Centrifugazione con gradiente di densità: un metodo per isolare le cellule CLL dal sangue periferico
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0 visualizzazioni • 3:40 min • April 30th, 2023
- Nei pazienti con leucemia linfatica cronica, o LLC, i linfociti a cellule B aumentano significativamente nel midollo osseo e nel sangue. Per isolare queste cellule CLL da un campione di sangue, in primo luogo, trattare il campione con un cocktail di arricchimento di cellule B umane che separa le cellule B utilizzando la selezione negativa. Gli anticorpi nel cocktail riconoscono e reticolano in modo specifico gli antigeni espressi dalle cellule non B e dagli eritrociti, formando complessi densi.
Quindi, sovrapporre il campione su un mezzo a gradiente di densità avente una densità ottimale per l'isolamento dei linfociti. Con la successiva centrifugazione, i diversi componenti del sangue si separano in base alle variazioni della loro densità rispetto al mezzo di gradiente. I complessi di cellule RBC-non-B con densità più elevate si depositano attraverso il mezzo, formando un pellet. La frazione plasmatica meno densa forma lo strato più superficiale. Le cellule CLL meno dense formano uno strato bianco all'interfaccia plasma-mezzo di densità.
Trasferire con cura lo strato bianco in un tubo nuovo. Centrifugare nuovamente per ottenere un pellet contenente cellule CLL purificate. Nel seguente protocollo, mostriamo l'isolamento di cellule di leucemia linfatica cronica, da campioni di sangue del paziente.
- Ottenere campioni di sangue periferico da pazienti con leucemia linfatica cronica precedentemente consentiti in provette per la raccolta del sangue EDTA accompagnati dalla conta dei globuli bianchi.
- I campioni di sangue umano dovrebbero essere considerati pericolosi, in quanto potenzialmente contengono virus trasmessi per via ematica. Assicurarsi che questi campioni siano conservati in una cabina di biosicurezza di Classe II e che l'utente indossi sempre un camice da laboratorio e guanti. Smaltire i materiali contaminati dal sangue e disinfettarli.
- Se la conta dei globuli bianchi è uguale o superiore a 40 milioni di cellule per millilitro, diluire il campione con un rapporto di 1 a 1 con tampone di lavaggio RT CLL. Quindi aliquotare il mezzo del gradiente di densità RT in una provetta da centrifuga conica di dimensioni adeguate per il campione. Sovrapporre con cura il campione sopra il terreno e centrifugare a 400 volte G per 30 minuti a RT.
Utilizzando una pipetta di plastica pasteur, raccogliere delicatamente lo strato bianco di cellule mononucleate che si è raccolto all'interfaccia del mezzo di gradiente di densità e del tampone di lavaggio CLL. Trasferire questo monostrato isolato in una nuova provetta da centrifuga conica da 50 millilitri. Per lavare le cellule, aggiungere 40 millilitri di tampone di lavaggio CLL a questo monostrato e centrifugare a 300 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente.
Scartare il surnatante, muovere il fondo del tubo per risospendere il pellet e ripetere questo lavaggio. Scartare il surnatante, sbattere nuovamente il fondo della provetta e quindi risospendere il pellet cellulare in un determinato volume di tampone di lavaggio CLL, a seconda delle dimensioni del pellet. Dopo aver contato le cellule e dopo la citometria a flusso per verificare la purezza delle cellule, posizionare le cellule in piastre di coltura tissutale alla densità cellulare richiesta, pronte per la stimolazione o il trattamento farmacologico.
Panoramica
In questo articolo viene descritto un protocollo per l'isolamento di cellule di leucemia linfatica cronica (CLL) da campioni di sangue di pazienti. Il metodo prevede l'utilizzo di un cocktail di arricchimento per cellule B umane e una centrifugazione su gradiente di densità per separare le cellule CLL dagli altri componenti del sangue.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ematologia
- Oncologia
- Biologia cellulare
Sfondo
- La leucemia linfocitica cronica (CLL) è caratterizzata da un aumento dei linfociti B.
- L'isolamento delle cellule CLL è fondamentale per la ricerca e lo sviluppo di trattamenti.
- Esistono protocolli standard per l'isolamento cellulare, ma sono necessarie adattamenti specifici per la CLL.
- Le precauzioni di sicurezza sono essenziali durante la manipolazione di campioni di sangue umano.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo dettagliato per l'isolamento di cellule CLL da campioni di sangue.
- Garantire la purezza e la vitalità delle cellule isolate per ulteriori ricerche.
- Evidenziare le misure di sicurezza da adottare quando si lavora con campioni di sangue umano.
Metodi Utilizzati
- I campioni di sangue vengono trattati con un cocktail di arricchimento per linfociti B per una selezione negativa.
- Viene impiegata una centrifugazione su gradiente di densità per separare i componenti del sangue.
- Le cellule mononucleate vengono raccolte dall'interfaccia del mezzo a gradiente.
- Le cellule vengono lavate e risospese per ulteriori analisi o trattamenti.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di cellule CLL da campioni di sangue di pazienti.
- Elevata purezza delle cellule isolate confermata mediante citometria a flusso.
- Il protocollo consente successivi stimoli o trattamenti farmacologici delle cellule CLL.
- Misure di sicurezza efficaci per ridurre al minimo i rischi associati alla manipolazione di campioni di sangue.
Conclusioni
- Il protocollo descritto è efficace per l'isolamento delle cellule CLL.
- Garantire la sicurezza durante il processo è fondamentale per il personale di laboratorio.
- Questo metodo può facilitare ulteriori ricerche sulla CLL e su potenziali terapie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento di cellule CLL primarie dal sangue periferico consente studi meccanicistici sul segnaling delle cellule B e sulla risposta ai farmaci in un sistema rilevante per la patologia. Questo metodo supporta la validazione degli bersagli e lo screening fenotipico fornendo cellule primarie purificate per saggi successivi. Migliora l'affidabilità predittiva dei modelli preclinici riducendo la variabilità derivante da popolazioni cellulari miste.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche in linfociti CLL primari.
- Valore operativo: Fornisce una popolazione cellulare purificata per saggi di convalida funzionale delle target.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio biologico isolando linfociti B rilevanti per la malattia da campioni di pazienti.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara cellule mononucleate validate per flussi di lavoro di screening di composti coerenti.
- Valore operativo: Garantisce la standardizzazione dei saggi attraverso l'isolamento riproducibile di cellule dall'interfaccia del gradiente di densità.
- Valore scientifico: Consente letture quantitative affidabili per esperimenti di trattamento farmacologico e di stimolazione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene la rilevanza clinica utilizzando cellule CLL primarie isolate direttamente dal sangue del paziente.
- Valore operativo: Favorisce la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica grazie a una preparazione cellulare costante.
- Valore scientifico: Facilita la riduzione del rischio meccanicistico dei bersagli in un contesto cellulare clinicamente rilevante.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di isolamento si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, consentendo l'identificazione di composti promettenti e la valutazione preclinica mediante cellule primarie derivate da pazienti.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi in cellule B CLL primarie.
- Screening: Fornisce cellule pronte per il saggio con elevata purezza e vitalità per lo screening di composti.
- Analisi: Permette misurazioni quantitative di variabili dipendenti come il traffico delle proteine e la risposta ai farmaci.
- Ricerca traslazionale: Collega l'isolamento a studi successivi di stimolazione e trattamento in un sistema rilevante per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Offre una capacità riutilizzabile per l'isolamento di linfociti primari in diversi progetti di ricerca sul CLL.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nei modelli di cellule primarie.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità nell'isolamento cellulare tra diversi laboratori.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento/cessazione consentendo test preclinici di efficacia affidabili.
- Impatto sul portafoglio: Supporta decisioni di avanzamento corrette per il rischio grazie ai dati ottenuti da cellule CLL primarie purificate.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di campioni ematici umani primari e nelle tecniche di arricchimento delle cellule B.
- Necessita dell'accesso a mezzi per gradiente di densità, centrifughe e attrezzature per il contenimento biosicuro.
- Richiede una standardizzazione tra i gruppi di lavoro per il conteggio cellulare e la citometria a flusso per la valutazione della purezza.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si applica il protocollo ad altri contesti di isolamento di linfociti.
- Comprende limitazioni pratiche come la variabilità del campione e la necessità di una lavorazione tempestiva dopo il prelievo.
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Ultimo aggiornamento: 29 agosto 2026