Name: Un metodo HPLC lectina per arricchire Peptidi selettivamente glicosilata da campioni biologici complessi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-01T21:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 23 s
Description: Scopri l'arricchimento di glicopeptidi da plasma umano mediante cromatografia di affinità a lectina HPLC. Questo metodo migliora l'isolamento selettivo per la scoperta di biomarcatori in proteomica.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Technologies Proteomica clinica per il cancro iniziativa, 5U24CA126477-04.

1) Preparare lectina coniugato colonne POROS <ol><li> Indossare una maschera per la protezione contro l&#39;inalazione di Poros-AL perline durante le fasi di 1,1-1,2. Pesare la quantità desiderata di perline POROS (100 mg beads/300 microlitri di volume finale) e trasferire in una provetta pulita eppendorf. </li><li> Lavare le perline con l&#39;aggiunta di 1 ml di soluzione salina tampone fosfato (PBS). Perle di pellet per centrifugazione in una microcentrifuga alla massima velocità per 3 minuti. Rimuovere il surnatante e ripetere il lavaggio. </li><li> Pesare la quantità desiderata di lectina non coniugato (1 - 4 mg / 200 perline microlitri) e trasferirlo in una provetta pulita eppendorf. Aggiungi PBS per formare un 5 - 20 mg / ml soluzione. Riserva di 25 ml di questa soluzione. </li><li> Trasferire la soluzione rimanente lectina ai talloni POROS. Aggiungi cyanoborohydride di sodio ad una concentrazione finale di 50 mm. Posizionare il tubo su una sedia a dondolo e reagire notte a temperatura ambiente. (Nota:. Cyanoborohydride sodio è tossico e deve essere gestito in una cappa aspirante I rifiuti contaminati devono essere smaltite in modo appropriato.) </li><li> Pellet le perline POROS come al punto 1.2. Rimuovere il surnatante e salvarli come il post-coniugazione soluzione. </li><li> Lavare le perline con 1 mL di tampone tempra (1 M Tris-Cl, pH 7,4). Perline pellet come al punto 1.2 e in modo sicuro surnatante. </li><li> Bloccare i siti rimanenti reattivi sulle palle POROS con 1 mL di tampone tempra. Aggiungi cyanoborohydride di sodio ad una concentrazione finale di 50 mm. Posizionare il tubo su una sedia a dondolo e incubare a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Perline pellet come al punto 1.2 e scartare il surnatante. </li><li> Lavare con 1 ml di perline 1 M NaCl. Perline pellet surnatante e gettarlo. Ripetere quattro volte per un totale di cinque lavaggi. Le perle sono ora pronti per il confezionamento. </li><li> Per determinare la quantità di proteina che è stato coniugato con le perline POROS, eseguire un test di concentrazione di proteine ​​sulle soluzioni lectina pre-coniugato e post-coniugati. La differenza di concentrazione è la quantità di proteina che è stato coniugato con le perline. La quantità di proteina coniugata per volume cordone uguale la concentrazione di lectina sul perline. Concentrazioni di lectina target sono tra 2 -20 mg / ml. </li></ol> 2) Imballaggio della lectina coniugato perle POROS in una colonna PEEK <ol><li> Assemblare il sistema di imballaggio (segue descrizione) e il supporto su un supporto ad anello in metallo. Il sistema è composto da imballaggio, dal basso verso l&#39;alto, limitatore di pressione, colonna fine accoppiatore 1, fritta, colonna (2 x 50 mm), colonna accoppiatore end 2, connettore colonna, colonna fine accoppiatore 3, colonna (4,5 x 50 mm), fine accoppiatore colonna 4 e il montaggio finale. La colonna superiore funge da serbatoio per il materiale di imballaggio. </li><li> Risospendere le sfere POROS nel volume desiderato di tampone A (10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM di cloruro di sodio, cloruro di calcio 10 mM, 10 mM cloruro di magnesio). Se una colonna di imballaggio (~ 200 microlitri di volume letto), risospendere in 400 A. Buffer microlitri </li><li> Trasferimento coniugato perline POROS nella colonna superiore (il serbatoio). Aggiungi tampone A al serbatoio fino a quando il buffer raggiunge la cima della colonna. Posizionare con delicatezza il raccordo finale sulla parte superiore della colonna, cercando di evitare bolle d&#39;aria nella colonna. Collegare il raccordo fine della colonna superiore per il sistema HPLC. </li><li> Pacco la colonna che scorre tampone A attraverso il sistema. Inizia con una portata di 0,5 ml / min. Aumentare la velocità di flusso di 0,5 mL / min ogni minuto fino a quando 4 mL / min o la pressione massima (3000 psi) è stato raggiunto. Continua alla portata massima possibile fino almeno 35 ml di tampone A sono passati attraverso la colonna. </li><li> Spegnere le pompe e permettere la pressione sulla colonna per scendere a &lt;20 psi. </li><li> Delicatamente, smontare il sistema di imballaggio, a partire dall&#39;alto. Quando la colonna 2 della fine accoppiatore è raggiunto, rimuovere con attenzione. Alcuni imballaggi sono da estrusione dalla parte superiore della colonna. Con una lametta o simili bordo affilato, rimuovere delicatamente le perline estrusione, lasciando una superficie delle sfere che è anche con la parte superiore della colonna. Non applicare la pressione ai talloni mentre fanno questo. </li><li> Sganciare la colonna confezionato dallo stand anello. Inserire una nuova fritta in un accoppiatore nuova fine e girare la colonna riempita oltre a collegare questo con la fritta / fine accoppiatore sul aperti (ex superiore) fine colonna. </li><li> Etichetta di colonna in modo appropriato. Ora è pronto per l&#39;uso. Quando non in uso, la colonna possono essere memorizzati in PBS con sodio azide 0,02% a 4 ° C per un massimo di 6 mesi. </li></ol> 3) Programmare il metodo HPLC <ol><li> I dettagli della programmazione del HPLC varierà a seconda delle specificità dei software del produttore. Usiamo un paradigma MG4 Michrom HPLC. Su questa macchina, i metodi sono costruiti e accedere sotto la scheda &quot;Impostazioni&quot; nella parte superiore dello schermo. Programmare il seguente metodo: <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Tempo </td><td> Portata (microlitri / min) </td><td> % A </td><td> % B </td></tr><tr><td> 00:00 </td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 09:00 </td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 09:01 </td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13:50 </td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13:51 </td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 19:50 </td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> Tampone A: 10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM di cloruro di sodio, cloruro di calcio 10 mm, 10 mM di cloruro di magnesio Buffer B: 0,5 M acido acetico Il rilevatore di raggi UV deve essere programmato per leggere a 280 nm 0:00-19:50. L&#39;asse y deve essere regolato per rilevare a basso assorbimento livelli, ad esempio, 0 -. 50 UA. </li><li> Se un campionatore automatico è disponibile, programma il seguente calendario per la raccolta della frazione. In caso contrario, raccogliere le frazioni a mano, come indicato durante l&#39;esecuzione di cromatografia. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Frazione </td><td> Ritardo alla raccolta di iniezione del campione </td><td> Durata della raccolta (min) </td></tr><tr><td> Flow-through </td><td> 2,8 </td><td> 4,1 </td></tr><tr><td> Legato </td><td> 9 </td><td> 2,6 </td></tr></tbody></table></li></ol> 4) Preparare i campioni per HPLC <ol><li> Prima di utilizzare in questo protocollo, plasma umano dovrebbe essere impoverito del 14 proteine ​​più abbondanti, con una colonna MARS (Agilent, Santa Clara, CA). Impoverito plasma umano lattoferrina e invertasi lievito deve essere valutata individualmente tripsina-digerito e dissalati come descritto in precedenza 1. </li><li> Per preparare la lectina specifica lattoferrina standard, eseguire la cromatografia su 50 ug-tripsina digerito lattoferrina oltre sia il AAL o la colonna SNA usando il metodo nella parte 3. La frazione legata conterrà lectina specifica glicopeptidi lattoferrina. Neutralizzare i campioni come nella parte 4.4, e desalt come in parte 6. Risospendere il campione in 1 ml di tampone A. Il campione risultante è pronto per l&#39;uso. </li><li> Tre sperimentale replica verrà eseguita. Per la preparazione del campione per tre repliche, aggiungere 3 pmol di tripsina-digerito invertasi e 1 ml di lectina specifica lattoferrina (sia AAL-LAC o SNA-ALC) a 30 microlitri MARS-impoverito, tripsina-digerito, equivalenti al plasma (PE). Un PE è definito come il volume di plasma non-processed/intact/original da cui provengono una data quantità di trattati al plasma (MARS-tripsina impoverito e digerito). Aggiungi tampone A al campione di raggiungere un volume finale di 330 microlitri. </li><li> Aggiungi buffer di neutralizzazione (1 M Tris pH 8,0), per le provette del campione che raccoglierà eluato. Il numero e il volume di flaconcini di lavorare con dipenderà dalle costrizioni del campionatore automatico. Per il paradigma MG4, un flaconcino raccoglie la flow-through e due raccogliere l&#39;eluato. Richiederà circa 1,5 ml Tampone Tris di neutralizzare 1 ml di eluato. PH neutralizzato obiettivo è 7,0-8,0; test del pH prova finale con una cartina di tornasole. </li></ol> 5) Eseguire la cromatografia <ol><li> Tutte le piste vuote e il campione che seguono utilizzerà il metodo descritto nella parte 1. La colonna e buffer sono a temperatura ambiente durante l&#39;uso. Le colonne sono conservati a 4 ° C, mentre i buffer vengono conservati a temperatura ambiente. </li><li> Attaccare o il AAL o la colonna lectina SNA al sistema HPLC ed eseguire due metodi vuoto (iniezione di buffer solo A). Assicurarsi che la colonna lectina corrisponde alla lectina specifica lattoferrina (Parte 2). </li><li> Cromatografo i tre campioni di plasma, l&#39;iniezione di un vuoto tra ogni campione iniettato, per un totale di 7 corre HPLC. Frazioni da corre vuoto non devono essere raccolti. </li></ol> 6) Desalt raccolti frazioni Per ogni frazione utilizzare uno da 1 ml Acque Oasis HLB cartuccia SPE come segue: <ol><li> Fissare il numero di cartucce necessarie al collettore vuoto. </li><li> Bagnate ogni cartuccia con 1 mL ACN 80% in 1% di acido formico (vacuometro sul collettore dovrebbe leggere 5-20 lnHg). </li><li> Equilibrare cartucce con 1,5 ml di acido formico allo 0,1% (vacuometro sul collettore dovrebbe leggere 5-20 lnHg) </li><li> Carico intero volume di un campione su una cartuccia (Vuotometro sul collettore dovrebbe leggere 2 -. 2,5 lnHg, e portata non dovrebbe superare 1 ml / min) </li><li> Lavare le cartucce con 3 x 1 ml di acido formico allo 0,1% (Vuotometro sul collettore dovrebbe leggere 5-20 lnHg) </li><li> Peptidi eluire / glicopeptidi in tubi eppendorf etichettati con 1 x 1 mL acetonitrile 80% a 0,1% acido formico. (Vuotometro sul collettore dovrebbe leggere 2-2,5 lnHg, e portata non dovrebbe superare 1 ml / min.) Un tubo di raccolta unica dovrebbe essere utilizzato per ogni cartuccia. </li><li> Neutralizzare eluato con l&#39;aggiunta di 60 microlitri di bicarbonato di ammonio 0,5 M per ogni tubo di raccolta. Obiettivo neutrpH è alized è 7,0-8,0; pH prova finale con una cartina di tornasole. </li><li> Concentrato peptidi eluiti / glicopeptidi a ~ 50 microlitri eseguendoli su una centrifuga a vuoto (ad esempio, Thermo Savant SpeedVac) per circa 2 ore a 35 ° C. </li></ol> 7) PNGase F-digestione <ol><li> PH del campione di prova per assicurarsi che sia tra 7,0-8,0. Se necessario, aggiungere 50 bicarbonato di ammonio mM per aumentare il pH. Se il volume del campione finale è&gt; 100 l, campione speedvac fino a quando non è tra 50-100 microlitri. </li><li> Aggiungere 0,5 microlitri (250 U) glicerolo senza F PNGase a ciascuna provetta ed incubare a 37 ° C durante la notte. </li></ol> 8) campioni Suggerimento Zip <ol><li> A partire da PNGase F-digerito campioni, ziptip ognuno nel modo seguente. </li><li> Ziptip bagnato con 10 microlitri acetonitrile al 100%, seguita da 10 microlitri acetonitrile 80%, 0,1% di acido formico. </li><li> Equilibrare ziptip con 20 microlitri di acido formico 0,1%. </li><li> Caricare il campione attraverso la ziptip pipettando su e giù attraverso la matrice ziptip 10 volte. </li><li> Lavare la ziptip pipettando 10 microlitri di acido formico 0,1%, 5 volte. </li><li> Eluire il campione in una provetta eppendorf pulita con 10 microlitri acetonitrile 80%, 0,1% di acido formico. </li><li> Ripetere l&#39;eluizione e aggiungere il secondo 10 microlitri nel tubo stesso. </li><li> Speedvac i campioni ad un volume di &lt;2 microlitri. </li><li> Risospendere i campioni in 20 microlitri di acido formico 0,1%. I campioni sono ora pronti per l&#39;analisi LC-MS/MS. </li></ol> 9) Risultati Rappresentante: La coniugazione POROS rendimenti generalmente concentrazioni lectina sul tallone nel range di 2 - 20 mg / mL. Questo è ottimale per cromatografia di affinità. Cromatografia lectina di tripsina-digerito MARS-impoverito plasma umano arricchisce tipicamente glicopeptidi nella frazione legata. Mentre il glicopeptidi sono PNGase F-trattati prima LC-MS/MS, essi sono identificati come peptidi con la N-linked sequenza consenso, NXS / T (dove X è un qualsiasi residuo, prolina), in cui l&#39;asparagina è stato convertito in un acido aspartico attraverso l&#39;azione di PNGase F. Peptidi con queste caratteristiche sono considerati peptidi deglicosilata (o &quot;deglycopeptides&quot;). In media la flow-through (FT) frazione da AAL o SNA cromatografia contiene deglycopeptides 2-4%, mentre il 30-50% dei peptidi recuperato nella frazione legata sono deglycopeptides. Di solito, usando una Elite QStar, 1000-1300 peptidi saranno identificati nella frazione FT, e 200-400 peptidi saranno identificati nella frazione legata. Due o più deglycopeptides invertasi distinte devono essere osservate nella frazione FT e due o più distinte deglycopeptides lattoferrina nella frazione legata (Tabella 1). <img src="/files/ftp_upload/1398/1398table.jpg" alt="Tabella 1" /> Tabella 1.

<ol><li>Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((multiplexed+assays+for+low+abundance+proteins+in+plasma+by+targeted+mass+spectrometry+and+stable+isotope+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 2212-2229 (2007).</li>
</ol>

Questo protocollo fornisce un metodo rapido per isolare e identificare glicopeptidi in una glycan specifico modo. Come glicosilazione varia ampiamente all&#39;interno di un organismo, in particolare durante lo sviluppo e la patogenesi, questa tecnica può essere applicabile per affrontare una vasta gamma di domande. In particolare, stiamo usando il metodo per arricchire selettivamente glicopeptidi che sono stati modificati con associata al cancro epitopi come primo passo verso la scoperta di biomarcatori.

<table><tbody><tr><td>Plasma umano</td><td></td><td></td><td>Prodotto in laboratorio</td></tr><tr><td>Lattoferrina umana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0520</td><td>Digerire con tripsina prima dell'uso</td></tr><tr><td>Invertasi di lievito</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0408</td><td>Digerire con tripsina prima dell'uso</td></tr><tr><td>Cartucce SPE Oass HLB</td><td>Waters</td><td>WAT094225</td><td>Volume di 1 cc</td></tr><tr><td>Punte pipetta ZipTip</td><td>Fisher Scientific</td><td>ZTC1 8M0 96</td><td>Millipore, C18 per pipetta da 10 ml</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td>99%</td></tr><tr><td>Bicarbonato di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6141</td><td>99%</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>96%</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>98%</td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242853</td><td>99,7%</td></tr><tr><td>Carta indicatrice del pH</td><td>Fisher Scientific</td><td>M95903</td><td>Intervallo 0-14</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998</td><td>99,9%</td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>28905</td><td>99%</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata al fosfato</td><td>Invitrogen</td><td>14190-136</td><td>Senza calcio e magnesio</td></tr><tr><td>Azoturo di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71289</td><td>99,5%</td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>New England Biolabs</td><td>P0705L</td><td>Senza glicerolo</td></tr><tr><td>Imbocchi filtranti sotto vuoto</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGVU05RE</td><td>Porosità 0,2 mm</td></tr><tr><td>Perle POROS-AL</td><td>Applied Biosystems</td><td>1-6028-02</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aleuria aurantia&lt;/em&gt; lectina</td><td>Vector Laboratories</td><td>L-1390</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sambucus nigra&lt;/em&gt; agglutinina</td><td>Vector Laboratories</td><td>L-1300</td><td></td></tr><tr><td>Cianoboroidruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296945</td><td>Soluzione 5,0 M</td></tr></tbody></table>

un metodo hplc lectina per arricchire peptidi selettivamente glicosilata da campioni biologici complessi

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glicani sono una classe importante di modificazioni post-traduzionali. Tipicamente presenti su secreto e molecole extracellulari, strutture glycan segnalare lo stato interno della cellula. Glicani sulle cellule tumorali tendono ad avere abbondante acido sialico e frazioni fucosio. Proponiamo che queste associata al cancro varianti glycan essere sfruttata per lo sviluppo di biomarcatori volti a diagnosticare in fase iniziale della malattia. Di conseguenza, abbiamo sviluppato una spettrometria di massa a base di flusso di lavoro che incorpora cromatografia su matrici di affinità formata da lectine, proteine ​​che si legano strutture glycan specifici. Le lectine Sambucus nigra (SNA) e Aleuria aurantia (AAL), che legano l&#39;acido sialico e fucosio, rispettivamente, sono state accoppiate in modo covalente a microsfere POROS (Applied Biosystems) e confezionata in colonne PEEK per cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC). In breve, il plasma è stato impoverito dei quattordici proteine ​​più abbondanti con un sistema di rimozione più affinità (MARS-14; Agilent). Impoverito plasma è stato tripsina-digerito e separati in flow-through e le frazioni vincolato da SNA o AAL HPLC. Le frazioni sono stati trattati con PNGaseF per rimuovere N-glicani legate, e analizzati da LC-MS/MS su Elite QStar. I dati sono stati analizzati utilizzando il software Mascot. Il disegno sperimentale inclusi controlli positivi-fucosylated e sialylated umano glicopeptidi e lattoferrina negativo glicopeptidi mannosio controlli alto da Saccharomyces cerevisiae, che sono stati utilizzati per monitorare la specificità di cattura lectina. Le caratteristiche principali di questo flusso di lavoro includono la riproducibilità derivato dal formato HPLC, l&#39;identificazione positiva dei glicopeptidi catturato e PNGaseF trattati dai loro motivi Asn-Xxx-Ser/Thr deamidato, e valutazione della qualità utilizzando standard glicoproteina. Protocollo di ottimizzazione incluso anche determinare il rapporto appropriato di materiale di partenza alla capacità di colonna, individuando la cattura più efficiente e buffer di eluizione, e il monitoraggio della PNGaseF-trattamento per garantire la piena deglycosylation. Direzioni future includono l&#39;utilizzo di questo flusso di lavoro di effettuare la spettrometria di massa a base di esperimenti di scoperta sul plasma da pazienti affetti da tumore al seno e individui di controllo.

Lectina coniugato perline POROS sono stati impiegati per HPLC. Standard glicopeptide serviti come controlli positivi e negativi. MARS-14 impoverito, tripsina-digerito plasmatiche umane è stato cromatografato e flow-through (FT) e le frazioni legato raccolti per analisi ESI-LC-MS/MS. Glicopeptidi sono stati arricchiti nella frazione legata, rispetto a FT.

Un metodo HPLC lectina per arricchire Peptidi selettivamente glicosilata da campioni biologici complessi

I glicani rappresentano un'importante classe di modificazioni post-traduzionali. Tipicamente presenti su molecole secrete ed extracellulari, le strutture dei glicani segnalano il...

Questa procedura permette l'isolamento specifico di glicopeptidi glicosilati dal plasma umano. Il plasma viene digerito con tripsina per ottenere una miscela di peptidi e glicopeptidi, insieme a standard di glicopeptidi. Controlli positivi e negativi per la cromatografia con lectina vengono aggiunti al plasma.Il campione viene sottoposto a cromatografia di affinità con lectine basata su cromatografia liquida ad alta pressione. Le lectine utilizzate riconoscono rispettivamente il diffuco e l'acido sialico; i peptidi e i glicopeptidi irrilevanti eluiscono dalla colonna nella frazione di flusso. Per eluire la frazione legata dalla colonna si utilizza l'acido acetico.Questo è arricchito per glicopeptidi specificamente modificati. Ciao, sono Penny Drake del laboratorio di Susan Fisher del Dipartimento di Ostetricia, Ginecologia e Scienze della Riproduzione e della struttura centrale di spettrometria di massa San Lamore presso l'Università della California di San Francisco. E io sono Eric Johansen, anch'io della struttura centrale di spettrometria di massa Sandler Moore e del Fisher Lab.Oggi vi mostreremo un procedimento per eseguire la cromatografia con lectina al fine di arricchire i glicopeptidi provenienti dal plasma umano e da altre miscele complesse. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio come strumento generale che ha numerose applicazioni. Ad esempio, svolge un ruolo importante nel nostro flusso di lavoro per la scoperta di biomarcatori del cancro al seno.Iniziamo. Per iniziare questa procedura, indossare una maschera per proteggersi dall'inalazione delle perle. Quindi pesare 100 milligrammi di perle di porro e trasferirli in un tubo einor pulito.Sono necessari circa 300 microlitri di perle per impacchettare una colonna. Inoltre, pesare la lectina non coniugata e trasferirla in una provetta einor pulita. Vengono utilizzate le lectine SNA e AAL.Procedere aggiungendo PBS alla lectina per ottenere una soluzione da cinque a venti milligrammi per millilitro. Riservare 25 microlitri di questa soluzione pre-coniugata. Successivamente, lavare le porro speeds aggiungendo un millilitro di PBS e centrifugando in un microcentrifugo alla velocità massima.Per tre minuti, rimuovere il soprannatante e ripetere il lavaggio. Ora lavorare nella cappa e trasferire la soluzione di lectina rimanente sui porro speeds lavati. Aggiungere sodio boroidruro a una concentrazione finale di 50 millimolari.Si noti che il boroidruro di sodio è tossico e i rifiuti devono essere smaltiti in modo appropriato. Chiudere in modo sicuro il tubo con un tappo e posizionarlo su un agitatore per far avvenire la reazione durante la notte a temperatura ambiente. Dopo il legame notturno della lectina ai porro speeds, centrifugare i porro speeds. Ancora una volta. Rimuovere il soprannatante e conservarlo come soluzione post-coniugazione per bloccare i siti reattivi residui sui bead.Prima, lavare le perle centrifugandole con un millilitro di tampone di arresto costituito da una soluzione uno molare di CL a pH 7,4. Quindi aggiungere un millilitro di tampone di arresto e sodio boroidruro ad una concentrazione finale di 50 millimolari. Posizionare il tubo su un agitatore rotante e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.La soppressione è ora completa. Centrifugare le perle, come in precedenza.Rimuovere il soprannatante e procedere a lavare le perle cinque volte con un millilitro di cloruro di sodio uno molare ogni volta, scartando il soprannatante. Eseguire un saggio di concentrazione proteica sulle soluzioni di lectina prima e dopo la coniugazione e utilizzare la differenza per determinare la quantità di proteina coniugata alle porro speeds. Le concentrazioni target di lectina sono comprese tra 2 e 20 milligrammi per millilitro, calcolate come quantità di proteina coniugata per volume di perle.I microsfera coniugati sono ora pronti per essere caricati in una colonna. Per caricare le microsfere in una colonna, assemblare il sistema di caricamento composto da due colonne supportate da un treppiede in metallo. La colonna superiore funge da serbatoio per il materiale di caricamento.Il sistema di imballaggio è composto, dal basso verso l'alto, da: restringitore di pressione, accoppiatore finale colonna uno per la colonna bersaglio, accoppiatore finale colonna, due connettori colonna, accoppiatore finale colonna tre, la colonna del serbatoio, accoppiatore finale colonna quattro e terminali. Successivamente, risospendere i 300 microlitri di porro speeds in 600.Microlitri di tampone A Per impaccare una colonna, trasferire le perle nel serbatoio superiore della colonna. Aggiungere il tampone A fino a quando non raggiunge la sommità della colonna. Posizionare delicatamente il raccordo terminale sulla parte superiore della colonna.Cercare di evitare bolle d'aria nella colonna. Collegare il raccordo finale della colonna superiore al sistema HPLC. Compattare la colonna facendo passare il tampone A o PBS attraverso il sistema.Iniziare con una portata di 0,5 millilitri al minuto. Aumentare la portata di 0,5 millilitri al minuto ogni minuto fino a raggiungere i 4 millilitri al minuto o la pressione massima. Proseguire alla portata massima possibile finché almeno 35 millilitri di tampone non abbiano attraversato la colonna.Al termine, spegnere le pompe e lasciare che la pressione sulla colonna scenda al di sotto di 20 PSI. Ora che la colonna è stata impaccata, smontare delicatamente il sistema di impaccamento a partire dalla sommità. Quando si raggiunge il secondo raccordo finale della colonna, rimuoverlo con attenzione.Utilizzando una lametta, rimuovere delicatamente il materiale compatto che fuoriesce dalla parte superiore della colonna. Non esercitare pressione sulle perle durante questa operazione. Sganciare la colonna impaccata dal supporto ad anello.Posizionare un nuovo frit in un nuovo raccordo terminale e capovolgere la colonna impaccata per collegarla al raccordo terminale FR presente all'estremità libera della colonna. La colonna è ora pronta per l'analisi HPLC. Quando non utilizzata, la colonna può essere conservata in PBS con azide di sodio allo 0,5% a quattro gradi Celsius per un periodo fino a sei mesi.I dettagli della programmazione del vostro HPLC variano a seconda dell'allestimento e delle specifiche del software del produttore. Qui utilizziamo un microme paradigm MG four HPLC su questa macchina. I metodi vengono creati e accessibili tramite la scheda setup nella parte superiore del programma dello schermo.Il metodo mostrato, che è anche descritto in dettaglio nel protocollo scritto allegato. Se si utilizza un programma per campionatore automatico, seguire anche il protocollo scritto. Utilizzare il tampone A come in precedenza e il tampone B per l'esecuzione della HPLC e mantenere sia i tamponi che le colonne a temperatura ambiente.Impostare il rivelatore UV in modo da leggere a due e 80 nanometri da zero a 19 minuti e 50 secondi. Regolare l'asse Y per rilevare livelli bassi di assorbanza nell'intervallo da zero a 50 unità di assorbanza. Successivamente, preparare i campioni.I campioni di prova derivano da plasma umano privato delle 14 proteine più abbondanti mediante una colonna MARS. I campioni di plasma depauperati e due standard, lactoferrina umana e invertasi di lievito, vengono rispettivamente digeriti con tripsina e desalati come precedentemente descritto.Per neutralizzare i campioni, avere pronto il tampone di neutralizzazione nei vial campione che raccoglieranno l'EIT per il paradigma MG: un vial raccoglie il flusso iniziale e tre vial raccolgono l'eluito. Saranno necessari circa 1,5 millilitri di tampone per neutralizzare un millilitro di EIT. Il pH desiderato dopo la neutralizzazione è compreso tra 7,0 e 8,0.Assicurarsi di verificare il pH finale utilizzando carta indicatrice del pH. Desalare i campioni come descritto più avanti in questo protocollo. E risospendere il campione in un millilitro di buffer A per ottenere i migliori risultati.Eseguire tre replicati sperimentali in modo che i dati possano essere confrontati e combinati. Per preparare i campioni per tre replicati, aggiungere tre picomoli di tripsina, invertasi digerita e un microlitro di lectina purificata tramite HPLC specifica per la lattoferrina a 30 microlitri di plasma digerito con tripsina deprivato di Mars o equivalente di plasma (pe). Ciò corrisponde a circa 50 microgrammi di proteina plasmatica utilizzata per ciascun replicato; aggiungere il buffer A al campione per raggiungere un volume finale di 330 microlitri, ovvero 110 microlitri per replicato sperimentale, utilizzando prima la colonna di lectina AAL oppure SNA. Eseguire due metodi vuoti iniettando soltanto il buffer A. Assicurarsi che la colonna di lectina corrisponda alla lectina specifica per la lattoferrina utilizzata come standard e precedentemente purificata mediante cromatografia.I tre campioni plasmatici vengono iniettati inserendo un bianco tra ciascun campione iniettato, per un totale di sette analisi HPLC. Le frazioni provenienti dalle corsie del bianco non devono essere raccolte. Ancora una volta, assicurarsi di neutralizzare i campioni aggiungendo tampone di neutralizzazione nei vial campione che raccolgono l'eluito dopo la desalazione e la digestione con P-N-G-A-F; a questo punto, i campioni saranno pronti per l'analisi spettrometrica di massa.Utilizzare un cartuccia da un millilitro di Waters Oasis H-L-B-S-P-E per ciascuna delle frazioni HBLC provenienti dal campione standard di lattoferrina e dai campioni sperimentali, al fine di desalinare. Iniziare collegando al manifold sotto vuoto il numero di cartucce necessarie. Inumidire ogni cartuccia con un millilitro di acetonitrile al 80% in acido formico all'1%.Il manometro a vuoto sul collettore deve indicare da cinque a venti pollici. Equilibrare le cartucce con 1,5 millilitri di acido formico 0,1%. Ancora una volta, il manometro a vuoto sul collettore deve indicare da cinque a venti pollici.Mercury carica l'intero volume di un campione su una cartuccia. Ora il manometro del vuoto sul manifold dovrebbe indicare da due a 2,5 pollici. Il mercurio e la velocità di flusso non devono superare un millilitro al minuto.Lavare le cartucce tre volte con un millilitro di acido formico 0,1% utilizzando un tubo di raccolta etichettato singolarmente per ogni cartuccia. Eluire i glicopeptidi con un millilitro di acetonitrile 80% in acido formico 0,1%, quindi neutralizzare l’EIT aggiungendo 60 microlitri di bicarbonato di ammonio 0,5 M a ciascun tubo di raccolta. Il pH neutralizzato desiderato è compreso tra 7,0 e 8,0.Assicurarsi di verificare il pH finale utilizzando carta indicatrice del pH. Concentrare i peptidi eluiti fino a circa 50 microlitri mediante centrifugazione in vuoto, ad esempio con un dispositivo Thermo Savant Speed Vac, per circa due ore a 35 gradi Celsius. Dopo la concentrazione, verificare nuovamente il pH del campione per assicurarsi che sia compreso tra 7,0 e 8,0. Se necessario, aggiungere bicarbonato di ammonio 50 millimolare per aumentare il pH.Se il volume finale del campione è superiore a 100 microlitri, concentrare il campione mediante centrifugazione in vuoto fino a raggiungere un volume compreso tra 50 e 100 microlitri. Infine, rimuovere i carboidrati N-legati dai peptidi aggiungendo 250 unità di peptidasi N-glicosidasi F priva di glicerolo o P-N-G-A-F a ciascun tubo del campione e incubare a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Dopo l'incubazione notturna con P-N-G-S-F, utilizzare puntali zip tip contenenti una matrice in fase inversa C 18 per desalare i campioni prima di iniziare.Preparare due gocce, una di acido formico 0,1% e una di acetonitrile 80% più acido formico 0,1%, su un pezzo di paraform per il lavaggio e l'eluzione. Le gocce vengono utilizzate per prevenire la contaminazione incrociata tra peptidi di diversi campioni e nuove gocce vengono preparate per ogni campione trattato con la pipetta. Iniziare inumidendo una zip tip con soluzioni di acetonitrile. Equilibrare la zip tip aspirando e dispensando su e giù per tre volte 10 microlitri di acido formico 0,1%.Caricare il campione pipettando su e gi&ugrave; 10 volte. Quindi lavare la punta con 10 microlitri di acido formico 0,1% per cinque volte. Infine, eluire il campione due volte con acetonitrile al 80% in acido formico 1%, raccogliendo i peptidi eluiti in un tubo Eppendorf.Ridurre il volume del campione a meno di due microlitri mediante concentrazione in un centrifugo sotto vuoto e completare risospendendo i campioni in 20 microlitri di acido formico 0,1%. I campioni sono ora pronti per l'analisi mediante L-C-M-S-M-S. La coniugazione porro fornisce tipicamente concentrazioni di lectina sulle perle nell'intervallo da due a 20 milligrammi per millilitro, valore ottimale per la cromatografia ad affinità.La cromatografia con lectine di plasma umano privato di albumina e digerito con tripsina arricchisce tipicamente i glicopeptidi nella frazione legata. Il nostro flusso di lavoro identifica i glicopeptidi N-legati, che contengono la sequenza conservata NXS o NXT, in cui X è qualsiasi residuo tranne la prolina. Il trattamento con PNGF rimuove i glicani legati e deamina il residuo di asparagina a cui i glicani erano attaccati.La datione provoca uno spostamento di massa di un Dalton del peptide desglicosilato o del deglicopeptide rispetto al peptide non modificato. Pertanto, i deglicopeptidi vengono identificati come peptidi contenenti la sequenza consenso per N-glicosilazione, in cui il residuo di asparagina all'interno della sequenza consenso è desammato, osservato come una differenza di massa di +1 rispetto a un residuo di asparagina non modificato. Qui, due spettri esemplificativi illustrano questo concetto.Lo spettro superiore mostra la frammentazione di un peptide non modificato contenente la sequenza consenso EnLink. Lo spettro inferiore mostra la frammentazione dello stesso peptide con il residuo di asparagina deaminato all'interno della sequenza consenso EnLink. Gli ioni molecolari cerchiati dei frammenti Y sette, Y otto e B tre del peptide deamidato presentano un aumento di massa di un Dalton rispetto ai corrispondenti frammenti del peptide non modificato.Questo spostamento di massa indica che il peptide nello spettro inferiore contiene un residuo di asparagina deamidato. Tipicamente, utilizzando un QStar elite, verranno identificati da 1000 a 1300 peptidi totali nella frazione di flusso iniziale e da 200 a 400 peptidi nella frazione legata. In media, la frazione di flusso iniziale da una cromatografia con a-l o SNA contiene dal 2 al 4% di peptidi deglicosilati, mentre dal 30 al 50% dei peptidi recuperati nella frazione legata sono peptidi deglicosilati.Utilizziamo il termine deg glicopeptidi piuttosto che glicopeptidi, poiché durante l'analisi spettrometrica di massa vengono osservate molecole deglicosilate e deamidate. Tuttavia, proponiamo che la maggior parte dei glicopeptidi DEG nei nostri campioni fossero in precedenza glicopeptidi non legati, che sono stati deglicosilati e deaminati dal trattamento con PN GF. L'arricchimento dei glicopeptidi deg nei nostri campioni legati supporta questa ipotesi e ci permette di utilizzare il rilevamento dei glicopeptidi D come indicatore indiretto dei glicopeptidi catturati mediante il nostro protocollo di cromatografia di affinità con lectine.Dovrebbero essere osservati due o più glicopeptidi distinti di invertasi d nella frazione di flusso e due o più glicopeptidi distinti di lattoferrina de nella frazione legata. Vi abbiamo appena mostrato come preparare colonne di lectina ed eseguire una cromatografia di affinità con lectina in formato HPLC. Quando si esegue questa procedura, è importante iniziare con campioni di glicopeptidi di alta qualità, monitorare il pH dei campioni durante tutto l'esperimento e confermare la qualità della cromatografia utilizzando standard di glicopeptidi.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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