Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تطبيق الجرافين أحادي الطبقة على شبكات المجهر الإلكتروني المبرد لتحديد الهيكل عالي الدقة

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/66023
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, 2Program in Computational and Systems Biology, Massachusetts Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

يمكن أن يؤدي تطبيق طبقات الدعم على شبكات المجهر الإلكتروني المبرد (cryoEM) إلى زيادة كثافة الجسيمات ، والحد من التفاعلات مع واجهة الهواء والماء ، وتقليل الحركة التي يسببها الحزمة ، وتحسين توزيع اتجاهات الجسيمات. تصف هذه الورقة بروتوكولا قويا لطلاء شبكات cryoEM بطبقة أحادية من الجرافين لتحسين تحضير عينة التبريد.

Abstract

في المجهر الإلكتروني المبرد (cryoEM) ، يتم تطبيق الجزيئات الكبيرة المنقاة على شبكة تحمل رقائق كربون هولي. ثم يتم تنظيف الجزيئات لإزالة السائل الزائد وتجميدها بسرعة في طبقة سميكة من الجليد الزجاجي بسمك 20-100 نانومتر تقريبا ، معلقة عبر ثقوب رقائق بعرض 1 ميكرومتر تقريبا. يتم تصوير العينة الناتجة باستخدام المجهر الإلكتروني المبرد ، وبعد معالجة الصور باستخدام برنامج مناسب ، يمكن تحديد هياكل الدقة شبه الذرية. على الرغم من اعتماد cryoEM على نطاق واسع ، لا يزال تحضير العينات يمثل عنق زجاجة شديد في سير عمل cryoEM ، حيث يواجه المستخدمون غالبا تحديات تتعلق بالعينات التي تتصرف بشكل سيئ في الجليد الزجاجي المعلق. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير طرق لتعديل شبكات cryoEM بطبقة واحدة مستمرة من الجرافين ، والتي تعمل كسطح دعم يزيد غالبا من كثافة الجسيمات في المنطقة المصورة ويمكن أن يقلل من التفاعلات بين الجسيمات وواجهة الهواء والماء. هنا ، نقدم بروتوكولات مفصلة لتطبيق الجرافين على شبكات cryoEM وللتقييم السريع للمحبة المائية النسبية للشبكات الناتجة. بالإضافة إلى ذلك ، نصف طريقة قائمة على EM لتأكيد وجود الجرافين من خلال تصور نمط الحيود المميز. أخيرا ، نوضح فائدة دعامات الجرافين هذه من خلال إعادة بناء خريطة كثافة دقة 2.7 Å لمجمع Cas9 بسرعة باستخدام عينة نقية بتركيز منخفض نسبيا.

Introduction

تطور المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيم (cryoEM) إلى طريقة مستخدمة على نطاق واسع لتصور الجزيئات البيولوجيةالكبيرة 1. مدعوما بالتقدم في الكشف المباشر عن الإلكترون2،3،4 ، والحصول على البيانات5 ، وخوارزميات معالجة الصور6،7،8،9،10 ، أصبح cryoEM الآن قادرا على إنتاج هياكل ثلاثية الأبعاد قريبة من الدقة الذرية لعدد متزايد بسرعة من الجزيئاتالكبيرة 11. علاوة على ذلك ، من خلال الاستفادة من طبيعة الجزيء الواحد للنهج ، يمكن للمستخدمين تحديد هياكل متعددة من عينة واحدة12،13،14،15 ، مما يسلط الضوء على الوعد باستخدام البيانات التي تم إنشاؤها لفهم المجموعات الهيكلية غير المتجانسة16,17. على الرغم من هذا التقدم ، لا تزال الاختناقات في إعداد شبكة العينات المبردة قائمة.

للتوصيف الهيكلي بواسطة cryoEM ، يجب أن تكون العينات البيولوجية مشتتة جيدا في محلول مائي ثم يجب تجميدها بسرعة من خلال عملية تسمى التزجيج 18,19. الهدف هو التقاط الجسيمات في طبقة رقيقة بشكل موحد من الجليد المزجج المعلق عبر ثقوب متباعدة بانتظام والتي يتم قطعها عادة إلى طبقة من الكربون غير المتبلور. يتم دعم رقائق الكربون غير المتبلورة المزخرفة هذه بواسطة شبكة TEM تحمل شبكة من قضبان دعم النحاس أو الذهب. في سير العمل القياسي ، يتم تقديم الشبكات محبة للماء باستخدام معالجة بلازما متوهجة التفريغ قبل تطبيق العينة. يتم تنظيف السائل الزائد بورق الترشيح ، مما يسمح لمحلول البروتين بتكوين طبقة سائلة رقيقة عبر الثقوب التي يمكن تزجيجها بسهولة أثناء تجميد الغطس. تشمل التحديات الشائعة توطين الجسيمات إلى واجهة الهواء والماء (AWI) والتمسخ اللاحق20،21،22 أو اعتماد الاتجاهات المفضلة23،24،25 ، والتزام الجسيمات برقائق الكربون بدلا من الهجرة إلى الثقوب ، وتجميع وتجميع الجسيمات داخل الثقوب26. سمك الجليد غير المنتظم هو مصدر قلق آخر. يمكن أن يؤدي الجليد السميك إلى مستويات أعلى من ضوضاء الخلفية في الصور المجهرية بسبب زيادة تشتت الإلكترون ، في حين أن الجليد الرقيق للغاية يمكن أن يستبعد الجسيمات الأكبر27.

لمواجهة هذه التحديات ، تم استخدام مجموعة متنوعة من أغشية الدعم الرقيقة لطلاء أسطح الشبكة ، مما يسمح للجزيئات بالراحة على هذه الدعامات ، ومن الناحية المثالية ، تجنب التفاعلات مع واجهة الهواء والماء. أظهرت دعامات الجرافين وعدا كبيرا ، ويرجع ذلك جزئيا إلى قوتها الميكانيكية العالية إلى جانب الحد الأدنى من المقطع العرضي للتشتت ، مما يقلل من إشارة الخلفية التي تضيفها طبقة الدعم28. بالإضافة إلى الحد الأدنى من مساهمته في ضوضاء الخلفية ، يظهر الجرافين أيضا موصلية كهربائية وحراريةملحوظة 29. لقد ثبت أن الشبكات المطلية بالجرافين وأكسيد الجرافين تنتج كثافة جسيمات أعلى ، وتوزيع جسيمات أكثر اتساقا30 ، وتقلل من التوطين إلى AWI22. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر الجرافين سطح دعم يمكن تعديله بشكل أكبر من أجل: 1) ضبط الخصائص الفيزيائية والكيميائية لسطح الشبكة من خلال التشغيلالوظيفي 31،32،33 ؛ أو 2) عوامل ربط الزوجين التي تسهل تنقية تقارب البروتينات ذات الأهمية34،35،36.

في هذه المقالة ، قمنا بتعديل إجراء موجود لطلاء شبكات cryoEM بطبقة موحدة واحدة من الجرافين30. تهدف التعديلات إلى تقليل معالجة الشبكة في جميع أنحاء البروتوكول ، بهدف زيادة العائد وقابلية التكاثر. بالإضافة إلى ذلك ، نناقش نهجنا لتقييم فعالية علاجات الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون المختلفة في جعل الشبكات محبة للماء قبل الغرق. تعد هذه الخطوة في تحضير عينة cryoEM باستخدام الشبكات المطلية بالجرافين أمرا بالغ الأهمية ، وقد وجدنا أن طريقتنا المباشرة لتحديد المحبة المائية النسبية للشبكات الناتجة مفيدة. باستخدام هذا البروتوكول ، نوضح فائدة استخدام الشبكات المطلية بالجرافين لتحديد الهيكل من خلال توليد إعادة بناء 3D عالية الدقة ل S. pyogenes Cas9 غير النشط تحفيزيا في مجمع مع توجيه الحمض النووي الريبي والحمض النووي المستهدف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الجرافين CVD

  1. تحضير محلول نقش الجرافين كما هو موضح أدناه.
    1. قم بإذابة 4.6 جم من كبريتات الأمونيوم (APS) في 20 مل من الماء الجزيئي في دورق سعة 50 مل لمحلول 1 متر وقم بتغطيته بورق الألمنيوم. السماح APS ليذوب تماما أثناء المتابعة إلى الخطوة 1.2.
  2. تحضير قسم من الجرافين CVD لطلاء ميثاكريلات الميثيل (MMA). قطع بعناية قسم مربع من الجرافين الأمراض القلبية الوعائية. انقل المربع إلى غطاء (50 مم × 24 مم) داخل طبق بتري نظيف وقم بتغطيته أثناء النقل إلى مغلف الدوران.
    ملاحظة: يجب أن ينتج مربع 18 مم × 18 مم 25-36 شبكة مطلية بالجرافين.

2. طلاء الجرافين CVD مع MMA

  1. اضبط إعدادات طلاء الدوران على دوران عالي السرعة 60 ثانية عند 2500 دورة في الدقيقة. ضع الجرافين CVD بعناية على ظرف الحجم المناسب.
    ملاحظة: من الناحية المثالية ، سيمتد الجرافين CVD بمقدار 1-2 مم على حافة ظرف الظرف المحدد لمنع شفط MMA في نظام التفريغ.
  2. اضغط على زر Take/Absorb لتعشيق مضخة التفريغ وتثبيت الجرافين CVD على ظرف الظرف . ضع MMA على وسط مربع الجرافين CVD ، وأغلق الغطاء ، واضغط على زر التشغيل / الإيقاف على الفور. بالنسبة لمربع 18 مم × 18 مم من الجرافين CVD ، يكفي 40 ميكرولتر من MMA.
  3. بمجرد توقف الدوران ، افصل مضخة التفريغ واسترد بعناية الجرافين CVD المطلي ب MMA باستخدام الملقط. اقلب جرافين CVD بحيث يكون الجانب المطلي ب MMA متجها لأسفل وضعه مرة أخرى على غطاء الغطاء الزجاجي.

3. حفر البلازما من الجانب الخلفي الجرافين

  1. انقل جرافين CVD الموجود على الغطاءينزلق إلى مفرغ التوهج وتفريغ التوهج لمدة 30 ثانية عند 25 مللي أمبير باستخدام ملاقط مسطحة الأطراف.
  2. أعد الجرافين CVD على الغطاء إلى طبق بتري وقم بتغطيته أثناء النقل إلى منطقة النقش على النحاس. سيحمي طلاء MMA طبقة الجرافين العلوية من حفر البلازما.

4. قطع مربعات الجرافين CVD المطلية ب MMA بحجم الشبكة

  1. استخدم زوجين من الملقط لدعم مربع الجرافين CVD. لاحظ اتجاه مربع الجرافين CVD ، وحافظ على جانب MMA لأعلى أثناء توصيله بالملاقط (حرج).
  2. قطع الجرافين CVD إلى مربعات 3 مم × 3 مم تقريبا. استخدم مجموعتين من ملقط الحركة العكسية لهذه الخطوة لتثبيت مربع الجرافين CVD على الجانب الأيمن لأعلى وتثبيته في موضعه ، وكذلك لتثبيت حافة مربع 3 مم × 3 مم بعد قطعه بعيدا عن بقية المربع.

5. إذابة الركيزة النحاسية من الجرافين CVD المطلي MMA

  1. تطفو بعناية كل 3 مم × 3 مم مربع في APS الحل. اتصل بسطح APS الحل قبل تحرير كل مربع. قم بإمالة الدورق بحيث يمكن وضع كل مربع في المحلول بزاوية ضحلة ؛ هذا يضمن أن المربع لا يغرق.
  2. تغطى الدورق بورق الألمنيوم وتحتضن طوال الليل على حرارة 25 درجة مئوية.

6. إزالة أفلام MMA / الجرافين من APS

  1. استخدم غطاء زجاجي بأبعاد 12 مم × 50 مم واستخرج مربعات MMA / الجرافين من APS عن طريق غمر الغطاء برفق عموديا في APS ثم تحريك غطاء الغطاء بشكل جانبي بحيث يتاخم مربع MMA / الجرافين العائم.
  2. قم بإزالة غطاء الغطاء بعناية وتأكد من أن المربع يلتصق تماما بجانب غطاء الغطاء عند الإزالة.
  3. انقل مربعات MMA / الجرافين إلى دورق نظيف سعة 50 مل مملوء بالماء الجزيئي لمدة 20 دقيقة. اغمس الغطاء برفق باستخدام مربع MMA / الجرافين المتصل بالماء عموديا وتأكد من إزاحة المربع من غطاء الغطاء عند التفاعل مع سطح الماء. كرر لجميع مربعات MMA / الجرافين.

7. التصاق الجرافين بالشبكات

  1. باستخدام ملاقط الحركة السلبية ، اغمس الشبكة برفق عموديا في الماء بحيث يواجه جانب الكربون مربعا عائما MMA / جرافين. بمجرد ملامسة المربع ، قم بإزالة الشبكة بعناية وتأكد من أن المربع يلتصق تماما بجانب الكربون من الشبكة عند الإزالة. قلل من الحركة الجانبية للشبكة عند غمرها في الماء لمنع تلف مربعات الشبكة (حرج).
  2. ضع الشبكات على غطاء نظيف من جانب MMA / الجرافين لأعلى وجفف في الهواء لمدة 1 إلى 2 دقيقة. انقل الغطاء المغطى بالجرافين / MMA إلى لوح تسخين مضبوط على 130 درجة مئوية باستخدام ملاقط مسطحة الأطراف.
  3. يغطى بالجزء العلوي من طبق بتري زجاجي ويحتضن لمدة 20 دقيقة. يرفع عن النار ويبرد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 1 إلى 2 دقيقة.
    تنبيه: توخ الحذر لأن سطح طبق بتري سيكون ساخنا للغاية.

8. إذابة MMA مع الأسيتون

  1. انقل الغطاء بالكامل إلى طبق بتري مملوء ب 15 مل من الأسيتون. احتضان لمدة 30 دقيقة.
  2. باستخدام ماصة مصلية زجاجية نظيفة ، قم بنقل الأسيتون ، الذي تم فيه تحضين الشبكات ، إلى حاوية نفايات. أضف بعناية 15 مل من الأسيتون الطازج إلى طبق بتري باستخدام ماصة مصلية زجاجية نظيفة. احتضان لمدة 30 دقيقة.
  3. كرر خطوات الغسيل هذه لما مجموعه 3 غسلات من الأسيتون.

9. إزالة الأسيتون المتبقي مع الأيزوبروبانول

  1. بعد غسل 3 أسيتون ، قم بإزالة الأسيتون واستبدله ب 15 مل من الأيزوبروبانول باستخدام ماصة مصلية زجاجية نظيفة. احتضان لمدة 20 دقيقة.
  2. كرر 3 مرات ليصبح المجموع 4 غسلات الأيزوبروبانول. قم بإزالة الشبكات بعناية من الأيزوبروبانول وجففها في الهواء على غطاء نظيف باستخدام الملقط.
    ملاحظة: يمكن أن يجعل الأيزوبروبانول المتبقي من الصعب إطلاق الشبكات من الملقط. يمكن أن يؤدي الاتصال بين الشبكة وغطاء الغطاء النظيف قبل تحرير الشبكة من الملقط إلى تخفيف هذه المشكلة.
  3. تبخر المواد العضوية المتبقية عن طريق نقل غطاء الغطاء بشبكات مطلية بالجرافين على لوح تسخين مضبوط على 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تبرد إلى درجة حرارة الغرفة وتخزن تحت فراغ حتى الاستخدام.

10. معالجة الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون للشبكات المطلية بالجرافين

  1. باستخدام ملاقط ذات حركة عكسية ، ضع الشبكات برفق في منطقة إضاءة نظيفة لمنظف الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون بحيث يكون الجانب المطلي بالجرافين متجها لأعلى.
  2. حرك منطقة الإضاءة لإغلاقها ثم قم بتشغيل الجهاز. أدر قرص الوقت إلى وقت العلاج المحدد لبدء معالجة الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون للشبكات.
    ملاحظة: مدة العلاج هي معلمة قابلة للضبط ، مع المعالجة الزائدة التي لديها القدرة على إتلاف الشبكة. يوصي Han et al.30 ب 10 دقائق من العلاج بالأشعة فوق البنفسجية / الأوزون ، وقد وجدنا أيضا علاجا لمدة 10 دقائق يكفي. انظر الخطوة 12 للحصول على إرشادات حول ضبط وقت العلاج هذا.
  3. انتقل مباشرة إلى غمر عينة cryoEM على الشبكات المعالجة باتباع خطوات الغطس كما هو موضح في Koh et al.37.
    ملاحظة: يمكن أن تتراكم الهيدروكربونات في الغلاف الجوي على سطح الشبكة بعد المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية / الأوزون وتزيد من مقاومة الماء لسطح الجرافين 38,39. لتجنب ذلك ، قم بإغراق الشبكات المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية / الأوزون على الفور. قد يكون من المفيد معالجة شبكات الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون على دفعات ، على سبيل المثال ، الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون التي تعالج ست شبكات وتغرق تلك الشبكات الست على الفور ، ثم تعالج الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون دفعة ثانية من الشبكات ، تليها غرق الدفعة الثانية.

11. التقاط صورة حيود

  1. تأكد من ضبط المجهر جيدا مع إنشاء إضاءة متوازية وضبط إلغاء التركيز النهائي على -0.2 ميكرومتر.
  2. أدخل شاشة الفلورسنت وتوقف الشعاع بالكامل. أدخل وضع الحيود لتصور نقاط الحيود بوضوح.
  3. الحصول على صورة باستخدام كاميرا CCD وتقييمها باستخدام برنامج تحليل الصور.
    ملاحظة: أكثر بقع الحيود سهولة في الملاحظة والتعرف عليها الناتجة عن طبقة أحادية من الجرافين هي 6 نقاط تقابل ترددا مكانيا يبلغ 2.13 Å. استخدم أداة قياس لتقدير المسافة من مركز الحزمة المنحرفة إلى إحدى نقاط الحيود هذه بوحدات مقلوبة. لا سيما 2.13 Å Equation 1 0.47 Å-1.

12. تقييم محبة الشبكة للماء

  1. قم بإعداد إعداد التصوير. حدد موقع حامل الهاتف ، وسطح تصوير الطاولة ، والهاتف المزود بالكاميرا ، وغطاء زجاجي ، وفيلم البارافين. تم الحصول على الصور المعروضة هنا باستخدام حامل الهاتف وسطح التصوير المنضدية التي تمت طباعتها ثلاثية الأبعاد باستخدام ملفات .stl المتوفرة ، مما أدى إلى قياسات زاوية اتصال قابلة للتكرار والقياس الكمي بسهولة أكبر (الشكل التكميلي 1A).
  2. ضع غطاء زجاجي على السطح المسطح ، ثم اقطع 1 سم × 1 سم مربع من فيلم البارافين وضعه على غطاء الزجاج. ضع الهاتف على حامل الهاتف ، وقم بتوجيه الهاتف بحيث تكون الكاميرا على متن الطائرة مع غطاء زجاجي. قم بتأمين الهاتف في هذا الوضع باستخدام الأربطة المطاطية (الشكل التكميلي 1B). التقط عينة صورة للتحقق من محاذاة الكاميرا لسطح التصوير.
  3. مباشرة بعد المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية / الأوزون للشبكات المطلية بالجرافين ، ضع شبكة واحدة على مربع فيلم البارافين على غطاء الزجاج. تأكد من أن جانب الجرافين متجها لأعلى. أضف قطرة ماء 2 ميكرولتر إلى وسط سطح الشبكة باستخدام ماصة والتقط صورة على الفور.
    ملاحظة: كرر هذه الخطوة بعد: i) الفترات المرغوبة من العلاج بالأشعة فوق البنفسجية / الأوزون لتحديد مدة كافية من العلاج ؛ أو ب) الفترات الزمنية المرغوبة بعد المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية / الأوزون لقياس المدة التي يحتفظ فيها سطح الشبكة بطابعه المحب للماء بعد المعالجة.
  4. احسب زوايا الاتصال من الصور عن طريق استيرادها إلى ImageJ43 واستخدام المكون الإضافي لزاوية الاتصال.

13. تحليل الجسيمات المفردة لمجموعة البيانات المعقدة dCas9

ملاحظة: تم إجراء جميع عمليات معالجة الصور الموضحة في هذا البروتوكول باستخدام الإصدار 4.2.1 من cryoSPARC.

  1. المعالجة المسبقة للأفلام باستخدام مهام تصحيح حركة التصحيح وتقدير CTF للتصحيح. قم بإجراء انتقاء الجسيمات باستخدام وظيفة منتقي Blob ، باستخدام نقطة كروية يتراوح قطرها من 115 Å إلى 135 Å.
  2. استخراج الجسيمات باستخدام وظيفة الاستخراج من الصور المجهرية ، باستخدام معامل الارتباط الطبيعي (NCC) وعتبات الطاقة مما ينتج عنه حوالي 200-300 جسيم لكل صورة مجهرية. لاحظ أن العتبات المناسبة وعدد الجسيمات الناتجة قد تختلف ، ويجب على المستخدمين فحص جودة الانتقاء عبر مجموعة من الصور المجهرية لتحديد الظروف المناسبة.
  3. قم بإجراء عمليات إعادة بناء أولية متعددة الفئات باستخدام مهمة إعادة بناء Ab-initio ، والتي تتطلب ثلاث فئات. من المحتمل أن تحتوي اثنتان من الفئات الثلاث على جزيئات غير Cas9 ، بما في ذلك الملوثات السطحية. حدد الفئة التي تشبه dCas9 لمزيد من المعالجة.
    ملاحظة: يمكن تطبيق جولات إضافية من إعادة بناء Ab-initio متعددة الفئات أو التحسين غير المتجانس لزيادة تحسين كومة الجسيمات.
  4. قم بإجراء تحسين 3D باستخدام مهمة التحسين غير المنتظم لتحديد المعلمات الافتراضية. تقدير دقة إعادة الإعمار باستخدام التحقق من الصحة (FSC) ، ووظائف ThreeDFSC ، باستخدام الخرائط والقناع من التحسين النهائي 3D.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

سيؤدي التصنيع الناجح لشبكات cryoEM المطلية بالجرافين باستخدام المعدات (الشكل 1) والبروتوكول (الشكل 2) الموضحة هنا إلى طبقة أحادية من الجرافين تغطي ثقوب الرقائق التي يمكن تأكيدها من خلال نمط الحيود المميز. لتعزيز امتصاص البروتين على سطح الجرافين ، يمكن استخدام المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية / الأوزون لجعل السطح محبا للماء عن طريق تركيب مجموعات وظيفية تحتوي على الأكسجين. ومع ذلك ، يمكن للملوثات الهيدروكربونية في الهواء أن تمتز على سطح الجرافين في وقت مبكر من 5 دقائق بعد العلاج بالأشعة فوق البنفسجية / الأوزون ومواجهة هذا التأثير38,39. الأهم من ذلك ، أن مدة العلاج بالأشعة فوق البنفسجية / الأوزون والوقت المنقضي بين العلاج والغطس يمكن أن تؤثر على جودة العينة. نوضح هذه التأثيرات باستخدام طريقة بسيطة لتقييم الطابع المحب للماء للشبكة المطلية بناء على زاوية ملامسة السطح (الشكل 3 ؛ انظر الخطوة 12).

لإثبات استخدام دعامات الجرافين في cryoEM أحادي الجسيمات ، قمنا بتطبيق نوكلياز داخلي للحمض النووي غير نشط موجها بالحمض النووي الريبي S. pyogenes Cas9 (H10A; C80S; C574S; H840A)40 في مجمع مع sgRNA والحمض النووي المستهدف إلى الشبكات المغلفة بالجرافين ، وجمع مجموعة بيانات cryoEM من هذه الشبكات ، وأجرى تحليل جسيم واحد7. احتوت الشبكات المطلية بالجرافين باستمرار على ~ 300 جسيم لكل صورة مجهرية عند تكبير 0.654 Å / pix باستخدام مجهر 300 keV مزود بكاشف إلكترون مباشر K3 (الشكل 4A-E). أسفرت جلسة جمع البيانات لمدة 8 ساعات مع إمالة المسرح + 18 درجة عن 2,963 فيلما و 324,439 جسيما في مكدس نهائي منسق. باستخدام هذه الجسيمات ، أنشأنا إعادة بناء ثلاثية الأبعاد والتي ، عند التحسين ، أسفرت عن خريطة كثافة بدقة تقديرية تبلغ 2.7 Å وأخذ عينات زاوية كافية لتجنب القطع الأثرية متباينة الخواص (الشكل 5). تم إرساء نموذج ذري (PDB 6o0z) 41 في هذه الخريطة ، وتم تحسينه باستخدام ISOLDE42. يتم عرض المخلفات R63-L82 من هذا النموذج الذري المجهز مع خريطة كثافة cryoEM المكررة ، مع تسليط الضوء على كثافة السلسلة الجانبية التي تم حلها (الشكل 5B). عند مقارنة نفس العينة والتركيز (250 نانوغرام / ميكرولتر) المطبقة على شبكات متطابقة تفتقر إلى الجرافين ، لم يلاحظ أي جسيمات (الشكل 4F ، G). تسلط هذه الملاحظة الضوء على فعالية دعم الجرافين في تمكين تصور الجسيمات من العينات منخفضة التركيز.

Figure 1
الشكل 1: المعدات المطلوبة. معدات وأدوات المختبر اللازمة لتصنيع شبكات الجرافين باستخدام البروتوكول المفصل في هذه المقالة. يتم عرض العناصر وكميتها وتصنيفها وفقا لذلك. تشمل الكواشف المطلوبة التي لا تظهر: الجرافين CVD ، ميثيل ميثاكريلات EL-6 (MMA) ، بيرسلفات الأمونيوم (APS) ، الأسيتون ، الأيزوبروبانول ، الإيثانول ، الماء الجزيئي. تشمل الأدوات المطلوبة التي لا يتم عرضها: مغلف الدوران ، ومفرغ التوهج ، ولوح التسخين ، ومجفف الفراغ ، ومقياس الحرارة. جميع العناصر المطلوبة مفصلة في جدول المواد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: رسم تخطيطي لعملية تصنيع شبكة الجرافين. يتم طلاء الجرافين بطبقة رقيقة من ميثيل ميثاكريلات EL-6 (MMA) باستخدام طبقة دوارة (الخطوة 2). تتم إزالة الجرافين الموجود على الجانب الآخر من رقائق النحاس عن طريق نقش البلازما (الخطوة 3). ثم يتم استخدام كبريتات الأمونيوم (APS) لحفر النحاس بعيدا (الخطوات 4-5). يتم وضع فيلم MMA-graphene على سطح الشبكة (الخطوة 6-7). أخيرا ، يتم إذابة MMA خلال سلسلة من الغسلات بالمذيبات العضوية (الخطوات 8-9). تتوافق الخطوات المشار إليها أعلاه مع الخطوات المرقمة الموضحة في قسم البروتوكولات. تم تكييف هذه الطريقة من Han et al.30. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تقييم المحبة المائية لسطح الشبكة كدالة لمدة المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية / الأوزون والوقت المنقضي بعد المعالجة. (أ) زوايا التلامس المقاسة المرسومة كدالة لمدة المعالجة. تتوافق زوايا التلامس المنخفضة مع زيادة المحبة للماء (الشبكة غير المعالجة: 78 درجة ؛ 20 دقيقة: 37 درجة). تم قياس زوايا الاتصال باستخدام ImageJ43. (ب) زوايا التلامس المقاسة المرسومة كدالة للوقت ، بعد المعالجة (0 دقيقة: 45 درجة ؛ 60 دقيقة: 74 درجة). تم قياس الشبكة في الدورة الزمنية اللاحقة للعلاج بالأشعة فوق البنفسجية / الأوزون لمدة 12 دقيقة ، كما هو موضح بعلامة النجمة. تم إجراء كل قياس بعد المعالجة على نفس الشبكة ، مع إزالة العينة عن طريق الفتل بين القياسات. من المتوقع أن تختلف زوايا الاتصال المحددة المقاسة كدالة للظروف البيئية المختبرية ، ونوصي المستخدمين بإجراء تجارب مماثلة في مختبراتهم لتحديد الظروف المناسبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: صور تمثيلية للشبكة المطلية بالجرافين وشبكات التحكم غير المطلية. (A-C) صور الأطلس التمثيلي ، ومربع الشبكة ، وثقب الرقائق لشبكات الكربون الهولية المطلية بالجرافين المأخوذة على مجهر 300 كيلو فولت مجهز بكاشف إلكتروني مباشر K3. (د) صورة مجهرية بالتبريد ل S. pyogenes dCas9 في مركب مع sgRNA والحمض النووي المستهدف (معقد بتركيز 250 نانوغرام / ميكرولتر) على شبكة كربون هولي مغلفة بالجرافين. (ه) صورة الحيود من الشبكة المصورة في لوحات (A-D). يشير السهم البرتقالي إلى موضع يتوافق مع تردد مكاني يبلغ 2.13 Å. تم تطبيق عينة مماثلة لتلك الموجودة في اللوحة (D) على (F) المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية / الأوزون و (G) شبكات الكربون المفرغة المتوهجة بدون الجرافين. تمثل الصور المجهرية CryoEM المعروضة كل شبكة ولا تظهر أي جسيمات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: إعادة بناء CryoEM لمركب Cas9 من شبكات مطلية بالجرافين. (أ) خريطة كثافة CryoEM من إعادة بناء 3D ل S. pyogenes dCas9 في مجمع مع sgRNA والحمض النووي المستهدف. (ب) يتم تصوير البقايا R63-L82 من نموذج مجهز ضمن كثافة cryoEM شبه الشفافة ، مع تسمية مجموعة فرعية من السلاسل الجانبية المرئية. (C) منحنيات ارتباط فورييه شل (FSC) للخرائط غير المقنعة والفضفاضة والمقنعة بإحكام. (د) الرسم البياني ومخطط FSC الاتجاهي بناء على طريقة 3DFSC23. انظر الشكل التكميلي 2 والخطوة 13 للحصول على مزيد من المعلومات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: حامل تصوير زاوية الاتصال. (A) حامل كاميرا مطبوع 3D وحامل تصوير منضدية لتأمين الكاميرا في وضع يحاذي الكاميرا داخل الطائرة مع قسيمة الغطاء. (ب) توضع الشبكة على غطاء الغطاء فوق قطعة مربعة من طبقة البارافين مقاس 1 سم × 1 سم. تمت طباعة حامل التصوير المصور ثلاثي الأبعاد باستخدام ملفات .stl المتوفرة (ملف الترميز التكميلي 1 وملف الترميز التكميلي 2) ويمكن تعديله بسهولة لاستيعاب معظم الأجهزة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: سير عمل معالجة الصور. معالجة سير العمل لمجمع dCas9. تتم الإشارة إلى أسماء الوظائف وتفاصيل الوظيفة والمعلمات غير الافتراضية (مائلة). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف الترميز التكميلي 1: يتم توفير ملفات CAD للطباعة الحجرية المجسمة بتنسيق STL لتسهيل الطباعة ثلاثية الأبعاد لحامل الكاميرا (camera_stand_v1.stl). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف الترميز التكميلي 2: يتم توفير ملفات CAD للطباعة الحجرية المجسمة بتنسيق STL لتسهيل الطباعة ثلاثية الأبعاد لحامل التصوير المنضدي (slide_mount_v1.stl) ويرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ينطوي تحضير عينات CryoEM على مجموعة من التحديات التقنية، حيث تتطلب معظم مهام سير العمل من الباحثين التعامل يدويا مع الشبكات الهشة بعناية فائقة لتجنب إتلافها. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن التنبؤ بقابلية أي عينة للتزجيج ؛ غالبا ما تتفاعل الجسيمات مع واجهة الهواء والماء أو مع رقائق الدعم الصلبة التي تغطي الشبكات ، مما قد يؤدي إلى تبني الجسيمات للاتجاهات المفضلة أو الفشل في دخول ثقوب التصوير ما لم يتم تطبيق تركيزات عالية جدا من البروتين24. أظهر تراكب شبكات cryoEM الهولي مع طبقة أحادية مستمرة من الجرافين وعدا هائلا في تحسين توزيعات الجسيمات على الصور المجهرية ، وزيادة أعداد الجسيمات بتركيزات منخفضة ، وتقليل الاتجاهات المفضلة المدفوعة بالتفاعلات في واجهة الهواء والماء30.

يتمثل أحد قيود بروتوكولات طلاء الجرافين الحالية لشبكات cryoEM في التلاعب اليدوي المكثف المطلوب لعملية الطلاء ، والتي يمكن أن تؤثر على الجودة وتزيد من تباين الشبكة إلى الشبكة. في هذا العمل ، نصف تعديلات طفيفة على بروتوكول موجود لطلاء شبكات cryoEM بطبقة أحادية من الجرافين30.

تشمل الخطوات الحاسمة ضمن هذا البروتوكول طلاء الجرافين CVD ب MMA ، وإذابة ركيزة النحاس الجرافين CVD في APS ، وتطبيق الجرافين على شبكات cryoEM. قمنا بتعديل البروتوكول الأصلي لتقليل التلاعب اليدوي للشبكات المطلية عن طريق تبادل المذيبات داخل نفس طبق بتري ، بدلا من التعامل مع الشبكات ونقلها بشكل فردي إلى حاوية مذيب جديدة لكل خطوة غسيل ، وبالتالي تهدف إلى زيادة إنتاجية الشبكات السليمة وعالية الجودة والمغلفة بالجرافين. بينما سعينا جاهدين لتقليل التلاعب بالشبكات المطلية بالجرافين إلى الحد الأدنى ، فإننا نقر بأن التطبيق اليدوي لمربعات الجرافين الفردية على شبكات cryoEM يمثل تحديا بطبيعته ، وأنه من المتوقع حدوث بعض التقلبات من شبكة إلى شبكة.

تتطلب الشبكات المطلية بالجرافين عادة معالجة بالأشعة فوق البنفسجية / الأوزون لجعل السطح محبا للماء لتطبيق العينة. يمكن أن تؤثر مدة المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية / الأوزون والوقت المنقضي بعد المعالجة وقبل الغرق على محبة الماء للشبكة وجودة العينة في النهاية. بالإضافة إلى بروتوكول تصنيع الشبكة ، وصفنا تقنية لتقييم محبة الماء للشبكة بعد المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية / الأوزون. في الإجراء ، يتم استخدام زاوية التلامس السطحي للعينة المطبقة كمؤشر على الطابع المحب للماء للشبكة المطلية20,44. يتم توفير تصاميم لطباعة 3D غير مكلفة جبل التصوير الشبكة المخصصة التي تستخدم كاميرا الهاتف الخليوي بسيطة لتقدير زاوية الاتصال السطحي.

أخيرا ، نصف النتائج التي تم الحصول عليها من خلال استخدام هذا البروتوكول لتحديد بنية 2.7 Å cryoEM للنوكلياز الداخلي للحمض النووي غير النشط الموجه بالحمض النووي الريبي ، S. pyogenes Cas9 في مجمع مع sgRNA والحمض النوويالمستهدف 40. في غياب الجرافين ، لم يلاحظ أي جزيئات في ثقوب الرقائق بتركيزات معقدة مستخدمة (250 نانوغرام / ميكرولتر). في المقابل ، تحمل الشبكات المطلية بالجرافين جسيمات بكثافة عالية ، مما يتيح إعادة بناء 3D سهلة لخريطة عالية الدقة من 2,961 صورة مجهرية. تسلط هذه البيانات مجتمعة الضوء على قيمة تطبيق طبقات الجرافين الأحادية على شبكات cryoEM لتحليل الجسيمات المفردة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تعارضات للكشف عنها.

Acknowledgments

تم إعداد العينات وتصويرها في مرفق CryoEM في MIT.nano على المجاهر التي تم الحصول عليها بفضل مؤسسة أرنولد ومابل بيكمان. تمت طباعة أجهزة تصوير زاوية الاتصال في MIT Metropolis Maker Space. نشكر مختبرات Nieng Yan و Yimo Han ، والموظفين في MIT.nano على دعمهم طوال اعتماد هذه الطريقة. على وجه الخصوص ، نعرب عن شكرنا للدكتورين Guanhui Gao و Sarah Sterling على مناقشاتهما الثاقبة وتعليقاتهما. تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01-GM144542 و 5T32-GM007287 و NSF-CAREER 2046778 المنح. يتم دعم الأبحاث في مختبر ديفيس من قبل مؤسسة ألفريد بي سلون ، وصندوق جيمس إتش فيري ، وعيادة MIT J-Clinic ، وعائلة وايتهيد.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250 mL beaker (3x) Fisher 02-555-25B
50 mL beaker (2x) Corning 1000-50
Acetone Fisher A949-4
Aluminum foil Fisher 15-078-292
Ammonium persulfate Fisher (I17874
Coverslips 50 mm x 24 mm Mattek PCS-1.5-5024
CVD graphene Graphene Supermarket CVD-Cu-2x2
easiGlow discharger Ted-Pella 91000S
Ethanol Millipore-Sigma 1.11727
Flat-tip tweezers  Fisher 50-239-60
Glass cutter Grainger 21UE26
Glass petri plate and cover  VWR 75845-544
Glass serological pipette Fisher 13-676-34D
Grid Storage Case EMS 71146-02
Hot plate Fisher 07-770-108
Isopropanol Sigma W292907
Kimwipe Fisher 06-666
Lab scissors  Fisher 13-806-2
Methyl-Methacrylate EL-6  Kayaku MMA M310006 0500L1GL
Molecular grade water Corning 46-000-CM
Negative action tweezers (2x) Fisher 50-242-78
P20 pipette Rainin 17014392
P200 pipette Rainin 17008652 
Parafilm Fisher 13-374-12
Pipette tips Rainin 30389291
Quantifoil grids with holey carbon  EMS Q2100CR1
Spin coater  SetCas KW-4A with chuck SCA-19-23
Straightedge ULINE H-6560
Thermometer  Grainger 3LRD1
UV/Ozone cleaner  BioForce SKU: PC440
Vacuum desiccator Thomas Scientific 1159X11
Whatman paper VWR 28297-216

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).
  2. Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461 (2013).
  3. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  4. Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  5. Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Sci. 30 (1), 136-150 (2021).
  6. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
  7. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  8. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  9. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
  10. Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
  11. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  12. Kinman, L. F., Powell, B., Zhong, E., Berger, B., Davis, J. H. Uncovering structural ensembles from single particle cryo-EM data using cryoDRGN. Nat Protoc. 18 (2), 319-339 (2022).
  13. Zhong, E. D., Bepler, T., Berger, B., Davis, J. H. CryoDRGN: reconstruction of heterogeneous cryo-EM structures using neural networks. Nat Methods. 18 (2), 176-185 (2021).
  14. Chen, M., Ludtke, S. J. Deep learning-based mixed-dimensional Gaussian mixture model for characterizing variability in cryo-EM. Nat Methods. 18 (8), 930-936 (2021).
  15. Punjani, A., Fleet, D. J. 3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM. J Struct Biol. 213 (2), 107702 (2021).
  16. Dashti, A., et al. Retrieving functional pathways of biomolecules from single-particle snapshots. Nat Commun. 11 (1), 4734 (2020).
  17. Sun, J., Kinman, L. F., Jahagirdar, D., Ortega, J., Davis, J. H. KsgA facilitates ribosomal small subunit maturation by proofreading a key structural lesion. Nat Struct Mol Biol. , (2023).
  18. Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10 (1-2), 55-61 (1982).
  19. Dubochet, J. Cryo-EM--the first thirty years. J Microsc. 245 (3), 221-224 (2012).
  20. Glaeser, R. M., et al. Factors that influence the formation and stability of thin, cryo-EM specimens. Biophys J. 110 (4), 749-755 (2016).
  21. Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-Em grids. Curr Opin Colloid Interface Sci. 34, 1-8 (2018).
  22. D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
  23. Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  24. Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO. J Struct Biol X. 1, 100005 (2019).
  25. Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nat Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
  26. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 560-571 (2018).
  27. Neselu, K., et al. Measuring the effects of ice thickness on resolution in single particle cryo-EM. J Struct Biol X. 7, 100085 (2023).
  28. Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. J Struct Biol. 174 (1), 234-238 (2011).
  29. Geim, A. K., Novoselov, K. S. The rise of graphene. Nat Mater. 6 (3), 183-191 (2007).
  30. Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (2), 1009-1014 (2020).
  31. Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Sci Rep. 13 (1), 2279 (2023).
  32. Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nat Commun. 13 (1), 6718 (2022).
  33. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  34. Liu, N., et al. Bioactive functionalized monolayer graphene for high-resolution cryo-electron microscopy. J Am Chem Soc. 141 (9), 4016-4025 (2019).
  35. Benjamin, C. J., et al. Selective capture of histidine-tagged proteins from cell lysates using TEM grids modified with NTA-graphene oxide. Sci Rep. 6, 32500 (2016).
  36. Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24269-24273 (2020).
  37. Koh, A., et al. Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope. J Vis Exp. (181), (2022).
  38. Schweizer, P., et al. Mechanical cleaning of graphene using in situ electron microscopy. Nat Commun. 11 (1), 1743 (2020).
  39. Li, Z., et al. Effect of airborne contaminants on the wettability of supported graphene and graphite. Nat Mater. 12 (10), 925-931 (2013).
  40. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  41. Zhu, X., et al. Cryo-EM structures reveal coordinated domain motions that govern DNA cleavage by Cas9. Nat Struct Mol Biol. 26 (8), 679-685 (2019).
  42. Croll, T. I. ISOLDE: a physically realistic environment for model building into low-resolution electron-density maps. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 519-530 (2018).
  43. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  44. Prydatko, A. V., Belyaeva, L. A., Jiang, L., Lima, L. M. C., Schneider, G. F. Contact angle measurement of free-standing square-millimeter single-layer graphene. Nat Commun. 9 (1), 4185 (2018).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 201،
تطبيق الجرافين أحادي الطبقة على شبكات المجهر الإلكتروني المبرد لتحديد الهيكل عالي الدقة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Grassetti, A. V., May, M. B., Davis, … More

Grassetti, A. V., May, M. B., Davis, J. H. Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination. J. Vis. Exp. (201), e66023, doi:10.3791/66023 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter