Immunoistochimica e immunocitochimica: imaging dei tessuti tramite microscopia ottica

1. Preparazione di cellule per immunocitochimica

1. Semina cellule di interesse su vetrini camerati o coverslip camerati aggiungendo 0,5 ml di sospensione cellulare ai pozzetti di una piastra di coltura a 24 pozzi.
   Nota: Alcune cellule possono richiedere la crescita su coverslips trattati, come coverslips trattati con poli-lisina. Le condizioni di trattamento ottimali devono essere determinate dall'utente in base al tipo di cellula utilizzata.
2. Posizionare la piastra in un incubatore a CO₂ umidificato e consentire alle cellule di crescere a 37 ° C fino al 50-70% di confluente.
3. Una volta che le cellule raggiungono la confluenza ottimale, rimuovere i mezzi di coltura da ciascun pozzo e quindi fissare le cellule incubandole in 0,5 ml di PFA al 4% (diluito in 1X PBS) e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
4. Rimuovere il fissativo e lavare i fori tre volte con 1 mL di 1X PBS.
5. Successivamente, permeabilizzare le cellule aggiungendo 0,5 ml di Triton-X-100 allo 0,1% in 1X PBS a ciascun pozzezzo e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
6. Aspirare il tampone di permeabilizzazione e lavare i pozzi tre volte con 1 mL di 1X PBS.
7. Le cellule su coverslips sono ora fisse e permeabilizzate. Procedere alla procedura di colorazione dimostrata per il seguente esempio di immunoistochimica, con l'eccezione che le incubazioni devono essere eseguite all'interno dei pozzetti della piastra a 24 pozzetti piuttosto che direttamente su un vetrino di sezione tissutale.

2. Preparazione di sezioni fissate con formalina e incorporata in paraffina per la colorazione

1. Ottenere sezioni di tessuto incorporate in paraffina fissate in formalina preparate.

Deparaffinizzazione

2. Immergere le diapositive in 100% xilene 2 volte per 5 minuti ciascuna.

Reidratazione

3. Immergere le diapositive in etanolo al 100% 2 volte per 3 minuti ciascuna.
4. Immergere i vetrini in etanolo al 95% per 3 min.
5. Immergere i vetrini in etanolo al 70% per 3 min.
6. Immergere i vetrini in etanolo al 50% per 3 min.

Blocco dell'attività della perossidasi endogena

7. Incubare i vetrini in 100 mL di 0,3% H₂O₂ per 30 min a temperatura ambiente.
8. Lavare le diapositive con 1X PBS 2 volte per 5 minuti ciascuna.

Recupero dell'antigene

9. Immergere i vetrini nel tampone citrato IHC (pH 6) e farli bollire per 20 minuti.
10. I vetrini in tessuto sono ora pronti per la colorazione.

3. Preparazione di sezioni fresche congelate, OTC-Embedded per la colorazione

1. Posizionare 5 mm di tessuto fresco isolato in uno stampo e aggiungere OCT fino a quando la sezione non è completamente coperta.
2. Immergere lentamente il blocco di tessuto in azoto liquido fino a completo congelamento. Il campione può ora essere conservato a -80°C per un massimo di 1 anno.
3. Una volta pronto per il sezionamento, trasferire il blocco di tessuto congelato su un criostato e consentire all'intera configurazione di arrivare a -20 ° C.
4. Tagliare sezioni di tessuto spesse 5-10 μm usando un criostato e utilizzare la spazzola per posizionare le sezioni direttamente su vetrini compatibili IHC.
5. Lasciare asciugare le diapositive durante la notte a temperatura ambiente. Le diapositive possono anche essere conservate a -80°C.
6. Immergere i vetrini in 250 ml di PFA al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente per fissare i vetrini prima della colorazione. Il metodo di fissazione ottimale dovrebbe essere determinato dall'utente.
7. Immergere le diapositive in 250 mL di 1X PBS 2 volte per 5 minuti ciascuna.
8. Immergere le diapositive in 250 mL di 0,3% H₂O₂ per 30 minuti a temperatura ambiente al fine di bloccare qualsiasi attività endogena della perossidasi.
9. Immergere le diapositive in 250 mL di 1X PBS 2 volte per 5 minuti ciascuna.
10. Le diapositive sono ora pronte per la colorazione.

4. Colorazione

1. Circondare il tessuto con una barriera idrofoba usando una penna barriera.

Inceppamento

2. Utilizzando una pipetta, posizionare 100 μL di tampone bloccante (siero di cavallo diluito in 1X PBS) - sopra la sezione per 1 ora a temperatura ambiente.
3. Rimuovere il buffer di blocco utilizzando una pipetta.

Incubazione di anticorpi primari

4. Incubare il tessuto circondato con 100 μL di soluzione anticorpale primaria diluita (ciclina D1 anti-umana di topo diluita 1:100 in tampone bloccante) per 30 minuti a temperatura ambiente.
5. Scaricare l'anticorpo primario da ogni vetrino e lavare i vetrini con 1X PBS 2 volte per 5 minuti ciascuno.

Incubazione di anticorpi secondari

6. Incubare il campione con 100 μL di anticorpo secondario biotinilato diluito (IgG di cavallo biotinilato anti-topo diluito 1:200) per 30 minuti a temperatura ambiente.
7. Rimuovere l'anticorpo secondario drenando le sezioni e lavare con 1X PBS 2 volte per 5 minuti ciascuna.

Sviluppo del colore

8. Visualizzazione utilizzando HRP: aggiungere 100 μL di reagente del complesso avidina-biotina (ABC) e incubare le sezioni al buio per 30 minuti a temperatura ambiente
   Nota: Gli anticorpi marcati con fluorescenza possono anche essere utilizzati e visualizzati utilizzando un microscopio appropriato.
9. Lavare le diapositive con 1X PBS 2 volte per 5 minuti ciascuna.
10. Sviluppare le diapositive incubando le sezioni in 100 μL di DAB per un massimo di 5 minuti.
11. Interrompere lo sviluppo aggiungendo acqua distillata (dH₂O) per 5 minuti a temperatura ambiente.

Controbattere (se lo si desidera)

12. Immergere brevemente i vetrini nella soluzione di ematossilina Harris (o verde metile allo 0,5% in acetato di sodio 0,1 M (pH 4,2)) per 10 minuti.
13. Risciacquare la controstita lavando i vetrini in dH₂O due volte per 5 minuti ciascuno.

Disidratazione

14. Immergere i vetrini in etanolo al 95% 2 volte per 5 minuti ciascuno.
15. Immergere le diapositive in etanolo al 100% 2 volte per 5 minuti ciascuna.
16. Immergere le diapositive in 100% xilene 2 volte per 5 minuti ciascuna.
17. Asciugare le diapositive con un asciugamano di carta.

Montaggio e applicazione coverslip

18. Aggiungere una goccia di supporto di montaggio come Organo-Limonene Mount alle diapositive e posizionare un coperchio sulle sezioni.

Analisi microscopica

19. Osservare le sezioni macchiate sotto un microscopio appropriato per l'analisi. Qui è stato utilizzato un microscopio ottico standard per l'osservazione e una fotocamera digitale montata è stata utilizzata per l'imaging.