Il rilascio di dopamina a singoli terminali presinaptici visualizzate con FFNs

Il neurotrasmettitore fluorescente falso. FFN 511 è il monoammina fluorescente che può agire come substrato per il trasportatore fisico di monoammine sinaptico quando viene applicato a fette di cervello. FFN 511 viene captato dalle vescicole sinaptiche dopaminergiche tramite il trasportatore di monoammine ed è utilizzabile per visualizzare direttamente il rilascio del neurotrasmettitore dai terminali presinaptici di neuroni monoamminergici, come quelli presenti nello strato S. Il rilascio del neurotrasmettitore dai terminali è visibile nella fetta come una riduzione dei segnali fluorescenti puntiformi.

In questo video, vengono preparate sezioni coronali di sal dello spessore di 250 micrometri utilizzando un vibratomo, colorate con FFN 511 e analizzate mediante microscopio a laser a due fotoni. Vengono mostrati esperimenti di imaging che rivelano un'eterogeneità dipendente dalla frequenza del rilascio di iCal. Ciao, sono HU del laboratorio di David del Dipartimento di Neurologia della Columbia University.

Ciao, sono Minerva, anch'io del laboratorio Soldier. Oggi vi mostreremo un procedimento per etichettare i terminali dopaminergici in sezioni cerebrali mediante neurotrasmettitori falsi fluorescenti. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare il rilascio di dopamina.

Cominciamo. Prima di preparare sezioni acute di sal, è necessario ossigenare il liquido cerebrospinale artificiale A CSF e raffreddarlo con ghiaccio per almeno 15 minuti prima dell'estrazione del cervello; mantenere l'A CSF ghiacciato e ossigenato. Durante la dissezione, estrarre l'intero cervello dal topo e montarlo sul piatto del vibrom, utilizzando colla istantanea. L'estrazione e il montaggio del cervello devono essere eseguiti entro due minuti.

Riempire il vassoio con A CSF ossigenata e raffreddata, quindi tagliare sezioni coronali rette del cervello con uno spessore di 250 micrometri compreso tra +1,54 e +0,623. Si otterranno fette di tessuto, che possono essere divise in sei semifette utilizzando un ago. Incubare le fette cerebrali in A CSF ossigenata a temperatura ambiente per almeno un'ora, mentre le fette cerebrali sono in incubazione.

In un liquido cerebrospinale A ossigenato, preparare la soluzione di carico di FFN 511 a 10 micromolare aggiungendo la soluzione stock di FFN 511 a 10 millimolare al liquido cerebrospinale A. Successivamente, preparare una soluzione di A-D-V-A-S-E-P sette a cento micromolare in liquido cerebrospinale A e ossigenare entrambe le soluzioni per almeno 15 minuti prima del caricamento nei tessuti singolarmente. Incubare ogni fetta cerebrale con la soluzione di carico di FFN 511 per 30 minuti a temperatura ambiente.

Successivamente, rimuovere il di legato ai tessuti extracellulari incubando la sezione carica in 100 micromolar di advers, sette A CSF ossigenato per 30 minuti a temperatura ambiente. Le sezioni sono ora pronte per l'acquisizione di immagini. La colorazione FFN 511 verrà visualizzata nelle sezioni utilizzando un microscopio a scansione laser multifotone prairie Ultima. Posizionare la sezione carica di FFN 511 nella camera di registrazione e sovrafondere con A CSF ossigenato a una portata di uno-due millilitri al minuto. Quindi, posizionare un arco di platino con fili di nylon sopra la sezione per minimizzare i movimenti.

Durante l'esperimento, per ridurre ulteriormente i movimenti, lasciare che le sezioni si stabilizzino per almeno 10 minuti nella camera prima dell'acquisizione delle immagini. Visualizzare e localizzare il corpo striato dorsale AUM mediante illuminazione in campo chiaro utilizzando un obiettivo ad immersione in acqua 10x, quindi posizionare gli elettrodi bipolari in tungsteno ritorti in questa regione per eseguire un esperimento di stimolazione. L'area di acquisizione inattiva si trova entro 300 micrometri.

Tra le due punte dell'elettrodo bipolare stimolante, posizionare questa regione al centro dell'immagine del campo visivo FFN 511 etichettata come terminali Sal, utilizzando un obiettivo ad immersione in acqua da 63x ultravioletto. FFN 511 viene eccitato a 760 nanometri con un laser mi tai della Spectral Physics. La fluorescenza ottimale dei terminali SAL si osserva attraverso un filtro passa-banda; acquisire le immagini in formato 12 bit con regioni di interesse di 75 per 75 micrometri a una risoluzione di 512 per 512 pixel. Qui viene mostrata un'immagine esempio con terminali dopaminergici Sal marcati con FFN 511.

Il marcatore FFN 511 può essere rilasciato sia da alte concentrazioni di cloruro di potassio o solfato di anfetamina, sia mediante stimolazione elettrica nell'esperimento di rilascio in cloruro di potassio; quando una soluzione di CSF con alto contenuto di potassio viene applicata alla sezione cerebrale, il marcatore FFN 511 viene rilasciato entro quattro minuti. Registrare immagini XYZT per tracciare nel tempo il rilascio di FFN 511 durante la colorazione indotta da stimolazione elettrica. Ottenere una serie temporale di immagini di controllo dello Zack prima della stimolazione per almeno cinque minuti, per garantire un movimento minimo della sezione e l'assenza di fotobiancamento indotto dal laser; successivamente procedere all'acquisizione delle immagini di controllo.

Continuare l'imaging XYZT avviando la stimolazione a frequenze di uno, quattro o 20 hertz; gli stimoli vengono applicati localmente al corpo striato mediante un isolatore di stimolo isoflex, attivato da un generatore di impulsi master eight, utilizzando elettrodi polari. Questo video mostra il rilascio di FFN 511 durante l'esocitosi in una sezione cerebrale SAL. Al termine del caricamento di FFN 511 nel SAL, si osserva un'abbondante marcatura nel corpo striato, una marcatura scarsa nella corteccia e nessuna marcatura nel corpo calloso.

L'etichettatura selettiva dei terminali della dopamina può essere osservata mediante cloruro di potassio ad alta concentrazione, come mostrato in queste immagini rappresentative prima del cloruro di potassio e due minuti dopo l'applicazione di cloruro di potassio 70 millimolare. Un'etichettatura del CSF contenente FFN 511 può essere ottenuta anche mediante anfetamina. Questa immagine mostra l'etichettatura con FFN 511 nello striato prima dell'amministrazione di anfetamina.

Sebbene questa immagine mostri lo striato 20 minuti dopo l'incubazione con anfetamina 20 micromolare, il rilascio del marcatore FFN 511 indotto da stimolazione elettrica locale è illustrato in queste immagini, che mostrano l'etichettatura con FFN 511 nello striato prima della stimolazione e a 217 secondi e 514 secondi dall'inizio della stimolazione a quattro hertz. Questo grafico dell'intensità di fluorescenza normalizzata nel tempo mostra che il rilascio di FFN 511 è dipendente dal calcio e dalla frequenza; i controlli, rappresentati dai triangoli vuoti, non ricevono alcuna stimolazione. L'incubazione con cloruro di cadmio, rappresentata dai cerchi vuoti, produce risultati identici ai controlli non stimolati.

Le curve di decadimento per ciascuna frequenza di stimolazione, rappresentate dai cerchi colorati, sono state adattate mediante una funzione di decadimento esponenziale singola e i valori di emivita sono stati calcolati come tau moltiplicato per 0,693. Vi abbiamo appena mostrato come caricare un neurotrasmettitore fluorescente di forza FFN511 nei terminali dopaminergici in una sezione acuta di cervello e come rilasciarlo mediante potassio ad alta concentrazione e stimolazione elettrica. Questo è il primo metodo sviluppato per esaminare otticamente il rilascio di neurotrasmettitori a livello dei singoli terminali sinaptici.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di mantenere le sezioni estremamente sane ed essere consapevoli del tempo di carico, dell'autofluorescenza di fondo e degli artefatti dovuti al movimento; le sezioni devono mostrare un buon carico di FFN cinque 11 e possono essere sottoposte a imaging fino a quattro ore dopo la preparazione. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.