Centrifugazione con gradiente di densità: un metodo per isolare le cellule CLL dal sangue periferico

- Nei pazienti con leucemia linfatica cronica, o LLC, i linfociti a cellule B aumentano significativamente nel midollo osseo e nel sangue. Per isolare queste cellule CLL da un campione di sangue, in primo luogo, trattare il campione con un cocktail di arricchimento di cellule B umane che separa le cellule B utilizzando la selezione negativa. Gli anticorpi nel cocktail riconoscono e reticolano in modo specifico gli antigeni espressi dalle cellule non B e dagli eritrociti, formando complessi densi.

Quindi, sovrapporre il campione su un mezzo a gradiente di densità avente una densità ottimale per l'isolamento dei linfociti. Con la successiva centrifugazione, i diversi componenti del sangue si separano in base alle variazioni della loro densità rispetto al mezzo di gradiente. I complessi di cellule RBC-non-B con densità più elevate si depositano attraverso il mezzo, formando un pellet. La frazione plasmatica meno densa forma lo strato più superficiale. Le cellule CLL meno dense formano uno strato bianco all'interfaccia plasma-mezzo di densità.

Trasferire con cura lo strato bianco in un tubo nuovo. Centrifugare nuovamente per ottenere un pellet contenente cellule CLL purificate. Nel seguente protocollo, mostriamo l'isolamento di cellule di leucemia linfatica cronica, da campioni di sangue del paziente.

- Ottenere campioni di sangue periferico da pazienti con leucemia linfatica cronica precedentemente consentiti in provette per la raccolta del sangue EDTA accompagnati dalla conta dei globuli bianchi.

- I campioni di sangue umano dovrebbero essere considerati pericolosi, in quanto potenzialmente contengono virus trasmessi per via ematica. Assicurarsi che questi campioni siano conservati in una cabina di biosicurezza di Classe II e che l'utente indossi sempre un camice da laboratorio e guanti. Smaltire i materiali contaminati dal sangue e disinfettarli.

- Se la conta dei globuli bianchi è uguale o superiore a 40 milioni di cellule per millilitro, diluire il campione con un rapporto di 1 a 1 con tampone di lavaggio RT CLL. Quindi aliquotare il mezzo del gradiente di densità RT in una provetta da centrifuga conica di dimensioni adeguate per il campione. Sovrapporre con cura il campione sopra il terreno e centrifugare a 400 volte G per 30 minuti a RT.

Utilizzando una pipetta di plastica pasteur, raccogliere delicatamente lo strato bianco di cellule mononucleate che si è raccolto all'interfaccia del mezzo di gradiente di densità e del tampone di lavaggio CLL. Trasferire questo monostrato isolato in una nuova provetta da centrifuga conica da 50 millilitri. Per lavare le cellule, aggiungere 40 millilitri di tampone di lavaggio CLL a questo monostrato e centrifugare a 300 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente.

Scartare il surnatante, muovere il fondo del tubo per risospendere il pellet e ripetere questo lavaggio. Scartare il surnatante, sbattere nuovamente il fondo della provetta e quindi risospendere il pellet cellulare in un determinato volume di tampone di lavaggio CLL, a seconda delle dimensioni del pellet. Dopo aver contato le cellule e dopo la citometria a flusso per verificare la purezza delle cellule, posizionare le cellule in piastre di coltura tissutale alla densità cellulare richiesta, pronte per la stimolazione o il trattamento farmacologico.