Name: Il rilascio di dopamina a singoli terminali presinaptici visualizzate con FFNs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-31T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Scopri come visualizzare il rilascio di dopamina a singoli terminali presinaptici usando FFN 511 in fette cerebrali di topo. Questo metodo ottico permette di studiare la neurotrasmissione in tempo reale.

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D. Il Sames grazie Harold G. &amp; Leila Y. Mathers Charitable Foundation e della Columbia University Iniziative in Scienze e Ingegneria. D. Sames e D. Sulzer ringraziare la Fondazione McKnight per le innovazioni tecnologiche nel McKnight Premio Neuroscienze D. Sulzer grazie NIDA, NIMH, e il Picower e Fondazioni Malattia di Parkinson. H. grazie Zhang NARSAD. RH Edwards ringrazia la Michael J. Fox Foundation, la National Parkinson Foundation, NIDA e NIMH. Ringraziamo Robert Burke per 6-OHDA iniezioni e consulenza, Sonders Marchio di discussione utile, Merek Siu per la programmazione di analisi delle immagini, e Jan Schmoranzer per l&#39;assistenza tecnica con l&#39;installazione di microscopia TIRF.

Questo metodo è stato utilizzato nella ricerca riportata in <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/324/5933/1441">gubernator et al. Science 324 (5933). 1441-1444 (2009)</a> . 1. Preparazione acuta fette striatale <ol><li> Prima di preparare acuta fettine striatali, si deve ossigenare il liquido cerebrospinale artificiale (ASCF) e raffreddare con ghiaccio per almeno 15 minuti prima l&#39;estrazione del cervello. Tenere il freddo ghiaccio ACSF e ossigenato durante la dissezione. ACSF (in mM): NaCl 125, KCl 2.5, NaHCO 3 26, CaCl 2 2,4, MgSO4 1.3, KH 2 PO 4 0,3, glucosio 10, HEPES 5, pH 7,3-7,4, 290-295 mOsm. </li><li> Decapitare topo maschio senza anestesia. </li><li> Estrarre l&#39;intero cervello dal mouse, e montarlo sul vassoio vibratome immessi sul vibratome con Krazy Glue ®. Estrazione del cervello e di montaggio deve essere fatto entro 2 minuti. Durante questo tempo, assicurarsi di mantenere il freddo ghiaccio ACSF e ossigenato per mantenere il tessuto sano. </li><li> Tagliate le fette coronali del cervello striatale a spessore 250μm tra bregma 1,54-0,62 1. Tre fette si ottiene che possono poi essere tagliato in 6 fette di mezzo con un ago. </li><li> Incubare le fette di cervello in ACSF ossigenata a temperatura ambiente per almeno 1 ora prima del caricamento della sonda. Fette di buon display FFN511 carico e rimane attivo per le immagini fino a 4 ore dopo la preparazione fetta. </li></ol> 2. Caricamento FFN511 <ol><li> Preparare FFN511 soluzione di carico (10μM FFN511 in ACSF); anche preparare 100μM ADVASEP-7 in ACSF. Tutte le soluzioni devono essere preparate di fresco e ossigenato almeno 15 minuti prima di caricare in fette. </li><li> Individualmente incubare fetta con FFN511 soluzione di carico per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Quindi rimuovere il colorante legato al tessuto extracellulare incubando la fetta caricata in ossigenato 100μM ADVASEP-7 ACSF per 30 minuti a temperatura ambiente 2. Fette sono ora pronti per l&#39;imaging. </li></ol> 3. Imaging FFN511 in fettine di cervello Imaging di FFN511 nel fette viene eseguita utilizzando microscopio a scansione laser multiphoton. Stiamo usando una prateria di Ultima multiphoton microscopio a scansione laser (Stavamo usando un obiettivo Zeiss LSM 510 NLO multiphoton microscopio a scansione laser in precedenza e alcuni risultati sono stati ottenuti con il microscopio Zeiss). <ol><li> Posizionare il FFN511-caricato fetta nella camera di registrazione (RC-27L, Warner) e con superfuse ACSF ossigenato ad un flusso di 1-2 ml al minuto. Poi posto l&#39;arpa platino con corde di nylon sulla parte superiore della fetta per minimizzare i movimenti durante l&#39;esperimento. Per ridurre ulteriormente il movimento, permettono la fetta si stabilizzi per almeno 10 minuti nella camera prima di imaging. </li><li> Visualizzare e localizzare il corpo striato dorsale con luminescenza in campo chiaro con un obiettivo 10x immersione in acqua. </li><li> Posto e la posizione degli elettrodi di tungsteno bipolare intrecciato in questa regione se si esegue un esperimento di stimolazione. L&#39;area di imaging ideale si trova nel raggio di 300 micron tra le due punte degli elettrodi bipolari stimolante. Posto questa regione al centro del campo visivo. </li><li> Immagine FFN511 marcato terminali striatali sotto (0,9 NA) obiettivo ultravioletti 63x immersione in acqua. FFN511 è eccitato a 760 nm con un laser da Mai Tai Fisica spettrale e fluorescenza ottimale di terminali striatali è visto attraverso un filtro passa banda (480-520 nm). Le immagini vengono catturate in 12-bit con formato 75 x 75 micron regioni di interesse a 512 x 512 pixel di risoluzione. Per stimolato esperimenti decolorazione, per compensare z turno, una serie z di immagini 5-7, separati da 1 micron nel piano z, si ottiene per ogni periodo di tempo. </li></ol> 4. FFN511 decolorante Il FFN511 etichetta può essere decolorato sia un&#39;alta concentrazione di KCl (usiamo 70 mm KCl), (+)-amfetamina solfato (AMPH, 20 mM), o la stimolazione elettrica. Nell&#39;esperimento decolorazione KCl, quando una soluzione ad alta ACSF potassio viene applicata la fetta cervello, il FFN511 destains etichetta entro 2 minuti. Record xyz-t immagini per tracciare FFN511 decolorazione nel tempo. Di seguito sono descritte stimolazione elettrica-dipendente decolorazione terminale della dopamina: <ol><li> Per tenere traccia FFN511 decolorazione nel tempo, xyz-t immagini vengono registrate. Per garantire minimo movimento della fetta (meno di 4 micron di z) e non photobleaching dai, immagini in tempo laser serie il controllo della z-stack dovrebbe essere ottenuto per almeno 5 minuti prima della stimolazione. In caso contrario, regolare la potenza del laser. </li><li> A seguito di queste immagini di controllo, continuare la xyz-t immagini mentre inizio la stimolazione a frequenza di 1, 4 o 20 Hz. Gli stimoli a 1, 4 o 20 Hz (300 ms x 1 mA) vengono applicati al corpo striato a livello locale da parte di un Iso-Flex isolatore stimolo innescato da un Maestro-8 generatore di impulsi (AMPI, Gerusalemme, Israele) con elettrodi bipolari. Per ridurre al minimola variazione della depolarizzazione dei siti di rilascio, abbiamo utilizzato un protocollo di stimolazione applicare il 150% della massima intensità di stimolazione determinata dalla voltammetria ciclica. </li><li> Utilizzare il software appropriato per l&#39;analisi di imaging. Nel nostro laboratorio usiamo Immagine J (Wayne Rosband, National Institutes of Health, Rockville, MD) e personalizzato il software scritto in IDL (Systems Research, Boulder, CO) per quantificare la fluorescenza puncta e le modifiche con Time3. </li></ol> Risultati Represenative La figura 1 mostra FFN511 caricamento in fetta striatale è ora completa. Immagini rappresentative con obiettivo 10x e 60x sono mostrati in Fig.1. L&#39;etichettatura selettiva dei terminali della dopamina può essere decolorato del 20 mM anfetamine. La Figura 2 mostra decolorazione di FFN511 etichettatura KCl alto. La figura 3 mostra decolorazione di FFN511 etichettatura locali stimolazione elettrica. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 FFN511 etichette terminali della dopamina nel vivo fette acuta cortico-striatali (A) Etichettatura di FFN511 in acuto vivere cortico-striatale fetta:.. Etichettatura abbondante nello striato (STR), etichettatura rado nella corteccia (CTX), e nessuna etichetta in corpo calloso (CC). Scala grafica:. 100 micron (B) decolorante della FFN511 dallo striato da anfetamine. Pannelli di sinistra: prima di anfetamine; pannelli di destra: dopo 20 minuti di 20 mM anfetamine. Scala grafica: 10 micron. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Decolorante di FFN511 etichettatura KCl alto. Etichettatura FFN511 è decolorato entro 2 minuti di applicazione mM KCl 70 in ACSF. Scala grafica: 10μm. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Dipendente dalla frequenza di decolorazione FFN511 etichettatura striato. (A) stimolazione locale a 4 Hz portato decolorazione dai terminali. Stimolazione iniziata al tempo t = 0. Scala grafica: 5 micron (B) decolorante di FFN511 a 4 Hz è Ca 2 + - e dipendente dalla frequenza.. Controlli ricevuto alcuna stimolazione (153 puncta da 3 fette). Decolorazione con cloruro di cadmio (200 mM) era identico a controlli non stimolate (475 puncta da 5 fette). Le curve di decolorazione per ogni frequenza di stimolazione erano idonei da una singola funzione di decadimento esponenziale e l&#39;emivita (t 1 / 2) valori calcolati come τ x 0,693 (1 Hz: 765 puncta da 9 fette, 4 Hz: 410 puncta da 7 fette, 20 Hz: 416 puncta da 6 fette). Si prega di fare riferimento al microscopio video da 2-fotone microscopia di FFN511 decolorazione durante esocitosi in un preparato striato fetta cervello.

<ol><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxi coordinators. , Academic Press. San Diego. (1997).</li>
<li>Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+activity+in+intact+brain+and+slices+with+FM1-43+in+C.+elegans%2C+lamprey%2C+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat.</a> Neuron. 24, 8098-8117 (1999).</li>
<li>Bamford, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosynaptic+dopamine+neurotransmission+selects+sets+of+corticostriatal+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Heterosynaptic dopamine neurotransmission selects sets of corticostriatal terminals.</a> Neuron. 42, 653-653 (2004).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

In questo video, dimostriamo un metodo per visualizzare neurotrasmissione otticamente con analoghi della dopamina fluorescenti. FFN511 è la prima generazione di FFNs abbiamo sviluppato. Anche se è stato progettato prendendo di mira i neuroni trasportatore vescicolare delle monoamine (VMAT2) che porta neurotrasmettitori monoamine dal citoplasma in vescicole sinaptiche, e le etichette in particolare i terminali della dopamina nello striato e catecolamine presunta e / o terminali della serotonina nella corteccia (come mostrato nella Scienza carta), un periodo di carico appropriata è fondamentale per la specificità in quanto è relativamente FFN511 idrofobo. Abbiamo scoperto che l&#39;incubazione per più di 40 minuti si tradurrà in ampi colorazione aspecifica a fette dello striato. La specificità può essere direttamente determinato da decolorazione con un&#39;alta concentrazione di KCl, che dovrebbe causare il rilascio di FFN all&#39;interno funzionale vescicole sinaptiche. L&#39;esposizione della fetta di FFN511 per meno di 15 minuti si tradurrà in debole segnale fluorescente a causa del carico insufficiente del colorante nei terminali. In questo protocollo, utilizziamo 100μM ADVASEP-7 per rimuovere il colorante legato al tessuto extracellulare. Questo passaggio non è necessario, ma se è omesso, il tempo di washout in ACSF deve essere prolungata. In sintesi, a seconda della preparazione si è scelto, sarà necessario modificare il periodo di concentrazione e di carico per determinare l&#39;etichettatura ottimale.

<table><tbody><tr><td>FFN511 (8-(2-ammino-etil)-2,3,5,6-tetraidro-1H,4H-11-ossa-3a-aza-benzo[de]antracen-10-one)</td><td>Columbia University - Dalibor Sames Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADVASEP-7 </td><td>CyDex</td><td>AR-OA7-005</td><td></td></tr><tr><td>Camera di registrazione RC-27L</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0375</td><td></td></tr><tr><td>Portapiastra PELCO PrepEze a 6 pozzetti</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>36157-1</td><td>Per l'incubazione di fette</td></tr><tr><td>Stimolatore a impulsi Master-8 e isolatore di stimolo Iso-Flex</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

il rilascio di dopamina a singoli terminali presinaptici visualizzate con ffns

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

Il sistema nervoso trasmette i segnali tra i neuroni attraverso il rilascio dei neurotrasmettitori durante la fusione delle vescicole sinaptiche. Per osservare l&#39;assorbimento e il rilascio dei neurotrasmettitori dai singoli terminali presinaptici direttamente, abbiamo progettato fluorescenti falsi neurotrasmettitori come substrato per il trasportatore della vescicole sinaptiche monoamine. L&#39;utilizzo di questi sonde per il rilascio di dopamina nello striato immagine, abbiamo fatto alcune osservazioni pertinenti alla plasticità sinaptica. Abbiamo trovato che la frazione delle vescicole sinaptiche per il rilascio dei neurotrasmettitori stimolo era dipendente dalla frequenza dello stimolo. Un cineticamente distinte popolazione &quot;riserva&quot; delle vescicole sinaptiche non è stata osservata in queste condizioni sperimentali. Una frequenza dipendente dalla eterogeneità dei terminali presinaptici stato rivelato che era dipendente in parte sui recettori della dopamina D2, che indica un meccanismo per dipendente dalla frequenza di codifica di selezione presinaptico. Hui Zhang e Niko gubernator G. contribuito in maniera uguale a questo lavoro.

Un nuovo mezzo per misurare la neurotrasmissione otticamente con analoghi della dopamina fluorescenti.

Il rilascio di dopamina a singoli terminali presinaptici visualizzate con FFNs

Il sistema nervoso trasmette i segnali tra i neuroni attraverso il rilascio di neurotrasmettitori durante la fusione delle vescicole sinaptiche. Per osservare l'uptake dei neurotrasmettitori e...

Il neurotrasmettitore fluorescente falso. FFN 511 è il monoammina fluorescente che può agire come substrato per il trasportatore fisico di monoammine sinaptico quando viene applicato a fette cerebrali. FFN 511 viene captato dalle vescicole sinaptiche dopaminergiche tramite il trasportatore di monoammine ed è utilizzabile per visualizzare direttamente il rilascio del neurotrasmettitore dai terminali presinaptici di neuroni monoamminergici, come quelli nello strato S. Il rilascio del neurotrasmettitore dai terminali è visibile nella fetta come una riduzione dei segnali fluorescenti puntiformi.In questo video, vengono preparate sezioni coronali di sal dello spessore di 250 micrometri utilizzando un vibratomo, colorate con FFN 511 e analizzate mediante microscopio laser a multiphoton. Vengono mostrati esperimenti di imaging che rivelano un'eterogeneità dipendente dalla frequenza nel rilascio di iCal. Ciao, sono HU del laboratorio di David del Dipartimento di Neurologia della Columbia University.Ciao, sono Minerva, anch'io del laboratorio Soldier. Oggi vi mostreremo un procedimento per etichettare i terminali dopaminergici in sezioni cerebrali mediante neurotrasmettitori falsi fluorescenti. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare il rilascio di dopamina.Cominciamo. Prima di preparare sezioni acute di sal, è necessario ossigenare il liquido cerebrospinale artificiale A CSF e raffreddarlo con ghiaccio per almeno 15 minuti prima dell'estrazione del cervello; mantenere l'A CSF ghiacciato e ossigenato. Durante la dissezione, estrarre l'intero cervello dal topo e montarlo sul piatto del vibromicrotomo, fissandolo al piatto mediante colla istologica. L'estrazione e il montaggio del cervello devono essere eseguiti entro due minuti.Riempire il vassoio con A CSF ossigenata e raffreddata, quindi tagliare sezioni coronali cerebrali dritte di 250 micrometri di spessore comprese tra +1,54 e +0,623 mm. Si otterranno fette che potranno essere divise in sei mezze fette con un ago. Incubare le fette cerebrali in A CSF ossigenata a temperatura ambiente per almeno un'ora, mentre le fette cerebrali sono in incubazione.In un liquido cerebrospinale A ossigenato, preparare la soluzione di carico di FFN 511 a 10 micromolari aggiungendo la soluzione stock di FFN 511 a 10 millimolari al liquido cerebrospinale A. Successivamente, preparare una soluzione di A-D-V-A-S-E-P sette a cento micromolari nel liquido cerebrospinale A e ossigenare entrambe le soluzioni per almeno 15 minuti prima di caricarle singolarmente nelle fette. Incubare ogni fetta cerebrale con la soluzione di carico di FFN 511 per 30 minuti a temperatura ambiente.Successivamente, rimuovere il di legato ai tessuti extracellulari incubando la sezione carica in 100 micromolar di advers, sette A CSF, ossigenato, per 30 minuti a temperatura ambiente. Le sezioni sono ora pronte per l'acquisizione di immagini. La colorazione con FFN 511 verrà osservata nelle sezioni utilizzando un microscopio a scansione laser multifotone prairie Ultima. Posizionare la sezione carica con FFN 511 nella camera di registrazione e sovrafondere con A CSF ossigenato a un flusso di uno-due millilitri al minuto. Quindi, posizionare sopra la sezione un pettine di platino con fili di nylon per minimizzare i movimenti.Durante l'esperimento, per ridurre ulteriormente i movimenti, lasciare che le sezioni si stabilizzino per almeno 10 minuti nella camera prima dell'acquisizione delle immagini. Visualizzare e localizzare il corpo striato dorsale AUM mediante illuminazione in campo chiaro con un obiettivo ad immersione in acqua 10x, quindi posizionare gli elettrodi bipolari in tungsteno ritorti in questa regione per eseguire un esperimento di stimolazione. L'area di imaging inattiva si trova entro 300 micrometri.Tra le due punte dell'elettrodo bipolare stimolante, posizionare questa regione al centro dell'immagine del campo visivo con i terminali Sal marcati con FFN 511, utilizzando un obiettivo ad immersione in acqua da 63x ultravioletto. FFN 511 viene eccitato a 760 nanometri con un laser mi tai della Spectral Physics. La fluorescenza ottimale dei terminali SAL si osserva attraverso un filtro passa-banda; acquisire le immagini in formato 12 bit con regioni di interesse di 75 per 75 micrometri a una risoluzione di 512 per 512 pixel. Qui viene mostrata un'immagine esempio con i terminali dopaminergici Sal marcati con FFN 511.Il marcatore FFN 511 può essere rilasciato sia da alte concentrazioni di solfato di amfetamina in cloruro di potassio, sia mediante stimolazione elettrica nell'esperimento di rilascio in cloruro di potassio; quando una soluzione di CSF con alto contenuto di potassio viene applicata alla sezione cerebrale, il marcatore FFN 511 viene rilasciato entro quattro minuti. Registrare immagini XYZT per tracciare nel tempo il rilascio di FFN 511 durante la colorazione indotta da stimolazione elettrica. Ottenere una serie temporale di immagini di controllo dello Zack prima della stimolazione per almeno cinque minuti, per garantire un movimento minimo della sezione e l'assenza di fotobiancamento indotto dal laser; successivamente procedere all'acquisizione delle immagini di controllo.Continuare l'imaging XYZT avviando la stimolazione a frequenze di uno, quattro o 20 hertz; gli stimoli vengono applicati localmente al corpo striato mediante un isolatore di stimolo isoflex, attivato da un generatore di impulsi master eight, utilizzando elettrodi polari. Questo video mostra il rilascio di FFN 511 durante l'esocitosi in una sezione cerebrale SAL. Al termine del caricamento di FFN 511 nel SAL, si osserva un'intensa marcatura nel corpo striato, una marcatura scarsa nella corteccia e nessuna marcatura nel corpo calloso.L'etichettatura selettiva dei terminali della dopamina può essere stimolata da un'elevata concentrazione di cloruro di potassio, come mostrato in queste immagini rappresentative prima del cloruro di potassio e due minuti dopo l'applicazione di cloruro di potassio 70 millimolare. Un'analisi del liquido cerebrospinale contenente l'etichettatura con FFN 511 può essere ottenuta anche mediante anfetamina. Questa immagine mostra l'etichettatura con FFN 511 nello striato prima dell'amministrazione di anfetamina.Sebbene questa immagine mostri lo striato 20 minuti dopo l'incubazione con anfetamina 20 micromolare, il rilascio del marcatore FFN 511 indotto da stimolazione elettrica locale è illustrato in queste immagini, che mostrano l'etichettatura con FFN 511 nello striato prima della stimolazione e a 217 secondi e 514 secondi dall'inizio della stimolazione a quattro hertz. Questo grafico dell'intensità di fluorescenza normalizzata nel tempo mostra che il rilascio di FFN 511 è dipendente dal calcio e dalla frequenza; i controlli, rappresentati dai triangoli vuoti, non ricevono alcuna stimolazione. L'incubazione con cloruro di cadmio, rappresentata dai cerchi vuoti, ha prodotto risultati identici ai controlli non stimolati.Le curve di decadimento per ciascuna frequenza di stimolazione, rappresentate dai cerchi colorati, sono state adattate mediante una funzione di decadimento esponenziale singola e i valori di emivita sono stati calcolati come tau moltiplicato per 0,693. Vi abbiamo appena mostrato come caricare un neurotrasmettitore fluorescente di forza FFN511 nei terminali dopaminergici in una sezione acuta di cervello e come rilasciarlo mediante potassio elevato e stimolazione elettrica. Questo è il primo metodo sviluppato per esaminare otticamente il rilascio di neurotrasmettitori a livello dei singoli terminali sinaptici.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di mantenere le sezioni molto vitali ed essere attenti al tempo di caricamento, allo sbiancamento dello sfondo e agli artefatti di movimento; le sezioni devono mostrare un buon caricamento di FFN 511 e permettere l'acquisizione di immagini fino a quattro ore dopo la preparazione. È tutto. Grazie per averci seguito e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Scopri come visualizzare il rilascio di dopamina a singoli terminali presinaptici usando FFN 511 in fette cerebrali di topo. Questo metodo ottico permette di studiare la neurotrasmissione in tempo reale.

Il rilascio di dopamina a singoli terminali presinaptici visualizzate con FFNs

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