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Immunoistochimica e immunocitochimica: imaging dei tessuti tramite microscopia ottica

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Immunology

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Immunohistochemistry and Immunocytochemistry: Tissue Imaging via Light Microscopy

5.4: ELISPOT Assay: Detection of IFN-γ Secreting Splenocytes

5.6: Antibody Generation: Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

77,906 Views

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13:24 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Michael S. Lee¹ e Tonya J. Webb¹
¹ Dipartimento di Microbiologia e Immunologia, University of Maryland School of Medicine e Marlene and Stewart Greenebaum Comprehensive Cancer Center, Baltimora, Maryland 21201

L’immunoistochimica (IHC) e l’immunocitochimica (ICC) sono tecniche utilizzate per visualizzare l’espressione e la localizzazione di antigeni specifici utilizzando anticorpi. Il primo uso pubblicato di IHC fu nel 1941 quando Albert Coons usò la tecnica per visualizzare la presenza di antigene pneumococcico nelle sezioni di tessuto di topi infetti da Pneumococco (1). Il nome, immunoistochimica, deriva dalle radici “immuno-“, in riferimento agli anticorpi, e “histo-“, in riferimento alle sezioni tissutali utilizzate nell’IHC. La radice “cyto-” in immunocitochimica evidenzia la differenza chiave tra ICC e IHC. Mentre IHC utilizza sezioni di tessuto intero, ICC utilizza cellule che sono state isolate dal tessuto o coltivate in coltura. La differenza nei campioni utilizzati significa che la preparazione del campione differisce tecnicamente tra IHC e ICC, ma per il resto i protocolli per ICC e IHC sono identici e si scoprirà che i termini sono spesso usati in modo intercambiabile.

Sia in IHC che in ICC, gli anticorpi con tag chimici o fluorescenti, come rispettivamente la perossidasi o la rodamina, vengono utilizzati per visualizzare la distribuzione di qualsiasi antigene di interesse attraverso il legame specifico dell’anticorpo marcato all’antigene. Nel caso dell’IHC, sottili fette di tessuto vengono immobilizzate su un vetrino per mantenere la struttura del tessuto prima di essere macchiate, consentendo la visualizzazione di antigeni nel contesto di interi tessuti (Figura 1). Nel caso dell’ICC, le cellule vengono distribuite uniformemente su un vetrino prima di essere macchiate, consentendo la visualizzazione della distribuzione dell’antigene all’interno delle singole cellule ma non all’interno della struttura di un tessuto specifico. A causa delle somiglianze tra i due protocolli, questo protocollo si concentrerà sull’IHC per affrontare le ulteriori complessità della preparazione del campione coinvolte nell’IHC.

Figura 1: Schema del protocollo IHC. Profilo visivo di un protocollo IHC per tessuto incorporato in paraffina sezionato da un topo. Questo protocollo utilizza un anticorpo secondario biotinilato e strepavidin-HRP per visualizzare la posizione del legame anticorpale. Sono possibili anche altre opzioni, come gli anticorpi marcati fluorescenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La prima decisione importante quando si esegue L’IHC è come preparare le sezioni di tessuto al fine di mantenere la struttura del tessuto durante tutto il processo di colorazione. Le due scelte principali sono sezioni fissate in formalina di tessuto incorporato in paraffina o sezioni fresche di tessuto congelato. Non esiste una risposta semplice su quale metodo utilizzare in quanto dipende da quale analisi a valle verrà condotta. La fissazione della formalina dei tessuti incorporati di paraffina è generalmente pensata per preservare meglio la morfologia del tessuto per un’imaging ottimale, mentre il congelamento del tessuto fresco può preservare la funzione proteica per i successivi saggi al di fuori dell’IHC. Inoltre, le sezioni di tessuto fresco congelato hanno dimostrato di essere più adatte per l’analisi dell’espressione genica (2). Una terza considerazione è se gli anticorpi per il tuo antigene di interesse sono adatti o meno per sezioni di tessuto fisse o congelate, poiché alcuni anticorpi sono stati ottimizzati solo per un tipo specifico di sezione e potrebbero non funzionare per altri. Infine, è necessario determinare per quanto tempo devono conservare le sezioni di tessuto, poiché i campioni freschi congelati devono essere conservati a -80 ° C e non possono durare oltre un anno, mentre le sezioni fisse possono essere conservate per molto più tempo a temperatura ambiente. Queste sono alcune delle principali considerazioni per determinare se utilizzare sezioni fissate in formalina di tessuto incorporato in paraffina o sezioni fresche di tessuto congelato. In definitiva, se uno ha abbastanza tessuto, potrebbe essere meglio avere solo un po ‘di entrambi.

In questo esperimento, abbiamo deciso di determinare se l’espressione della ciclina D1 era aumentata nella milza ingrossata da un modello murino spontaneo di sviluppo del linfoma. I campioni di tessuto splenico sono stati isolati per la prima volta da topi wild-type, topi transgenici che non hanno linfoma o topi transgenici che hanno sviluppato spontaneamente linfoma. I campioni di tessuto della milza sono stati fissati in paraformaldeide, incorporati nella paraffina, sezionati, colorati utilizzando un anticorpo primario anticiclina D1 di topo seguito da un anticorpo secondario anti-topo di cavallo e sviluppati utilizzando 3,3-diaminobenzidina (DAB). Le sezioni sono state poi controcolorate nella soluzione di ematossilina di Harris e quindi le sezioni sono state riprese con un ingrandimento 20X.

Reagenti

Sezioni incorporate in paraffina

4% Paraformaldeide (PFA)
Etanolo (denaturato anidro, grado istologico 100%, 95%, 80%, 75% e 50%). Può essere diluito al 100% con acqua doppia distillata (ddH₂O)
Xilene
Vetrino compatibile IHC per garantire che la sezione tissutale rimanga attaccata durante l’intera procedura. Le vetrini compatibili IHC hanno un rivestimento specializzato e sono prontamente disponibili presso più rivenditori. Se si esegue ICC, utilizzare una diapositiva camerata. I vetrini camerati consentono alle cellule di essere seminate nelle camere e poste nell’incubatore fino a quando le cellule non si attaccano al vetrino e raggiungono la corretta confluenza, a quel punto le camere possono essere rimosse e la colorazione può procedere allo stesso modo di IHC.
Paraffina
0,3% perossido di idrogeno (H₂O₂)/metanolo: per preparare, aggiungere 1 mL 30% H₂O₂ a 99 ml di metanolo. Conservare a -20°C
Tampone di recupero dell’antigene: tampone citrato IHC pH 6.0

Sezioni fresche congelate

Composto di incorporamento a temperatura di taglio ottimale (OCT)
Fissativo ottimale: 4% PFA o acetone che è stato raffreddato a -20 °C

Macchiatura

Buffer di blocco: deve essere determinato dall’utente. Un esempio è il siero di cavallo diluito in 1X PBS
Anticorpo primario diluito: vedere le specifiche del produttore
Anticorpo secondario biotinilato diluito: vedere le specifiche del produttore
Avidina-Rafano perossidasi diluita (HRP): Solo per la visualizzazione della perossidasi. Vedere le specifiche del produttore.
DAB o un altro substrato compatibile
Controstain (opzionale)
Etanolo (denaturato anidro, grado istologico 100% e 95%)
Xilene
Organo/Limonene Mount

Procedure

1. Preparazione di cellule per immunocitochimica

Semina cellule di interesse su vetrini camerati o coverslip camerati aggiungendo 0,5 ml di sospensione cellulare ai pozzetti di una piastra di coltura a 24 pozzi.
Nota: Alcune cellule possono richiedere la crescita su coverslips trattati, come coverslips trattati con poli-lisina. Le condizioni di trattamento ottimali devono essere determinate dall’utente in base al tipo di cellula utilizzata.
Posizionare la piastra in un incubatore a CO₂ umidificato e consentire alle cellule di crescere a 37 ° C fino al 50-70% di confluente.
Una volta che le cellule raggiungono la confluenza ottimale, rimuovere i mezzi di coltura da ciascun pozzo e quindi fissare le cellule incubandole in 0,5 ml di PFA al 4% (diluito in 1X PBS) e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
Rimuovere il fissativo e lavare i fori tre volte con 1 mL di 1X PBS.
Successivamente, permeabilizzare le cellule aggiungendo 0,5 ml di Triton-X-100 allo 0,1% in 1X PBS a ciascun pozzezzo e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
Aspirare il tampone di permeabilizzazione e lavare i pozzi tre volte con 1 mL di 1X PBS.
Le cellule su coverslips sono ora fisse e permeabilizzate. Procedere alla procedura di colorazione dimostrata per il seguente esempio di immunoistochimica, con l’eccezione che le incubazioni devono essere eseguite all’interno dei pozzetti della piastra a 24 pozzetti piuttosto che direttamente su un vetrino di sezione tissutale.

2. Preparazione di sezioni fissate con formalina e incorporata in paraffina per la colorazione

Ottenere sezioni di tessuto incorporate in paraffina fissate in formalina preparate.

Deparaffinizzazione

Immergere le diapositive in 100% xilene 2 volte per 5 minuti ciascuna.

Reidratazione

Immergere le diapositive in etanolo al 100% 2 volte per 3 minuti ciascuna.
Immergere i vetrini in etanolo al 95% per 3 min.
Immergere i vetrini in etanolo al 70% per 3 min.
Immergere i vetrini in etanolo al 50% per 3 min.

Blocco dell’attività della perossidasi endogena

Incubare i vetrini in 100 mL di 0,3% H₂O₂ per 30 min a temperatura ambiente.
Lavare le diapositive con 1X PBS 2 volte per 5 minuti ciascuna.

Recupero dell’antigene

Immergere i vetrini nel tampone citrato IHC (pH 6) e farli bollire per 20 minuti.
I vetrini in tessuto sono ora pronti per la colorazione.

3. Preparazione di sezioni fresche congelate, OTC-Embedded per la colorazione

Posizionare 5 mm di tessuto fresco isolato in uno stampo e aggiungere OCT fino a quando la sezione non è completamente coperta.
Immergere lentamente il blocco di tessuto in azoto liquido fino a completo congelamento. Il campione può ora essere conservato a -80°C per un massimo di 1 anno.
Una volta pronto per il sezionamento, trasferire il blocco di tessuto congelato su un criostato e consentire all’intera configurazione di arrivare a -20 ° C.
Tagliare sezioni di tessuto spesse 5-10 μm usando un criostato e utilizzare la spazzola per posizionare le sezioni direttamente su vetrini compatibili IHC.
Lasciare asciugare le diapositive durante la notte a temperatura ambiente. Le diapositive possono anche essere conservate a -80°C.
Immergere i vetrini in 250 ml di PFA al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente per fissare i vetrini prima della colorazione. Il metodo di fissazione ottimale dovrebbe essere determinato dall’utente.
Immergere le diapositive in 250 mL di 1X PBS 2 volte per 5 minuti ciascuna.
Immergere le diapositive in 250 mL di 0,3% H₂O₂ per 30 minuti a temperatura ambiente al fine di bloccare qualsiasi attività endogena della perossidasi.
Immergere le diapositive in 250 mL di 1X PBS 2 volte per 5 minuti ciascuna.
Le diapositive sono ora pronte per la colorazione.

4. Colorazione

Circondare il tessuto con una barriera idrofoba usando una penna barriera.

Inceppamento

Utilizzando una pipetta, posizionare 100 μL di tampone bloccante (siero di cavallo diluito in 1X PBS) – sopra la sezione per 1 ora a temperatura ambiente.
Rimuovere il buffer di blocco utilizzando una pipetta.

Incubazione di anticorpi primari

Incubare il tessuto circondato con 100 μL di soluzione anticorpale primaria diluita (ciclina D1 anti-umana di topo diluita 1:100 in tampone bloccante) per 30 minuti a temperatura ambiente.
Scaricare l’anticorpo primario da ogni vetrino e lavare i vetrini con 1X PBS 2 volte per 5 minuti ciascuno.

Incubazione di anticorpi secondari

Incubare il campione con 100 μL di anticorpo secondario biotinilato diluito (IgG di cavallo biotinilato anti-topo diluito 1:200) per 30 minuti a temperatura ambiente.
Rimuovere l’anticorpo secondario drenando le sezioni e lavare con 1X PBS 2 volte per 5 minuti ciascuna.

Sviluppo del colore

Visualizzazione utilizzando HRP: aggiungere 100 μL di reagente del complesso avidina-biotina (ABC) e incubare le sezioni al buio per 30 minuti a temperatura ambiente
Nota: Gli anticorpi marcati con fluorescenza possono anche essere utilizzati e visualizzati utilizzando un microscopio appropriato.
Lavare le diapositive con 1X PBS 2 volte per 5 minuti ciascuna.
Sviluppare le diapositive incubando le sezioni in 100 μL di DAB per un massimo di 5 minuti.
Interrompere lo sviluppo aggiungendo acqua distillata (dH₂O) per 5 minuti a temperatura ambiente.

Controbattere (se lo si desidera)

Immergere brevemente i vetrini nella soluzione di ematossilina Harris (o verde metile allo 0,5% in acetato di sodio 0,1 M (pH 4,2)) per 10 minuti.
Risciacquare la controstita lavando i vetrini in dH₂O due volte per 5 minuti ciascuno.

Disidratazione

Immergere i vetrini in etanolo al 95% 2 volte per 5 minuti ciascuno.
Immergere le diapositive in etanolo al 100% 2 volte per 5 minuti ciascuna.
Immergere le diapositive in 100% xilene 2 volte per 5 minuti ciascuna.
Asciugare le diapositive con un asciugamano di carta.

Montaggio e applicazione coverslip

Aggiungere una goccia di supporto di montaggio come Organo-Limonene Mount alle diapositive e posizionare un coperchio sulle sezioni.

Analisi microscopica

Osservare le sezioni macchiate sotto un microscopio appropriato per l’analisi. Qui è stato utilizzato un microscopio ottico standard per l’osservazione e una fotocamera digitale montata è stata utilizzata per l’imaging.

L’immunocitochimica e l’immunoistochimica sono metodi di colorazione per una proteina di interesse rispettivamente nelle cellule e nei tessuti in coltura. Il principio di base di entrambe le tecniche correlate prevede l’utilizzo di anticorpi specifici contrassegnati con un sistema di rilevamento per identificare e visualizzare la proteina e determinare la sua posizione all’interno delle cellule e dei tessuti, nonché i livelli relativi. Il processo in entrambi gli esperimenti inizia con la preparazione del campione.

Per l’immunocitochimica, che visualizza specificamente le posizioni delle proteine o degli antigeni nelle cellule, ciò comporta tre passaggi. Il primo passo è la placcatura, che comporta la coltura delle cellule nei mezzi di crescita su una scivolata o una diapositiva di copertura, in genere, nei pozzetti di una piastra di coltura. Questo è seguito dalla fissazione, in cui un agente precipitante o reticolante come la paraformaldeide viene aggiunto alle cellule per preservare l’integrità strutturale delle proteine e impedire all’attività enzimatica di degradarle. L’ultimo passo è la permeabilizzazione, che prevede l’aggiunta di un detergente per rendere le membrane cellulari permeabili alla colorazione.

Nel metodo di controparte, l’immunoistochimica, le proteine o gli antigeni vengono visualizzati nei tessuti e la preparazione del campione ha cinque fasi. In primo luogo, l’intero tessuto è sottoposto a fissazione, di solito con paraformaldeide. Questo è seguito dall’incorporazione del tessuto in un blocco di paraffina, e quindi dal sezionamento di questo blocco usando una macchina chiamata microtomo per tagliare il tessuto in fette sottili che possono essere posizionate su vetrini. Successivamente, i vetrini sono sottoposti a deparaffinazione o rimozione della paraffina da intorno alla fetta di tessuto. Quindi, è possibile eseguire una fase opzionale di recupero dell’antigene. Questo può essere fatto usando calore o enzimi per smascherare gli epitopi che sono stati reticolati durante la fissazione rendendoli disponibili per il legame anticorpale. Dopo l’appropriata preparazione del campione, un anticorpo primario specifico del bersaglio viene aggiunto al campione di cellula o tessuto. Questo anticorpo primario dovrebbe legarsi alla proteina di interesse. Successivamente, viene aggiunto un anticorpo secondario, che rileva e si lega all’anticorpo primario. Questo anticorpo secondario è coniugato a, o può legarsi a, un enzima chiamato HRP. Quando viene aggiunto il suo substrato specifico, DAB, HRP lo converte in un precipitato marrone insolubile. Questa macchia marrone segna la posizione della proteina bersaglio. I vetrini sono anche colorati con ematossilina, che etichetta i nuclei in blu e fornisce un punto di riferimento spaziale per determinare la localizzazione subcellulare. Successivamente, il supporto di montaggio viene aggiunto alla diapositiva, seguito da una scivolata di copertura per sigillare e preservare il campione macchiato. Infine, le diapositive possono essere riprese su un microscopio ottico.

In questo video, osserverai la tecnica di preparazione del campione per le cellule placcate e le sezioni tissutali, seguita dall’immunostaining delle sezioni tissutali.

In primo luogo, le cellule di interesse devono essere sedute su coperture. Per fare questo, lavorando in una cappa di coltura di tessuto, posizionare singoli coverslip nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Quindi, chiudere l’anta e accendere la luce UV per sterilizzare le coperture per almeno 15 minuti. Quindi, spegnere la luce UV. Per sollevare le cellule di interesse da un piatto confluente di 10 centimetri, aspirare il supporto, lavare brevemente con PBS e aggiungere tripsina alle cellule per 2 minuti. Quindi, toccare il lato della piastra per assicurarsi che le cellule si siano staccate e neutralizzare la tripsina con i mezzi. Quindi, aggiungi 0. 5 mL di sospensione cellulare in ciascun pozzo, assicurandosi di coprire i coperchi. Posizionare la piastra in un incubatore a CO2 umidificato e consentire alle cellule di crescere a 37 gradi Celsius fino a quando non sono confluenti al 50-70%.

Una volta che le cellule raggiungono la confluenza ottimale, aspirare il terreno di coltura da ciascun pozzo e quindi fissare le cellule incubandole in . 5 ml di paraformaldeide al 4% diluita in 1X PBS per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso il fissativo, sciacquare le celle aggiungendo 1 mL di 1X PBS su ogni coverslip. Aspirare immediatamente il PBS, quindi ripetere il risciacquo altre 2 volte per un totale di 3 lavaggi.

Ora, permeablizzare le cellule aggiungendo 0,5 ml di 0,1% Triton X-100 in 1X PBS a ciascun pozzedo. Lasciare il piatto a temperatura ambiente per 15 minuti. Aspirare il tampone di permeabilizzazione e quindi risciacquare le cellule aggiungendo 1 mL di 1X PBS in ciascun pozzo. Aspirare immediatamente il PBS e ripetere il risciacquo altre 2 volte per un totale di 3 lavaggi. Ora che le cellule sui coverslip sono fisse e permeabilizzate, procedere alla procedura di colorazione dimostrata per il seguente esempio di immunoistochimica con l’eccezione che le incubazioni dovrebbero essere eseguite all’interno dei pozzetti della piastra a 24 pozzetti piuttosto che direttamente su un vetrino di sezione tissutale.

Per iniziare, ottenere sezioni di tessuto preparate, fissate in formalina e incorporate in paraffina. Deparaffinizzare i vetrini inserendoli in una griglia e poi immergendoli completamente in 250 ml di xilene al 100%. Lasciare incubare i vetrini per 5 minuti nello xilene. Quindi, rimuovere i vetrini dal contenitore, pulirli con un tovagliolo di carta e metterli in un nuovo bagno di xilene in un contenitore fresco per altri 5 minuti.

Quindi, reidratare le sezioni in una serie di soluzioni di etanolo graduato a partire da etanolo al 100% per 3 minuti. Pulire il portaslievi con un tovagliolo di carta e trasferire i vetrini in un nuovo contenitore di etanolo al 100% per altri 3 minuti. Continuare questo ciclo di lavaggio, asciugatura con un tovagliolo di carta e trasferimento dei vetrini in un nuovo bagno seguendo le concentrazioni indicate di etanolo per il tempo specificato. Dopo l’ultimo lavaggio con etanolo, pulire il rack con un tovagliolo di carta e incubare i vetrini in 100 ml di perossido di idrogeno allo 0,3% per 30 minuti a temperatura ambiente al fine di bloccare qualsiasi attività endogena della perossidasi. Lavare le diapositive in 250 ml di 1X PBS per 5 minuti. Ripetere questo lavaggio in un contenitore di 1X PBS fresco per altri 5 minuti.

Successivamente, eseguire il recupero dell’antigene immergendo i vetrini in 250 mL di tampone citrato IHC a pH 6,0 e facendoli bollire per 20 minuti. Quindi, procedere al protocollo di colorazione.

Per iniziare il processo di colorazione per IHC, cerchiare le sezioni con una penna idrofoba per identificare l’area minima che il tampone deve coprire. Quindi, utilizzare una pipetta per posizionare 100 microlitri di tampone di blocco, che in questo esperimento è siero di cavallo diluito in 1X PBS, sopra la sezione. Incubare i vetrini per 1 ora a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere il buffer di blocco utilizzando una pipetta.

Successivamente, diluire l’anticorpo primario e il tampone bloccante a una diluizione 1:100 aggiungendo 990 microlitri di siero di cavallo diluito in 1X PBS in un 1. Tubo di Eppendorf da 5 ml, seguito da 10 microlitri dell’anticorpo primario. Aggiungere 100 microlitri dell’anticorpo primario diluito a ciascuna sezione e incubare i vetrini per 30 minuti a temperatura ambiente. Quando il timer suona, scaricare l’anticorpo primario da ogni vetrino, quindi lavarli in 250 ml di 1X PBS per 5 minuti. Ripeti questo lavaggio ancora una volta usando 1X PBS fresco.

Mentre i vetrini vengono lavati in 1X PBS, diluire l’anticorpo secondario a una diluizione 1:200 aggiungendo 995 microlitri di tampone bloccante a un tubo da 1,5 ml seguito da 5 microlitri dell’anticorpo secondario, che in questo caso è IGG anti-topo di cavallo biotinilato. Aggiungere 100 microlitri dell’anticorpo secondario diluito a ciascuna sezione, quindi incubare i vetrini per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, rimuovere l’anticorpo secondario drenandolo dalle sezioni, quindi lavare i vetrini in 250 ml di 1X PBS per 5 minuti. Ripeti questo lavaggio usando 1X PBS fresco.

Ora, aggiungi 100 microlitri di reagente complesso avidina-biotina e incuba le sezioni al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare i vetrini immergendoli in 250 ml di 1X PBS per 5 minuti. Simile ai passaggi di lavaggio precedenti, ripetere questo lavaggio ancora una volta utilizzando 1X PBS fresco. Successivamente, sviluppare le diapositive incubando le sezioni in 100 microlitri di DAB per un massimo di 5 minuti. Fermare lo sviluppo immergendo le sezioni in 250 ml di acqua distillata per 5 minuti.

Ora, le diapositive possono essere controbattete, se lo si desidera. Per fare ciò, immergere brevemente le diapositive in 250 ml di Harris Hematoxylin Solution. Risciacquare la controstain lavando i vetrini in 250 ml di acqua distillata per 5 minuti. Ripeti questo lavaggio 1 altra volta usando acqua distillata fresca. Quindi, disidratare le sezioni. Per fare questo, prima incubare i vetrini in etanolo al 95% per 5 minuti. Asciugare i vetrini su un tovagliolo di carta e trasferirli in un nuovo contenitore di etanolo fresco al 95% per altri 5 minuti. Continuare il ciclo di lavaggio, tamponando con un tovagliolo di carta e trasferendo le diapositive in un nuovo bagno, seguendo le soluzioni indicate per 5 minuti ciascuna.

Dopo l’incubazione finale, asciugare le diapositive con un tovagliolo di carta, quindi aggiungere una goccia di supporto di montaggio, come Organo-Limonene Mount, alle diapositive. Ora, posiziona un coverslip sopra le sezioni, facendo attenzione a non intrappolare le bolle d’aria. I vetrini sono ora pronti per essere osservati al microscopio per l’analisi.

Per osservare le sezioni macchiate, utilizzare un microscopio ottico standard per visualizzare la macchia e una fotocamera digitale per catturare l’immagine. In questo particolare esempio di IHC, i tessuti della milza di topi wild type e spontanei, doppi transgenici o DTG, vengono confrontati per lo studio dell’espressione di Dyclin D1 nel linfoma. I tessuti sono stati incorporati in paraffina, sezionati e colorati con anticorpo anticiclina D1 e ripresi con ingrandimento 20X. Le cellule che esprimono la ciclina D1 sono indicate dal colore bruno-rossastro sullo sfondo del tessuto blu. Confrontando le intensità di colorazione tra le immagini dei vari topi, le milza non ingrandite hanno quantità relativamente basse di espressione di ciclina D1 indipendentemente dal genotipo del topo. Al contrario, la milza ingrandita dal topo DTG, mostra un aumento della colorazione bruno-rossastra che indica una correlazione tra lo sviluppo del cancro e l’espressione di ciclina D1 in questo modello murino.

Results

IHC e ICC hanno una vasta gamma di applicazioni. Ad esempio, un uso di IHC è quello di esaminare l’espressione di oncogeni in modelli murini spontanei di sviluppo tumorale. Nella Figura 2,ci siamo prefissati di determinare se l’espressione della ciclina D1 fosse aumentata nella milza ingrossata in un modello murino spontaneo di sviluppo del linfoma. I campioni di tessuto splenico sono stati fissati in paraformaldeide, incorporati nella paraffina, sezionati, colorati usando un anticorpo anticiclina D1 (diluito 1:200 in tampone bloccante), e quindi le sezioni sono state riprese con ingrandimento 20X. Le cellule che esprimono la ciclina D1 sono indicate dal colore bruno-rossastro sullo sfondo del tessuto blu. Questi risultati suggeriscono che l’espressione della ciclina D1 è aumentata nella milza ingrossata, indicando una correlazione tra lo sviluppo del cancro e l’espressione della ciclina D1 in questo modello.

Figura 2: Espressione della ciclina splenica D1 in un modello murino spontaneo di linfoma a doppio transgenico (DTG). Un’immagine di tessuto splenico colorato con un anticorpo primario anti-ciclina D1, contromaccato con verde metilico e visualizzato utilizzando un anticorpo secondario biotinilato e un reagente ABC attivato con substrato DAB. Il colore bruno-rossastro rappresenta le posizioni in cui l’anticorpo si è legato indicando la presenza di cellule tumorali che esprimono ciclina D1 all’interno della struttura del tessuto splenico che è stato controcolorato blu. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Applications and Summary

L’immunoistochimica (IHC) e l’immunocitochimica (ICC) sono tecniche utilizzate per visualizzare l’espressione e la localizzazione di antigeni specifici utilizzando anticorpi. I tessuti vengono prima tagliati in sezioni sottili che mantengono la morfologia del tessuto e posizionati su un vetrino. Gli anticorpi vengono quindi aggiunti e legheranno l’antigene di interesse e sono dotati di un tag specifico che consente di visualizzarli al microscopio. Pertanto, attraverso questo concetto di base, la distribuzione degli antigeni nel contesto della struttura tissutale può essere visualizzata e studiata. Tuttavia, mentre il concetto generale è di base, ci sono più approcci e variazioni diversi che sono stati sviluppati che aumentano sia la complessità che l’utilità di queste tecniche. Questo documento ha coperto il concetto di base di IHC e ICC, le principali decisioni che devono essere considerate quando si utilizzano queste tecniche e un protocollo dettagliato passo-passo. Le immagini prodotte da IHC e ICC sono generalmente il prodotto finale e possono essere pubblicate così com’è per evidenziare evidenti differenze nelle quantità o nella distribuzione della colorazione tra le diverse condizioni.

References

Coons, A. H. Creech, H. J., Jones, N. and Berliner, E. The Demonstration of Pneumococcal Antigen in Tissues by the Use of Fluorescent Antibody, The Journal of Immunology, 45 (3), 159-170 (1942).
Ripoli, F. L., Mohr, A., Hammer, S. C., Willenbrock, S., Hewicker-Trautwein, M., Hennecke, S., Escobar, H. M. and Nolte, I. A comparison of fresh frozen vs. Formalin-fixed, paraffin-embedded specimens of canine mammary tumors via branched-DNA assay. International Journal of Molecular Sciences, 17 (5) (2016).

Transcript

Immunocytochemistry and immunohistochemistry are staining methods for a protein of interest in cultured cells and tissues, respectively. The basic principle of both related techniques involves using specific antibodies tagged with a detection system to identify and visualize the protein and determine its location within the cells and tissues, as well as the relative levels. The process in either experiment begins with sample preparation.

For immunocyctochemistry, which specifically visualizes protein or antigen locations in cells, this involves three steps. The first step is plating, which entails culturing the cells in growth media on a cover slip or slide, typically, in the wells of a culture plate. This is followed by fixation, where a precipitating or crosslinking agent like paraformaldehyde is added to the cells to preserve the structural integrity of the proteins and prevent enzyme activity from degrading them. The last step is permeabilization, which involves adding a detergent to make the cell membranes permeable for the staining.

In the counterpart method, immunohistochemistry, proteins or antigens are visualized in tissues and sample preparation has five steps. First, the whole tissue is subjected to fixation, usually with paraformaldehyde. This is followed by embedding of the tissue in a block of paraffin, and then sectioning of this block using a machine called a microtome to cut the tissue into thin slices which can be placed onto slides. Next, the slides are subjected to deparaffinization, or removal of the paraffin from around the tissue slice. Then, an optional antigen retrieval step can be performed. This can either be done using heat or enzymes to unmask epitopes that were cross-linked during fixation making them available for antibody binding. After the appropriate sample preparation, a target-specific primary antibody is added to the cell or tissue sample. This primary antibody should bind to the protein of interest. Next, a secondary antibody is added, which detects and binds to the primary antibody. This secondary antibody is conjugated to, or can bind to, an enzyme called HRP. When its specific substrate, DAB, is added, HRP converts this to an insoluble, brown precipitate. This brown stain marks the location of the target protein. The slides are also stained with hematoxylin, which labels the nuclei in blue and provides a spatial reference point for determining subcellular localization. After that, mounting media is added to the slide, followed by a cover slip in order to seal and preserve the stained sample. Finally, the slides can be imaged on a light microscope.

In this video, you will observe the sample preparation technique for plated cells and tissue sections, followed by immunostaining of the tissue sections.

First, the cells of interest need to be seated onto coverslips. To do this, working in a tissue culture hood, place individual coverslips into the wells of a 24-well plate. Then, close the sash and turn on the UV light to sterilize the coverslips for at least 15 minutes. Next, turn off the UV light. To lift the cells of interest from a confluent 10-centimeter dish, aspirate the media, wash briefly with PBS, and add trypsin to the cells for 2 minutes. Then, tap the side of the plate to ensure the cells have detached and neutralize the trypsin with media. Next, add 0. 5 mL of the cell suspension into each well, making sure to cover the coverslips. Place the plate into a humidified CO2 incubator and allow the cells to grow at 37 degrees celsius until they are 50-70% confluent.

Once the cells reach the optimal confluency, aspirate the culture medium from each well, and then fix the cells by incubating them in . 5 mL of 4% paraformaldehyde diluted in 1X PBS for 20 minutes at room temperature. After removing the fixative, rinse the cells be adding 1 mL of 1X PBS over each coverslip. Immediately aspirate the PBS, then repeat the rinse 2 more times for a total of 3 washes.

Now, permeablize the cells by adding 0.5 mL of 0.1% Triton X-100 in 1X PBS to each well. Leave the plate at room temperature for 15 minutes. Aspirate off the permeabilization buffer and then rinse the cells by adding 1 mL of 1X PBS into each well. Immediately aspirate off the PBS and repeat the rinse 2 more times for a total of 3 washes. Now that the cells on the coverslips are fixed and permeabilized, proceed to the staining procedure demonstrated for the following immunohistochemistry example with the exception that the incubations should be performed within the wells of the 24-well plate rather than directly on a tissue section slide.

To begin, obtain prepared, formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. Deparaffinize the slides by placing them into a slide rack and then completely immersing them into 250 mL of 100% xylene. Allow the slides to incubate for 5 minutes in the xylene. Then, remove the slides from the container, wipe them off with a paper towel, and place them into a new xylene bath in a fresh container for a further 5 minutes.

Next, rehydrate the sections in a series of graded ethanol solutions starting with 100% ethanol for 3 minutes. Wipe off the slide rack with a paper towel and transfer the slides to a new container of 100% ethanol for another 3 minutes. Continue this cycle of washing, drying with a paper towel, and transferring the slides to a new bath following the indicated concentrations of ethanol for the specified time. After the final ethanol wash, wipe off the rack with a paper towel and incubate the slides in 100 mL of .3% hydrogen peroxide for 30 minutes at room temperature in order to block any endogenous peroxidase activity. Wash the slides in 250 mL of 1X PBS for 5 minutes. Repeat this wash in a container of fresh 1X PBS for an additional 5 minutes.

Next, perform antigen retrieval by immersing the slides in 250 mL of IHC citrate buffer at pH 6.0 and boiling them for 20 minutes. Then, proceed to the staining protocol.

To begin the staining process for IHC, circle the sections with a hydrophobic pen to identify the minimal area that the buffer needs to cover. Then, use a pipette to place 100 microliters of blocking buffer, which in this experiment is horse serum diluted in 1X PBS, over the section. Incubate the slides for 1 hour at room temperature. Following this, remove the blocking buffer using a pipette.

Next, dilute the primary antibody and blocking buffer at a 1:100 dilution by adding 990 microliters of horse serum diluted in 1X PBS into a 1. 5 mL Eppendorf tube, followed by 10 microliters of the primary antibody. Add 100 microliters of the diluted primary antibody to each section, and incubate the slides for 30 minutes at room temperature. When the timer sounds, drain the primary antibody off each slide, and then wash them in 250 mL of 1X PBS for 5 minutes. Repeat this wash once more using fresh 1X PBS.

While the slides are washing in 1X PBS, dilute the secondary antibody to a 1:200 dilution by adding 995 microliters of blocking buffer to a 1.5 mL tube followed by 5 microliters of the secondary antibody, which in this case is biotinylated horse anti-mouse IGG. Add 100 microliters of the diluted secondary antibody to each section, and then incubate the slides for 30 minutes at room temperature. After 30 minutes, remove the secondary antibody by draining it off the sections, then wash the slides in 250 mL of 1X PBS for 5 minutes. Repeat this wash using fresh 1X PBS.

Now, add 100 microliters of avidin-biotin complex reagent, and incubate the sections in the dark for 30 minutes at room temperature. Next, wash the slides by immersing them in 250 mL of 1X PBS for 5 minutes. Similar to previous wash steps, repeat this wash one more time using fresh 1X PBS. Next, develop the slides by incubating the sections in 100 microliters of DAB for up to 5 minutes. Stop the development by immersing the sections in 250 mL of distilled water for 5 minutes.

Now, slides can be counterstained, if desired. To do this, briefly dip the slides in 250 mL of Harris Hematoxylin Solution. Rinse off the counterstain by washing the slides in 250 mL of distilled water for 5 minutes. Repeat this wash 1 more time using fresh distilled water. Next, dehydrate the sections. To do this, first incubate the slides in 95% ethanol for 5 minutes. Blot the slides on a paper towel, and transfer them to a new container of fresh 95% ethanol for another 5 minutes. Continue the cycle of washing, blotting with a paper towel, and transferring the slides to a new bath, following the indicated solutions for 5 minutes each.

After the final incubation, blot the slides with a paper towel, then add a drop of mounting media, such as Organo-Limonene Mount, to the slides. Now, place a coverslip over the sections, taking care not to trap air bubbles. The slides are now ready to be observed under a microscope for analysis.

To observe the stained sections, use a standard light microscope to visualize the stain, and a digital camera to capture the image. In this particular example of IHC, spleen tissues from wild type and spontaneous, double-transgenic, or DTG mice, are compared for studying Dyclin D1 expression in lymphoma. The tissues were paraffin-embedded, sectioned, and stained with anticyclin D1 antibody, and imaged at 20X magnification. Cyclin D1 expressing cells are indicated by the reddish-brown color against the blue tissue background. Comparing the staining intensities among the images from the various mice, the non-enlarged spleens have relatively low amounts of Cyclin D1 expression irrespective of the mouse genotype. In contrast, the enlarged spleen from the DTG mouse, shows increased reddish-brown staining indicating a correlation between cancer development and Cyclin D1 expression in this mouse model.

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