Caratterizzazione e isolamento di Mouse Microglia primaria di centrifugazione in gradiente di densità

L'obiettivo generale di questo protocollo è isolare una popolazione di microglia ad alta purezza dai roditori. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neuroinformazione, come l'identificazione delle proprietà immunomodulatorie delle cellule staminali sulla microglia o l'esecuzione di saggi di screening farmacologico. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'isolamento di una popolazione di microglia di elevata purezza senza la necessità di un tempo prolungato in coltura.

Per iniziare questa procedura, inserire le punte delle forbici attraverso l'apertura nel canale spinale e praticare incisioni laterali nel condotto uditivo. Quindi, fai scorrere delicatamente il tessuto verso il rostro per esporre il cranio. Successivamente, praticare un'incisione lungo la sutura sagittale verso il bregma.

Quindi, inserire la punta delle forbici nella bregma e praticare delle incisioni laterali. Successivamente, stacca delicatamente il cranio per esporre il cervello. Utilizzando una pinza curva, rimuoverla e trasferirla in un contenitore sterile da cinque millilitri.

Lavalo due o tre volte con cinque millilitri di liquido di lavaggio ghiacciato per lavaggio per rimuovere il sangue. In una cappa a flusso d'aria laminare, posizionare il contenuto del contenitore da cinque millilitri in una piccola capsula di Petri appoggiata sul ghiaccio. Utilizzando una lama di bisturi sterile o forbici sterili, rimuovere il cervelletto e il bulbo olfattivo.

Quindi, fai un taglio sulla linea mediana per separare i due emisferi. Successivamente, identificare lo strato meningeo come uno strato molto sottile di cellule con una sfumatura rossa sulla superficie del cervello con vasi sanguigni visibili. Staccare con cura lo strato meningeo con una pinza fine, facendo attenzione a non danneggiare le cortecce cutanee.

Se lo strato meningeo si rompe, continuare a staccare i frammenti strappati fino a quando non sono completamente rimossi. Quindi, trasferire gli emisferi in una nuova piccola piastra di Petri con ghiaccio e riempirla con un mezzo di lavaggio. Taglia il cervello in piccoli pezzi con una lama di bisturi sterile.

Successivamente, aggiungere 100 microlitri di papaina e 150 microlitri di DNasi1 nel terreno e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo la digestione, triturare il tessuto utilizzando una pipetta P1000. Se i pezzi di tessuto sono troppo grandi per entrare nella pipetta, prendere in considerazione l'uso di un paio di forbici sterili per allargare la punta della pipetta.

Durante questo processo, fare attenzione a non introdurre bolle nel terreno in quanto ciò potrebbe ridurre la vitalità cellulare. In una cappa a flusso laminare, preparare una provetta conica da 50 millilitri con un filtro cellulare da 100 micrometri. Versare il mezzo digestivo e i pezzi di cervello sul colino.

Spingi attraverso i pezzi di cervello usando lo stantuffo di una siringa sterile da tre millilitri con un movimento di macinazione fino a quando non c'è più tessuto visibile. Lavare continuamente il filtro con il mezzo di lavaggio durante questo processo. Questo laverà tutte le cellule intrappolate nel colino.

Successivamente, centrifugare la sospensione a cella singola a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, preparare il Percoll isotonico stock aggiungendo un rapporto di nove a uno tra il mezzo di gradiente di densità e l'HBSS sterile 10X. Preparare i gradienti come 30% SIP in DMEM e 70% SIP in one-X HBSS.

Ad esempio, per preparare 10 millilitri di SIP al 30%, aggiungere tre millilitri di SIP a sette millilitri di DMEM. Quindi, aspirare il surnatante dal tubo conico e risospendere il pellet cellulare con otto millilitri di SIP al 30% in DMEM. Trasferire l'intero volume in un tubo conico fresco da 15 millilitri.

Successivamente, stendere la soluzione SIP al 70% riempiendo una pipetta di trasferimento con SIP al 70% e spingere con cautela attraverso la pipetta di trasferimento fino al fondo del tubo conico. Una volta che il puntale è vicino al fondo, spingere delicatamente il contenuto attraverso la pipetta di trasferimento. Successivamente, centrifugare gli strati SIP comprese le celle a 650 G con zero freno e accelerazione quattro per 25 minuti a temperatura ambiente.

Lo strato di Percoll al 70% deve essere posato con grande cura. L'interruzione di questa interfaccia può avere un grave impatto sull'intrappolamento della microglia nello strato cellulare e ridurre notevolmente le rese. Quindi, aspirare quattro millilitri di terreno con detriti cellulari dalla parte superiore del tubo per facilitare la rimozione delle cellule mononucleate nella fase successiva.

Quindi, abbassare con cautela la punta della pipetta verso l'interfaccia e isolare le celle mononucleate dall'interfaccia del mezzo con gradiente di densità 30/70. Raccogli circa tre millilitri dall'interfaccia torbida e trasferiscili in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Successivamente, diluire la miscela con nove millilitri di HBSS per favorire la rimozione del mezzo di gradiente di densità.

Centrifugare l'interfaccia del mezzo a gradiente di densità diluito contenente le celle mononucleate a 500 G per cinque minuti. Aspirare il surnatante e rimetterlo in sospensione con un millilitro di terreno di coltura. Successivamente, colorare le cellule ri-sospese con il blu di tripano ed eseguire una conta cellulare utilizzando un emocitometro.

In questa fase, centrifugare le cellule mononucleate raccolte a 300 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere il mezzo di crescita in quanto ciò interferirà con l'isolamento magnetico. Utilizzando la stessa conta cellulare ottenuta in precedenza, risospendere una volta per 10 alle otto cellule nucleate per millilitro in PBS contenente il 2% di FBS e un millimolare di EDTA entro un intervallo di volume compreso tra 0,1 e 2,5 millilitri. Quindi, aggiungi l'intero volume di cellule nucleate in PBS a un nuovo tubo a fondo tondo in polistirene da cinque millilitri.

Quindi, aggiungere 50 microlitri di reagente di marcatura CD11b PE per un millilitro di campione. Incubarlo a temperatura ambiente per 15 minuti al riparo dalla luce. Successivamente, aggiungere 70 microlitri di cocktail di selezione per un millilitro di campione.

Incubarlo a temperatura ambiente per 15 minuti al riparo dalla luce. Successivamente, mescolare le particelle magnetiche pipettando su e giù più di cinque volte. Aggiungere 50 microlitri per millilitro al campione e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti al riparo dalla luce.

Se il volume totale della miscela cellulare è inferiore a 2,5 millilitri, rabboccare fino a questo volume con PBS contenente il 2% di FBS e un millimolare di EDTA e mescolare pipettando delicatamente due o tre volte. Quindi, posizionare la provetta nel magnete e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Con un movimento continuo, capovolgere completamente il magnete contenente il tubo per due o tre secondi per versare il surnatante.

Riposizionare il magnete in posizione verticale e rimuovere il tubo dal magnete. Successivamente, lavare le cellule rimanenti dalla colonna ripetendo le procedure. Risospendere le cellule in un mezzo di crescita desiderato.

Sciacquare il lato del recipiente di raccolta per raccogliere le cellule dai lati del tubo e massimizzare le rese. Come si può vedere in questa figura, le microglia primarie isolate conservano il loro corpo cellulare sferico e la distinta struttura ramificata. Ecco i grafici rappresentativi dei fatti della microglia isolata.

La colorazione combinata di annessina V e ioduro di propidio consente la categorizzazione di cellule apoptotiche, necrotiche o vive dopo stimolazione con LPS. Il terreno condizionato con hAEC ha ridotto significativamente l'apoptosi della microglia rispetto ai controlli, suggerendo una forma di protezione su questo tipo di cellula. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sei-otto ore se eseguita correttamente.

Quando si esegue questo metodo, è importante prestare molta attenzione nella stratificazione del Percoll, poiché questo passaggio avrà il maggiore impatto sulle rese. Seguendo questa tecnica, altre procedure come il test della funzione fagocitaria o la co-coltura con i neuroni possono essere utilizzate per rispondere a ulteriori domande sulle proprietà immunomodulatorie del tipo di cellula scelta sulla microglia primaria. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori del settore per scoprire come la microglia primaria possa essere modulata nelle lesioni cerebrali perinatali.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia e alla diagnosi della lesione cerebrale perinatale in quanto consente la caratterizzazione di un tipo di cellula immunitaria primaria nota per essere coinvolta nella neuroinformazione che porta a disfunzioni motorie e cognitive. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui disturbi motori come la paralisi cerebrale, può essere applicato anche ad altri disturbi in cui la microglia svolge un ruolo nella patogenesi come il morbo di Alzheimer. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando volevamo una tecnica per la caratterizzazione rapida della microglia eludendo potenziali cambiamenti epigenetici dopo un periodo prolungato in coltura.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare la popolazione di microglia ad alta purezza per la caratterizzazione a valle.