Aortica Anello Assay

L'obiettivo generale del test dell'anello aortico è quello di fornire un sistema sperimentale flessibile in cui i vasi sanguigni vengono germogliati da pezzi interi di aorta di topo all'interno di una matrice 3D. Ciò si ottiene sezionando prima l'aorta toracica di un topo e poi pulendola accuratamente da qualsiasi tessuto circostante residuo. Fette dell'aorta pulita o degli anelli aortici vengono poste in pozzetti individuali di una piastra da 48 pozzetti, ciascuno contenente estratto di matrice basale o BME modellato in cupole.

Una goccia in più di BME racchiude l'anello in una struttura 3D. La matrice può contenere qualsiasi reagente sperimentale di scelta. Dopo un'incubazione di diversi giorni, si può osservare la fuoriuscita di vasi dagli anelli aortici e si può valutare il potenziale angiogenico dei composti in esame.

Ciao, sono Karen Bein del laboratorio del Dr.E Lewis nel Dipartimento di Biochimica Clinica presso la Beon University of the Negative a Be Sheva Israele. Oggi ti mostreremo una procedura per il test dell'anello aortico del topo. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare gli effetti di vari materiali sulla formazione dei vasi sanguigni.

Quindi iniziamo. Per iniziare questa procedura, lasciare scongelare l'estratto della matrice basale o BME su ghiaccio o a quattro gradi Celsius. Una volta scongelato, continua a mantenere freddo il BME per evitare che si solidifichi di nuovo.

Il giorno dell'esperimento, l'eutanasia di un topo di sei o sette settimane con un'iniezione standard di ketamina e xilazina sanguina rapidamente attraverso le arterie del collo, seguita da lussazione cervicale. Iniziare la procedura pulendo l'animale con etanolo al 70% in una cappa sterile a flusso laminare. Successivamente, mentre si lavora sotto un cannocchiale da dissezione, utilizzare una pinza sterile e forbici da dissezione per eseguire un'incisione verticale della pelle e aprire la parete peritoneale.

L'incisione deve essere praticata per esporre lo sterno superiore dove viene tagliata anche la gabbia toracica e rimosso il diaframma. Procedere a spingere con cautela tutti gli organi da parte esponendo completamente l'aorta toracica situata lungo la colonna vertebrale con l'aorta esposta, inserire sottili pinzette sterili tra l'aorta e la colonna vertebrale. Allargare le pinzette e sollevare gradualmente l'aorta dal suo letto, separando il segmento toracico dal resto dell'aorta.

Ora che l'aorta è separata, usa le forbici affilate per tagliarla via dal topo iniziando dall'estremità, che si trova in prossimità dei vasi renali e termina vicino al cuore. Porre l'aorta toracica asportata in una capsula di Petri riempita con PBS sterile freddo. Ora che l'aorta è stata rimossa, gli anelli aortici possono essere preparati utilizzando due pinzette sterili e lavorando sotto un binocolo.

Pulire l'aorta toracica dal tessuto adiposo circostante. Assicurati di non danneggiare l'aorta e tienila solo per i bordi. L'aorta deve essere ripetutamente immersa nella capsula di Petri contenente PBS per prevenire la disidratazione fino a quando non viene finalmente pulita.

Ora che l'aorta toracica è pulita, usa una lama chirurgica e lavora sotto il binocolo per tagliare l'aorta in modo uniforme in anelli di un millimetro. Utilizzando un righello posizionato sotto la superficie di taglio come guida, assicurarsi di utilizzare una nuova lama e sostituirla di tanto in tanto per mantenere l'affilatura. Le estremità dell'aorta non vengono utilizzate Dopo aver tagliato ogni anello, utilizzare una pinzetta per trasferirlo molto delicatamente in un nuovo piatto contenente PBS freddo.

Posizionare tutti gli anelli nella stessa piastra contenente PBS per garantire che il test sia randomizzato. Poiché ogni segmento dell'aorta ha un potenziale angiogenico leggermente diverso, mantenere gli anelli sul ghiaccio. Quindi, preparare la piastra del saggio utilizzando i puntali per pipette pre-raffreddati.

Aggiungere a ciascun pozzetto in una piastra a 48 pozzetti intorno a una goccia di 150 microlitri di BME freddo, la goccia si solidifica in una cupola a metà movimento. Il BME consente il trasporto di sostanze, la chemiotassi delle cellule e, soprattutto, la differenziazione e la migrazione cellulare che porta alla formazione di neo vasi I pozzetti perimetrali sono riempiti con PBS Per evitare la disidratazione del BME, lasciare che la goccia di BME si solidifichi a 37 gradi Celsius per 20-30 minuti. Una volta che il BME si è solidificato, sollevare con cautela un anello aortico dalla capsula di Petri usando una pinzetta per evitare danni, l'anello deve essere trasferito all'interno della goccia di lipidi che si forma tra le punte delle pinzette. Come risultato della tensione superficiale del liquido, posizionare un singolo anello aortico in alto al centro di ciascuna cupola e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius sopra ogni anello, aggiungere altri 150 microlitri di BME e incubare per 20-30 minuti.

A 37 gradi Celsius, l'anello è ora racchiuso in BME e saggio. I materiali possono essere aggiunti alla piastra per avviare il saggio. Integratore Pres precedentemente preparato con il terreno libero di siero endoteliale umano con il materiale sperimentale o l'integratore per la crescita delle cellule endoteliali come controllo positivo per un controllo negativo.

Usa il mezzo da solo. Aggiungere 500 microlitri del terreno dell'integratore pres a ciascun pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius per sei-12 giorni. Durante questo periodo di incubazione, esaminare la piastra al microscopio e cercare i vasi che spuntano dall'aorta e i vasi maturi avanzati identificati da ulteriori vasi ramificati.

Dovrebbe estendersi dal tessuto dell'anello, fotografare tridimensionalmente gli anelli tra il sesto e il dodicesimo giorno con lo stereoscopio standard a contrasto di fase. Inoltre, raccogliere i surnatanti in vari giorni tra il sesto e il 12° giorno e conservare a quattro gradi per l'uso nell'arco di un giorno o Eloqua e conservare a meno 20 o meno 80 per un uso futuro. I surnatanti possono essere analizzati con varie tecniche come Eliza per vgf o il saggio dei grassi per i livelli di ossido nitrico.

Queste immagini sono state raccolte 12 giorni dopo il posizionamento degli anelli nei pozzetti e l'incubazione con coltura, il mezzo visto nella riga superiore delle immagini o l'ECGS utilizzato come controllo positivo per la germinazione dei vasi osservata. Nel pannello inferiore. Ogni immagine è un'istantanea rappresentativa di quattro dei 12 anelli, che viene tipicamente utilizzata nel test per condizione.

L'angolo di ciascun anello aortico in ogni pozzetto separato è nero. Quando vengono fotografati in questo modo, gli anelli aortici che sono stati esposti all'ECGS mostrano una crescita vascolare e le frecce indicano molti dei molti vasi che si sono formati. Ogni vaso è caratterizzato da catene di cellule endoteliali con ramificazioni occasionali che indicano che sono mature.

Nella coltura non si possono osservare vasi germoglianti. Pozzetti medi nel pannello superiore, ti abbiamo appena mostrato come eseguire il test del cuore aortico quando esegui questa procedura. È importante ricordarsi di lavorare in modo accurato e di comprendere le proprie condizioni.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.