Encyclopedia of Experiments: Biology
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- ब्लीडिंग ग्रेविड वयस्क कीड़े से अलग किए गए पेल्ड अंडे से शुरू करें। यह सुनिश्चित करें कि इस प्रक्रिया का प्रत्येक चरण सुसंस्कृत कोशिकाओं के प्रदूषण से बचने के लिए बाँझ आयोजित किया जाता है। चिटिन के घोल में गोली को निलंबित करें, एक एंजाइम जो चिटिन को तोड़ता है - एक बड़ा पॉलीसैकराइड जो अंडे के खोल का एक संरचनात्मक घटक है।
एक उपयुक्त पाचन अवधि के बाद, धीरे से अंडे अपकेंद्रित्र और पाचन को रोकने के लिए सेल संस्कृति माध्यम के साथ सुपरनिटेंट की जगह । फिर, 18 गेज सुई के माध्यम से भ्रूण को यांत्रिक रूप से अलग करने के लिए अलग-अलग कोशिकाओं को पास करें। इसके बाद, अंडे के खोल या बिना किसी विभाजित कोशिका झुरमुटों से मलबे को हटाने के लिए समाधान को फ़िल्टर करें। एक ग्लास कवर पर संस्कृति पकवान में कोशिकाओं को प्लेट करें मूंगफली एग्लुटिनिन के साथ लेपित स्लिप -- एक लेक्टिन जो कोशिकाओं को कोशिकाओं को सतह कार्बोहाइड्रेट बाध्यकारी करके कवर स्लिप से जोड़ने में मदद करता है।
उदाहरण प्रोटोकॉल में, हम इन विट्रो रूपात्मक भेदभाव और विश्लेषण के लिए भ्रूण कोशिकाओं को तैयार करेंगे।
- बैक्टीरियल संदूषण शुरू करने से बचने के लिए एक लेमिनार प्रवाह हुड के तहत काम करते समय, दो मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर चिटनेज के एक मिलीलीटर में पेल्ड अंडे को फिर से खर्च करें और उन्हें एक ताजा 15 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करें। एंजाइम की ताजगी के आधार पर कमरे के तापमान पर 10 से 30 मिनट तक ट्यूब को रॉक करें। जब अंडे के गोले का लगभग 80% पचा जाता है, तो अंडे को तीन मिनट के लिए 900 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
सुपरनेट को ध्यान से हटाने के बाद, एल15 माध्यम के तीन मिलीलीटर जोड़ें। अंडे को छह सेंटीमीटर व्यास की प्लेट में स्थानांतरित करें और 18 गेज की सुई के साथ 10 मिलीलीटर बाँझ सिरिंज का उपयोग करके मैन्युअल वियोजन शुरू करें। वियोजन की डिग्री की निगरानी करने के लिए, निलंबन की एक बूंद को एक ताजा पेट्री डिश में रखें और एक माइक्रोस्कोप के नीचे देखें। कोशिकाओं के लगभग 80% तक जारी रखें।
सेल झुरमुट, अपाच्य अंडे, और लार्वा रची को हटाने के लिए, धीरे-धीरे पांच माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से निलंबन को फ़िल्टर करें और कोशिकाओं को ठीक करने के लिए फ़िल्टर के माध्यम से एल15 माध्यम के अतिरिक्त चार से पांच मिलीलीटर चलाएं। 900 ग्राम पर फिलट्रेट को तीन मिनट तक अपकृण करने के बाद कोशिकाओं को संस्कृति से बाहर निकालें, कोशिकाओं को पूर्ण L15 माध्यम में फिर से निलंबित करें। प्लेट एक मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से, और एक आर्द्र सील वाले कक्ष में प्लेटों को स्टोर करें।
