Diretto Cellular Self-Assembly di fabbricare Cell-Derived Anelli tessuto per l'analisi biomeccanica e di ingegneria dei tessuti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare costrutti tissutali 3D da cellule aggregate e matrici derivate da cellule che possono essere utilizzate per l'analisi funzionale. Ciò si ottiene fresando prima uno stampo in policarbonato per creare pozzetti anulari a fondo tondo. Successivamente, il polimetildimetilSloane o PDMS viene colato sullo stampo in policarbonato per creare un modello.

Quindi il modello PDMS viene utilizzato per formare pozzi aros. Il passaggio finale consiste nel seminare le cellule in pozzetti aros per consentire loro di aggregarsi e formare anelli di tessuto coesivi. In definitiva, questo metodo può essere utilizzato per ottenere l'autoassemblaggio cellulare e l'ingegneria tissutale utilizzando diversi tipi di cellule e consente l'analisi del contributo delle cellule e della matrice extracellulare derivata dalle cellule alla struttura e alla funzione dei tessuti.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri approcci di ingegneria tissutale è che possiamo generare costrutti di tessuto interamente dalle cellule e dalla matrice extracellulare che producono più rapidamente di quanto precedentemente riportato e in un formato che favorisce l'analisi meccanica, iniziando macinando un pezzo di policarbonato spesso mezzo pollice per creare 15 pozzetti anulari a fondo rotondo con un diametro del perno centrale di due millimetri. Pulire lo stampo in policarbonato per rimuovere eventuali detriti di plastica generati dal processo di fresatura e lasciare asciugare lo stampo. Successivamente, miscelare PDMS con un rapporto di 10 a uno dell'agente indurente di base, degassare la soluzione per rimuovere tutte le bolle d'aria e quindi versarla nello stampo in policarbonato.

Quindi degassare nuovamente la miscela sullo stampo per rimuovere eventuali bolle d'aria rimanenti e polimerizzare il PDMS in un forno a 60 gradi Celsius per quattro ore mentre il PDMS si sta dissolvendo. 2%AROS in DMEM una volta polimerizzato rimuovere con cura il modello PDMS staccandolo lentamente dal policarbonato, quindi lavare il PDMS con acqua e sapone e sterilizzarlo in autoclave insieme alla soluzione DMEM AROS. Ora posiziona il modello PDMS dell'autoclave su una superficie piana e riempilo con aros fusi pipettando prima aros in ciascuno degli stampi centrali e poi pipettando aros nello spazio circostante.

Lasciare solidificare gli aros per circa 15 minuti. Quindi capovolgere lo stampo per rilasciare gli aros dal PDMS. Tagliare l'aros in eccesso intorno a ciascuno dei pozzetti, quindi posizionare un aros in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Ora.

Aggiungere terreni di coltura cellulare intorno all'esterno del pozzetto senza coprire la parte superiore del pozzetto. Quindi posizionare le piastre nell'incubatrice per consentire loro di equilibrarsi mentre le cellule vengono preparate. Al 90% di tripsina di confluenza, cellule muscolari lisce aortiche di ratto e resus.

Sospendere le cellule a una concentrazione di cinque volte 10 per sei cellule per millilitro. Quindi pipettare 100 microlitri della sospensione cellulare risoluta in ciascuno dei pozzetti aros equilibrati. Usando un movimento circolare per applicare le cellule a ciascuno dei pozzetti.

Metti le piastre nell'incubatrice a riposare indisturbate per 24 ore. Sostituire il terreno ogni due giorni aspirando il terreno intorno al pozzetto e poi riempiendo nuovamente ogni pozzetto fino a quando lo stampo aros non è completamente sommerso. E alla fine della coltura, riempi una piccola capsula di Petri con PBS.

Rimuovere ogni anello dal suo stampo aros facendolo scorrere sopra la parte superiore del montante centrale. Posizionare gli anelli nelle piastre di Petri con PBS Center, un anello sotto il sistema di imaging digitale. Utilizza il software di rilevamento dei bordi per misurare lo spessore dell'anello in quattro posizioni, in alto, in basso, a sinistra e a destra attorno alla sua circonferenza.

Per eseguire prove di trazione assiale uni. Montare un campione ad anello su due impugnature a filo sottile. Estendere le impugnature fino a quando non viene applicato un carico di strappo di cinque milli Newton all'anello.

Quindi inserire l'area della sezione trasversale calcolata dalle misurazioni dello spessore e registrare la lunghezza del calibro. Pre-ciclo dell'anello otto volte tra il carico di strappo e 50 kg pascal. Lo stress a una velocità di 10 millimetri al minuto dopo l'ottavo pre-ciclo ha portato al cedimento a 10 millimetri al minuto.

Per ogni anello, misurare la sollecitazione di trazione e la deformazione di rottura e calcolare il modulo di tangente massimo dai dati acquisiti. Oltre agli studi funzionali in vitro, questi anelli cellulari viventi possono anche fondersi per formare tubi di tessuto. Utilizzare le forbici chirurgiche per tagliare le estremità dei tubi di silicone ad angolo per creare bordi smussati, quindi sterilizzare in autoclave i tubi di silicone mentre i tubi vengono sterilizzati in autoclave.

Riempire una capsula di Petri con supporti per provette in silicone personalizzate sterilizzate per il trasferimento dei terreni in una cabina di biosicurezza e posizionarla in una capsula di Petri vuota. Quindi, rimuovere gli anelli dai pozzetti degli aros e metterli nella capsula di Petri riempita di terreno. Posizionare i tubi di silicone nella stessa capsula di Petri per bagnarli prima dell'uso.

Usa una pinza per posizionare la punta di un tubo di silicone al centro di un anello e fai scorrere delicatamente l'anello sul tubo di silicone. Far scorrere gli anelli a contatto l'uno con l'altro spingendoli delicatamente in successione in entrambe le direzioni lungo il tubo. Una volta montati gli anelli, allineare i tubi in silicone all'interno dei supporti in policarbonato e avvitare insieme le due parti del supporto.

Aggiungere 55 millilitri di terreno alla capsula di Petri. Sostituire il terreno ogni tre giorni per tutta la durata della coltura per rimuovere le provette di tessuto. Per prima cosa, riempi una capsula di Petri con PBS.

Quindi rilasciare i tubi di silicone dal supporto in policarbonato e utilizzare una pinza per far scorrere i tubi di tessuto fuori dal tubo di silicone e nel piatto. Se eseguite correttamente, le cellule si depositano sul fondo dei pozzetti di aros e si contraggono entro 24 ore dalla sede per generare un anello di tessuto attorno al perno centrale nel pozzetto di Agarro, questo è un grafico rappresentativo di una curva di deformazione da sforzo ottenuta da un test di trazione assiale uni di un anello di tessuto di due millimetri generato da cellule muscolari lisce di ratto. I valori di resistenza alla trazione, modulo di trazione e deformazione a rottura vengono quindi utilizzati per confrontare le proprietà meccaniche di campioni di anelli di tessuto cresciuti con diversi parametri di coltura.

Le proprietà meccaniche degli anelli di tessuto possono essere controllate modificando i parametri di coltura, tra cui il numero di sedi cellulari, la lunghezza della coltura, il terreno di coltura e il tipo di cellula utilizzata. Oltre alle cellule muscolari lisce di ratto. Le cellule muscolari primarie lisce umane formano anelli di tessuto con una resistenza alla trazione simile.

Anche le cellule staminali mesenchimali umane si aggregano per formare anelli, ma non erano abbastanza forti per i test meccanici. Il nostro sistema consente la fabbricazione di costrutti di tessuto ingegnerizzati interamente da cellule semplicemente seminando le cellule nei nostri pozzetti aros personalizzati. Una volta che lo stampo iniziale in policarbonato è stato lavorato, possiamo realizzare un numero illimitato di modelli PDMS che possono essere utilizzati per realizzare gli stampi, quindi non sono necessarie attrezzature aggiuntive.

Il sistema è versatile in quanto abbiamo utilizzato una serie di diversi tipi di cellule nel sistema per creare anelli di tessuto, e quindi questo sistema potrebbe essere utilizzato potenzialmente sia per applicazioni di ingegneria tissutale che per studi in vitro sui contributi delle cellule e della matrice extracellulare alla struttura e alla funzione dei tessuti.