Aortica Anello Assay

L'obiettivo generale del saggio dell'anello aortico è fornire un sistema sperimentale flessibile in cui vasi sanguigni germoglino da interi frammenti di aorta di topo all'interno di una matrice tridimensionale. Questo risultato si ottiene prima dissezionando l'aorta toracica da un topo e poi pulendola con cura da qualsiasi tessuto residuo circostante. Fette di aorta pulita, o anelli aortici, vengono posizionate in singole pozzette di una piastra a 48 pozzette, ciascuna contenente estratto di matrice basale o BME modellato in forma di cupole.

Una goccia aggiuntiva di BME racchiude l'anello in una struttura tridimensionale. La matrice può contenere qualsiasi reagente sperimentale desiderato. Dopo un'incubazione di diversi giorni, è possibile osservare la formazione di nuovi vasi dagli anelli aortici e valutare il potenziale angiogenico dei composti in esame.

Ciao, sono Karen Bein del laboratorio del Dott. E. Lewis del Dipartimento di Biochimica Clinica della Beon University of the Negative di Be Sheva, Israele. Oggi vi mostreremo un procedimento per il saggio dell'anello aortico murino. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare gli effetti di diversi materiali sulla formazione dei vasi sanguigni.

Iniziamo. Per iniziare questa procedura, lasciare scongelare l'estratto di matrice basale o BME sul ghiaccio o a quattro gradi Celsius. Una volta scongelato, continuare a mantenere freddo il BME per evitare che si solidifichi nuovamente.

Il giorno dell'esperimento, eutanasia un topo di sei o sette settimane mediante iniezione standard di chetamina e xilazina, seguita da un'emorragia rapida attraverso le arterie del collo e successiva dislocazione cervicale. Iniziare la procedura pulendo l'animale con etanolo al 70% in una cappa a flusso laminare sterile. Successivamente, operando sotto una lente stereoscopica, utilizzare pinze sterili e forbici da dissezione per effettuare un'incisione verticale della cute e aprire la parete peritoneale.

L'incisione deve essere eseguita per esporre lo sterno superiore, dove viene anche tagliata la gabbia toracica e rimosso il diaframma. Procedere quindi spostando con cura tutti gli organi di lato, esponendo completamente l'aorta toracica situata lungo la colonna vertebrale; con l'aorta esposta, inserire una pinzetta sterile sottile tra l'aorta e la colonna vertebrale. Aprire leggermente le lame della pinzetta e sollevare gradualmente l'aorta dal suo alloggiamento, separando il segmento toracico dal resto dell'aorta.

Ora che l'aorta è stata separata, utilizzare forbici affilate per tagliarla a partire dall'estremità vicina ai vasi renali fino a quella prossima al cuore. Posizionare l'aorta toracica asportata in una piastra di Petri contenente PBS sterile freddo. Dopo aver rimosso l'aorta, si possono preparare gli anelli aortici utilizzando due pinzette sterili e operando al microscopio stereoscopico.

Pulire l'aorta toracica dal tessuto adiposo circostante. Accertarsi di non danneggiare l'aorta e di manipolarla solo ai margini. L'aorta deve essere immersa ripetutamente nella piastra di Petri contenente PBS per evitare la disidratazione fino al completamento della pulizia.

Ora che l'aorta toracica è pulita, utilizzare una lama chirurgica e lavorare al microscopio binoculare per tagliare l'aorta in anelli uniformi di un millimetro. Utilizzando un righello posizionato sotto la superficie di taglio come guida, assicurarsi di usare una lama nuova e di sostituirla di tanto in tanto per mantenerla affilata. Le estremità dell'aorta non vengono utilizzate. Dopo aver tagliato ogni anello, utilizzare pinzette per trasferirlo molto delicatamente in una nuova piastra contenente PBS freddo.

Posizionare tutti gli anelli nella stessa piastra contenente PBS per garantire che il saggio sia randomizzato. Poiché ogni segmento dell'aorta presenta un potenziale angiogenico leggermente diverso, mantenere gli anelli sul ghiaccio. Successivamente, preparare la piastra per il saggio utilizzando punte di pipetta pre-riscaldate.

Aggiungere in ogni pozzetto di una piastra a 48 pozzetti una goccia di circa 150 microlitri di BME freddo; la goccia si solidifica formando una cupola durante il movimento. Il BME permette il trasporto di sostanze, la chemotassi cellulare e, soprattutto, la differenziazione e la migrazione cellulare che portano alla formazione di nuovi vasi. I pozzetti periferici vengono riempiti con PBS per evitare la disidratazione del BME. Lasciare solidificare la goccia di BME a 37 gradi Celsius per 20-30 minuti. Una volta solidificato il BME, sollevare con delicatezza un anello aortico dalla capsula di Petri utilizzando pinzette, al fine di evitare danni; l'anello deve essere trasferito all'interno della goccia lipidica che si forma tra le punte delle pinzette. A causa della tensione superficiale del liquido, posizionare un singolo anello aortico al centro superiore di ogni cupola e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Sopra ciascun anello, aggiungere ulteriori 150 microlitri di BME e incubare per 20-30 minuti.

A 37 gradi Celsius, l'anello è ora incapsulato nel BME e nel saggio. I materiali possono essere aggiunti alla piastra per avviare il saggio. Presupplementare il mezzo sierico privo di siero umano per endoteliociti precedentemente preparato con il materiale sperimentale oppure con il supplemento per la crescita delle cellule endoteliali come controllo positivo, e un controllo negativo.

Utilizzare solo il mezzo. Aggiungere 500 microlitri di mezzo con supplemento pres a ogni pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius per sei-dodici giorni. Durante questo periodo di incubazione, esaminare la piastra al microscopio e osservare la formazione di vasi che germogliano dall'aorta e la presenza di vasi maturi avanzati identificati da ulteriori diramazioni vascolari.

Deve essere eseguita un'estensione tridimensionale dal tessuto degli anelli; fotografare gli anelli tra il sesto e il dodicesimo giorno mediante stereomicroscopio a contrasto di fase standard. Inoltre, raccogliere i soprannatanti in diversi giorni compresi tra il sesto e il dodicesimo giorno e conservarli a quattro gradi per l'uso entro un giorno oppure a meno 20 o meno 80 per utilizzi futuri. I soprannatanti possono essere analizzati mediante diverse tecniche, come Elisa per VGF o saggio Grease per i livelli di ossido nitrico.

Queste immagini sono state raccolte 12 giorni dopo il posizionamento degli anelli nei pozzetti e l'incubazione con coltura, mezzo mostrato nella riga superiore delle immagini o ECGS utilizzato come controllo positivo per la formazione di nuovi vasi visibile nel pannello inferiore. Ogni immagine rappresenta un'istantanea rappresentativa di quattro degli 12 anelli, tipicamente impiegati nel saggio per ogni condizione.

L'angolo di ogni anello aortico in ciascun pozzetto separato è nero. Quando fotografati in questo modo, gli anelli aortici esposti a ECGS mostrano una crescita vascolare e le frecce indicano alcuni dei numerosi vasi formati. Ogni vaso è caratterizzato da catene di cellule endoteliali con occasionali diramazioni, a indicare che sono maturi.

Non possono essere osservati vasi in germogliamento nella coltura. Pozzetti con mezzo nella pannello superiore, abbiamo appena mostrato come eseguire il saggio dell'aorta quando si effettua questa procedura. È importante ricordare di lavorare con precisione e comprendere le condizioni sperimentali.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.