Summary
Dieses Protokoll bietet ein Mausmodell für ulzerativen Koloproktitis-assoziierten Darmkrebs, der durch Azomethan in Kombination mit Dextransulfat-Natrium induziert wird. Das Modell wurde verwendet, um die Wirksamkeit von Verbindungen der traditionellen chinesischen Medizin bei der Prävention und Behandlung von Darmkrebs zu bewerten.
Abstract
Darmkrebs (CRC) ist eine häufige bösartige Erkrankung des Verdauungssystems und hat sich zur dritthäufigsten bösartigen Erkrankung weltweit und zur zweithäufigsten Ursache für malignitätsbedingte Todesfälle entwickelt. Die ulzerative Koloproktitis (UC) ist eine präkanzeröse Läsion, und UC-assoziiertes CRC (UC-CRC) ist der häufigste Subtyp von CRC. Daher ist ein vernünftiges UC-CRC-Modell der Eckpfeiler und Garant für die Entwicklung neuer Medikamente. Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) ist aufgrund ihrer guten Wirksamkeit bei der Behandlung von UC-CRC weit verbreitet. Als klassisches Tonikum der TCM ist die Liujunzi-Abkochung (LJZD) bei der Behandlung von UC-CRC weit verbreitet. In dieser Studie wurde ein UC-CRC-Modell durch Kombination von Azomethan und Dextransulfat-Natrium etabliert und das LJZD verabreicht. Die Daten bestätigten, dass LJZD den Krebsübergang bei UC-CRC wirksam hemmen kann, indem es das Körpergewicht der Maus, die kolorektale Länge, pathologische und entzündliche Faktoren, die kolorektale Barrierefunktion und Krebsmarker verwendet. Dieses Protokoll bietet ein System zur Bewertung der Wirksamkeit von TCM bei der Prävention und Behandlung von UC-CRC.
Introduction
Darmkrebs (CRC) ist eine häufige gastrointestinale Malignität, die dritthäufigste Malignität und die zweithäufigste Todesursache der Welt, die 10 % der weltweiten Krebsinzidenz und 9,4 % der gesamten krebsbedingten Todesfälle ausmacht 1,2. Genetische Faktoren, chronische Entzündungen, fettreiche Ernährung, Diabetes und eine abnormale Darmflora sind Risikofaktoren für den Darmkrebs 3,4. Unter ihnen ist eine entzündliche Darmerkrankung, insbesondere die Cololoproktitis ulcerosa (UC), ein klarer Risikofaktor für den Darmkrebs 5,6. UC-assoziiertes CRC (UC-CRC) ist ein Übergangsprozess von Entzündungen, atypischer Hyperplasie und Krebs, der auf einer chronischen Entzündung des Dickdarms beruht und sich vom typischen Adenom-Adenokarzinom-Entwicklungsmodell des SFB 7,8 unterscheidet. Im Vergleich zur Allgemeinbevölkerung ist das Risiko für Darmkrebs bei Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen etwa 10-40-mal höher9.
Derzeit ist eine Operation immer noch die Standardbehandlung für Darmkrebs, und je nach Ort und Stadium des Tumors sind eine Strahlentherapie, eine systemische medikamentöse Therapie oder eine Kombination aus beidem möglich10. Obwohl diese traditionellen Behandlungsmodalitäten aufgrund der hohen Heterogenität und Rezidivrate von Darmkrebs große Fortschritte gemacht haben, ist die Prognose schlecht und der Behandlungseffekt nicht ideal11,12. Daher sind Früherkennung, Früherkennung und umfassende Behandlung der Schlüssel zur Verbesserung der Überlebensrate von Darmkrebspatienten, und es ist besonders wichtig, auf die Umwandlung von UC in Darmkrebs zu achten. Im Laufe der Jahre hat die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) aufgrund ihrer begrenzten Nebenwirkungen und ihrer signifikanten Wirksamkeit viel Aufmerksamkeit bei der Behandlung von UC-CRC oder chronischer Gastritis auf sich gezogen. Basierend auf der dialektischen Behandlung haben berühmte chinesische Mediziner verschiedener Generationen eine große Anzahl klassischer Rezepte erstellt, wie z. B. Huangqi Jianzhong Abkochung13, Sijunzi Abkochung14 und Sishen Pille15.
Der Liujunzi-Sud (LJZD) stammt aus den Werken von Yi Xue Zheng Zhuan, die in der Ming-Dynastie zusammengestellt wurden, und ist eine klassische Verschreibung in TCM16. Wie in Tabelle 1 gezeigt, besteht LJZD aus sechs traditionellen Kräutern, darunter Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf. (Dangshen), Poria cocos (Schw.) Wolf (Fuling), Atractylodes macrocephala Koidz. (Baizhu), Glycyrrhiza uralensis Fisch. (Gancao), Citrus reticulata Blanco (Chenpi) und Pinellia ternata (Thunb.) Breit (Banxia), das die Wirkung hat, das Qi wieder aufzufüllen und die Milz zu stärken, Feuchtigkeit zu trocknen und Schleim aufzulösen. In der modernen klinischen Praxis wird es häufig zur Behandlung von chronischer Gastritis, Magengeschwüren und Zwölffingerdarmgeschwüren eingesetzt. Moderne pharmakologische Forschung hat gezeigt, dass LJZD und modifiziertes LJZD einen hohen Anwendungswert bei der adjuvanten Behandlung von UC und Krebs des Verdauungstrakts haben 17,18,19.
Gegenwärtig gibt es viele Möglichkeiten, UC-CRC-Mausmodelle zu konstruieren, aber das Azoxymethan (AOM)/Dextransulfat-Natrium (DSS)-induzierte Mausmodell ist das am weitesten verbreitete UC-CRC-Modell; Die klinischen Symptome, morphologischen und pathologischen Beobachtungen haben gezeigt, dass das Modell dem menschlichen UC-CRC sehr ähnlichist 20,21. Das Grundprinzip besteht darin, zunächst die Karzinogenese mit dem chemisch karzinogenen AOM zu induzieren und dann Mäuse kontinuierlich der entzündlichen Stimulationsumgebung von DSS auszusetzen, um die kontinuierliche Schädigung und Reparatur des Darmschleimhautepithels zu simulieren und so ein UC-CRC-Mausmodellzu konstruieren 22. Ziel dieser Arbeit ist es, ein Mausmodell von UC-CRC durch intraperitoneale Injektion von AOM und zyklische Stimulation von DSS kurzfristig zu etablieren und die Wirkung des Medikaments und den molekularen Mechanismus von LJZD auf UC-CRC zu bewerten, um eine wissenschaftliche Grundlage für die Behandlung von UC-CRC zu schaffen.
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Protocol
Das Tierverfahren wurde von der Ethikkommission der Changchun University of Chinese Medicine genehmigt (Aktenzeichen: 2021214). Spezifische pathogenfreie C57BL/6J-Mäuse (8-10 Wochen, Gewicht 18-22 g), männlich und weiblich, wurden in unabhängig belüfteten Käfigen bei 22 °C und 65% relativer Luftfeuchtigkeit untergebracht. Die Mäuse begannen das Experiment nach 7 Tagen adaptiver Fütterung, während der sie freien Zugang zu Wasser und Nahrung hatten.
1. Arzneimittelvorbereitung
- Vorbereitung von LJZD
HINWEIS: Das verwendete chinesische Arzneimittel wurde vom angeschlossenen Krankenhaus der Changchun University of Chinese Medicine gekauft und als echte chinesische Medizin identifiziert (siehe Tabelle 1).- Dangshen (12 g), Baizhu (12 g), Gancao (6 g), Chenpi (12 g), Jiangbanxia (9 g) in einen speziellen Keramiktopf geben (siehe Materialtabelle). 1000 ml destilliertes Wasser hinzufügen und 1 h bei Raumtemperatur einweichen (siehe Abbildung 1A).
- Pulver 12 g Mit einem Mahlwerk zu feinem Pulver verarbeiten und in 300 ml destilliertem Wasser in einem anderen Behälter 1 h bei Raumtemperatur einweichen.
- Mischen Sie die oben genannte chinesische Medizin in dem speziellen Keramiktopf. Kochen Sie die Mischung und halten Sie sie dann auf mittlerer Flamme, bis nur noch 300 ml Abkochung übrig sind. Verwenden Sie medizinische Gaze zum Filtern und bewahren Sie das Filtrat bei Raumtemperatur auf.
- Fügen Sie 1000 ml destilliertes Wasser hinzu und wiederholen Sie den obigen Abkochvorgang noch einmal. Filtern Sie erneut mit medizinischer Gaze. Kombinieren Sie das Filtrat und kochen Sie es, bis nur noch 150 ml übrig sind.
- Die konzentrierte Flüssigkeit wird 5 Minuten lang bei 10.000 x g zentrifugiert und der erhaltene Überstand bei mittlerer Hitze auf 30 ml weiter konzentriert. Das endgültige Konzentrat in eine Schüssel geben und mit einem elektrischen Trockenofen trocknen, bis nur noch der gelöste Stoff als Pulver übrig bleibt.
- Wiegen Sie den obigen Feststoff und lösen Sie ihn in sterilem destilliertem Wasser auf, um eine Lösung zu erhalten, die 22,85 mg Arzneimittel pro 0,2 ml (114,16 mg/ml) enthält, was der Tagesdosis von Mäusen entspricht.
- Herstellung von 5-Amino-Salicylsäure
HINWEIS: 5-Amino-Salicylsäure (5-ASA; siehe Materialtabelle) hat eine gute vorbeugende Wirkung auf UC-CRC und wurde in dieser Studie als positives Medikament verwendet23.- 64 mg 5-ASA-Pulver in 200 ml sterilem destilliertem Wasser auflösen, um 1,82 mg/ml 5-ASA-Lösung zu erhalten. Die Tagesdosis für eine einzelne Maus betrug 0,2 ml.
- Herstellung der AOM-Injektionslösung
- 2,5 ml steriles destilliertes Wasser in 25 mg AOM-Pulver geben (siehe Materialtabelle) und mit einem Vortex-Mischer (siehe Materialtabelle) mischen, um 10 mg/ml AOM-Stammlösung herzustellen, bis zur Verwendung bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie die AOM-Injektionslösung vor, indem Sie die AOM-Stammlösung mit sterilem destilliertem Wasser bei 10:1 (1 mg/ml) verdünnen.
2. Etablierung des UC-CRC-Modells
HINWEIS: Das Experiment wurde in 4 Gruppen unterteilt: Kontroll-, Modell-, LJZD- und 5-ASA-Gruppe, 10 Mäuse in jeder Gruppe. Mit Ausnahme der Kontrollgruppe wurden die anderen Gruppen mit AOM und DSS behandelt.
- Intraperitoneale Injektion von AOM-Injektionslösung
HINWEIS: Nach adaptiver Fütterung für 7 Tage erhielten die Mäuse AOM-Injektionslösung (1 mg/ml) durch intraperitoneale Injektion (siehe Abbildung 1B).- Halten Sie die Maus mit dem Bauch nach oben und dem Kopf leicht nach unten. Fassen Sie die Rückenhaut an, um die Bauchhaut zu straffen, und stechen Sie die Haut etwa 1 cm rechts vom Schnittpunkt der Wurzellinie beider Oberschenkel auf der Mittelbauchlinie mit einer 1-ml-Spritze ein (siehe Materialtabelle).
- Drücken Sie die 1-ml-Spritzennadel in einem Abstand von 3-5 mm unter die Haut, halten Sie sie parallel zur Bauchmittellinie und führen Sie die Nadel 0,3-0,5 mm in einem Winkel von 45° in die Bauchhöhle ein.
- Nachdem die Spitze den Bauchmuskel passiert hat, spürt der Bediener einen plötzlichen Widerstandsverlust. Ziehen Sie anschließend die Spritze nach außen und hinten, um zu beobachten, ob Flüssigkeit austritt. Wenn nicht, drücken Sie die AOM-Injektionslösung langsam mit 0,1 ml/10 g in die Mäuse.
- Zyklische Stimulation von 2% DSS-Lösung
HINWEIS: Jede AOM-induzierte Maus erhielt in den Wochen 3, 6 und 9 500 ml DSS-Lösung, und die Mäuse tranken während dieses Zeitraums frei.- Bereiten Sie eine 2%ige DSS-Lösung vor, indem Sie 500 ml steriles destilliertes Wasser zu 10 g DSS hinzufügen (siehe Materialtabelle). Mit einem Vortex-Mixer mischen und bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
- Jede AOM-induzierte Maus trinkt 500 ml 2%ige DSS-Lösung für 7 Tage in den Wochen 3, 6 und 9 nach der AOM-Induktion.
3. Medikamentöse Behandlung
HINWEIS: Erwachsene Menschen benötigen 63 g LJZD pro Tag. Nach der Umrechnungsformel der experimentellen Arzneimitteldosis für Mäuse und Menschen, äquivalente experimentelle Dosis für Mäuse (mg/kg) = menschliche Dosis (mg/kg)/Körpergewicht (60 kg) x 9,1, betrug die Tagesdosis von Mäusen etwa 9,6 g/kg.
- Behandeln Sie die LJZD- und 5-ASA-Gruppe mit 0,1 ml/10 g der vorbereiteten LJZD- und 5-ASA-Lösung durch Magensonde in Woche 7 bzw. Woche 15.
- Führen Sie für die intragastrische Verabreichung bei Mäusen das folgende Verfahren durch. Halten Sie die Maus in der linken Hand und in der rechten Hand das Magenperfusionsgerät. Führen Sie die Spritzennadel in den Mund ein und schieben Sie sie an der Rückwand des Rachens der Mäuse hinunter. Gleiten Sie den Rachen hinunter, während die Mäuse schlucken, und bewegen Sie sich weiter vorwärts. Wenn ein Gefühl des Widerstands vorhanden war und die Spritze in den Rachen geschoben werden konnte, ziehen Sie die Nadel heraus und beenden Sie die Injektion.
- Behandeln Sie die Kontroll- und Modellgruppe mit der gleichen Menge Kochsalzlösung (siehe Materialtabelle).
- Behandeln Sie die Mäuse in jeder Gruppe während des Verabreichungszeitraums einmal täglich zur gleichen Zeit mit einem geeigneten Medikament.
4. Bewertung des UC-CRC-Modells und Wirksamkeit von LJZD
- Krankheitsaktivitätsindex-Score
HINWEIS: Gemäß Tabelle 2 wurde der Krankheitsaktivitätsindex (DAI) durch Kombination von Gewichtsverlust, Stuhlviskosität und Stuhlblutung der Mäuse bewertet.- Zeichnen Sie das Gewicht der Mäuse täglich vom Beginn der adaptiven Fütterung bis zum Ende der medikamentösen Behandlung auf.
- Beobachten Sie die Kotkonsistenz jeder Versuchsmaus sorgfältig und notieren Sie den Stuhlgang als eine der drei Bedingungen: normaler, lockerer Stuhl und wässriger Durchfall.
- Zeichnen Sie die Kotblutungen von Versuchstieren als eine der drei Bedingungen auf: keine Blutung, geringe Blutung und sichtbares Blut im Stuhl.
- Nachweis des IL-6-Spiegels im Serum
- Behandeln Sie Mäuse 9 Wochen lang mit LJZD oder 5-ASS. Fixieren Sie die Mäuse, indem Sie mit der linken Hand die Halshaut der Maus greifen und leicht auf den Experimentiertisch drücken, um die seitliche Dekubitusposition einzunehmen. Schneiden Sie die Schnurrhaare der Mäuse mit einer Schere ab. Schneiden Sie die Schnurrhaare der Mäuse vorsichtig mit einer Schere ab (siehe Materialtabelle), um eine Blutkontamination zu vermeiden.
HINWEIS: Mäuse, die nicht frei wackeln konnten, wurden als ordnungsgemäß fixiert angesehen. Geschieht dies nicht, sollten die Mäuse fixiert werden. - Betäuben Sie die Maus durch Inhalation von 2% Isofluran. Sterilisieren Sie die Haut um den Augapfel mit Ethanol (siehe Materialtabelle). Drücken Sie die Augenhaut sanft auf die Seite, um den Augapfel zu verstopfen und hervorzustehen.
- Klemmen Sie den Augapfel mit einer Ellbogenpinzette fest und entfernen Sie die Augäpfel genau und schnell. Lassen Sie das Blut in das Zentrifugalröhrchen tropfen (siehe Materialtabelle). Tippen Sie dabei auf das Herz der Maus, um die Blutentnahme zu beschleunigen.
- Das gesammelte Blut 30 min bei Raumtemperatur aufbewahren und 10 min bei 3.500 x g zentrifugieren. Sammeln Sie den Überstand und erkennen Sie den IL-6-Füllstand gemäß den Anweisungen des IL-6-Inhaltserkennungskits (siehe Materialtabelle).
- Behandeln Sie Mäuse 9 Wochen lang mit LJZD oder 5-ASS. Fixieren Sie die Mäuse, indem Sie mit der linken Hand die Halshaut der Maus greifen und leicht auf den Experimentiertisch drücken, um die seitliche Dekubitusposition einzunehmen. Schneiden Sie die Schnurrhaare der Mäuse mit einer Schere ab. Schneiden Sie die Schnurrhaare der Mäuse vorsichtig mit einer Schere ab (siehe Materialtabelle), um eine Blutkontamination zu vermeiden.
- Trennung von kolorektalem Gewebe
- Euthanasieren Sie die Mäuse nach der Blutentnahme durch Einatmen von 5% überdosiertem Isofluran und Gebärmutterhalsluxation (siehe Materialtabelle) in Übereinstimmung mit der Tierethik.
- Halten Sie die Mäuse in einer kryogenen anatomischen Umgebung. Immobilisieren Sie die Mäuse in Rückenlage. Schneiden Sie die Unterbauchhaare mit einer Schere ab und sterilisieren Sie sie mit Ethanol.
- Drücken Sie den Schnittpunkt zwischen den beiden Oberschenkelwurzeln und der Bauchmittellinie mit einer Augenlidzange zusammen (siehe Materialtabelle). Schneiden Sie mit einer Schere einen Querschnitt von ca. 1-1,5 cm.
- Schneiden Sie einen Längsschnitt entlang der Mittellinie des Abdomens vom Mittelpunkt des Querschnitts in Richtung des Processus xiphoideus.
- Entfernen Sie das perikolorektale Gewebe in Richtung des Anus, um das Kolorektum vom umgebenden Gewebe zu trennen. Achten Sie darauf, den Darm nicht zu beschädigen.
- Drücken Sie die Haut des Bauches zur Seite, um den Darm vollständig freizulegen. Entfernen Sie den Darm mit einer Augenlidzange aus der Bauchhöhle und schneiden Sie die Segmente vom Anus bis zum Blinddarm ab (ausgenommen). Die Gesamtlänge beträgt ca. 10 cm. Lagern Sie das erhaltene kolorektale Gewebe in Kochsalzlösung bei 4 °C.
- Beurteilung der Länge und des Gewichts des Enddarms
- Extrahieren Sie die Kochsalzlösung bei 4 °C mit einer 5-ml-Nadel (siehe Materialtabelle), um das Innere des Darms zu spülen. Legen Sie dann den Darm auf saugfähiges Papier, um die Feuchtigkeit des Gewebes aufzunehmen.
- Wiegen Sie die kolorektalen Gewebe und legen Sie sie dann auf A4-Papier, um ihre Länge zu messen.
- Messen Sie die Anzahl der Tumoren im Darm
- Schneiden Sie den Darm der Länge nach ab, um ihn vollständig zu entfalten, und beobachten Sie die Anzahl und Größe der Tumoren im Darm.
- Pathologische Analyse des Kolorektums
- Fixieren Sie das Colorectum 24 h lang in 4% Paraformaldehyd. Das fixierte rektale Gewebe in geschmolzenes Paraffin einbetten und kontinuierlich mit einer Dicke von 5 μm durch ein Gewebegefriermikrotom schneiden.
- Nach dem Verfahren von Hou et al.24 werden die Abschnitte in Xylol entwachst und dann mit seriellen Ethanolkonzentrationen dehydriert. Spülen Sie die Abschnitte nach 5 Minuten Färbung mit Hämatoxylinlösung mit reinem Wasser ab. Danach 1 Minute lang mit 0,5% iger Eosinlösung färben (siehe Materialtabelle).
- Führen Sie erneut eine Gradientendehydrierung und eine transparente Xylolbehandlung durch. Versiegeln Sie die Schnitte und betrachten Sie sie unter dem Lichtmikroskop (siehe Materialtabelle) und fotografieren Sie, wie von Xie et al.25 beschrieben.
- Immunhistochemische Analyse des Kolorektums
- Entwachse und dehydriere die Schnitte nach der obigen Methode. Reparieren Sie das Antigen in den Schnitten mit thermischer Hochdruckreparaturtechnik, wie von Gök et al. beschrieben26.
- Die Schnitte 15 min bei Raumtemperatur in endogenen Peroxidaseblockern einweichen. Versiegeln Sie die Abschnitte mit Ziegenserum (siehe Materialtabelle).
- Die primären Antikörper ZO-1 (1:1000), Occludin (1:1000) und KI67 (1:500; siehe Materialtabelle) werden in die Schnitte gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Spülen Sie die Schnitte mit PBS-Puffer (siehe Materialtabelle), fügen Sie Allzweck-Sekundärantikörper (1:5000; siehe Materialtabelle) hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 °C.
- Fügen Sie die DAB-Lösung (siehe Materialtabelle) zu den Abschnitten für die Farbentwicklung hinzu. Färben Sie die Abschnitte mit Hämatoxylinlösung.
- Entwässern, transparentisieren und versiegeln Sie die Abschnitte erneut. Beobachten Sie die Expression von Proteinen mit dem Lichtmikroskop.
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Representative Results
Die Abkochung von LJZD wurde gemäß dem Zusammensetzungsverhältnis der Arzneimittel in Tabelle 1 und der Abkochmethode der TCM in Abbildung 1A hergestellt. Gemäß dem in Abbildung 1B angegebenen Zeitpunkt wurden Mäusen am 7. Tag intraperitoneal 1 mg/ml AOM injiziert, und Mäuse erhielten in der 3., 6. und 9. Woche freien Zugang zu Trinkwasser mit 2% DSS. Das UC-CRC-Mausmodell wurde in der 15. Woche erfolgreich etabliert. In der Zwischenzeit wurden Mäuse von Woche 7 bis Woche 15 mit LJZD durch Sonde behandelt. Die Daten zeigten, dass die UC-CRC-Modellgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe einen signifikanten Gewichtsverlust aufwies, der durch die LJZD-Behandlung gelindert wurde (Abbildung 2A, P < 0,01). Am Ende der Studie verbesserte die LJZD-Behandlung den DAI-Score im Vergleich zur UC-CRC-Modellgruppe (Abbildung 2B). Im Vergleich zur Kontrollgruppe hatte die UC-CRC-Modellgruppe eine kürzere kolorektale Länge, die durch die LJZD-Behandlung erhöht wurde (Abbildung 2C, D, P < 0,01). Das Verhältnis von kolorektalem Gewicht zu Körpergewicht spiegelt die Entwicklung von Darmkrebs bei Mäusen wider, und ein höheres Verhältnis weist auf eine akute Tumorentwicklunghin 27. Im Vergleich zur Kontrollgruppe war der kolorektale Organindex der Modellgruppe signifikant erhöht, und die LJZD-Behandlung reduzierte den kolorektalen Organindex stark (Abbildung 2E, P < 0,05). Darüber hinaus hemmte die LJZD-Behandlung auch die Bildung von kolorektalen Tumoren (Abbildung 2F, P < 0,01) und den Spiegel des proinflammatorischen Faktors IL-628 im Serum (Abbildung 2G, P < 0,05).
Pathologische Ergebnisse bestätigten, dass die Mäuse in der UC-CRC-Modellgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe größere kolorektale Tumoren aufwiesen und ein Adenokarzinom gebildet hatten, während die LJZD-Behandlung die Größe und den Grad der Tumoren reduzierte (Abbildung 3). Immunhistochemische Daten zeigten, dass die LJZD-Behandlung die kolorektale Barrierefunktion in UC-CRC-Modellmäusen verbesserte, was durch eine erhöhte Proteinexpression von ZO-1 und Occludin29 angezeigt wurde (Abbildung 4). Parallel dazu unterdrückte die LJZD-Behandlung die Proteinexpressionsniveaus des Krebsmarkers KI6730 (Abbildung 4).
Abbildung 1: Vorbereitung von LJZD und Etablierung eines Mausmodells für Koloproktitis-Krebs.( A) Die Mischung aus Dangshen (12 g), Baizhu (12 g), Gancao (6 g), Chenpi (12 g) und Ingwer verarbeitetem Ban Xia (9 g) wurde 1 h lang bei Raumtemperatur in 1000 ml destilliertes Wasser getaucht. Das 12 g Fuling-Pulver wurde 1 h lang in 300 ml destilliertem Wasser bei Raumtemperatur eingeweicht. Die Mischung der oben genannten sechs Kräuter wurde bei 100 °C für 40 Minuten abgekocht. (B) An Tag 7 wurden C57BL/6J-Mäusen intraperitoneal 1 mg/ml AOM injiziert. Mäuse erhielten in der 3., 6. und 9. Woche Wasser mit 2% DSS ad libitum. Von 7 bis 15 Wochen erhielten Mäuse LJZD per Sonde. Abkürzungen: AOM, Azomethan; DAI, Krankheitsaktivitätsindex; DSS, Dextransulfat-Natrium; LJZD, Liujunzi Abkochung; w, Woche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bewertung des UC-CRC-Modells und der Wirksamkeit von LJZD. (A) LJZD verbesserte das Körpergewicht in UC-CRC-Modellmäusen. (B) LJZD milderte die DAI-Werte in UC-CRC-Modellmäusen. (C, D) LJZD vergrößerte die Länge des Kolorektums in UC-CRC-Modellmäusen. (E) LJZD reduzierte den Organindex des Kolorektums in UC-CRC-Modellmäusen. (F) LJZD hemmte die kolorektale Tumorgenese in Koloproktitis-Krebsmodellmäusen. (G) LJZD unterdrückte den Serum-IL-6-Spiegel in UC-CRC-Modellmäusen. #P< 0,05 und ##P< 0,01 im Vergleich zur Kontrollgruppe; *P < 0,05 und **P< 0,01 im Vergleich zur Modellgruppe. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichungen (n = 10) ausgedrückt und durch eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) analysiert, gefolgt von Tukeys Test. P < 0,05 zeigte einen statistisch signifikanten Unterschied an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Bewertung der pathologischen Eigenschaften von kolorektalen Geweben bei Mäusen durch Hämatoxylin-Eosin-Färbung. In der Kontrollgruppe gab es keine pathologischen Schäden. Das Tumorgewebe der UC-CRC-Modellgruppe war groß und hatte Adenokarzinome und hochgradige Neoplasien gebildet, während die LJZD-Behandlungsgruppe reduziertes Tumorgewebe aufwies, begleitet von einer geringen Menge an lokalem Adenom und niedriggradiger Neoplasie. Der schwarze Pfeil stellt die präkanzeröse dysplastische Tumordrüse dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Wirkung von LJZD auf die kolorektale Barrierefunktion und den Krebsmarker in UC-CRC-Modellmäusen. (A) Immunhistochemische Bilder von ZO-1, Occludin und KI67. (B) Statistische Ergebnisse der Proteinexpression von ZO-1, Occludin und KI67. Die LJZD-Behandlung erhöhte die Expression der kolorektalen Barrierefunktionsproteine ZO-1 und Occludin, während der Spiegel des Krebsmarkers KI67 in UC-CRC-Modellmäusen gesenkt wurde. ## P < 0,01 im Vergleich zur Kontrollgruppe; ** P < 0,01 im Vergleich zur Modellgruppe. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichungen (n = 10) ausgedrückt und durch eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) analysiert, gefolgt von Tukeys Test. P < 0,05 zeigte einen statistisch signifikanten Unterschied an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Komponenten | Pinyin | Gewicht (g) |
| Codonopsis Radix | Dangshen | 12 |
| Poria Cocos | Fuling | 12 |
| Atractylodis Macrocephalae Rhizoma | Baizhu | 12 |
| Lakritze | Gancao | 6 |
| Getrocknete Orangenschale | Chenpi | 12 |
| Rhizom Pinelliae Preparata | Jiangbanxia | 9 |
Tabelle 1: Zusammensetzung und Anteil der Drogen in LJZD.
| Artikel | Grad oder Symptome | Spielergebnisse |
| Gewichtsverlust | < 1% | 0 |
| 1%-5% | 1 | |
| 5%-10% | 2 | |
| 10%-15% | 3 | |
| ≥15 % | 4 | |
| Tests auf okkultes Blut im Stuhl | Negativ | 0 |
| Positiv | 2 | |
| Sichtbares Blut im Stuhl mit bloßem Auge | 4 | |
| Kot-Konsistenz | normal | 0 |
| loser Stuhl | 2 | |
| wässriger Durchfall | 4 |
Tabelle 2: Krankheitsaktivitätsindex-Score für das UC-CRC-Modell bei Mäusen.
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Discussion
Darmkrebs ist eine der häufigsten Krebsarten weltweit, mit etwa 1.148.000 neuen Fällen und mehr als 576.000 Todesfällen pro Jahr. CRC kann nach unterschiedlichen Ursachen in drei Typen unterteilt werden, darunter erbliche, sporadische und UC-CRC31. Die Inzidenz von Darmkrebs bei Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen wie UC ist deutlich höher als in der Allgemeinbevölkerung. UC stimuliert die Entwicklung von Darmkrebs über den entzündlichen Krebsweg, der sich vom typischen Adenom-Adenokarzinom-Wegunterscheidet 6. Derzeit ist die Ursache von UC-CRC unbekannt, hauptsächlich verursacht durch langfristig wiederkehrende chronische Entzündungen mit einer Mortalitätsrate von bis zu 60%32,33. Es gibt keine wirksame Behandlung für UC-CRC, das in den letzten Jahren der Hotspot der Forschung war. Das Verständnis des molekularen Mechanismus von UC-CRC ist entscheidend für die Früherkennung und präzise Behandlung von UC-CRC.
Derzeit gibt es viele Methoden, um Tiermodelle von UC-CRC zu konstruieren, und die Entstehungsmechanismen sind unterschiedlich. IL-10- oder Muc2/4-Gen-Knockout, der zu Epithelbarrieredefekten führt, kann bei Mäusen eine spontane Kolitis auslösen, daher wird es häufig verwendet, um Tier-Darmkrebsmodelle zu konstruieren, die auf genetischen Defekten basieren, die mit UC assoziiert sind 34,35,36. Dennoch kann das durch Gen-Knockout induzierte Tiermodell von UC-CRC nicht die vollständige Pathogenese der Krankheit simulieren, und seine Arbeitsweise ist komplex, das Experiment ist teuer und hat offensichtliche Einschränkungen. Chemische Induktion ist die klassische und gängige Methode zur Konstruktion von UC-CRC-Tiermodellen37,38. DSS, AOM und Dimethylhydrazin sind häufig verwendete chemische Induktoren für den Aufbau von UC-CRC. Die alleinige Verwendung dieser chemischen Reagenzien zur Erstellung von Tiermodellen dauert jedoch lange und hat eine geringe Erfolgsquote39. Studien haben gezeigt, dass die Inzidenz von UC-CRC, die durch die Kombination von AOM und DSS induziert wird, fast 100 % erreichen kann40. Im Vergleich zu anderen Methoden hat die Kombination von AOM/DSS die Vorteile einer einfachen Bedienung, einer starken Steuerbarkeit, eines kurzen Zyklus und einer hohen Replikationsrate und kann menschliches UC-CRC in Bezug auf Pathologie und molekularen Mechanismus besser simulieren 40,41,42. Obwohl die Verwendung der AOM/DSS-Zyklusstimulation zur Erstellung eines UC-CRC-Modells viele Vorteile hat, hat sie auch die Nachteile einer langen Modellierungszeit, teurer Modellierungsreagenzien und kann die Pathogenese von menschlichem UC-CRC immer noch nicht vollständig simulieren.
Um ein potenzielles therapeutisches Ziel für UC-CRC zu finden, verwendeten wir AOM, ein chemisches Karzinogen, in Kombination mit DSS-induzierten Mäusen, um ein UC-CRC-Modell zu erstellen. In dieser Studie zeigten Mäuse, die AOM und zyklischer Stimulation von DSS ausgesetzt waren, unterschiedliche Grade von UC-CRC-bezogenen Symptomen. Im Vergleich zur Kontrollgruppe war der DAI-Score der Modellgruppe signifikant erhöht, was sich als Gewichtsverlust, Blutstuhl, lockerer Stuhl oder wässriger Durchfall manifestierte. Während LJZD den DAI-Score signifikant reduzierte. Die verkürzte kolorektale Länge ist ein wichtiger Marker für die Entzündungsreaktion bei UC-CRC43,44. In dieser Studie war die Darmlänge der Modellmäuse signifikant kürzer als die der Kontrollgruppe, und LJZD konnte den verkürzten Darm verbessern. Die kolorektale Schleimhaut entwickelt eine chronische Entzündung, die sich allmählich zu einer atypischen Hyperplasie des kolorektalen Gewebes entwickelt und schließlich Krebs verursacht45. In dieser Studie stieg die Anzahl der Tumoren im kolorektalen Gewebe von Mäusen in der Modellgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant an, und entsprechend nahm auch das kolorektale Gewebegewicht zu. Nach der LJZD-Behandlung nahm die Anzahl der Tumoren signifikant ab und das kolorektale Gewicht nahm ab. Es wird vermutet, dass LJZD eine signifikante hemmende Wirkung auf die durch UC induzierte Bildung von CRC hat. Frühere Studien haben gezeigt, dass LJZD Entzündungen lindern und die Expressionsniveaus von TNF-α, IL-6 und IL-1β in vivo reduzieren kann 16,28,46. In dieser Studie war der Serum-IL-6-Spiegel von Mäusen in der Modellgruppe erhöht, aber die Produktion von Serum-IL-6 war nach LJZD-Behandlung signifikant gehemmt.
Die mikroskopische Beobachtung zeigte eine entzündliche Infiltration des Rektalgewebes, eine Zerstörung der Schleimhautbarriere, eine Verringerung der Schleimsekretion, ein unregelmäßiges oder verschwindendes Verschwinden von Becherzellen, eine Verzerrung oder Atrophie der Darmkrypten und eine offensichtliche Störung der Drüsenstruktur bei AOM/DSS-behandelten Mäusen. Nach der LJZD-Behandlung war die Morphologie der Becherzellen im kolorektalen Gewebe normal, die Struktur von Aussparung und Drüse war regelmäßig und die Schädigung der Schleimhautbarriere wurde verbessert. Die epitheliale Tight Junction (TJ) ist eine unverzichtbare mechanische Barriere zur Aufrechterhaltung der Zellintegrität und -permeabilität, zu der hauptsächlich ZO-1 und Occludin29 gehören. Es wurde berichtet, dass die Expression von TJ-Proteinen wie ZO-1 im kolorektalen Gewebe von UC-CRC-Patienten signifikant reduziert ist47,48. Diese Studie zeigte, dass die kolorektale Schleimhautgewebestruktur von UC-CRC-Mäusen zerstört wurde und die Expression von ZO-1 und Occludin im Gewebe abnahm, während LJZD diese Abnahme umkehren konnte, was darauf hindeutet, dass LJZD die Integrität der kolorektalen Schleimhautbarriere schützen kann, indem es die Expression von ZO-1 und Occludin erhöht. Das kernassoziierte Antigen (KI67) ist ein wesentlicher Bestandteil der Zellzyklusregulation und wird häufig als Indikator für die proliferative Aktivität von Tumorzellen verwendet30,49. In dieser Studie war die KI67-Proteinexpression in der Modellgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöht, was auf eine signifikante Tumorzellproliferation im kolorektalen Gewebe hinweist. Nach der LJZD-Behandlung war die Expression des KI67-Proteins verringert, was zeigte, dass LJZD einen guten Effekt auf UC-CRC hatte.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die intraperitoneale AOM-Injektion und die DSS-Kreislaufstimulation in kurzer Zeit effektiv ein UC-CRC-Modell etablieren können und in Bezug auf die Histopathologie und die molekularen Entstehungsmechanismen dem menschlichen UC-CRC ähneln. Als klassische Verschreibung kann LJZD den DAI-Score, das kolorektale Gewebegewicht und den Entzündungsfaktorspiegel reduzieren, die Verkürzung der kolorektalen Länge wirksam hemmen und eine Rolle im Stadium der UC bei UC-CRC-Mäusen spielen. Gleichzeitig kann es die Expression von TJ-Proteinen erhöhen, die pathologische Schädigung des kolorektalen Gewebes signifikant verbessern, die Expression des KI67-Proteins reduzieren, das Auftreten von Gewebetumoren signifikant reduzieren und den Transformationsprozess von UC zu CRC hemmen. Diese Studie liefert eine neue Idee für die Behandlung von UC-CRC.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Jilin Provincial Department of Science and Technology (YDZJ202201ZYTS181) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Azoxymethane | Sigma | A5486 | |
| 5-amino salicylic acid | Kuihua Pharmaceuticals Group Jiamusi Luling Pharmaceutical Co., Ltd | 3819413 | |
| C57BL/6J mice | Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd | NO 210726210100853716 | |
| Cover slip | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 10212432C | |
| DAB color development kit | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 2005289 | |
| Dewatering machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JJ-12J | |
| Dextran sulfate sodium | Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd | MB5535 | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Hematoxylin-eosin dye | Wuhan Hundred Degree Biotechnology Co., Ltd | B1000 | |
| IL-6 | Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd | MM-0163M2 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd | R510-22-10 | |
| KI67 primary antibody | Google Biotechnology Inc | GB121141 | |
| Neutral gum | Wuhan Hundred Degree Biotechnology Co., Ltd | 10004160 | |
| Object slide | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 10212432A | |
| Occludin primary antibody | Affnity | DF7504 | |
| Orthostatic optical microscope | Nikon | Nikon Eclipse CI | |
| Pathological microtome | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | |
| ZO-1 primary antibody | Abcam | ab221547 |
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