Summary
היישום של שכבות תמיכה ברשתות מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (cryoEM) יכול להגדיל את צפיפות החלקיקים, להגביל אינטראקציות עם ממשק אוויר-מים, להפחית תנועה הנגרמת על ידי אלומה, ולשפר את התפלגות כיווני החלקיקים. מאמר זה מתאר פרוטוקול חזק לציפוי רשתות cryoEM בשכבה אחת של גרפן לשיפור הכנת דגימת קריו.
Abstract
במיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (cryoEM), מקרומולקולות מטוהרות מיושמות על רשת הנושאת רדיד פחמן חור; לאחר מכן מכתימים את המולקולות כדי להסיר עודפי נוזל ומוקפאות במהירות בשכבה בעובי של 20-100 ננומטר של קרח זגוגית, המרחפים על פני חורי רדיד אלומיניום ברוחב של כ-1 מיקרומטר. הדגימה המתקבלת מצולמת באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני, ולאחר עיבוד תמונה באמצעות תוכנה מתאימה, ניתן לקבוע מבנים ברזולוציה כמעט אטומית. למרות האימוץ הנרחב של cryoEM, הכנת הדגימות נותרה צוואר בקבוק חמור בתהליכי העבודה של cryoEM, כאשר משתמשים נתקלים לעתים קרובות באתגרים הקשורים לדגימות המתנהגות בצורה גרועה בקרח הזגוגית המרחף. לאחרונה פותחו שיטות לשינוי רשתות cryoEM עם שכבה רציפה אחת של גרפן, הפועלת כמשטח תמיכה שלעתים קרובות מגדיל את צפיפות החלקיקים באזור המצולם ויכול להפחית אינטראקציות בין חלקיקים לבין ממשק אוויר-מים. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים ליישום גרפן לרשתות cryoEM ולהערכה מהירה של ההידרופיליות היחסית של הרשתות המתקבלות. בנוסף, אנו מתארים שיטה מבוססת EM כדי לאשר את נוכחותו של גרפן על ידי הדמיה של דפוס עקיפה אופייני שלה. לבסוף, אנו מדגימים את התועלת של תמיכות גרפן אלה על ידי שחזור מהיר של מפת צפיפות ברזולוציה של 2.7 Å של קומפלקס Cas9 באמצעות מדגם טהור בריכוז נמוך יחסית.
Introduction
מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני של חלקיק יחיד (cryoEM) התפתח לשיטה נפוצה להדמיית מקרומולקולות ביולוגיות1. מונע על ידי התקדמות בזיהוי אלקטרונים ישיר 2,3,4, רכישת נתונים5, ואלגוריתמים לעיבוד תמונה 6,7,8,9,10, cryoEM מסוגל כעת לייצר מבנים תלת-ממדיים ברזולוציה כמעט אטומית של מספר גדל במהירות של מקרומולקולות11. יתר על כן, על ידי מינוף האופי המולקולרי היחיד של הגישה, משתמשים יכולים לקבוע מבנים מרובים ממדגם יחיד 12,13,14,15, תוך הדגשת ההבטחה להשתמש בנתונים שנוצרו כדי להבין הרכבים מבניים הטרוגניים 16,17. למרות התקדמות זו, צווארי בקבוק בהכנת רשת דגימות הקפאה נמשכים.
עבור אפיון מבני על ידי cryoEM, דגימות ביולוגיות צריכות להיות מפוזרות היטב בתמיסה מימית ולאחר מכן יש להקפיא אותן באמצעות תהליך הנקרא ויטריפיקציה 18,19. המטרה היא ללכוד חלקיקים בשכבה דקה ואחידה של קרח מזוגג, המרחפים על פני חורים במרווחים קבועים, שבדרך כלל נחתכים לשכבה של פחמן אמורפי. רדיד פחמן אמורפי בדוגמה זו נתמך על ידי רשת TEM הנושאת רשת של מוטות תמיכה מנחושת או זהב. בתהליכי עבודה סטנדרטיים, רשתות הופכות הידרופיליות באמצעות טיפול פלזמה זוהר פריקה לפני יישום הדגימה. עודפי נוזל מוכתמים בנייר פילטר, מה שמאפשר לתמיסת החלבון ליצור שכבה נוזלית דקה על פני החורים שניתן לזגוג בקלות במהלך הקפאת צלילה. אתגרים נפוצים כוללים לוקליזציה של חלקיקים לממשק אוויר-מים (AWI) ודנטורציה עוקבת 20,21,22 או אימוץ כיוונים מועדפים 23,24,25, היצמדות חלקיקים לרדיד הפחמן במקום לנדוד לתוך החורים, והתקבצות וצבירה של החלקיקים בתוך החורים 26. עובי קרח לא אחיד הוא דאגה נוספת; קרח סמיך יכול לגרום לרמות גבוהות יותר של רעשי רקע במיקרוגרפים עקב פיזור אלקטרונים מוגבר, בעוד קרח דק במיוחד יכול להוציא חלקיקים גדולים יותר27.
כדי להתמודד עם אתגרים אלה, נעשה שימוש במגוון יריעות תמיכה דקות כדי לצפות משטחי רשת, המאפשרים לחלקיקים לנוח על תמיכות אלה, ובאופן אידיאלי, להימנע מאינטראקציות עם ממשק אוויר-מים. תומכי הגרפן הראו הבטחה גדולה, בין השאר בשל חוזקם המכני הגבוה יחד עם חתך הפיזור המינימלי שלהם, אשר מפחית את אות הרקע שנוסף על ידי שכבת התמיכה28. בנוסף לתרומתו המינימלית לרעשי רקע, הגרפן מפגין גם מוליכות חשמלית ותרמית יוצאת דופן29. רשתות מצופות גרפן ותחמוצת גרפן הוכחו כמניבות צפיפות חלקיקים גבוהה יותר, פיזור חלקיקים אחיד יותר30, ולוקליזציה מופחתת ל-AWI22. בנוסף, גרפן מספק משטח תמיכה שניתן לשנות עוד יותר כדי: 1) לכוונן את התכונות הפיזיוכימיות של משטח הרשת באמצעות פונקציונליות 31,32,33; או 2) סוכני קישור זוגיים המאפשרים טיהור זיקה של חלבונים בעלי עניין 34,35,36.
במאמר זה, שינינו נוהל קיים לציפוי רשתות cryoEM בשכבה אחידה אחת של גרפן30. השינויים נועדו למזער את הטיפול ברשת לאורך כל הפרוטוקול, במטרה להגדיל את התפוקה ואת יכולת השחזור. בנוסף, אנו דנים בגישה שלנו להערכת היעילות של טיפולי UV / אוזון שונים בהפיכת רשתות הידרופיליות לפני צלילה. שלב זה בהכנת דגימת cryoEM באמצעות רשתות מצופות גרפן הוא קריטי, ומצאנו שהשיטה הפשוטה שלנו לכמת את ההידרופיליות היחסית של הרשתות המתקבלות היא שימושית. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מדגימים את התועלת של שימוש ברשתות מצופות גרפן לקביעת מבנה על ידי יצירת שחזור תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה של S. pyogenes Cas9 שאינו פעיל קטליטית בקומפלקס עם RNA מנחה ו- DNA מטרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת גרפן CVD
- הכינו תמיסת תחריט גרפן כמתואר להלן.
- יש להמיס 4.6 גרם אמוניום פרסולפט (APS) ב-20 מ"ל מים באיכות מולקולרית במיכל של 50 מ"ל לקבלת תמיסה של 1 מ' ולכסות ברדיד אלומיניום. אפשר ל-APS להתמוסס לחלוטין תוך כדי המשך לשלב 1.2.
- הכינו קטע של גרפן CVD לציפוי מתיל מתקרילט (MMA). בזהירות לחתוך קטע מרובע של גרפן CVD. מעבירים את הריבוע למכסה (50 מ"מ x 24 מ"מ) בתוך צלחת פטרי נקייה ומכסים במהלך ההובלה לקואטר המסתובב.
הערה: ריבוע בגודל 18 מ"מ x 18 מ"מ אמור להניב 25-36 רשתות מצופות גרפן.
2. ציפוי גרפן CVD עם MMA
- הגדר את הגדרות מעיל הסחיטה לסחרור במהירות גבוהה של 60 שניות ב-2,500 סל"ד. מניחים בזהירות את הגרפן CVD על הצ'אק בגודל המתאים.
הערה: באופן אידיאלי, גרפן CVD ישתרע 1-2 מ"מ על קצה הצ'אק שנבחר כדי למנוע שאיפה של MMA לתוך מערכת ואקום. - לחץ על כפתור Take/Absorb כדי להפעיל את משאבת הוואקום ולהצמיד את הגרפן CVD לצ'אק. יש למרוח MMA על מרכז ריבוע הגרפן CVD, לסגור את המכסה וללחוץ מיד על לחצן ההפעלה/עצירה . עבור ריבוע של 18 מ"מ x 18 מ"מ של גרפן CVD, 40 μL של MMA מספיק.
- לאחר הפסקת הספינינג, נתקו את משאבת הוואקום ושלפו בזהירות את גרפן CVD מצופה MMA בפינצטה. הפוך את הגרפן CVD כך שהצד המצופה MMA פונה כלפי מטה והנח אותו בחזרה על כיסוי הזכוכית.
3. תחריט פלזמה של הצד האחורי של הגרפן
- העבירו גרפן CVD על הכיסוי, לתוך פריקת הזוהר ופריקה זוהרת למשך 30 שניות ב-25 mA באמצעות פינצטה שטוחה.
- מחזירים את הגרפן CVD על תלוש הכיסוי לצלחת הפטרי ומכסים במהלך ההובלה לאזור תחריט הנחושת. ציפוי MMA יגן על שכבת הגרפן העליונה מפני חריטת פלזמה.
4. חיתוך ריבועי גרפן CVD מצופים MMA בגודל רשת
- השתמש בשני זוגות פינצטה כדי לתמוך בריבוע הגרפן CVD. שימו לב לכיוון ריבוע הגרפן CVD, שמרו על צד ה-MMA כלפי מעלה כשהוא מחובר לפינצטה (קריטי).
- חותכים גרפן CVD לריבועים בגודל של כ-3 מ"מ x 3 מ"מ. השתמש בשתי קבוצות של מלקחיים בפעולה הפוכה עבור שלב זה כדי להחזיק את ריבוע הגרפן CVD בצד ימין למעלה ולעגן אותו במקומו, וגם כדי להחזיק את הקצה של ריבוע 3 מ"מ x 3 מ"מ לאחר חיתוך אותו משאר הריבוע.
5. המסת מצע נחושת מגרפן CVD מצופה MMA
- צף בזהירות כל ריבוע בגודל 3 מ"מ x 3 מ"מ בתמיסת APS. צור מגע עם פני השטח של פתרון APS לפני שחרור כל ריבוע. הטה את הכד כך שניתן יהיה למקם כל ריבוע בתמיסה בזווית רדודה; זה מבטיח שהכיכר לא תשקע.
- מכסים את הכוס ברדיד אלומיניום ודגרים למשך הלילה ב-25°C.
6. הסרת יריעות MMA/גרפן מ-APS
- השתמש בכיסוי זכוכית במידות 12 מ"מ x 50 מ"מ וחלץ את ריבועי MMA/גרפן מ- APS על ידי צלילה עדינה של הכיסוי אנכית לתוך APS ולאחר מכן הזזת החלקת הכיסוי לרוחב כך שהיא נוגעת בריבוע MMA/גרפן צף.
- הסירו בזהירות את הכיסוי וודאו שהריבוע נצמד לחלוטין לצד הכיסוי בעת ההסרה.
- מעבירים ריבועי MMA/גרפן לכוס נקייה של 50 מ"ל מלאה במים באיכות מולקולרית למשך 20 דקות. טבלו בעדינות את הכיסוי עם ריבוע MMA/גרפן המחובר למים בצורה אנכית וודאו שהריבוע מתנתק מהכיסוי באינטראקציה עם פני המים. חזור על הפעולה עבור כל ריבועי MMA/גרפן.
7. הדבקת גרפן לרשתות
- באמצעות פינצטה עם פעולה שלילית, טבלו בעדינות רשת אנכית לתוך המים כאשר צד הפחמן פונה לריבוע MMA/גרפן צף. ברגע שאתה בא במגע עם הריבוע, הסר בזהירות את הרשת וודא שהריבוע נצמד לחלוטין לצד הפחמן של הרשת בעת הסרתו. מזער את התנועה הרוחבית של הרשת כאשר היא שקועה במים כדי למנוע פגיעה בריבועי הרשת (קריטי).
- הניחו את הרשתות על מכסה נקי, צד MMA/גרפן כלפי מעלה וייבשו באוויר למשך דקה עד שתיים. העבירו רשתות מצופות גרפן/MMA לפלטה חמה המוגדרת ל-130°C באמצעות פינצטה שטוחה.
- מכסים בחלק העליון של צלחת פטרי מזכוכית ודגרים במשך 20 דקות. מסירים מהאש ומצננים לטמפרטורת החדר למשך דקה עד שתיים.
זהירות: יש לנקוט משנה זהירות מכיוון שהחלק העליון של צלחת הפטרי יהיה חם במיוחד.
8. המסת MMA עם אצטון
- מעבירים את כל הכיסוי לצלחת פטרי מלאה ב-15 מ"ל אצטון. דוגרים במשך 30 דקות.
- באמצעות פיפטה סרולוגית נקייה מזכוכית, מעבירים אצטון, שבו הודגרו הרשתות, למיכל פסולת. בזהירות להוסיף 15 מ"ל של אצטון טרי לצלחת פטרי באמצעות פיפטה סרולוגית זכוכית נקייה. דוגרים במשך 30 דקות.
- חזרו על שלבי השטיפה האלה במשך 3 שטיפות אצטון בסך הכל.
9. הסרת אצטון שיורי עם איזופרופנול
- לאחר 3 שטיפות אצטון, יש להסיר את האצטון ולהחליף באיזופרופנול במינון 15 מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית נקייה מזכוכית. דוגרים במשך 20 דקות.
- יש לחזור על הפעולה 3 פעמים לקבלת 4 שטיפות איזופרופנול. יש להסיר בזהירות את הרשתות מהאיזופרופנול ולייבש באוויר על כיסוי נקי באמצעות פינצטה.
הערה: איזופרופנול שיורי יכול להקשות על שחרור רשתות מפינצטה. יצירת מגע בין הרשת לבין הכיסוי הנקי לפני שחרור הרשת מהפינצטה יכולה להקל על בעיה זו. - יש לאדות שאריות של חומרים אורגניים על ידי העברת הכיסוי עם רשתות מצופות גרפן לפלטה חמה המוגדרת ל-100°C למשך 10 דקות. מצננים לטמפרטורת החדר ומאחסנים תחת ואקום עד לשימוש.
10. טיפול UV/אוזון ברשתות מצופות גרפן
- באמצעות פינצטה בעלת פעולה הפוכה, מקם בעדינות את הרשתות באזור תאורה נקי של חומר ניקוי UV/אוזון כאשר הצד המצופה בגרפן פונה כלפי מעלה.
- סגור את אזור התאורה והפעל את המכונה. סובב את חוגת הזמן לזמן הטיפול המיועד כדי להתחיל בטיפול בקרינת UV/אוזון ברשתות.
הערה: משך הטיפול הוא פרמטר גמיש, כאשר לטיפול עודף יש פוטנציאל לפגוע ברשת. Han et al.30 ממליצים על 10 דקות של טיפול UV / אוזון, ומצאנו גם טיפול של 10 דקות כדי להספיק. ראה שלב 12 לקבלת הדרכה לכוונון זמן טיפול זה. - המשך ישירות להטלת דגימת cryoEM על הרשתות המטופלות על ידי ביצוע שלבי צלילה כמתואר ב- Koh et al.37.
הערה: פחמימנים אטמוספריים יכולים להצטבר על פני הרשת לאחר טיפול UV / אוזון ולהגדיל את ההידרופוביות של משטח הגרפן38,39. כדי להימנע מכך, צללו מיד את הרשתות המטופלות ב- UV / אוזון. זה עשוי להיות יתרון לרשתות טיפול UV / אוזון בקבוצות, לדוגמה, UV / אוזון מטפל שש רשתות מיד צולל אלה שש רשתות, ואז UV / אוזון מטפל אצווה שנייה של רשתות, ואחריו צולל את האצווה השנייה.
11. לכידת תמונת עקיפה
- ודא כי המיקרוסקופ מכוון היטב עם תאורה מקבילה הוקמה ולהגדיר את defocus הסופי ל -0.2 מיקרומטר.
- הכנס את המסך הפלואורסצנטי ועצירת הקרן במלואה. היכנסו למצב עקיפה כדי להמחיש בבירור את כתמי העקיפה.
- רכוש תמונה באמצעות מצלמת CCD והערך אותה באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.
הערה: כתמי העקיפה הקלים ביותר לזיהוי הנוצרים על ידי חד-שכבה של גרפן הם 6 כתמים המתאימים לתדירות מרחבית של 2.13 Å. השתמש בכלי מדידה כדי להעריך את המרחק ממרכז הקרן המפוזרת לאחד מנקודות העקיפה הללו ביחידות הדדיות. ראוי לציין 2.13 å
0.47 å-1.
0.47 å-1.12. הערכת הידרופיליות הרשת
- הכן את הגדרת ההדמיה. אתר מעמד לטלפון, משטח הדמיה שולחני, טלפון עם מצלמה, כיסוי זכוכית וסרט פרפין. התמונות המוצגות כאן התקבלו באמצעות מעמד טלפון ומשטח הדמיה שולחני שהודפסו בתלת-ממד באמצעות קבצי .stl שסופקו, וכתוצאה מכך מדידות זווית מגע קלות יותר לשחזור ולכימות (איור משלים 1A).
- הניחו כיסוי זכוכית על המשטח השטוח, ואז חתכו ריבוע בגודל 1 ס"מ על 1 ס"מ של סרט פרפין והניחו אותו על מכסה הזכוכית. הנח את הטלפון על מעמד הטלפון, כיוון את הטלפון כך שהמצלמה תהיה במטוס עם כיסוי הזכוכית. אבטח טלפון במצב זה באמצעות גומיות (איור משלים 1B). צלם תמונה לדוגמה כדי לוודא שהמצלמה מיושרת עם משטח ההדמיה.
- מיד לאחר טיפול UV / אוזון של רשתות מצופות גרפן, מניחים רשת אחת על ריבוע של סרט פרפין על מכסה זכוכית. ודא שצד הגרפן פונה כלפי מעלה. הוסף טיפת מים של 2 μL למרכז משטח הרשת עם פיפטה ומיד צלם תמונה.
הערה: חזור על שלב זה לאחר: i) מרווחי הזמן הרצויים של טיפול UV / אוזון כדי לקבוע משך טיפול מספיק; או ii) מרווחי הזמן הרצויים לאחר טיפול UV / אוזון כדי למדוד כמה זמן לאחר הטיפול משטח הרשת שומר על אופיו ההידרופילי. - חשב זוויות מגע מתמונות על ידי ייבואן ל- ImageJ43 ושימוש בתוסף זווית המגע.
13. ניתוח חלקיקים בודדים של מערך הנתונים המורכב dCas9
הערה: כל עיבוד התמונה המתואר בפרוטוקול זה בוצע באמצעות cryoSPARC גרסה 4.2.1.
- עיבוד מוקדם של סרטים באמצעות משימות תיקון תנועה והערכת תיקון CTF. בצע ליקוט חלקיקים באמצעות משימת בורר הכתמים, באמצעות כתם כדורי בקוטר שבין 115 Å ל- 135 Å.
- חילוץ חלקיקים באמצעות משימת Extract from micrographs, תוך שימוש במקדם מתאם מנורמל (NCC) וספי הספק המביאים לכ-200-300 חלקיקים למיקרוגרף. שים לב שערכי הסף המתאימים וספירת החלקיקים המתקבלת עשויים להשתנות, ועל המשתמשים לבדוק את איכות הבחירה במגוון מיקרוגרפים כדי לזהות תנאים מתאימים.
- בצע שחזורים ראשוניים מרובי מחלקות באמצעות עבודת השחזור Ab-initio, הדורשת שלוש כיתות. שתיים מתוך שלוש המחלקות יכילו ככל הנראה חלקיקים שאינם Cas9, כולל מזהמים על פני השטח. בחר את המחלקה הדומה ל- dCas9 לעיבוד נוסף.
הערה: ניתן להחיל סבבים נוספים של שחזור Ab-initio מרובה מחלקות או עידון הטרוגני כדי לחדד עוד יותר את מחסנית החלקיקים. - בצע עידון תלת-ממדי באמצעות משימת המיקוד הלא אחידה, בחירת פרמטרי ברירת מחדל. הערך את הרזולוציה של השחזור באמצעות משימות אימות (FSC) ו- ThreeDFSC, תוך שימוש במפות ובמסיכה מהעידון התלת-ממדי הסופי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ייצור מוצלח של רשתות cryoEM מצופות גרפן באמצעות הציוד (איור 1) והפרוטוקול (איור 2) המתוארים כאן יביא לשכבה אחת של גרפן המכסה את חורי נייר הכסף שניתן לאשר באמצעות דפוס העקיפה האופייני שלה. כדי לקדם ספיחת חלבונים לפני השטח של הגרפן, ניתן להשתמש בטיפול UV / אוזון כדי להפוך את פני השטח להידרופיליים על ידי התקנת קבוצות פונקציונליות המכילות חמצן. עם זאת, מזהמים פחמימנים באוויר יכולים לספוח על פני הגרפן כבר 5 דקות לאחר הטיפול UV / אוזון ולנטרל השפעה זו38,39. חשוב לציין, הן משך הטיפול ב- UV / אוזון והן הזמן שחלף בין הטיפול לצניחה יכולים להשפיע על איכות הדגימה. אנו מדגימים את ההשפעות האלה באמצעות שיטה פשוטה להערכת האופי ההידרופילי של הרשת המצופה בהתבסס על זווית המגע עם פני השטח (איור 3; ראו שלב 12).
כדי להדגים את השימוש בתמיכות גרפן ב-cryoEM של חלקיק יחיד, יישמנו אנדונוקלאז DNA מונחה RNA קטליטי לא פעיל S. pyogenes Cas9 (H10A; C80S; C574S; H840A)40 בקומפלקס עם sgRNA ודנ"א מטרה לרשתות מצופות גרפן, אסף מערך נתונים cryoEM מרשתות אלה, וביצע ניתוח חלקיקים בודדים7. רשתות מצופות גרפן הכילו באופן עקבי ~300 חלקיקים למיקרוגרף בהגדלה של 0.654 Å/pix באמצעות מיקרוסקופ של 300 keV המצויד בגלאי אלקטרונים ישיר K3 (איור 4A-E). סשן איסוף נתונים של 8 שעות עם הטיית במה של +18° הניב 2,963 סרטים ו-324,439 חלקיקים בערימה סופית. באמצעות החלקיקים האלה יצרנו שחזור תלת-ממדי אשר, לאחר הזיכוך, הניב מפת צפיפות עם רזולוציה משוערת של 2.7 Å ודגימה זוויתית מספקת כדי להימנע מממצאים אנאיזוטרופיים (איור 5). מודל אטומי (PDB 6o0z)41 עוגן במפה זו, ושוכלל באמצעות ISOLDE42. שאריות R63-L82 של מודל אטומי מותאם זה מוצגות עם מפת צפיפות cryoEM מעודנת, המדגישה את צפיפות שרשרת הצד שנפתרה (איור 5B). כאשר השווינו את אותה דגימה וריכוז (250 ננוגרם/מיקרוליטר) שהוחלו על רשתות זהות ללא גרפן, לא נצפו חלקיקים (איור 4F,G). תצפית זו מדגישה את היעילות של תמיכת הגרפן במתן אפשרות להדמיה של חלקיקים מדגימות בריכוז נמוך.
איור 1: ציוד נדרש. ציוד מעבדה וכלים הדרושים לייצור רשתות גרפן באמצעות הפרוטוקול המפורט במאמר זה. הפריטים והכמות שלהם מוצגים ומתויגים בהתאם. ריאגנטים נדרשים שאינם מוצגים כוללים: CVD גרפן, מתיל-מתקרילט EL-6 (MMA), אמוניום פרסולפט (APS), אצטון, איזופרופנול, אתנול, מים באיכות מולקולרית. מכשירים נדרשים שאינם מוצגים כוללים: מעיל סיבוב, פריקת זוהר, פלטה חמה, מייבש ואקום ומדחום. כל הפריטים הנדרשים מפורטים בטבלת החומרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סכמה של תהליך ייצור רשת הגרפן. גרפן מצופה בשכבה דקה של מתיל-מתקרילט EL-6 (MMA) באמצעות ציפוי ספין (שלב 2). גרפן בצד הנגדי של רדיד הנחושת מוסר באמצעות תחריט פלזמה (שלב 3). לאחר מכן משתמשים באמוניום פרסולפט (APS) כדי לחרוט את הנחושת (שלבים 4-5). סרט MMA-גרפן ממוקם על משטח הרשת (שלב 6-7). לבסוף, MMA מומס במהלך סדרה של שטיפות עם ממיסים אורגניים (שלבים 8-9). השלבים המצוינים לעיל תואמים לשלבים ממוספרים המתוארים בסעיף פרוטוקולים. שיטה זו אומצה על ידי Han et al.30. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הערכת הידרופיליות פני השטח של הרשת כפונקציה של משך הטיפול בקרינת UV/אוזון והזמן שחלף לאחר הטיפול. (A) זוויות מגע מדודות המשורטטות כפונקציה של משך הטיפול. זוויות מגע מופחתות תואמות להידרופיליות מוגברת (רשת לא מטופלת: 78°; 20 דקות: 37°). זוויות מגע נמדדו באמצעות ImageJ43. (B) זוויות מגע מדודות המשורטטות כפונקציה של זמן, לאחר הטיפול (0 דקות: 45°; 60 דקות: 74°). הרשת שנמדדה במסלול הזמן שלאחר הטיפול טופלה ב- UV / אוזון במשך 12 דקות, כפי שמצוין בכוכבית. כל מדידה לאחר הטיפול בוצעה על אותה רשת, כאשר הדגימה הוסרה על ידי פתיל בין מדידות. זוויות מגע ספציפיות שנמדדו צפויות להשתנות בהתאם לתנאי הסביבה במעבדה, ואנו ממליצים למשתמשים לבצע ניסויים דומים במעבדותיהם כדי לזהות תנאים מתאימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונות מייצגות של רשתות בקרה מצופות גרפן ורשתות בקרה לא מצופות. (A-C) אטלס מייצג, ריבוע רשת וחורי רדיד אלומיניום של רשתות פחמן חוריות מצופות גרפן שצולמו במיקרוסקופ 300 keV המצויד בגלאי אלקטרונים ישיר K3. (D) מיקרוגרף CryoEM של S. pyogenes dCas9 בקומפלקס עם sgRNA ודנ"א מטרה (קומפלקס בריכוז 250 ng/μL) על רשת פחמן חורי מצופה גרפן. (E) תמונת עקיפה מהרשת שצולמה בחלוניות (A-D). חץ כתום מציין מיקום המתאים לתדירות מרחבית של 2.13 Å. מדגם זהה לזה שבפאנל (D) יושם על (F) טיפול UV/אוזון ו- (G) זוהר רשתות פחמן חוריות ללא גרפן. מיקרוגרפים CryoEM המוצגים מייצגים כל רשת ואינם מראים חלקיקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: שחזור CryoEM של קומפלקס Cas9 מרשתות מצופות גרפן. (A) מפת צפיפות CryoEM משחזור תלת-ממדי של S. pyogenes dCas9 בקומפלקס עם sgRNA ו-DNA מטרה. (B) שאריות R63-L82 מדגם מותאם מתוארות בתוך צפיפות cryoEM שקופה למחצה, עם תת-קבוצה של שרשראות צדדיות גלויות מסומנות. (C) עקומות מתאם מעטפת פורייה (FSC) של המפות ללא מסיכה, באופן רופף ומוסווה היטב. (D) היסטוגרמה ותרשים FSC כיווני המבוסס על שיטת 3DFSC23. ראו איור משלים 2 ושלב 13 לקבלת מידע נוסף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: מעמד להדמיית זווית מגע. (A) מעמד מצלמה מודפס בתלת-ממד ותושבת הדמיה שולחנית כדי לאבטח את המצלמה במיקום שמיישר את המצלמה במישור עם הכיסוי. (B) הרשת מונחת על גבי פיסת סרט פרפין בגודל 1 ס"מ על 1 ס"מ מרובע. תושבת ההדמיה המתוארת הודפסה בתלת-ממד באמצעות קבצי .stl שסופקו (קובץ קידוד משלים 1 וקובץ קידוד משלים 2) וניתן לשנות אותה בקלות כדי להתאים לרוב ההתקנים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 2: תהליך עבודה של עיבוד תמונה. עיבוד זרימת עבודה עבור קומפלקס dCas9. מצוינים שמות משימה, פרטי משימה ופרמטרים שאינם ברירת מחדל (נטוי). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 1: קובצי CAD סטריאוליתוגרפיים בפורמט STL מסופקים כדי להקל על הדפסה תלת-ממדית של מעמד המצלמה (camera_stand_v1.stl). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 2: קובצי CAD סטריאוליתוגרפיים בפורמט STL מסופקים כדי להקל על הדפסה תלת-ממדית של תושבת ההדמיה השולחנית (slide_mount_v1.stl) ואנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הכנת דגימות CryoEM כרוכה בשורה של אתגרים טכניים, כאשר רוב זרימות העבודה דורשות מהחוקרים לתפעל ידנית רשתות שבריריות בזהירות רבה כדי להימנע מפגיעה בהן. בנוסף, ההתאמה של כל דגימה לוויטריפיקציה היא בלתי צפויה; חלקיקים מתקשרים לעתים קרובות עם ממשק אוויר-מים או עם רדיד התמיכה המוצק המכסה את הרשתות, מה שעלול להוביל לכך שחלקיקים יאמצו כיוונים מועדפים או לא ייכנסו לחורי ההדמיה אלא אם כן מיושמים ריכוזי חלבון גבוהים מאוד24. כיסוי רשתות cryoEM חוריות עם מונושכבה רציפה של גרפן הראה הבטחה עצומה בשיפור התפלגות החלקיקים במיקרוגרפים, הגדלת מספר החלקיקים בריכוזים נמוכים והפחתת כיוונים מועדפים המונעים על ידי אינטראקציות בממשק אוויר-מים30.
מגבלה של פרוטוקולי ציפוי גרפן קיימים עבור רשתות cryoEM היא המניפולציות הידניות הנרחבות הנדרשות לתהליך הציפוי, אשר יכולות לפגוע באיכות ולהגדיל את השונות מרשת לרשת. בעבודה זו אנו מתארים שינויים קלים בפרוטוקול קיים לציפוי רשתות cryoEM בשכבה אחת של גרפן30.
שלבים קריטיים בפרוטוקול זה כוללים ציפוי גרפן CVD ב-MMA, המסת מצע נחושת גרפן CVD ב-APS, ויישום גרפן ברשתות cryoEM. שינינו את הפרוטוקול המקורי כדי למזער מניפולציות ידניות של הרשתות המצופות על ידי החלפת ממסים בתוך אותה צלחת פטרי, במקום לטפל בנפרד ולהעביר רשתות למיכל ממס חדש עבור כל שלב שטיפה, ובכך במטרה להגדיל את התפוקה של רשתות שלמות, באיכות גבוהה ומצופות גרפן. בעוד ששאפנו להפחית את המניפולציות של רשתות מצופות גרפן למינימום, אנו מכירים בכך שהיישום הידני של ריבועי גרפן בודדים לרשתות cryoEM הוא מאתגר מטבעו, וכי צפויה שונות מסוימת בין רשת לרשת.
רשתות מצופות גרפן דורשות בדרך כלל טיפול UV / אוזון כדי להפוך את פני השטח הידרופיליים ליישום דגימה. משך הטיפול ב- UV / אוזון והזמן שחלף לאחר הטיפול ולפני הצניחה יכולים להשפיע על הידרופיליות הרשת ובסופו של דבר על איכות הדגימה. בנוסף לפרוטוקול ייצור הרשת, אנו מתארים טכניקה להערכת הידרופיליות רשת בעקבות טיפול ב- UV / אוזון. בהליך, זווית מגע פני השטח של מדגם מוחל משמשת כאינדיקטור לאופי ההידרופילי של הרשת המצופה20,44. עיצובים מסופקים כדי להדפיס בזול בתלת-ממד תושבת הדמיית רשת מותאמת אישית המשתמשת במצלמת טלפון סלולרי פשוטה כדי להעריך את זווית המגע עם פני השטח.
לבסוף, אנו מתארים תוצאות שהתקבלו על ידי שימוש בפרוטוקול זה כדי לקבוע את מבנה ה- cryoEM 2.7 Å של אנדונוקלאז DNA מונחה RNA קטליטי, S. pyogenes Cas9 בקומפלקס עם sgRNA ו- DNAמטרה 40. בהיעדר גרפן, לא נצפו חלקיקים בחורי רדיד אלומיניום בריכוזים המורכבים שבהם נעשה שימוש (250 ננוגרם/מיקרוליטר). לעומת זאת, רשתות מצופות גרפן נשאו חלקיקים בצפיפות גבוהה, מה שאיפשר שחזור תלת-ממדי קל של מפה ברזולוציה גבוהה מ-2,961 מיקרוגרפים. יחד, נתונים אלה מדגישים את הערך של יישום מונושכבות גרפן על רשתות cryoEM לניתוח חלקיקים בודדים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין קונפליקטים לחשוף.
Acknowledgments
הדגימות הוכנו וצולמו במתקן CryoEM ב-MIT.nano על מיקרוסקופים שנרכשו הודות לקרן ארנולד ומייבל בקמן. מכשירי הדמיה של זווית מגע הודפסו ב-MIT Metropolis Maker Space. אנו מודים למעבדות של Nieng Yan ו-Yimo Han, ולצוות של MIT.nano על תמיכתם לאורך כל אימוץ שיטה זו. בפרט, אנו מודים לד"ר גואנהוי גאו ושרה סטרלינג על הדיונים והמשוב מלאי התובנה שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01-GM144542, 5T32-GM007287 ומענק NSF-CAREER 2046778. המחקר במעבדת דייוויס נתמך על ידי קרן אלפרד פ. סלואן, קרן ג'יימס ה. פרי, MIT J-Clinic ומשפחת וייטהד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 mL beaker (3x) | Fisher | 02-555-25B | |
| 50 mL beaker (2x) | Corning | 1000-50 | |
| Acetone | Fisher | A949-4 | |
| Aluminum foil | Fisher | 15-078-292 | |
| Ammonium persulfate | Fisher | (I17874 | |
| Coverslips 50 mm x 24 mm | Mattek | PCS-1.5-5024 | |
| CVD graphene | Graphene Supermarket | CVD-Cu-2x2 | |
| easiGlow discharger | Ted-Pella | 91000S | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | 1.11727 | |
| Flat-tip tweezers | Fisher | 50-239-60 | |
| Glass cutter | Grainger | 21UE26 | |
| Glass petri plate and cover | VWR | 75845-544 | |
| Glass serological pipette | Fisher | 13-676-34D | |
| Grid Storage Case | EMS | 71146-02 | |
| Hot plate | Fisher | 07-770-108 | |
| Isopropanol | Sigma | W292907 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| Lab scissors | Fisher | 13-806-2 | |
| Methyl-Methacrylate EL-6 | Kayaku | MMA M310006 0500L1GL | |
| Molecular grade water | Corning | 46-000-CM | |
| Negative action tweezers (2x) | Fisher | 50-242-78 | |
| P20 pipette | Rainin | 17014392 | |
| P200 pipette | Rainin | 17008652 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| Pipette tips | Rainin | 30389291 | |
| Quantifoil grids with holey carbon | EMS | Q2100CR1 | |
| Spin coater | SetCas | KW-4A | with chuck SCA-19-23 |
| Straightedge | ULINE | H-6560 | |
| Thermometer | Grainger | 3LRD1 | |
| UV/Ozone cleaner | BioForce | SKU: PC440 | |
| Vacuum desiccator | Thomas Scientific | 1159X11 | |
| Whatman paper | VWR | 28297-216 |
References
- Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461 (2013).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Sci. 30 (1), 136-150 (2021).
- Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
- Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
- Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
- Kinman, L. F., Powell, B., Zhong, E., Berger, B., Davis, J. H. Uncovering structural ensembles from single particle cryo-EM data using cryoDRGN. Nat Protoc. 18 (2), 319-339 (2022).
- Zhong, E. D., Bepler, T., Berger, B., Davis, J. H. CryoDRGN: reconstruction of heterogeneous cryo-EM structures using neural networks. Nat Methods. 18 (2), 176-185 (2021).
- Chen, M., Ludtke, S. J. Deep learning-based mixed-dimensional Gaussian mixture model for characterizing variability in cryo-EM. Nat Methods. 18 (8), 930-936 (2021).
- Punjani, A., Fleet, D. J. 3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM. J Struct Biol. 213 (2), 107702 (2021).
- Dashti, A., et al. Retrieving functional pathways of biomolecules from single-particle snapshots. Nat Commun. 11 (1), 4734 (2020).
- Sun, J., Kinman, L. F., Jahagirdar, D., Ortega, J., Davis, J. H. KsgA facilitates ribosomal small subunit maturation by proofreading a key structural lesion. Nat Struct Mol Biol. , (2023).
- Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W.
- Dubochet, J.
- Glaeser, R. M., et al. Factors that influence the formation and stability of thin, cryo-EM specimens. Biophys J. 110 (4), 749-755 (2016).
- Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-Em grids. Curr Opin Colloid Interface Sci. 34, 1-8 (2018).
- D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO. J Struct Biol X. 1, 100005 (2019).
- Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nat Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 560-571 (2018).
- Neselu, K., et al. Measuring the effects of ice thickness on resolution in single particle cryo-EM. J Struct Biol X. 7, 100085 (2023).
- Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. J Struct Biol. 174 (1), 234-238 (2011).
- Geim, A. K., Novoselov, K. S.
- Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Sci Rep. 13 (1), 2279 (2023).
- Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nat Commun. 13 (1), 6718 (2022).
- Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Liu, N., et al. Bioactive functionalized monolayer graphene for high-resolution cryo-electron microscopy. J Am Chem Soc. 141 (9), 4016-4025 (2019).
- Benjamin, C. J., et al. Selective capture of histidine-tagged proteins from cell lysates using TEM grids modified with NTA-graphene oxide. Sci Rep. 6, 32500 (2016).
- Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24269-24273 (2020).
- Koh, A., et al. Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope. J Vis Exp. (181), (2022).
- Schweizer, P., et al. Mechanical cleaning of graphene using in situ electron microscopy. Nat Commun. 11 (1), 1743 (2020).
- Li, Z., et al. Effect of airborne contaminants on the wettability of supported graphene and graphite. Nat Mater. 12 (10), 925-931 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Zhu, X., et al. Cryo-EM structures reveal coordinated domain motions that govern DNA cleavage by Cas9. Nat Struct Mol Biol. 26 (8), 679-685 (2019).
- Croll, T. I. ISOLDE: a physically realistic environment for model building into low-resolution electron-density maps. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 519-530 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Prydatko, A. V., Belyaeva, L. A., Jiang, L., Lima, L. M. C., Schneider, G. F. Contact angle measurement of free-standing square-millimeter single-layer graphene. Nat Commun. 9 (1), 4185 (2018).
