3.10: Cromatografia a scambio ionico

1. Preparazione del campione e della colonna

1. In questa dimostrazione, una miscela di 2 proteine sarà separata su una colonna a scambio cationico: emoglobina e citocromo C. Aggiungere 0,2 mL di tampone di equilibrio (pH 8,1) al campione proteico e vortice per mescolare accuratamente. Centrifugare per 2 minuti per rimuovere qualsiasi schiuma.
2. Posizionare la colonna di scambio cationico in una provetta per 5 minuti per consentire alla resina di depositarsi. Bloccare la provetta con la colonna su un supporto ad anello per assicurarsi che sia in posizione verticale.
3. Aprire il cappuccio superiore della colonna e quindi il cappuccio inferiore. Lasciare che il tampone nella colonna goccioli sotto gravità nella provetta.
4. Lavare la colonna due volte con un volume di colonna (in questo caso il volume della colonna è di 0,3 ml) di tampone di equilibrio. Lasciare che il primo volume di colonna (0,3 mL) del tampone di equilibratura goccioli nel flaconcino di scarico prima di aggiungere il secondo volume di colonna. Questo passaggio consente alla colonna di equilibrarsi con il buffer di bilanciamento. Aggiungere lentamente il tampone di equilibrio in questo passaggio per non disturbare la resina.

2. Esecuzione di un campione proteico attraverso una colonna a scambio cationico

1. Inserire la colonna in un tubo centrifugo da 2 ml con l'etichetta "Unbound 1". Caricare con attenzione 0,1 ml del campione proteico sulla parte superiore della colonna.
2. Una volta che il campione è stato caricato sulla parte superiore della colonna, lavarlo con 0,3 ml di tampone di equilibrio aggiungendo il tampone nella parte superiore della colonna e lasciandolo gocciolare fino in fondo. Ripetere questo passaggio 4 volte (per un totale di 5 lavaggi) e raccogliere ogni lavaggio in un tubo centrifugo separato da 2 ml. Etichettare i tubi come "Unbound 1-5".
3. Per gli ultimi 2 lavaggi, centrifugare per 10 s a 1.000 x g per assicurarsi che tutte le specie non legate si staccano dalla colonna. Qualsiasi campione che si lega alla colonna non deve essere in questi lavaggi, ma il campione che non si lega si laverà senza essere trattenuto. La centrifugazione fornisce più forza per lavare i materiali non legati dalla colonna.
4. Inserire la colonna in un nuovo tubo di raccolta centrifuga da 2 ml etichettato "Bound 1". Mettere 0,3 mL di tampone di eluizione (sale alto, pH 5,5) sulla parte superiore della colonna. Centrifugare l'eluente risultante per 10 s a 1.000 x g.
5. Ripetere la fase di eluizione altre 2 volte posizionando la colonna in un nuovo tubo della centrifuga, aggiungendo 0,3 ml e centrifugando per 10 s. Etichetta questi "Bound 2 e 3".
6. Registrare eventuali cambiamenti di colore o osservazioni sulle frazioni. L'emoglobina è una proteina colorata che sembra bruno-rossastra mentre il citocromo C è di colore rossastro.

3. Risultati: Scambio cationico di emoglobina e citocromo C

1. Il citocromo C ha un pI di 10,5 e l'emoglobina un pI di 6,8. Pertanto, quando viene utilizzato un tampone di equilibrio pH 8,1, l'emoglobina non si lega alla colonna perché è caricata negativamente. Il citocromo C è caricato positivamente a questo pH e si lega alla colonna perché il pH < pI.
2. L'emoglobina è osservata nelle frazioni non legate perché non è legata alla colonna.
3. Il citocromo C è osservato in frazioni legate, perché era legato alla colonna di scambio cationico.

Figura 1. Immagine della frazione non legata (emoglobina) e della frazione legata (citocromo C).

La cromatografia a scambio ionico è ampiamente utilizzata nella separazione e nell'isolamento di composti carichi, in particolare di biomolecole di grandi dimensioni.

Questo tipo di cromatografia liquida utilizza una colonna di perle impaccate in fase stazionaria, chiamate resina. La tecnica separa gli analiti in base alla loro affinità con la resina carica.

Esistono due tipi principali di questa tecnica. Nella cromatografia a scambio cationico, la resina caricata negativamente viene utilizzata per legare analiti caricati positivamente. Allo stesso modo, nello scambio anionico, gli analiti caricati negativamente si legano alla resina caricata positivamente. I composti non legati vengono lavati attraverso la colonna e l'analita può quindi essere raccolto in un contenitore separato.

Questo video introdurrà le basi della cromatografia a scambio ionico e dimostrerà la tecnica separando una miscela proteica in laboratorio.

La fase stazionaria è una componente chiave per una separazione di successo. Le resine a scambio cationico forte presentano tipicamente gruppi funzionali acidi forti, come l'acido solfonico. Le resine a scambio cationico deboli presentano gruppi deboli, come gli acidi carbossilici.

Allo stesso modo, le resine a scambio anionico forte utilizzano basi forti, come le ammine quaternarie, mentre le resine a scambio anionico debole utilizzano ammine secondarie o terziarie. La selezione della resina dipenderà dalle proprietà della miscela del campione e dall'analita di interesse.

Anche i tamponi utilizzati, collettivamente chiamati fase mobile, sono importanti per la separazione, in particolare in termini di pH. Per le proteine, il pH viene selezionato in base al suo punto isoelettrico, o pI. A un pH uguale al pI della proteina, la proteina è neutra. Al di sopra del pI, avrà una carica negativa netta, mentre al di sotto del pI, avrà una carica positiva netta. Il pH del tampone deve essere selezionato in modo che la proteina sia caricata correttamente e in grado di legarsi alla fase stazionaria.

La cromatografia a scambio ionico è generalmente un processo in quattro fasi. In primo luogo, una colonna impaccata contenente resina scambiatrice di anioni o cationi viene equilibrata utilizzando il tampone. Per le colonne a scambio anionico, ciò comporta la protonazione della resina, assicurandosi che sia caricata positivamente.

Successivamente, l'esempio viene caricato nella colonna. Il tampone deve avere una bassa conducibilità, poiché le specie cariche possono competere con il campione per le interazioni con la resina. I composti di carica opposta si legano alla resina. Le molecole che non sono cariche, o che portano la stessa carica, rimangono non legate.

Nella terza fase, la colonna viene lavata con un buffer aggiuntivo per rimuovere i componenti non legati dalla colonna, lasciando dietro di sé il legato.

Infine, la quarta fase è l'eluizione dell'analita legato. Ciò si ottiene utilizzando un gradiente di sale, in cui la concentrazione di sale viene gradualmente aumentata, o utilizzando un tampone di eluizione ad alto contenuto di sale.

Le molecole che sono debolmente legate verranno eluite per prime, poiché il basso contenuto di sale disturberà più facilmente il loro legame ionico con la resina. I composti che si legano più fortemente eluiranno con concentrazioni di sale più elevate.

Ora che sono state delineate le basi della cromatografia a scambio ionico, diamo un'occhiata al suo utilizzo nella separazione di due proteine.

Innanzitutto, per preparare la miscela proteica per la separazione, aggiungere 0,2 ml di tampone legante e vortice per mescolare accuratamente. Quindi, centrifugare il composto per eliminare la schiuma. Per preparare la colonna a scambio cationico, fissarla verticalmente su un supporto ad anello e lasciare che la resina si depositi.

Aprire il tappo superiore della colonna e quindi quello inferiore. Lasciare che il tampone goccioli per gravità in un tubo sottostante.

Per preparare la colonna, equilibrarla caricando una colonna-volume di tampone, in questo caso 0,3 mL. Lasciare gocciolare il tampone dalla colonna in una fiala di scarto. Dopo che una colonna-volume di buffer è uscita, ripetere la fase di equilibratura.

Per eseguire l'esperimento, posizionare una provetta da centrifuga da 2 ml etichettata "Unbound 1" sotto la colonna. Caricare con cautela 0,1 mL del campione proteico sulla parte superiore della colonna.

Una volta caricato il campione, lavare con una colonna-volume di tampone e lasciarlo fluire fino in fondo. Ripetere per un totale di 5 lavaggi. Raccogli ogni lavaggio nel proprio tubo, etichettato da "Unbound 1" a "5".? Per gli ultimi 2 lavaggi, centrifugare la colonna per 10 s per assicurarsi che tutte le specie non legate vengano lavate via dalla colonna. Metti la colonna in una nuova provetta da centrifuga da 2 ml ed etichettala "Bound 1".? Caricare 1 colonna-volume di tampone di eluizione sulla parte superiore della colonna. Centrifugare per 10 s a 1.000 x g.

Ripetere la fase di eluizione altre 2 volte per garantire la raccolta dell'analita legato. Etichettare i tubi "Bound 2" e "3".? Registra eventuali cambiamenti di colore o osservazioni sulle frazioni.

In questo esempio, l'emoglobina e il citocromo C sono stati separati. L'emoglobina ha un pI di 6,8, mentre il citocromo C ha un pI di 10,5. Nel tampone pH 8,1, l'emoglobina è caricata negativamente e non si lega alla colonna. Al contrario, il citocromo C è caricato positivamente a pH 8,1 e si lega alla colonna.

L'emoglobina, una proteina di colore brunastro, è stata trovata nelle frazioni non legate, mentre il citocromo C, una proteina di colore rossastro, è stato osservato nella frazione legata.

Esistono molte forme di cromatografia liquida, ognuna con diverse capacità di separare i componenti di una miscela.

In questo esempio, la cromatografia su colonna è stata utilizzata per separare una miscela di DNA a singolo e doppio filamento. L'idrossiapatite, o HA, è una forma cristallina di fosfato di calcio comunemente usata come fase stazionaria a causa dei suoi ioni calcio caricati positivamente. In questo caso, la colonna HA era ideale per la separazione del DNA in quanto può legarsi alla spina dorsale del DNA caricata negativamente.

Un'altra forma di cromatografia su colonna frequentemente utilizzata per separare le proteine è la cromatografia di affinità con metalli immobilizzati, o IMAC. Nell'IMAC, la fase stazionaria possiede un ligando con uno ione metallico, che si lega a un tag istidina sulla proteina di interesse.

Tutti gli altri componenti della miscela escono dalla colonna. La proteina viene quindi eluita con una soluzione di imidazolo, che ha una struttura simile all'istidina, e si lega più fortemente con lo ione metallico.

Un'applicazione comune della cromatografia su colonna è la cromatografia liquida ad alta prestazione, o HPLC. L'HPLC è ampiamente utilizzata in chimica analitica sia per l'identificazione che per la separazione di composti biologici e non biologici in una miscela.

L'HPLC è simile alla cromatografia su colonna illustrata in questo video, tranne per il fatto che è automatizzata e funziona a pressioni molto elevate. Ciò consente l'uso di perle in fase stazionaria più piccole, con un rapporto superficie/volume più elevato. In questo modo, sono possibili migliori interazioni tra la fase stazionaria e i componenti nella fase mobile.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla cromatografia a scambio ionico. Ora dovresti capire i concetti che ci sono dietro, i 4 passaggi coinvolti e alcune tecniche correlate.

Grazie per l'attenzione!