGN: reconstruction of heterogeneous cryo-EM structures using neural networks. Nat Methods. 18 (2), 176-185 (2021).
- Chen, M., Ludtke, S. J. Deep learning-based mixed-dimensional Gaussian mixture model for characterizing variability in cryo-EM. Nat Methods. 18 (8), 930-936 (2021).
- Punjani, A., Fleet, D. J. 3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM. J Struct Biol. 213 (2), 107702 (2021).
- Dashti, A., et al. Retrieving functional pathways of biomolecules from single-particle snapshots. Nat Commun. 11 (1), 4734 (2020).
- Sun, J., Kinman, L. F., Jahagirdar, D., Ortega, J., Davis, J. H. KsgA facilitates ribosomal small subunit maturation by proofreading a key structural lesion. Nat Struct Mol Biol. , (2023).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W.
- Dubochet, J.
- Glaeser, R. M., et al. Factors that influence the formation and stability of thin, cryo-EM specimens. Biophys J. 110 (4), 749-755 (2016).
- Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-Em grids. Curr Opin Colloid Interface Sci. 34, 1-8 (2018).
- D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO. J Struct Biol X. 1, 100005 (2019).
- Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nat Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 560-571 (2018).
- Neselu, K., et al. Measuring the effects of ice thickness on resolution in single particle cryo-EM. J Struct Biol X. 7, 100085 (2023).
- Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. J Struct Biol. 174 (1), 234-238 (2011).
- Geim, A. K., Novoselov, K. S.
- Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Sci Rep. 13 (1), 2279 (2023).
- Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nat Commun. 13 (1), 6718 (2022).
- Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Liu, N., et al. Bioactive functionalized monolayer graphene for high-resolution cryo-electron microscopy. J Am Chem Soc. 141 (9), 4016-4025 (2019).
- Benjamin, C. J., et al. Selective capture of histidine-tagged proteins from cell lysates using TEM grids modified with NTA-graphene oxide. Sci Rep. 6, 32500 (2016).
- Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24269-24273 (2020).
- Koh, A., et al. Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope. J Vis Exp. (181), (2022).
- Schweizer, P., et al. Mechanical cleaning of graphene using in situ electron microscopy. Nat Commun. 11 (1), 1743 (2020).
- Li, Z., et al. Effect of airborne contaminants on the wettability of supported graphene and graphite. Nat Mater. 12 (10), 925-931 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Zhu, X., et al. Cryo-EM structures reveal coordinated domain motions that govern DNA cleavage by Cas9. Nat Struct Mol Biol. 26 (8), 679-685 (2019).
- Croll, T. I. ISOLDE: a physically realistic environment for model building into low-resolution electron-density maps. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 519-530 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Prydatko, A. V., Belyaeva, L. A., Jiang, L., Lima, L. M. C., Schneider, G. F. Contact angle measurement of free-standing square-millimeter single-layer graphene. Nat Commun. 9 (1), 4185 (2018).
