Immunoistochimica e immunocitochimica: imaging dei tessuti tramite microscopia ottica

L'immunocitochimica e l'immunoistochimica sono metodi di colorazione per una proteina di interesse rispettivamente nelle cellule e nei tessuti in coltura. Il principio di base di entrambe le tecniche correlate prevede l'utilizzo di anticorpi specifici marcati con un sistema di rilevamento per identificare e visualizzare la proteina e determinare la sua posizione all'interno delle cellule e dei tessuti, nonché i relativi livelli. Il processo in entrambi gli esperimenti inizia con la preparazione del campione.

Per l'immunocittochimica, che visualizza in modo specifico le posizioni delle proteine o degli antigeni nelle cellule, ciò comporta tre passaggi. La prima fase è la piastratura, che comporta la coltura delle cellule nei terreni di crescita su un vetrino coprioggetti o un vetrino, in genere, nei pozzetti di una piastra di coltura. Segue la fissazione, in cui un agente precipitante o reticolante come la paraformaldeide viene aggiunto alle cellule per preservare l'integrità strutturale delle proteine e impedire all'attività enzimatica di degradarle. L'ultimo passaggio è la permeabilizzazione, che prevede l'aggiunta di un detergente per rendere le membrane cellulari permeabili per la colorazione.

Nel metodo della controparte, l'immunoistochimica, le proteine o gli antigeni vengono visualizzati nei tessuti e la preparazione del campione prevede cinque fasi. In primo luogo, l'intero tessuto viene sottoposto a fissazione, solitamente con paraformaldeide. Segue l'inclusione del tessuto in un blocco di paraffina e quindi il sezionamento di questo blocco utilizzando una macchina chiamata microtomo per tagliare il tessuto in fette sottili che possono essere posizionate su vetrini. Successivamente, i vetrini vengono sottoposti a deparaffinazione o rimozione della paraffina intorno alla fetta di tessuto. Quindi, è possibile eseguire una fase facoltativa di recupero dell'antigene. Questo può essere fatto utilizzando il calore o gli enzimi per smascherare gli epitopi che sono stati reticolati durante la fissazione, rendendoli disponibili per il legame degli anticorpi. Dopo l'appropriata preparazione del campione, un anticorpo primario specifico per il bersaglio viene aggiunto al campione di cellule o tessuti. Questo anticorpo primario dovrebbe legarsi alla proteina di interesse. Successivamente, viene aggiunto un anticorpo secondario, che rileva e si lega all'anticorpo primario. Questo anticorpo secondario è coniugato o può legarsi a un enzima chiamato HRP. Quando viene aggiunto il suo substrato specifico, il DAB, l'HRP lo converte in un precipitato marrone insolubile. Questa macchia marrone segna la posizione della proteina bersaglio. I vetrini sono anche colorati con ematossilina, che etichetta i nuclei in blu e fornisce un punto di riferimento spaziale per determinare la localizzazione subcellulare. Successivamente, il supporto di montaggio viene aggiunto al vetrino, seguito da un vetrino coprioggetto per sigillare e preservare il campione colorato. Infine, i vetrini possono essere visualizzati con un microscopio ottico.

In questo video, osserverai la tecnica di preparazione del campione per le cellule piastrate e le sezioni di tessuto, seguita dall'immunocolorazione delle sezioni di tessuto.

Innanzitutto, le celle di interesse devono essere posizionate sui vetrini. A tale scopo, lavorando in una cappa per coltura tissutale, posizionare i singoli vetrini coprioggetti nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Quindi, chiudere l'anta e accendere la luce UV per sterilizzare i vetrini coprioggetti per almeno 15 minuti. Quindi, spegni la luce UV. Per sollevare le cellule di interesse da un piatto confluente di 10 centimetri, aspirare il terreno, lavare brevemente con PBS e aggiungere tripsina alle cellule per 2 minuti. Quindi, picchiettare il lato della piastra per assicurarsi che le cellule si siano staccate e neutralizzare la tripsina con il terreno. Quindi, aggiungi 0. 5 mL di sospensione cellulare in ciascun pozzetto, assicurandosi di coprire i vetrini. Posizionare la piastra in un incubatore a CO2 umidificato e lasciare che le cellule crescano a 37 gradi Celsius fino a quando non sono confluenti al 50-70%.

Una volta che le cellule raggiungono la confluenza ottimale, aspirare il terreno di coltura da ciascun pozzetto, quindi fissare le cellule incubandole in . 5 mL di paraformaldeide al 4% diluita in 1X PBS per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso il fissativo, sciacquare le cellule aggiungendo 1 mL di 1X PBS su ogni vetrino coprioggetti. Aspirare immediatamente il PBS, quindi ripetere il risciacquo altre 2 volte per un totale di 3 lavaggi.

Ora, permealizzare le cellule aggiungendo 0,5 mL di Triton X-100 allo 0,1% in 1X PBS a ciascun pozzetto. Lasciare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti. Aspirare il tampone di permeabilizzazione e quindi sciacquare le cellule aggiungendo 1 ml di PBS 1X in ciascun pozzetto. Aspirare immediatamente il PBS e ripetere il risciacquo altre 2 volte per un totale di 3 lavaggi. Ora che le cellule sui vetrini coprioggetti sono fissate e permeabilizzate, procedere con la procedura di colorazione dimostrata per il seguente esempio di immunoistochimica, con l'eccezione che le incubazioni devono essere eseguite all'interno dei pozzetti della piastra a 24 pozzetti piuttosto che direttamente su un vetrino di sezione di tessuto.

Per iniziare, ottenere sezioni di tessuto preparate, fissate in formalina e incluse in paraffina. Deparaffinare i vetrini inserendoli in un rack per vetrini e quindi immergendoli completamente in 250 mL di xilene al 100%. Lasciare incubare i vetrini per 5 minuti nello xilene. Quindi, rimuovi i vetrini dal contenitore, puliscili con un tovagliolo di carta e mettili in un nuovo bagno di xilene in un contenitore nuovo per altri 5 minuti.

Successivamente, reidratare le sezioni in una serie di soluzioni di etanolo graduato iniziando con etanolo al 100% per 3 minuti. Pulisci la griglia dei vetrini con un tovagliolo di carta e trasferisci i vetrini in un nuovo contenitore di etanolo al 100% per altri 3 minuti. Continuare questo ciclo di lavaggio, asciugatura con un tovagliolo di carta e trasferimento dei vetrini in un nuovo bagno seguendo le concentrazioni indicate di etanolo per il tempo specificato. Dopo il lavaggio finale con etanolo, pulire il rack con un tovagliolo di carta e incubare i vetrini in 100 mL di perossido di idrogeno al 3% per 30 minuti a temperatura ambiente al fine di bloccare qualsiasi attività della perossidasi endogena. Lavare i vetrini in 250 ml di 1X PBS per 5 minuti. Ripetere questo lavaggio in un contenitore di 1X PBS fresco per altri 5 minuti.

Successivamente, eseguire il recupero dell'antigene immergendo i vetrini in 250 ml di tampone citrato IHC a pH 6,0 e facendoli bollire per 20 minuti. Quindi, procedere con il protocollo di colorazione.

Per iniziare il processo di colorazione per l'IHC, cerchiare le sezioni con una penna idrofobica per identificare l'area minima che il tampone deve coprire. Quindi, utilizzare una pipetta per posizionare 100 microlitri di tampone bloccante, che in questo esperimento è siero di cavallo diluito in 1X PBS, sulla sezione. Incubare i vetrini per 1 ora a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere il tampone di blocco utilizzando una pipetta.

Successivamente, diluire l'anticorpo primario e il tampone bloccante a una diluizione 1:100 aggiungendo 990 microlitri di siero di cavallo diluito in 1X PBS in un 1. Provetta Eppendorf da 5 mL, seguita da 10 microlitri di anticorpo primario. Aggiungere 100 microlitri di anticorpo primario diluito a ciascuna sezione e incubare i vetrini per 30 minuti a temperatura ambiente. Quando suona il timer, drenare l'anticorpo primario da ciascun vetrino, quindi lavarli in 250 ml di 1X PBS per 5 minuti. Ripetere il lavaggio ancora una volta con 1X PBS fresco.

Mentre i vetrini vengono lavati in 1X PBS, diluire l'anticorpo secondario a una diluizione 1:200 aggiungendo 995 microlitri di tampone bloccante a una provetta da 1,5 mL seguiti da 5 microlitri dell'anticorpo secondario, che in questo caso è IGG biotinilato di cavallo anti-topo. Aggiungere 100 microlitri di anticorpo secondario diluito a ciascuna sezione, quindi incubare i vetrini per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, rimuovere l'anticorpo secondario drenandolo dalle sezioni, quindi lavare i vetrini in 250 ml di 1X PBS per 5 minuti. Ripetere questo lavaggio utilizzando 1X PBS fresco.

Ora, aggiungi 100 microlitri di reagente del complesso avidina-biotina e incuba le sezioni al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, lavare i vetrini immergendoli in 250 mL di 1X PBS per 5 minuti. Analogamente ai passaggi di lavaggio precedenti, ripetere questo lavaggio ancora una volta utilizzando 1X PBS fresco. Successivamente, sviluppare i vetrini incubando le sezioni in 100 microlitri di DAB per un massimo di 5 minuti. Arrestare lo sviluppo immergendo le sezioni in 250 ml di acqua distillata per 5 minuti.

Ora, i vetrini possono essere controcolorati, se lo si desidera. Per fare ciò, immergere brevemente i vetrini in 250 ml di soluzione di ematossilina Harris. Risciacquare la macchia di contrasto lavando i vetrini in 250 ml di acqua distillata per 5 minuti. Ripetere questo lavaggio ancora una volta utilizzando acqua distillata fresca. Quindi, disidrata le sezioni. Per fare ciò, incubare prima i vetrini in etanolo al 95% per 5 minuti. Tamponare i vetrini su un tovagliolo di carta e trasferirli in un nuovo contenitore di etanolo fresco al 95% per altri 5 minuti. Continuare il ciclo di lavaggio, tamponando con carta assorbente e trasferendo i vetrini in un nuovo bagno, seguendo le soluzioni indicate per 5 minuti ciascuna.

Dopo l'incubazione finale, tamponare i vetrini con un tovagliolo di carta, quindi aggiungere una goccia di terreno di montaggio, come Organo-Limonene Mount, ai vetrini. Ora, posiziona un vetrino coprioggetti sulle sezioni, facendo attenzione a non intrappolare bolle d'aria. I vetrini sono ora pronti per essere osservati al microscopio per l'analisi.

Per osservare le sezioni colorate, utilizzare un microscopio ottico standard per visualizzare la macchia e una fotocamera digitale per catturare l'immagine. In questo particolare esempio di IHC, i tessuti della milza di topi wild type e spontanei, a doppia transgenica o DTG, sono stati confrontati per studiare l'espressione della dicilina D1 nel linfoma. I tessuti sono stati incorporati in paraffina, sezionati e colorati con l'anticorpo anticiclina D1 e sottoposti a imaging con ingrandimento 20X. Le cellule che esprimono la ciclina D1 sono indicate dal colore bruno-rossastro sullo sfondo blu del tessuto. Confrontando le intensità di colorazione tra le immagini dei vari topi, le milze non ingrossate hanno quantità relativamente basse di espressione di ciclina D1 indipendentemente dal genotipo del topo. Al contrario, la milza ingrossata del topo DTG mostra un aumento della colorazione bruno-rossastra, indicando una correlazione tra lo sviluppo del cancro e l'espressione della ciclina D1 in questo modello murino.