PAR-Clip - un metodo per identificare trascrittoma livello i siti di legame delle proteine ​​RNA binding

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare i siti di legame dell'ampio trascrittoma delle proteine leganti l'RNA o RVP. Ciò si ottiene utilizzando prima analoghi nucleosidici fotoreattivi per la marcatura in vivo di trascritti nascenti. La seconda fase della procedura consiste nel reticolare l'RNA e le proteine leganti l'RNA mediante luce UV a 365 nanometri.

La terza fase della procedura consiste nell'immunoprecipitare la proteina legante l'RNA studiata e nel recuperare il legame incrociato con l'RNA. La fase finale della procedura consiste nel convertire l'RNA in una libreria di CD NA e in una sequenza profonda. Alla fine si possono ottenere risultati che mostrano ampi siti di legame del trascrittoma delle RVP e consentono la definizione dell'elemento di riconoscimento dell'RNA e delle sue preferenze di legame.

Ciao, mi chiamo Marcus Hoffner del laboratorio di Tom SEL alla Rockefeller University di New York. Oggi mostreremo un metodo chiamato par lip o analogo nucleosidico della costola fotobile potenziato e immunoprecipitazione. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per identificare su un trascrittoma dai suoi siti di legame a squame le proteine leganti l'RNA e i loro motivi e preferenze di legame.

Ok, allora iniziamo. La reticolazione UV in vivo inizia in una cappa a flusso laminare. In questo protocollo utilizzeremo IGF marcato due cellule BP come modello esemplare utilizzando una tecnica sterile.

Espandi HEK 2 93 cellule che esprimono stabilmente IGF marcato HA bandiera due BP uno sotto il controllo di un repressore Tet in HEK 2 93 terreno di coltura cellulare utilizzare tra 100 e 400 volte 10 alla sesta cellula e farli crescere fino a circa l'80% di fluenza co. A 14 ore prima della reticolazione, le cellule avevano l'analogo fotoreattivo del riboside per la tio uridina o per l'SU direttamente nel terreno di coltura cellulare. In alternativa, è possibile utilizzare sei ghinee o sei SG dopo l'aggiunta del riboside fotoreattivo, indurre l'espressione dell'IGF marcato con HA flag, due BP, uno con l'aggiunta di cellule doxiciclina, vengono quindi incubati durante la notte in incubatore cellulare.

Quindi, decantare il terreno di coltura. Quindi lavare le cellule una volta con 10 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato per piastra. Quindi rimuovere completamente il PBS decantando.

Posizionare le piastre scoperte su un vassoio con ghiaccio e irradiarle con luce UV a 365 nanometri in un reticolante UV straddle 2, 400 o equivalente dopo la radiazione UV, raschiare via le cellule con un poliziotto di gomma in un millilitro di PBS per piastra. Trasferire le cellule in provette da centrifugazione da 50 millilitri e centrifugare a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il nome del super e conservare il pellet della cella.

A questo punto, i pellet cellulari possono essere congelati in azoto liquido e conservati a meno 80 per almeno 12 mesi. Per continuare con la procedura, sospendere il pellet in tre volumi di un tampone di lisi X NP 40 e incubare su ghiaccio per 10 minuti. Eliminare il lisato cellulare mediante centrifugazione a 13.000 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, eliminare ulteriormente il lisato filtrandolo attraverso un filtro a siringa a membrana da cinque micron. Infine, aggiungere gli RNA T one a una concentrazione finale di un'unità per microlitro e incubare in un bagno d'acqua a 22 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, raffreddare la reazione sul ghiaccio per cinque minuti.

A seguito di reticolazione UV in vivo. Preparare le microsfere magnetiche per l'immunoprecipitazione. Trasferire 10 microlitri di particelle magnetiche di proteina G di perline di dyna per un mil di lisato cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Quindi posizionare il tubo contenente le perline su un supporto magnetico per uno o due minuti. Rimuovere il surnatante e aggiungere un millilitro di tampone citrato fosfato alla provetta mentre si trova sul separatore magnetico. Quindi, tappare il tubo e agitare il campione per risospendere le perline.

Centrifugare brevemente per raccogliere le perle rimaste nel tappo della provetta. Ripetere questo lavaggio con un ulteriore millilitro di tampone citrato fosfato. Dopo la ripresa di lavaggio, sospendere le perle e il tampone fosfato di citrato a un volume pari a due volte il volume originale della sospensione di barbabietola.

Quindi aggiungere 0,25 milligrammi di anticorpo monoclonale Anti-Flag M due per un millilitro di sospensione di battito. Incubare la sospensione su una ruota rotante per 40 minuti a temperatura ambiente dopo l'incubazione, lavare le perle due volte in un millilitro di tampone fosfato citrato come descritto in precedenza, questo lavaggio serve a rimuovere qualsiasi anticorpo non legato dopo il lavaggio Resus, sospendere le perle e il tampone fosfato citrato come prima quattro. Per iniziare l'immunoprecipitazione, aggiungere le microsfere magnetiche coniugate con anticorpi appena preparate agli RNA T uno lisato cellulare trattato.

Trasferire il composto in provette da centrifugazione da 15 millilitri e ruotare per un'ora a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, raccogliere le microsfere magnetiche, scartare le perle di risospensione del surnatante in un millilitro di tampone di lavaggio IP e trasferirle in provette da centrifuga da 1,5 millilitri. Lavare le perle come descritto prima due volte in un millilitro di tampone di lavaggio IP.

Dopo il lavaggio finale, sospendere nuovamente le perle nel volume originale del tampone di lavaggio IP. Quindi aggiungere RNAT uno a una concentrazione finale di 100 unità per microlitro. Incubare la sospensione di perle in un bagno d'acqua a 22 gradi Celsius per 15 minuti.

Successivamente raffreddare la sospensione con ghiaccio per cinque minuti. Quindi, lavare le perle tre volte in un millilitro di tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale. Quindi risospendere le perle in un volume originale di perlina di tampone di defosforilazione.

Aggiungere la fosfatasi alcalina intestinale di vitello a una concentrazione finale di 0,5 unità per microlitro e incubare la sospensione per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Lavare le perle due volte in un millilitro di tampone di lavaggio della fosfatasi e poi altre due volte in polinucleotide chinasi o tampone PNK senza DTT. Infine, risospendere le perle in un volume originale di tampone PNK.

Per iniziare la marcatura radio dell'RNA reticolato. Aggiungere gamma 32 PATP e T four PNK a un volume di cordone originale della sospensione di perline appena preparata. Incubare la sospensione per 30 minuti a 37 gradi Celsius.

Successivamente, aggiungere un TP non radioattivo alla sospensione e incubarla per altri cinque minuti a 37 gradi Celsius. Quindi lavare le perle magnetiche cinque volte con 800 microlitri di tampone PNK senza DTT. Infine, risospendere le perle in 70 microlitri di pagina SDS.

Tampone di caricamento: incubare la sospensione del radiomarcatore per cinque minuti in un blocco termico a 95 gradi Celsius per denaturare e rilasciare le proteine leganti l'RNA immunoprecipitato con l'RNA reticolato. Quindi rimuovere le microsfere magnetiche sul separatore e trasferire il super natin in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 millilitri Caricare 40 microlitri di suade per pozzetto di un gel di poliacrilammide prefabbricato novox bis triss da quattro al 12% e far funzionare il gel per 55 minuti a 200 volt. Una volta che il gel è stato eseguito, smontare la camera del gel e smontare le piastre, lasciando il gel montato su una piastra per facilitare l'allineamento del gel alla stampa della carta phosphoimager.

Impiantare tre minuscoli pezzi di gel radioattivo in modo asimmetrico agli angoli del gel. Avvolgere il gel in una pellicola di plastica come l'involucro Saran per evitare contaminazioni. Esporre il gel a uno schermo fosfoimager vuoto per un'ora e su un imager phospho

Quindi, allineare il gel sopra la stampa dell'imager fosfoscopico utilizzando i pezzi di gel impiantati per l'orientamento. Taglia le bande che corrispondono alla dimensione prevista della proteina legante l'RNA o RBP. Trasferire le bande in un tubo MIDI dializzatore dtu e aggiungere 800 microlitri di un elettro eluizione buffer XSDS.

Il complesso R-N-A-R-B-P reticolato a 100 volt per due ore secondo le istruzioni del produttore. Successivamente all'elettroeluizione. Aggiungere il tampone proteinasi K e la proteinasi K incubare la soluzione per 30 minuti a 55 gradi Celsius.

Recuperare l'RNA mediante estrazione acida di fenolo cloroformio isoamilico, seguita da un'estrazione di cloroformio. Quindi aggiungere un microlitro di glicogeno e precipitare l'RNA aggiungendo tre volumi di etanolo. Infine sciogliere il pellet risultante in 10,5 microlitri di acqua.

Una volta recuperato l'RNA, trasportarlo attraverso un protocollo standard di preparazione della libreria CDNA ed eseguire un'attenta analisi bioinformatica delle letture della sequenza. Risultati rappresentativi per una clip par eseguita con HK 2, 93 cellule che esprimono IGF marcato con flag H ha, due BP, una sono mostrate con gli analoghi nucleosidici fotoreattivi, quattro SU e sei SG, l'efficienza di reticolazione del riboside fotoreattivo alternativo, sei SG è generalmente inferiore a quella di quattro su. La minore efficienza di reticolazione potrebbe comportare un maggiore background di sequenze derivate da frammenti di abbondanti RNA cellulari e quindi più cellule dovrebbero essere inizialmente utilizzate per l'esperimento.

Diversi analoghi dell'uridina fotoreattiva par clip vengono confrontati con la tradizionale reticolazione UV 2 a 54 nanometri o clip come si vede qui. La reticolazione delle proteine dell'RNA UV 2 a 54 nanometri ha un'efficienza di reticolazione limitata. L'intensità della banda radioattiva di dimensioni adeguate indica se l'esperimento par clip ha funzionato e se è stata isolata una quantità sufficiente di RNA per eseguire un protocollo di sequenziamento dell'RNA piccolo.

Le frequenze delle mutazioni caratteristiche nelle reads sequenziate a seguito dell'analisi bioinformatica sono indicative di sequenze cross-linked riuscite a riuscire a creare sequenze incrociate. Queste mutazioni sono transizioni T due C quando si utilizzano quattro transizioni SU e G due transizioni A quando si utilizza il successo. G. La caratteristica distintiva del park lip è la possibilità di derivare la posizione del legame incrociato mediante il punteggio per una mutazione caratteristica che risiede nelle librerie di CD NA preparate dagli RNA recuperati.

Ciò consente la facile separazione del segnale derivato da RNA specificamente legati, dal rumore di sequenze derivate da frammenti co-isolati di abbondanti RNA cellulari. Oggi vi abbiamo mostrato come isolare i segmenti di RNA, specificamente riconosciuti dalle proteine leganti l'RNA. Quando si esegue questa procedura.

È importante lavorare senza RNA. E così è stato. Grazie per aver guardato e buona fortuna con gli esperimenti.