JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologia
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- Inizia con uova pellettate che sono state isolate sbiancando i vermi adulti gravidi. Assicurarsi che ogni fase di questa procedura sia condotta in modo sterile per evitare la contaminazione delle cellule in coltura. Sospendi il pellet in una soluzione di chitinasi, un enzima che scompone la chitina, un grande polisaccaride che è un componente strutturale del guscio dell'uovo.
Dopo un adeguato periodo di digestione, centrifugare delicatamente le uova e sostituire il surnatante con un terreno di coltura cellulare per fermare la digestione. Quindi, passa gli embrioni attraverso un ago calibro 18 per separare meccanicamente le singole cellule. Quindi, filtrare la soluzione per rimuovere i detriti dal guscio dell'uovo o i grumi di cellule non separati. Piastra le cellule in un piatto di coltura su un vetrino di vetro rivestito con agglutinina di arachidi, una lectina che aiuta le cellule ad attaccarsi al vetrino legando i carboidrati della superficie cellulare.
Nel protocollo di esempio, prepareremo cellule embrionali per la differenziazione morfologica e l'analisi in vitro.
- Mentre si lavora sotto una cappa a flusso laminare per evitare l'introduzione di contaminazioni batteriche, risospendere gli ovuli pellettati in un millilitro di due milligrammi per millilitro di chitinasi e trasferirli in una provetta conica fresca da 15 millilitri. Far oscillare il tubo per 10-30 minuti a temperatura ambiente, a seconda della freschezza dell'enzima. Quando circa l'80% dei gusci d'uovo sono stati digeriti, centrifugare le uova a 900 g per tre minuti.
Dopo aver rimosso con cura il surnatante, aggiungere tre millilitri di terreno L15. Trasferire gli ovuli in una piastra di sei centimetri di diametro e iniziare la dissociazione manuale utilizzando una siringa sterile da 10 millilitri con ago calibro 18. Per monitorare il grado di dissociazione, mettere una goccia di sospensione in una capsula di Petri fresca e osservare al microscopio. Continuare fino a quando circa l'80% delle cellule non si è dissociato.
Per rimuovere i grumi cellulari, le uova non digerite e le larve schiuse, filtrare delicatamente la sospensione attraverso un filtro da cinque micron e far passare altri quattro o cinque millilitri di terreno L15 attraverso il filtro per recuperare le cellule. Per coltivare le cellule dopo aver centrifugato il filtrato a 900 g per tre minuti, risospendere le cellule in un terreno L15 completo. Piastra un millilitro per pozzetto e conserva le piastre in una camera umida sigillata a 20 gradi Celsius all'aria ambiente.