Summary
Detta protokoll ger en musmodell av ulcerös koloproktit-associerad kolorektal cancer inducerad av azometan i kombination med dextransulfatnatrium. Modellen användes för att utvärdera effekten av traditionella kinesiska medicinföreningar vid förebyggande och behandling av kolorektal cancer.
Abstract
Kolorektal cancer (CRC) är en vanlig malignitet i matsmältningssystemet och har blivit den tredje vanligaste maligniteten i världen och den näst vanligaste orsaken till malignitetsrelaterad död. Ulcerös kolofroktit (UC) är en förstadier till cancer och UC-associerad CRC (UC-CRC) är den vanligaste subtypen av CRC. Därför är en rimlig UC-CRC-modell hörnstenen och garantin för utveckling av nya läkemedel. Traditionell kinesisk medicin (TCM) har använts i stor utsträckning vid behandling av UC-CRC på grund av dess goda effekt. Liujunzi avkok (LJZD) är ett klassiskt tonic-recept på TCM och har använts i stor utsträckning vid behandling av UC-CRC. I denna studie etablerades en UC-CRC-modell genom att kombinera azometan och dextransulfatnatrium, och LJZD administrerades. Data bekräftade att LJZD effektivt kan hämma cancerövergången i UC-CRC genom att använda musens kroppsvikt, kolorektal längd, patologiska och inflammatoriska faktorer, kolorektal barriärfunktion och cancermarkörer. Detta protokoll tillhandahåller ett system för att utvärdera effekten av TCM vid förebyggande och behandling av UC-CRC.
Introduction
Kolorektal cancer (CRC) är en vanlig gastrointestinal malignitet, den tredje vanligaste maligniteten och den näst vanligaste dödsorsaken i världen, och står för 10 % av den globala cancerincidensen och 9,4 % av den totala cancerrelaterade döden 1,2. Genetiska faktorer, kronisk inflammation, fettrik kost, diabetes och onormal tarmflora är riskfaktorer för CRC 3,4. Bland dem är inflammatorisk tarmsjukdom, särskilt ulcerös koloproktit (UC), en tydlig riskfaktor för CRC 5,6. UC-associerad CRC (UC-CRC) är en övergångsprocess av inflammation, atypisk hyperplasi och cancer baserad på kronisk inflammation i kolorektum, som skiljer sig från den typiska utvecklingsmodellen för adenokarcinom i CRC 7,8. Jämfört med den allmänna befolkningen är risken för CRC cirka 10-40 gånger högre hos patienter med inflammatorisk tarmsjukdom.
För närvarande är kirurgi fortfarande standardbehandlingen för CRC, och beroende på tumörens läge och stadium är strålbehandling, systemisk läkemedelsbehandling eller en kombination av båda möjliga10. Även om dessa traditionella behandlingsmetoder har gjort stora framsteg, på grund av den höga heterogeniteten och återfallsfrekvensen av CRC, är prognosen dålig och behandlingseffekten är inte idealisk11,12. Därför är tidig upptäckt, tidig diagnos och omfattande behandling nyckeln till att förbättra överlevnaden för patienter med tjock- och ändtarmscancer, och det är särskilt viktigt att uppmärksamma omvandlingen av UC till CRC. Under årens lopp har traditionell kinesisk medicin (TCM) väckt stor uppmärksamhet vid behandling av UC-CRC eller kronisk gastrit på grund av dess begränsade biverkningar och betydande effekt. Baserat på dialektisk behandling har kända utövare av kinesisk medicin i olika generationer skapat ett stort antal klassiska recept, såsom Huangqi Jianzhong avkok13, Sijunzi avkok14 och Sishen piller15.
Liujunzi-avkoket (LJZD) härstammar från Yi Xue Zheng Zhuans verk som sammanställdes under Mingdynastin och är ett klassiskt recept i TCM16. Som framgår av tabell 1 består LJZD av sex traditionella örter, inklusive Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf. (Dangshen), Poria cocos (Schw.) Varg (Fuling), Atractylodes macrocephala Koidz. (Baizhu), Glycyrrhiza uralensis Fisch. (Gancao), Citrus reticulata Blanco (Chenpi) och Pinellia ternata (Thunb.) Breit (Banxia), som har effekten att fylla på qi och stärka mjälten, torka fukt och lösa upp slem. I modern klinisk praxis används det ofta för att behandla kronisk gastrit, magsår och sår i tolvfingertarmen. Modern farmakologisk forskning har visat att LJZD och modifierad LJZD har högt appliceringsvärde vid adjuvant behandling av UC och mag-tarmcancer 17,18,19.
För närvarande finns det många sätt att konstruera UC-CRC-musmodeller, men den azoximetan (AOM)/dextransulfatnatrium (DSS) inducerade musmodellen är den mest använda UC-CRC-modellen; de kliniska symtomen, morfologiska och patologiska observationer har visat att modellen är mycket lik human UC-CRC20,21. Grundprincipen är att först inducera carcinogenes med kemiskt cancerframkallande AOM och sedan kontinuerligt exponera möss för den inflammatoriska stimuleringsmiljön av DSS för att simulera kontinuerlig skada och reparation av tarmslemhinneepitel, och därigenom konstruera en UC-CRC-musmodell22. Syftet med denna studie är att etablera en musmodell av UC-CRC genom intraperitoneal injektion av AOM och cyklisk stimulering av DSS på kort sikt och att utvärdera effekten av läkemedlet och den molekylära mekanismen av LJZD på UC-CRC för att ge en vetenskaplig grund för behandling av UC-CRC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsöket har godkänts av den etiska kommittén vid Changchun University of Chinese Medicine (diarienummer: 2021214). Specifika patogenfria C57BL/6J-möss (8–10 veckor, vikt 18–22 g), han- och honmöss, hölls i oberoende ventilerade burar vid 22 °C och 65 % relativ luftfuktighet. Mössen påbörjade experimentet efter 7 dagars adaptiv utfodring, under vilken de hade fri tillgång till vatten och kost.
1. Beredning av läkemedel
- Beredning av LJZD
OBS: Den kinesiska medicinen som användes köptes från Affiliated Hospital of Changchun University of Chinese Medicine och identifierades som äkta kinesisk medicin (se tabell 1).- Lägg Dangshen (12 g), Baizhu (12 g), Gancao (6 g), Chenpi (12 g), Jiangbanxia (9 g) i en specialiserad keramisk kruka (se Materialförteckning). Tillsätt 1000 ml destillerat vatten och blötlägg i rumstemperatur i 1 timme (se figur 1A).
- Pulver 12 g Fyll i fint pulver med en kvarn och blötlägg i 300 ml destillerat vatten i en annan behållare i 1 timme i rumstemperatur.
- Blanda ovanstående kinesiska medicin i den specialiserade keramiska grytan. Koka blandningen och låt den sedan stå på medelvärme tills endast 300 ml avkok återstår. Använd medicinsk gasväv för filtrering och bevara filtratet vid rumstemperatur.
- Tillsätt 1000 ml destillerat vatten och upprepa ovanstående avkok en gång till. Filtrera igen med medicinsk gasbinda. Blanda filtratet och koka det tills endast 150 ml återstår.
- Centrifugera den koncentrerade vätskan vid 10 000 x g i 5 minuter och koncentrera den erhållna supernatanten ytterligare till 30 ml på medelvärme. Överför det slutliga koncentratet till en skål och torka det med en elektrisk torkugn tills endast det lösta ämnet återstår som ett pulver.
- Väg ovanstående fasta ämne och lös upp det i sterilt destillerat vatten för att få en lösning som innehåller 22,85 mg läkemedel per 0,2 ml (114,16 mg/ml), vilket är den dagliga dosen för möss.
- Beredning av 5-aminosalicylsyra
OBS: 5-aminosalicylsyra (5-ASA; se Materialförteckning) har en god förebyggande effekt på UC-CRC, och det användes som ett positivt läkemedel i denna studie23.- Lös upp 64 mg 5-ASA-pulver i 200 ml sterilt destillerat vatten för att erhålla 1,82 mg/ml 5-ASA-lösning. Den dagliga dosen för en mus var 0,2 ml.
- Beredning av AOM-injektionslösning
- Tillsätt 2,5 ml sterilt destillerat vatten till 25 mg AOM-pulver (se materialtabell) och blanda med virvelblandare (se materialtabell) för att göra 10 mg/ml AOM-stamlösning, förvara vid -20 °C fram till användning.
- Bered AOM-injektionslösningen genom att späda AOM-stamlösningen med sterilt destillerat vatten vid 10:1 (1 mg/ml).
2. Etablering av UC-CRC-modellen
OBS: Experimentet delades in i 4 grupper: kontroll-, modell-, LJZD- och 5-ASA-gruppen, 10 möss i varje grupp. Förutom kontrollgruppen behandlades de andra grupperna med AOM och DSS.
- Intraperitoneal injektion av AOM-injektionslösning
OBS: Efter adaptiv utfodring i 7 dagar fick mössen AOM-injektionslösning (1 mg/ml) genom intraperitoneal injektion (se figur 1B).- Håll musen med magen uppåt och huvudet något nedåt. Ta tag i rygghuden för att strama åt bukhuden och stick hål i huden cirka 1 cm till höger om skärningspunkten mellan rotlinjen på båda låren på mitten av buklinjen med en 1 ml spruta (se materialtabell).
- Skjut in 1 ml sprutkanylen till ett avstånd av 3-5 mm under huden, håll den parallell med bukens mittlinje, och stick in nålen 0,3-0,5 mm i bukhålan i 45°.
- Efter att spetsen passerat genom magmuskeln känner operatören en plötslig förlust av motstånd. Dra sedan sprutan utåt och bakåt för att observera om vätska sipprar ut. Om inte, tryck långsamt in AOM-injektionslösningen i mössen med 0,1 ml/10 g.
- Cyklisk stimulering av 2% DSS-lösning
OBS: Varje AOM-inducerad mus fick 500 ml DSS-lösning vid vecka 3, 6 och 9, och mössen drack fritt under denna period.- Bered 2 % DSS-lösning genom att tillsätta 500 ml sterilt destillerat vatten till 10 g DSS (se materialtabell). Blanda med en virvelblandare och förvara vid 4 °C fram till användning.
- Varje AOM-inducerad mus dricker 500 ml 2 % DSS-lösning fritt i 7 dagar på vecka 3, 6 och 9 efter AOM-induktion.
3. Missbruksbehandling
OBS: Vuxna människor behöver 63 g LJZD per dag. Enligt omvandlingsformeln för experimentell läkemedelsdos från mus och människa, ekvivalent experimentell dos för möss (mg/kg) = human dos (mg/kg)/kroppsvikt (60 kg) x 9,1, var den dagliga dosen för möss cirka 9,6 g/kg.
- Behandla LJZD- och 5-ASA-gruppen med 0,1 ml/10 g av den beredda LJZD- och 5-ASA-lösningen genom gastrisk sondmatning vid vecka 7 respektive vecka 15.
- För intragastrisk administrering till möss, utför följande procedur. Håll musen i vänster hand och håll magperfusionsapparaten i höger hand. Stick in sprutnålen i munnen och skjut den längs bakväggen på mössens svalg. Glid nerför svalget när mössen sväljer och fortsätt framåt. När det fanns en känsla av motstånd och sprutan kunde tryckas in i svalget, dra ut nålen och avsluta injektionen.
- Behandla kontroll- och modellgruppen med samma mängd saltlösning (se materialförteckning).
- Behandla mössen i varje grupp med lämpligt läkemedel en gång om dagen vid samma tidpunkt under administreringsperioden.
4. Utvärdering av UC-CRC-modellen och effekten av LJZD
- Index för sjukdomsaktivitet
OBS: Enligt tabell 2 utvärderades sjukdomsaktivitetsindex (DAI) genom att kombinera viktminskning, fekal viskositet och avföringsblödning hos mössen.- Anteckna mössens vikt dagligen från början av adaptiv utfodring till slutet av läkemedelsbehandlingen.
- Observera avföringskonsistensen hos varje experimentell mus noggrant och registrera tarmrörelserna som ett av de tre tillstånden: normal, lös avföring och vattnig diarré.
- Registrera avföringsblödning hos försöksdjur som ett av de tre tillstånden: ingen blödning, liten blödning och synligt blod i avföringen.
- Påvisande av IL-6-nivå i serum
- Behandla möss med LJZD eller 5-ASA i 9 veckor. Fixera mössen genom att ta tag i musens nackhud med vänster hand och försiktigt trycka på experimentbordet för att inta den laterala decubituspositionen. Klipp av morrhåren på mössen med en sax. Klipp försiktigt av morrhåren på mössen med en sax (se materialtabell) för att förhindra blodkontaminering.
OBS: Möss som inte kunde vicka fritt ansågs vara ordentligt fixerade. Om detta inte sker bör mössen fixas. - Bedöva musen genom inhalation av 2% isofluran. Sterilisera huden runt ögongloben med etanol (se materialförteckning). Tryck försiktigt på ögonhuden på sidan för att göra ögongloben överbelastad och utskjutande.
- Kläm fast ögongloben med en armbågspincett och ta bort ögongloberna exakt och snabbt. Låt blodet droppa ner i centrifugalröret (se materialförteckning). Tryck på musens hjärta för att påskynda blodinsamlingen.
- Förvara det uppsamlade blodet i rumstemperatur i 30 minuter och centrifugera det vid 3 500 x g i 10 minuter. Samla upp supernatanten och detektera IL-6-nivån enligt instruktionerna för IL-6-innehållsdetekteringssatsen (se materialförteckning).
- Behandla möss med LJZD eller 5-ASA i 9 veckor. Fixera mössen genom att ta tag i musens nackhud med vänster hand och försiktigt trycka på experimentbordet för att inta den laterala decubituspositionen. Klipp av morrhåren på mössen med en sax. Klipp försiktigt av morrhåren på mössen med en sax (se materialtabell) för att förhindra blodkontaminering.
- Separering av kolorektal vävnad
- Avliva mössen efter blodprovstagning genom inhalation av 5 % överdoserat isofluran och cervikal luxation (se Materialförteckning) i enlighet med djuretik.
- Förvara mössen i en kryogen anatomisk miljö. Immobilisera mössen i ryggläge. Klipp av håret i nedre delen av buken med en sax och sterilisera det med etanol.
- Nyp ihop skärningspunkten mellan de två lårrötterna och bukens mittlinje med en ögonlockstång (se materialtabell). Klipp ett tvärsnitt ca 1-1,5 cm med en sax.
- Klipp ett längsgående snitt längs bukens medianlinje från mittpunkten av det tvärgående snittet mot xiphoidprocessen.
- Ta bort de perikolorektala vävnaderna i riktning mot anus för att separera kolorektum från den omgivande vävnaden. Var försiktig så att du inte skadar kolorektum.
- Skjut huden på buken åt sidorna för att helt exponera kolorektum. Ta bort kolorektum från bukhålan med en ögonlockstång och skär av segmenten från anus till blindtarmen (uteslutande); Den totala längden är ca 10 cm. Förvara den erhållna kolorektala vävnaden i koksaltlösning vid 4 °C.
- Utvärdering av ändtarmens längd och vikt
- Extrahera koksaltlösningen vid 4 °C med en 5 ml nål (se materialtabell) för att spola insidan av kolorektum. Placera sedan kolorektum på absorberande papper för att absorbera fukten i vävnaden.
- Väg kolorektala vävnader och lägg dem sedan på A4-papper för att mäta deras längd.
- Mät antalet tumörer i kolorektum
- Klipp kolorektum på längden för att veckla ut det helt och observera antalet och storleken på tumörerna i kolorektum.
- Patologisk analys av kolorektum
- Fixera kolorektum i 4% paraformaldehyd i 24 timmar. Bädda in den fixerade rektala vävnaden i smält paraffin och snitta kontinuerligt med en tjocklek av 5 μm med en vävnadsfrysande mikrotom.
- Enligt proceduren i Hou et al.24, avvaxa sektionerna i xylen och dehydrera den sedan med seriekoncentrationer av etanol. Efter färgning med hematoxylinlösning i 5 min, skölj sektionerna med rent vatten. Färga sedan med 0,5 % eosinlösning i 1 minut (se materialförteckning).
- Utför gradientdehydrering och xylen transparent behandling igen. Försegla sektionerna och observera dem under det optiska mikroskopet (se materialtabell) och fotografi, enligt beskrivningen av Xie et al.25.
- Immunhistokemisk analys av kolorektum
- Avvaxa och torka sektionerna enligt ovanstående metod. Reparera antigenet i sektionerna med termisk högtrycksreparationsteknik, enligt beskrivningen av Gok et al.26.
- Blötlägg sektionerna i endogena peroxidasblockerare i rumstemperatur i 15 min. Försegla sektionerna med getserum (se materialförteckning).
- Tillsätt primärantikropparna ZO-1 (1:1000), Occludin (1:1000) och KI67 (1:500; se materialtabell) till snitten och inkubera över natten vid 4 °C. Skölj sektionerna med PBS-buffert (se materialförteckning), tillsätt sekundär antikropp för allmänt bruk (1:5000; se materialtabell) till den och inkubera vid 37 °C i 30 min.
- Lägg till DAB-lösningen (se Materialförteckning) i avsnitten för färgutveckling. Motfärga sektionerna med hematoxylinlösning.
- Torka, genomskinliga och försegla sektionerna igen. Observera uttrycket av protein med det optiska mikroskopet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Avkoket av LJZD bereddes enligt sammansättningsförhållandet för läkemedel i tabell 1 och avkoksmetoden för TCM i figur 1A. Enligt den tidpunkt som anges i figur 1B injicerades möss intraperitonealt med 1 mg/ml AOM den 7:e dagen, och möss fick fri tillgång till dricksvatten innehållande 2 % DSS under den 3:e, 6:e och 9:e veckan. UC-CRC-musmodellen etablerades framgångsrikt under den 15:e veckan. Under tiden behandlades möss med LJZD genom sondmatning från vecka 7 till vecka 15. Data visade att jämfört med kontrollgruppen hade UC-CRC-modellgruppen en signifikant viktminskning, vilket lindrades av LJZD-behandling (Figur 2A, P < 0,01). I slutet av studien förbättrade LJZD-behandlingen DAI-poängen jämfört med UC-CRC-modellgruppen (Figur 2B). Jämfört med kontrollgruppen hade UC-CRC-modellgruppen en kortare kolorektal längd, som ökade med LJZD-behandling (Figur 2C,D, P < 0,01). Förhållandet mellan kolorektal vikt och kroppsvikt återspeglar utvecklingen av CRC hos möss, och ett högre förhållande indikerar akut tumörutveckling27. Jämfört med kontrollgruppen ökade modellgruppens kolorektala organindex signifikant, och LJZD-behandling minskade kolorektalorganindexet kraftigt (Figur 2E, P < 0,05). Dessutom hämmade LJZD-behandling också bildandet av kolorektala tumörer (Figur 2F, P < 0,01) och nivån av proinflammatorisk faktor IL-628 i serum (Figur 2G, P < 0,05).
Patologiska resultat bekräftade att jämfört med kontrollgruppen hade mössen i UC-CRC-modellgruppen större kolorektala tumörer och hade bildat adenokarcinom, medan LJZD-behandling minskade tumörernas storlek och grad (Figur 3). Immunhistokemiska data visade att LJZD-behandling förbättrade kolorektal barriärfunktion hos UC-CRC-modellmöss, vilket indikeras av förhöjt proteinuttryck av ZO-1 och Occludin29 (Figur 4). Parallellt undertryckte LJZD-behandling proteinuttrycksnivåerna av cancermarkören KI6730 (Figur 4).
Figur 1: Beredning av LJZD och etablering av en musmodell av koloproktitcancer.( A) Blandningen av Dangshen (12 g), Baizhu (12 g), Gancao (6 g), Chenpi (12 g) och ingefärsbearbetad Ban Xia (9 g) sänktes ner i 1000 ml destillerat vatten vid rumstemperatur i 1 timme. Fulingpulvret på 12 g blötlades i 300 ml destillerat vatten i rumstemperatur i 1 timme. Blandningen av ovanstående sex örter avkokades vid 100 °C i 40 minuter. (B) På dag 7 injicerades C57BL/6J-möss intraperitonealt med 1 mg/ml AOM. Möss fick vatten innehållande 2 % DSS ad libitum under den 3:e, 6:e och 9:e veckan. Från 7 till 15 veckor fick mössen LJZD genom sondmatning. Förkortningar: AOM, azometan; DAI, sjukdomsaktivitetsindex; DSS, dextransulfatnatrium; LJZD, Liujunzi Avkok; v, vecka. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Utvärdering av UC-CRC-modellen och effekten av LJZD. (A) LJZD förbättrade kroppsvikten hos möss av UC-CRC-modell. (B) LJZD lindrade DAI-poängen hos UC-CRC-modellmöss. (C, D) LJZD ökade längden på kolorektum hos möss av UC-CRC-modell. (E) LJZD minskade organindexet för kolorektum hos UC-CRC-modellmöss. (F) LJZD hämmade kolorektal tumörgenes hos koloproktitcancermodellmöss. (G) LJZD-hämmad serumnivå av IL-6 hos UC-CRC-modellmöss. #P< 0,05 och ##P< 0,01, jämfört med kontrollgruppen; *P < 0,05 och **P< 0,01, jämfört med modellgruppen. Data uttrycktes som medelvärdet ± standardavvikelser (n=10) och analyserades med envägsanalys av varians (ANOVA) följt av Tukeys test. P < 0,05 indikerade en statistiskt signifikant skillnad. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Utvärdering av de patologiska egenskaperna hos kolorektala vävnader hos möss genom hematoxylin-eosinfärgning. Det fanns inga patologiska skador i kontrollgruppen. Tumörvävnaden i UC-CRC-modellgruppen var stor och hade bildat adenokarcinom och höggradig neoplasi, medan LJZD-behandlingsgruppen hade reducerad tumörvävnad åtföljd av en liten mängd lokalt adenom och låggradig neoplasi. Den svarta pilen representerar den precancerösa dysplastiska tumörkörteln. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Effekt av LJZD på kolorektal barriärfunktion och cancermarkör i UC-CRC-modellmöss. (A) Immunhistokemiska bilder av ZO-1, Occludin och KI67. (B) Statistiska resultat av proteinuttryck av ZO-1, Occludin och KI67. LJZD-behandling ökade uttrycket av kolorektala barriärfunktionella proteiner ZO-1 och Occludin, medan nivån av cancermarkören KI67 minskade i UC-CRC-modellmöss. ## P < 0,01, jämfört med kontrollgruppen; ** P < 0,01 jämfört med modellgruppen. Data uttrycktes som medelvärdet ± standardavvikelser (n=10) och analyserades med envägsanalys av varians (ANOVA) följt av Tukeys test. P < 0,05 indikerade en statistiskt signifikant skillnad. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Komponenter | Pinyin | Vikt (g) |
| Codonopsis Radix | Dangshen (Dangshen) | 12 |
| Poria cocos | Fuling | 12 |
| Atractylodis macrocephalae Rhizom | Baizhu Baizhu | 12 |
| Lakrits | Gancao Gancao | 6 |
| Torkat apelsinskal | Chenpi Chenpi | 12 |
| Rhizome Pinelliae Preparata | Jiangbanxia Jiangbanxia | 9 |
Tabell 1: Sammansättning och andel läkemedel i LJZD.
| Objekt | Grad eller symtom | Noter |
| Viktminskning | < 1 % | 0 |
| 1%-5% | 1 | |
| 5%-10% | 2 | |
| 10%-15% | 3 | |
| ≥15% | 4 | |
| Ockult blodprov i avföringen | Negativ | 0 |
| Positiv | 2 | |
| synligt blod i avföringen med blotta ögat | 4 | |
| Fekal konsistens | normal | 0 |
| lös avföring | 2 | |
| vattnig diarré | 4 |
Tabell 2: Index för sjukdomsaktivitet för UC-CRC-modellen hos möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRC är en av de vanligaste cancerformerna i världen, med cirka 1 148 000 nya fall och mer än 576 000 dödsfall varje år. CRC kan delas in i tre typer beroende på olika orsaker, bland annat ärftlig, sporadisk och UC-CRC31. Incidensen av tjock- och ändtarmscancer hos patienter med inflammatoriska tarmsjukdomar som ulcerös kolit är betydligt högre än i den allmänna befolkningen. UC stimulerar utvecklingen av CRC genom den inflammatoriska cancervägen, som skiljer sig från den typiska adenom-adenokarcinomvägen6. För närvarande är orsaken till UC-CRC okänd, främst orsakad av långvarig återkommande kronisk inflammation, med en dödlighet på upp till 60%32,33. Det finns ingen effektiv behandling för UC-CRC, som har varit en hotspot för forskning de senaste åren. Att förstå den molekylära mekanismen för UC-CRC är avgörande för tidig upptäckt och exakt behandling av UC-CRC.
För närvarande finns det många metoder för att konstruera djurmodeller av UC-CRC, och bildningsmekanismerna är olika. IL-10 eller Muc2/4-genknockout, som resulterar i epitelbarriärdefekter, kan inducera spontan kolit hos möss, så det används ofta för att konstruera djurs CRC-modeller baserade på genetiska defekter associerade med UC 34,35,36. Djurmodellen av UC-CRC inducerad av genknockout kan dock inte simulera sjukdomens fullständiga patogenes, och dess operationsmetod är komplex, experimentet är dyrt och det har uppenbara begränsningar. Kemisk induktion är den klassiska och vanliga metoden för att konstruera UC-CRC-djurmodeller 37,38. DSS, AOM och dimetylhydrazin är alla vanliga kemiska inducerare för konstruktion av UC-CRC. Att använda dessa kemiska reagenser ensamma för att upprätta djurmodeller tar dock lång tid och har en låg framgångsfrekvens39. Studier har visat att incidensen av UC-CRC inducerad av kombinationen av AOM och DSS kan uppgå till nästan 100 %40. Jämfört med andra metoder har kombinationen av AOM/DSS fördelarna med enkel drift, stark styrbarhet, kort cykel och hög replikeringshastighet, och kan bättre simulera mänsklig UC-CRC när det gäller patologi och molekylär mekanism 40,41,42. Även om användningen av AOM/DSS-cykelstimulering för att konstruera UC-CRC-modellen har många fördelar, har den också nackdelarna med lång modelleringstid, dyra modelleringsreagenser och kan fortfarande inte fullt ut simulera patogenesen av mänsklig UC-CRC.
För att hitta ett potentiellt terapeutiskt mål för UC-CRC använde vi AOM, ett kemiskt cancerframkallande ämne, i kombination med DSS-inducerade möss för att etablera en UC-CRC-modell. I denna studie visade möss som exponerats för AOM och cyklisk stimulering av DSS varierande grad av UC-CRC-relaterade symtom. Jämfört med kontrollgruppen ökade DAI-poängen för modellgruppen signifikant, vilket manifesterades som viktminskning, blodavföring, lös avföring eller vattnig diarré. Medan LJZD minskade DAI-poängen avsevärt. Förkortad kolorektumlängd är en viktig markör för inflammatoriskt svar vid UC-CRC43,44. I denna studie var kolorektumlängden hos modellmössen signifikant kortare än hos kontrollgruppen, och LJZD kunde förbättra den förkortade kolorektumen. Den kolorektala slemhinnan utvecklar kronisk inflammation, som gradvis utvecklas till atypisk hyperplasi av kolorektal vävnad och så småningom orsakar cancer45. I denna studie ökade antalet tumörer i kolorektalvävnaden hos möss i modellgruppen signifikant jämfört med kontrollgruppen, och på motsvarande sätt ökade även kolorektalvävnadens vikt. Efter behandling med LJZD minskade antalet tumörer signifikant och kolorektalvikten minskade. Det har föreslagits att LJZD har en signifikant hämmande effekt på bildandet av CRC inducerad av UC. Tidigare studier har visat att LJZD kan lindra inflammation och minska uttrycksnivåerna av TNF-α, IL-6 och IL-1β in vivo 16,28,46. I denna studie var serumnivån av IL-6 hos möss i modellgruppen förhöjd, men produktionen av serum IL-6 hämmades signifikant efter LJZD-behandling.
Mikroskopisk observation visade inflammatorisk infiltration av rektal vävnad, förstörelse av slemhinnebarriären, minskning av slemutsöndring, oregelbunden eller försvinnande av bägarceller, förvrängning eller atrofi av tarmkryptor och uppenbar störning av körtelstrukturen hos AOM/DSS-behandlade möss. Efter LJZD-behandling var bägarcellernas morfologi i kolorektal vävnad normal, strukturen i fördjupning och körtel var regelbunden och skadorna på slemhinnebarriären förbättrades. Epitelial tight junction (TJ) är en oumbärlig mekanisk barriär för att upprätthålla cellintegritet och permeabilitet, främst inklusive ZO-1 och Occludin29. Det har rapporterats att uttrycket av TJ-proteiner såsom ZO-1 i kolorektal vävnad hos UC-CRC-patienter är signifikant reducerat47,48. Denna studie visade att den kolorektala slemhinnevävnadsstrukturen hos UC-CRC-möss förstördes, och uttrycket av ZO-1 och Occludin i vävnaden minskade, medan LJZD kunde vända denna minskning, vilket tyder på att LJZD kan skydda integriteten hos den kolorektala slemhinnebarriären genom att öka uttrycket av ZO-1 och Occludin. Nukleärt associerat antigen (KI67) är en viktig komponent i cellcykelregleringen och används ofta som en indikator på proliferativ aktivitet hos tumörceller30,49. I denna studie ökade KI67-proteinuttrycket i modellgruppen jämfört med kontrollgruppen, vilket tyder på signifikant tumörcellsproliferation i kolorektal vävnad. Efter LJZD-behandling minskade uttrycket av KI67-proteinet, vilket visade att LJZD hade god effekt på UC-CRC.
Sammanfattningsvis kan AOM intraperitoneal injektion och DSS-cirkulationsstimulering effektivt etablera en UC-CRC-modell på kort tid och liknar human UC-CRC när det gäller histopatologi och molekylära bildningsmekanismer. Som ett klassiskt recept kan LJZD minska DAI-poängen, kolorektal vävnadsvikt och inflammatoriska faktornivåer, effektivt hämma förkortningen av kolorektal längd och spela en roll i stadiet av UC hos UC-CRC-möss. Samtidigt kan det öka uttrycket av TJ-proteiner, avsevärt förbättra den patologiska skadan av kolorektal vävnad, minska uttrycket av KI67-protein, avsevärt minska förekomsten av vävnadstumörer och hämma omvandlingsprocessen av UC till CRC. Denna studie ger en ny idé för behandling av UC-CRC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Jilin Provincial Department of Science and Technology (YDZJ202201ZYTS181).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Azoxymethane | Sigma | A5486 | |
| 5-amino salicylic acid | Kuihua Pharmaceuticals Group Jiamusi Luling Pharmaceutical Co., Ltd | 3819413 | |
| C57BL/6J mice | Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd | NO 210726210100853716 | |
| Cover slip | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 10212432C | |
| DAB color development kit | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 2005289 | |
| Dewatering machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JJ-12J | |
| Dextran sulfate sodium | Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd | MB5535 | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Hematoxylin-eosin dye | Wuhan Hundred Degree Biotechnology Co., Ltd | B1000 | |
| IL-6 | Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd | MM-0163M2 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd | R510-22-10 | |
| KI67 primary antibody | Google Biotechnology Inc | GB121141 | |
| Neutral gum | Wuhan Hundred Degree Biotechnology Co., Ltd | 10004160 | |
| Object slide | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 10212432A | |
| Occludin primary antibody | Affnity | DF7504 | |
| Orthostatic optical microscope | Nikon | Nikon Eclipse CI | |
| Pathological microtome | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | |
| ZO-1 primary antibody | Abcam | ab221547 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
- Tsai, K. Y., et al. Novel heavily fucosylated glycans as a promising therapeutic target in colorectal cancer. J Transl Med. 21 (1), 505 (2023).
- Chen, X., et al. Smoking, genetic predisposition, and colorectal cancer risk. Clin Transl Gastroenterol. 12 (3), e00317 (2021).
- Keum, N., Giovannucci, E. Global burden of colorectal cancer: emerging trends, risk factors and prevention strategies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (12), 713-732 (2019).
- Sninsky, J. A., Shore, B. M., Lupu, G. V., Crockett, S. D. Risk factors for colorectal polyps and cancer. Gastrointest Endosc Clin N Am. 32 (2), 195-213 (2022).
- Rivera, A. P., et al. Ulcerative colitis-induced colorectal carcinoma: A deleterious concatenation. Cureus. 14 (2), e22636 (2022).
- Faye, A. S., Holmer, A. K., Axelrad, J. E.
- Becker, W. R., et al. Single-cell analyses define a continuum of cell state and composition changes in the malignant transformation of polyps to colorectal cancer. Nat Genet. 54 (7), 985-995 (2022).
- Choi, J. K., Kim, D. W., Shin, S. Y., Park, E. C., Kang, J. G. Effect of ulcerative colitis on incidence of colorectal cancer: Results from the nationwide population-based cohort study (2003-2013). J Cancer. 7 (6), 681-686 (2016).
- Gallo, G., Kotze, P. G., Spinelli, A. Surgery in ulcerative colitis: When? How. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 32-33, 71-78 (2018).
- Shah, S. C., Itzkowitz, S. H. Colorectal cancer in inflammatory bowel disease: Mechanisms and management. Gastroenterology. 162 (3), 715.e3-730.e3 (2022).
- Fabregas, J. C., Ramnaraign, B., George, T. J. Clinical updates for colon cancer care in 2022. Clin Colorectal Cancer. 21 (3), 198-203 (2022).
- Hu, J., et al. Pharmacological and molecular analysis of the effects of Huangqi Jianzhong decoction on proliferation and apoptosis in GES-1 cells infected with H. pylori.Front Pharmacol. 13, 1009705 (2022).
- Shang, L., et al. Mechanism of Sijunzi decoction in the treatment of colorectal cancer based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 302 (Pt A), 115876 (2023).
- Zhang, X. Y., et al. Sishen pill maintained colonic mucosal barrier integrity to treat ulcerative colitis via Rho/ROCK signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 5536679 (2021).
- Wu, X., Dai, Y., Nie, K. Research progress of Liujunzi decoction in the treatment of tumor-associated anorexia. Drug Des Devel Ther. 16, 1731-1741 (2022).
- Han, Y., et al. Liujunzi decoction exerts potent antitumor activity in oesophageal squamous cell carcinoma by inhibiting miR-34a/STAT3/IL-6R feedback loop and modifies antitumor immunity. Phytomedicine. 111, 154672 (2023).
- Chen, D., Zhao, J., Cong, W. Chinese herbal medicines facilitate the control of chemotherapy-induced side effects in colorectal cancer: Progress and perspective. Front Pharmacol. 9, 1442 (2018).
- Wang, M., Wang, S., Su, Q., Ma, T. Effect of combining early chemotherapy with Zhipu Liujunzi decoction under the concept of strengthening and consolidating body resistance for gastric cancer patients and nursing strategy. Contrast Media Mol Imaging. 2021, 2135924 (2021).
- Lin, Y., Koumba, M. H., Qu, S., Wang, D., Lin, L. Blocking NFATc3 ameliorates azoxymethane/dextran sulfate sodium induced colitis-associated colorectal cancer in mice via the inhibition of inflammatory responses and epithelial-mesenchymal transition. Cell Signal. 74, 109707 (2020).
- Yu, C. T., et al. Identification of significant modules and targets of Xian-Lian-Jie-Du decoction based on the analysis of transcriptomics, proteomics and single-cell transcriptomics in colorectal tumor. J Inflamm Res. 15, 1483-1499 (2022).
- Lin, L., Wang, D., Qu, S., Zhao, H., Lin, Y. miR-370-3p alleviates ulcerative colitis-related colorectal cancer in mice through inhibiting the inflammatory response and epithelial-mesenchymal transition. Drug Des Devel Ther. 14, 1127-1141 (2020).
- Qiu, X., Ma, J., Wang, K., Zhang, H. Chemopreventive effects of 5-aminosalicylic acid on inflammatory bowel disease-associated colorectal cancer and dysplasia: a systematic review with meta-analysis. Oncotarget. 8 (1), 1031-1045 (2017).
- Hou, Y., et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. J Ethnopharmacol. 249, 112426 (2020).
- Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
- Gok, A., et al. Role of reduced Bdnf expression in novel Apc mutant allele-induced intestinal and colonic tumorigenesis in mice. In Vivo. 37 (4), 1562-1575 (2023).
- Lin, Y., et al. Pou3f1 mediates the effect of Nfatc3 on ulcerative colitis-associated colorectal cancer by regulating inflammation. Cell Mol Biol Lett. 27 (1), 75 (2022).
- Xu, W., Zhao, R., Yuan, B. The therapeutic effect of traditional LiuJunZi decoction on ovalbumin-induced asthma in Balb/C mice. Can Respir J. 2021, 6406295 (2021).
- Kaihara, T., et al. Redifferentiation and ZO-1 reexpression in liver-metastasized colorectal cancer: possible association with epidermal growth factor receptor-induced tyrosine phosphorylation of ZO-1. Cancer Sci. 94 (2), 166-172 (2003).
- Lei, H. T., et al. Ki67 testing in the clinical management of patients with non-metastatic colorectal cancer: Detecting the optimal cut-off value based on the restricted cubic spline model. Oncol Lett. 24 (6), 420 (2022).
- Olén, O., et al. Colorectal cancer in ulcerative colitis: a Scandinavian population-based cohort study. Lancet. 395 (10218), 123-131 (2020).
- Arnold, M., et al. Global patterns and trends in colorectal cancer incidence and mortality. Gut. 66 (4), 683-691 (2017).
- Biller, L. H., Schrag, D. Diagnosis and treatment of metastatic colorectal cancer: A review. Jama. 325 (7), 669-685 (2021).
- Talero, E., et al. Expression patterns of sirtuin 1-AMPK-autophagy pathway in chronic colitis and inflammation-associated colon neoplasia in IL-10-deficient mice. Int Immunopharmacol. 35, 248-256 (2016).
- Qian, Z., et al. Mulberry fruit prevents LPS-induced NF-κB/pERK/MAPK signals in macrophages and suppresses acute colitis and colorectal tumorigenesis in mice. Sci Rep. 5, 17348 (2015).
- Pothuraju, R., et al. Depletion of transmembrane mucin 4 (Muc4) alters intestinal homeostasis in a genetically engineered mouse model of colorectal cancer. Aging. 14 (5), 2025-2046 (2022).
- Perše, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
- Zeng, B., et al. Dextran sodium sulfate potentiates NLRP3 inflammasome activation by modulating the KCa3.1 potassium channel in a mouse model of colitis. Cell Mol Immunol. 19 (8), 925-943 (2022).
- Parang, B., Barrett, C. W., Williams, C. S.
- Tanaka, T., et al. A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate. Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).
- Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Nakagama, H., Tanaka, T. Strain differences in the susceptibility to azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colon carcinogenesis in mice. Carcinogenesis. 27 (1), 162-169 (2006).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10, 9 (2011).
- Song, J. L., et al. Dietary mixed cereal grains ameliorate the azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colonic carcinogenesis in C57BL/6J mice. J Med Food. 23 (4), 440-452 (2020).
- Zou, Y. F., et al. Effects of Huaier extract on ameliorating colitis-associated colorectal tumorigenesis in mice. Onco Targets Ther. 13, 8691-8704 (2020).
- Luo, X., et al. Obacunone reduces inflammatory signalling and tumour occurrence in mice with chronic inflammation-induced colorectal cancer. Pharm Biol. 58 (1), 886-897 (2020).
- Dai, Y., et al. Liujunzi Decoction ameliorated cisplatin-induced anorexia by inhibiting theJAK-STAT signaling pathway and coordinating anorexigenic and orexigenic neuropeptides in rats. J Ethnopharmacol. 285, 114840 (2022).
- Ghosh, D., Dutta, A., Kashyap, A., Upmanyu, N., Datta, S. PLP2 drives collective cell migration via ZO-1-mediated cytoskeletal remodeling at the leading edge in human colorectal cancer cells. J Cell Sci. 134 (18), jcs253468 (2021).
- Yan, S., et al. Berberine regulates short-chain fatty acid metabolism and alleviates the colitis-associated colorectal tumorigenesis through remodeling intestinal flora. Phytomedicine. 102, 154217 (2022).
- Ma, Y. L., et al. Immunohistochemical analysis revealed CD34 and Ki67 protein expression as significant prognostic factors in colorectal cancer. Med Oncol. 27 (2), 304-309 (2010).
