Cromatografia a scambio ionico

1. Preparazione del campione e della colonna

1. In questa dimostrazione, una miscela di 2 proteine sarà separata su una colonna a scambio cationico: emoglobina e citocromo C. Aggiungere 0,2 mL di tampone di equilibrio (pH 8,1) al campione proteico e vortice per mescolare accuratamente. Centrifugare per 2 minuti per rimuovere qualsiasi schiuma.
2. Posizionare la colonna di scambio cationico in una provetta per 5 minuti per consentire alla resina di depositarsi. Bloccare la provetta con la colonna su un supporto ad anello per assicurarsi che sia in posizione verticale.
3. Aprire il cappuccio superiore della colonna e quindi il cappuccio inferiore. Lasciare che il tampone nella colonna goccioli sotto gravità nella provetta.
4. Lavare la colonna due volte con un volume di colonna (in questo caso il volume della colonna è di 0,3 ml) di tampone di equilibrio. Lasciare che il primo volume di colonna (0,3 mL) del tampone di equilibratura goccioli nel flaconcino di scarico prima di aggiungere il secondo volume di colonna. Questo passaggio consente alla colonna di equilibrarsi con il buffer di bilanciamento. Aggiungere lentamente il tampone di equilibrio in questo passaggio per non disturbare la resina.

2. Esecuzione di un campione proteico attraverso una colonna a scambio cationico

1. Inserire la colonna in un tubo centrifugo da 2 ml con l'etichetta "Unbound 1". Caricare con attenzione 0,1 ml del campione proteico sulla parte superiore della colonna.
2. Una volta che il campione è stato caricato sulla parte superiore della colonna, lavarlo con 0,3 ml di tampone di equilibrio aggiungendo il tampone nella parte superiore della colonna e lasciandolo gocciolare fino in fondo. Ripetere questo passaggio 4 volte (per un totale di 5 lavaggi) e raccogliere ogni lavaggio in un tubo centrifugo separato da 2 ml. Etichettare i tubi come "Unbound 1-5".
3. Per gli ultimi 2 lavaggi, centrifugare per 10 s a 1.000 x g per assicurarsi che tutte le specie non legate si staccano dalla colonna. Qualsiasi campione che si lega alla colonna non deve essere in questi lavaggi, ma il campione che non si lega si laverà senza essere trattenuto. La centrifugazione fornisce più forza per lavare i materiali non legati dalla colonna.
4. Inserire la colonna in un nuovo tubo di raccolta centrifuga da 2 ml etichettato "Bound 1". Mettere 0,3 mL di tampone di eluizione (sale alto, pH 5,5) sulla parte superiore della colonna. Centrifugare l'eluente risultante per 10 s a 1.000 x g.
5. Ripetere la fase di eluizione altre 2 volte posizionando la colonna in un nuovo tubo della centrifuga, aggiungendo 0,3 ml e centrifugando per 10 s. Etichetta questi "Bound 2 e 3".
6. Registrare eventuali cambiamenti di colore o osservazioni sulle frazioni. L'emoglobina è una proteina colorata che sembra bruno-rossastra mentre il citocromo C è di colore rossastro.

3. Risultati: Scambio cationico di emoglobina e citocromo C

1. Il citocromo C ha un pI di 10,5 e l'emoglobina un pI di 6,8. Pertanto, quando viene utilizzato un tampone di equilibrio pH 8,1, l'emoglobina non si lega alla colonna perché è caricata negativamente. Il citocromo C è caricato positivamente a questo pH e si lega alla colonna perché il pH < pI.
2. L'emoglobina è osservata nelle frazioni non legate perché non è legata alla colonna.
3. Il citocromo C è osservato in frazioni legate, perché era legato alla colonna di scambio cationico.

Figura 1. Immagine della frazione non legata (emoglobina) e della frazione legata (citocromo C).