Name: PAR-Clip - un metodo per identificare trascrittoma livello i siti di legame delle proteine RNA binding (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Impara il metodo PAR-CLIP per identificare i siti di legame delle proteine RNA-binding a livello del trascrittoma utilizzando analoghi nucleosidici fotoreattivi e cross-linking UV. Questa tecnica consente di definire elementi di riconoscimento dell'RNA.

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Ringraziamo i membri del laboratorio Tuschl per le discussioni utili. MH è supportato dal Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD). Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo Nazionale Svizzero di Grant # 3100A0-114001 a MZ; TT è un investigatore HHMI, e il lavoro nel suo laboratorio è stato sostenuto da NIH GM073047 e MH08442 e la Fondazione Starr.

Il protocollo seguente descrive il PAR-Clip procedura per cellule HEK293 che esprimono FLAG / HA-tag IGF2BP1 su induzione con doxiciclina. Useremo un anti-FLAG anticorpo per immunoprecipitazione. PAR-Clip funziona con qualsiasi linea di cellule che esprimono livelli rilevabili di endogeno, senza tag legame con le proteine ​​RNA (RBP) di interessi se un anticorpo efficace per immunoprecipitazione è disponibile. Le cellule in espansione <ol><li> Espandere FlpIn-HEK293/TO/FLAG/HA-IGF2BP1 cellule in terreno di crescita. Si consiglia di utilizzare tra 100-400 x 10 6 cellule (circa 15 centimetri 10-40 piastre di coltura cellulare) come punto di partenza. Crescere a circa l'80% confluenza. </li><li> 14 h prima di aggiungere un reticolazione) 4-thiouridine ad una concentrazione finale di 100 mM (1:1000 v / v di un 1 M 4-thiouridine soluzione madre) direttamente al mezzo di coltura cellulare e b) inducono l'espressione del FLAG / HA tagged IGF2BP1 mediante aggiunta di 1 mg / ml di doxiciclina (1:10.000 v / v di 10 mg / ml soluzione madre doxiciclina). NOTA: al posto di 4-thiouridine è anche possibile utilizzare il 100 mM di 6-thioguanosine. </li></ol> UV-reticolazione <ol><li> Lavare le cellule una volta con 10 ml ghiacciata PBS per piastra e rimuovere completamente PBS. </li><li> Piastre posto su un vassoio con ghiaccio e irradiare scoperto con 0,15 J / cm 2 di 365 nm luce UV in un Stratalinker 2400 (Stratagene) o un dispositivo simile. </li><li> Raschiare le cellule con un poliziotto in gomma in 1 ml di PBS per piastra, trasferimento in tubi da 50 ml centrifugazione e raccogliere per centrifugazione a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C e scartare il surnatante. 100 x 10 6 cellule HEK293 (10 15 lastre cm) produrrà circa. 1 ml di pellet umido. </li><li> (Opzionale) A meno che non si desidera continuare direttamente con la lisi cellulare, shock congelare il pellet di cellule in azoto liquido e conservare a -80 ° C. Pellet cellulare può essere conservato per almeno 12 mesi. </li></ol> Lisi cellulare e RNaseT1 digerire <ol><li> Raccogliere pellet cellulare delle cellule reticolato in 3 volumi di tampone di lisi 1x NP40 e incubare in ghiaccio per 10 minuti. </li><li> Lisato di cellule chiare per centrifugazione a 13.000 xg per 15 minuti a 4 ° C. </li><li> Cancella il lisato ulteriormente filtrandola attraverso una siringa da 0,2 micron filtro a membrana (Acrodisc Pall o equivalente). </li><li> Aggiungi RNasi T1 (Fermentas, 10.000 U / mL) a una concentrazione finale di 1 U / mL e incubare a bagnomaria per 15 minuti a 22 ° C. Reazione fredda successivamente per 5 minuti in ghiaccio prima di procedere. </li></ol> Immunoprecipitazione ed il recupero di frammenti di RNA bersaglio reticolato Utilizzando il separatore magnetico Seguire queste linee guida per tutta la preparazione del campione per evitare che il sfere magnetiche si secchi. <ol><li> Collocare la provetta contenente le perline sul supporto magnetico per 1 2 minuti. </li><li> Aggiungere la soluzione tampone al tubo mentre il tubo si trova sul separatore magnetico. </li><li> Chiudere la provetta, rimuoverlo dal separatore magnetico, e risospendere le sfere. Si può risospendere le sfere muovendo il tubo con le dita o utilizzare un vortex fissato a 5 6. </li><li> Centrifugare brevemente per raccogliere le sfere che possono rimanere nel tappo del tubo. </li><li> Ripetere i passaggi da 1 a 4 come richiesto. </li></ol> Preparazione di perline magnetiche <ol><li> Trasferire 10 ml di particelle di proteina G Dynabeads magnetico (Invitrogen) per cella ml di lisato (per un tipico esperimento che dovrebbe essere di ca. 40 50 ml di perline) in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml. Lavare perle due volte con 1 ml di tampone citrato-fosfato. </li><li> Risospendere in doppio del volume di tampone citrato-fosfato rispetto al volume originario di sospensione tallone. </li><li> Aggiungi 0,25 mg di anti-FLAG anticorpi monoclonali M2 (Sigma) per ogni ml di sospensione e incubare su una ruota girevole per 40 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare perle due volte in 1 ml di tampone citrato-fosfato per rimuovere l'anticorpo non legato. </li><li> Risospendere le sfere in doppio del volume di tampone citrato-fosfato rispetto al volume originario di sospensione tallone. </li></ol> Immunoprecipitazione (IP), secondo la digestione RNasi T1, e defosforilazione <ol><li> Aggiungere 20 ml di preparati al momento sfere magnetiche anticorpi coniugati per ml di lisato cellulare parziale RNasi T1 trattati e incubare in provette da 15 ml centrifugazione su una ruota girevole per 1 ora a 4 ° C. </li><li> Raccogliere sfere magnetiche su un collettore di particelle magnetiche per 15 e 50 tubi di centrifugazione ml (Invitrogen) e trasferimento in tubi da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Lavare perle 3 volte in 1 ml di tampone di lavaggio IP. </li><li> Aggiungi RNaseT1 (Fermentas, 10.000 U / mL) a una concentrazione finale di 100 U / mL e incubare la sospensione tallone a bagnomaria per 15 minuti a 22 ° C. Raffreddare successivamente sul ghiaccioper 5 min. </li><li> Lavare perle 3 volte in 1 ml di alto sale tampone di lavaggio. </li><li> Perline risospendere in 1 volume di tampone defosforilazione </li><li> Aggiungi vitello fosfatasi alcalina intestinale (CIAP, NEB) ad una concentrazione finale di 0,5 U / mL, e incubare la sospensione per 10 minuti a 37 ° C. </li><li> Lavare perle due volte in 1 ml di tampone di lavaggio fosfatasi </li><li> Lavare perle due volte in polinucleotide chinasi (PNK) buffer senza digitale terrestre (DTT la concentrazione necessaria per la reazione enzimatica è abbastanza alta da danneggiare le sfere magnetiche). </li><li> Perline risospendere in un unico volume originale cordolo di PNK tampone </li></ol> Radiomarcatura reticolato di segmenti di RNA a proteine ​​immunoprecipitato <ol><li> Per la sospensione tallone descritto sopra, aggiungere Υ-32 P-ATP ad una concentrazione finale di 0,5 μCi / mL e T4 PNK (ONA) a 1 U / mL in un unico volume originale tallone. Incubare la sospensione per 30 minuti a 37 ° C. </li><li> Aggiungi non radioattivo ATP per ottenere una concentrazione finale di 100 mM e incubare per altri 5 minuti a 37 ° C. </li><li> Lavare le sfere magnetiche 5 volte con 800 ml di PNK buffer senza DTT. </li><li> Risospendere le sfere in 70 ml di SDS-PAGE tampone di caricamento. </li></ol> SDS-PAGE e electroelution reticolato di RNA-proteina complessi da fette di gel <ol><li> Incubare la sospensione radiomarcato per 5 minuti in un blocco di calore a 95 ° C per denaturare e rilasciare il RBP immunoprecipitati con RNA reticolato e vortice. </li><li> Rimuovere le sfere magnetiche sul separatore e trasferire il supernatante in una provetta da microcentrifuga pulita 1,5 ml. </li><li> Carico massimo di 40 ml di supernatante per pozzetto di una Novex Bis-Tris 4-12% (Invitrogen) gel di poliacrilammide prefabbricati ed eseguire il gel per 55 min a 200 V. </li><li> Smontare la camera di gel e smantellare il gel, lasciandolo montato su una piastra. Per facilitare l'allineamento del gel alla lista su carta phosphorimager, si consiglia di impiantare tre pezzi minuscoli gel radioattivi asimmetrico a tre dei quattro angoli del gel. Pezzi gel radioattivi possono essere raccolti dal gel che in precedenza erano utilizzate per purificare radiomarcati oligonucleotidi sintetici. Avvolgere il gel in film plastico (ad esempio pellicola trasparente) per evitare contaminazioni. </li><li> Esporre il gel per uno schermo oscurato phosphorimager per 1 ora e visualizzare su un phosphorimager. </li><li> Allineare il gel sulla parte superiore della stampa phosphorimager utilizzando i pezzi di gel impiantati per l'orientamento. Tagliare le bande che corrispondono alle dimensioni previste di RBP (IGF2BP1, ca. 75 kDa) e trasferirla in un D-Tube Tubo dializzatore Midi e aggiungere 800 microlitri 1x tampone SDS esecuzione. </li><li> Electroelute il reticolato RNA-RBP complesso in 1x SDS gestione del buffer a 100 V per 2 ore escisse dal gel e electroeluted in un D-Tube dializzatore Midi (Novagen) in 800 microlitri di buffer SDS esecuzione secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> Proteinasi K digestione <ol><li> Aggiungere un volume equivalente di tampone 2x proteinasi K rispetto alla electroeluate, seguito con l'aggiunta di proteinasi K (Roche) ad una concentrazione finale di 1,2 mg / ml. Incubare per 30 minuti a 55 ° C. </li><li> Recuperare l'RNA da acido fenolo / cloroformio / IAA di estrazione (25:24:1, pH 4,0) seguita da un'estrazione con cloroformio. Aggiungere 1 ml di glicogeno (10 mg / ml di brodo) precipitare l'RNA con l'aggiunta di 3 volumi di etanolo. Sciogliere il precipitato in acqua 10,5 microlitri. </li></ol> biblioteca preparazione cDNA e sequenziamento profondo Portare l'RNA recuperato attraverso un protocollo standard cDNA preparazione biblioteca originariamente descritta per la clonazione dei piccoli RNA normativo 19. Il primo passo, la legatura adattatore 3 ', è stata effettuata come descritto in una scala 20 l con 10,5 ml di RNA recuperato. Utilizzare il Solexa sequenziamento adattatore set descritto. A seconda della quantità di RNA recuperato, 5'-adattatore-3'-adattatore prodotti senza inserti possono essere rilevati dopo l'amplificazione del cDNA come ulteriori bande PCR. In tali casi, il prodotto più accise PCR delle dimensioni previste dal NuSieve 3% a basso punto di fusione su gel di agarosio, eluire il prodotto di PCR dai pezzi gel con il kit GelElute (Qiagen) e sequenza utilizzando la tecnologia Solexa. Un Solexa sequenziamento eseguire offre di solito tra i 6 ei 10 milioni di sequenza si legge che sono sufficienti per una copertura trascrittoma gamma di siti di legame delle proteine ​​RNA vincolanti. Analisi bioinformatica Un'attenta analisi bioinformatica della sequenza di legge deve essere fatto per ottenere la intuizioni significative nei siti RNA vincolante per la RBP esame, come l'elemento di riconoscimento di RNA, le regioni preferito vincolante la RBP ha (exonic vs intronico, codifica sequenza vs non tradotte sequenza). La sequenza si legge devono essere allineati contro le banche dati del genoma e EST. Noi di solito utilizzare legge MAPPIng esclusivamente al genoma con fino a un disadattamento, inserimento o l'eliminazione di costruire gruppi di sequenza si legge che possono poi essere ulteriormente analizzato. La frequenza di mutazioni caratteristiche del cluster sequenziato legge, T alle transizioni C quando si usa 4-SU e G ad A transizioni quando si utilizzano 6-SG, sono indicativi di sequenze con successo reticolato. Nella nostra esperienza RNA uncrosslinked etichettati con 4-SU mostrano un tasso di mutazione sfondo di circa il 20%. Questo tasso è aumenta di ca. 50-80% su reticolazione. Una descrizione dettagliata delle analisi bioinformatica può essere trovato nel materiale supplementare della pubblicazione da parte Hafner et al 18. Passi opzionali Determinazione dei livelli di incorporazione di 4-thiouridine in RNA totale Isolare RNA totale dalla linea cellulare che esprimono stabilmente la RBP di interesse dopo essere cresciuto in media integrato con 100 mM 4SU 16 ore prima del raccolto. Come controllo, le cellule raccolta coltivati ​​senza aggiunta 4SU. Isolare RNA totale con l'aggiunta di 3 volumi di reagente Trizol (Sigma) al pellet cellulari lavato seguendo le istruzioni del produttore s. è stata ulteriormente purificare l'RNA totale usando Qiagen RNeasy secondo il protocollo del produttore. Per prevenire l'ossidazione del 4SU durante l'isolamento di RNA e analisi, aggiungere 0,1 mM ditiotreitolo (DTT) a tamponi di lavaggio e successive reazioni enzimatiche. Digerire e defosforilata RNA totale di nucleosidi singolo per l'analisi HPLC come descritto in precedenza 20. In breve, in un volume di 30 microlitri, incubare a 40 mcg di RNA totale sono stati purificati per 16 ore a 37 ° C con 0,4 U fosfatasi alcalina batterica (Biochemical Worthington) e 0,09 veleno di serpente U fosfodiesterasi (Worthington Biochemical). Come standard di riferimento, utilizzare una sintesi di RNA 4SU marcato, (siamo in standard uso CGUACGCGGAAUACUUCGA (4SU) U) e anche soggetti per completare la digestione enzimatica. Separare le miscele risultante di ribonucleosides mediante HPLC su Discovery Supelco C18 (particelle di silice legata fase mM 5, 250 x 4,6 mm) colonna a fase inversa (Bellefonte PA, USA). Buffer HPLC sono 0,1 M TEAA nel 3% acetonitrile (A) e il 90% acetonitrile in acqua (B). Utilizzare un gradiente isocratica: 0% B per 15 minuti, da 0 a 10 B% per 20 minuti, dal 10 al 100% B per 30 min. Applicare un min 5 100% B lavare applicata tra le esecuzioni per pulire la colonna HPLC. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2034/2034fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1 (pannello di destra) mostra un risultato rappresentativo di un PAR-Clip eseguita con linee cellulari che esprimono FLAG / HA-tag IGF2BP1 con 4-SU e 6-SG. Si noti che l'efficienza reticolazione di 6-SG per IGF2BP1 è inferiore al rendimento reticolazione per 4-SU. L'efficienza reticolazione inferiore si tradurrà in un contesto più elevato di sequenze derivate da abbondanti frammenti di RNA cellulare e quindi si dovrebbe considerare di scala l'esperimento quando si utilizzano nucleosidi fotoreattivo meno efficienti. Il pannello di sinistra della figura 1 mostra un confronto di utilizzare diversi analoghi uridina fotoreattivo che potrebbero essere potenzialmente utilizzate per PAR-Clip rispetto ai tradizionali reticolazione UV 254 nm. L'intensità della banda radioattiva della lunghezza corretta che dà una buona idea se il PAR-Clip esperimento ha funzionato e che è stato isolato l'RNA sufficiente per portare a termine una piccola sequenza di RNA protocollo (step-by-step descrizione per la preparazione di piccole librerie di cDNA sequenziamento RNA può essere trovato in 19). La frequenza di mutazioni caratteristiche della legge in sequenza, T alle transizioni C quando si usa 4-SU e G ad A transizioni quando si utilizzano 6-SG, sono indicativi di sequenze con successo reticolato. Nella nostra esperienza RNA uncrosslinked etichettati con 4-SU mostrano un tasso di mutazione sfondo di circa il 20%. Questo tasso è aumenta di ca. 50-80% su reticolazione.

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</ol>

TT è una co-fondatore e consulente scientifico per Alnylam Pharmaceuticals e consulente di Regulus Therapeutics.

Tamponi e reagenti Crescita media cellule HEK293 <ul><li> DMEM </li><li> 10% FBS </li><li> 2 mM L-Glutammina </li><li> 100 U / ml di penicillina </li><li> 100 U / ml streptomicina </li><li> 100 mg / ml Hygromycin </li><li> 15 mg / ml blasticidin </li></ul> 4-thiouridine soluzione madre (1 M) <ul><li> 260,27 mg 4-thiouridine </li><li> 1 ml di DMSO </li></ul> Doxycyclin magazzino (10 mg / ml) <ul><li> 10 mg doxycyclin </li><li> 1 ml di DMSO </li></ul> 1x NP40 buffer di lisi Preparare uno stock di tampone 5x senza DTT e inibitori della proteasi. Aggiungi DTT e inibitore della proteasi direttamente prima dell&#39;esperimento. <ul><li> HEPES 50 mM, pH 7,5 </li><li> 150 mM KCl </li><li> 2 mM EDTA </li><li> 1 mM NaF </li><li> 0,5% (v / v) NP40 </li><li> 0,5 mM DTT </li><li> completa EDTA senza inibitore della proteasi cocktail (Roche) </li></ul> Tampone citrato-fosfato <ul><li> 4,7 g / l di acido citrico </li><li> 9,2 g / l Na 2 HPO 4 </li><li> pH 5,0 </li></ul> IP-tampone di lavaggio <ul><li> 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5 </li><li> 300 mM KCl </li><li> 0,05% (v / v) NP40 </li><li> 0,5 mM DTT (aggiungere direttamente prima dell&#39;esperimento) </li><li> completa EDTA senza inibitore della proteasi cocktail (Roche) (aggiungere direttamente prima dell&#39;esperimento) </li></ul> High-sale tampone di lavaggio <ul><li> 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5 </li><li> 500 mM KCl </li><li> 0,05% (v / v) NP40 </li><li> 0,5 mM DTT (aggiungere direttamente prima dell&#39;esperimento) </li><li> completa EDTA senza inibitore della proteasi cocktail (Roche) (aggiungere direttamente prima dell&#39;esperimento) </li></ul> Defosforilazione tampone <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 </li><li> 100 mM NaCl </li><li> 10 mM MgCl 2 </li><li> 1 mM DTT </li></ul> Fosfatasi tampone di lavaggio <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> 20 mM EGTA </li><li> 0,5% (v / v) NP40 </li></ul> Polinucleotide chinasi (PNK) buffer senza DTT <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> 50 mM NaCl </li><li> 10 mM MgCl 2 </li></ul> PNK tampone <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> 50 mM NaCl </li><li> 10 mM MgCl 2 </li><li> 5 mM DTT </li></ul> SDS PAGE tampone di caricamento <ul><li> 10% glicerolo (v / v) </li><li> 50 mM Tris-HCl, pH 6.8 </li><li> 2 mM EDTA </li><li> 2% SDS (w / v) </li><li> 100 mM DTT </li><li> 0,1% bromofenolo blu </li></ul> 2x proteinasi K tampone <ul><li> 100 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> 150 mM NaCl </li><li> 12,5 mm EDTA </li><li> 2% (w / v) di SDS </li></ul>

par-clip - un metodo per identificare trascrittoma livello i siti di legame delle proteine ​​rna binding

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

Trascrizioni di RNA sono sottoposti a regolazione post-trascrizionale genica interagendo con centinaia di RNA-binding proteins (RBPs) e microRNA contenenti complessi ribonucleoproteina (miRNPs) che sono spesso espressi in una cellula di tipo dipendente. Per capire come l&#39;interazione di questi RNA-binding fattori influisce sulla regolazione della trascrizione individuale, mappe ad alta risoluzione in vivo le interazioni proteina-RNA sono necessari 1. Una combinazione di fattori genetici, biochimici e approcci computazionali sono generalmente applicati per individuare l&#39;RNA-RBP o RNA-RNP interazioni. Profiling microarray di RNA associate a RBPs immunopurified (RIP-Chip) 2 definisce gli obiettivi a livello del trascrittoma, ma la sua applicazione è limitata alla caratterizzazione delle interazioni cineticamente stabile e solo in rari casi 3,4 permette di identificare l&#39;elemento RBP riconoscimento (RRE ) all&#39;interno del RNA bersaglio lungo. Più diretto obiettivo informazioni RBP sito è ottenuto dalla combinazione di reticolazione UV 5,6 vivo con immunoprecipitazione 7-9 seguito da l&#39;isolamento reticolato di segmenti di RNA e sequenziamento del DNA (CLIP) 10. CLIP è stato utilizzato per identificare gli obiettivi di un certo numero di RBPs 11-17. Tuttavia, CLIP è limitata dalla scarsa efficienza dei raggi UV 254 nm RNA-proteina reticolazione, e la posizione della reticolazione non è facilmente individuabile all&#39;interno dei frammenti sequenziati reticolato, il che rende difficile separare reticolati UV bersaglio segmenti di RNA da sfondo non reticolati anche frammenti di RNA presenti nel campione. Abbiamo sviluppato una potente cellula approccio basato reticolazione a determinare in alta risoluzione e trascrittoma livello i siti di legame di RBPs cellulare e miRNPs che chiamiamo PAR-Clip (Photoactivatable-ribonucleosidi-Enhanced reticolazione e immunoprecipitazione) (vedi fig. 1A per uno schema del metodo). Il metodo si basa sulla costituzione di analoghi ribonucleosidi fotoreattivo, come thiouridine 4-(4-SU) e 6-thioguanosine (6-SG) nella nascente trascrizioni di RNA da cellule viventi. L&#39;irradiazione delle cellule dalla luce UV di 365 nm induce la reticolazione efficiente delle fotoreattivo nucleosidi marcati RNA cellulare RBPs interagenti. Immunoprecipitazione della RBP di interesse è seguita da isolamento del RNA reticolato e coimmunoprecipitated. L&#39;RNA isolato è trasformata in una libreria di cDNA e profondo in sequenza usando la tecnologia Solexa. Una caratteristica di librerie cDNA preparati da PAR-Clip è che la posizione precisa di reticolazione può essere identificata da mutazioni che risiedono nella sequenza del DNA. Quando si utilizza 4-SU, sequenze reticolato timidina di transizione citidina, mentre l&#39;uso di 6-SG risultati in guanosina di adenosina mutazioni. La presenza di mutazioni in sequenze reticolato rende possibile la loro separazione dallo sfondo di sequenze derivate da abbondanti RNA cellulare. Applicazione del metodo ad una serie di diverse proteine ​​RNA binding è stata riportata in Hafner et al 18.

Trascrizioni di RNA sono soggetti ad ampie regolamentazione posttranscriptional che è mediato da una moltitudine di trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Qui vi presentiamo un metodo generalizzabile per identificare con precisione e trascrittoma su scala i siti di legame di RNA RBPs.

PAR-Clip - un metodo per identificare trascrittoma livello i siti di legame delle proteine ​​RNA binding

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare i siti di legame dell'ampio trascrittoma delle proteine leganti l'RNA o RVP. Ciò si ottiene utilizzando prima analoghi nucleosidici fotoreattivi per la marcatura in vivo di trascritti nascenti. La seconda fase della procedura consiste nel reticolare l'RNA e le proteine leganti l'RNA mediante luce UV a 365 nanometri.La terza fase della procedura consiste nell'immunoprecipitare la proteina legante l'RNA studiata e nel recuperare il legame incrociato con l'RNA. La fase finale della procedura consiste nel convertire l'RNA in una libreria di CD NA e in una sequenza profonda. Alla fine si possono ottenere risultati che mostrano ampi siti di legame del trascrittoma delle RVP e consentono la definizione dell'elemento di riconoscimento dell'RNA e delle sue preferenze di legame.Ciao, mi chiamo Marcus Hoffner del laboratorio di Tom SEL alla Rockefeller University di New York. Oggi mostreremo un metodo chiamato par lip o analogo nucleosidico della costola fotobile potenziato e immunoprecipitazione. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per identificare su un trascrittoma dai suoi siti di legame a squame le proteine leganti l'RNA e i loro motivi e preferenze di legame.Ok, allora iniziamo. La reticolazione UV in vivo inizia in una cappa a flusso laminare. In questo protocollo utilizzeremo IGF marcato due cellule BP come modello esemplare utilizzando una tecnica sterile.Espandi HEK 2 93 cellule che esprimono stabilmente IGF marcato HA bandiera due BP uno sotto il controllo di un repressore Tet in HEK 2 93 terreno di coltura cellulare utilizzare tra 100 e 400 volte 10 alla sesta cellula e farli crescere fino a circa l'80% di fluenza co. A 14 ore prima della reticolazione, le cellule avevano l'analogo fotoreattivo del riboside per la tio uridina o per l'SU direttamente nel terreno di coltura cellulare. In alternativa, è possibile utilizzare sei ghinee o sei SG dopo l'aggiunta del riboside fotoreattivo, indurre l'espressione dell'IGF marcato con HA flag, due BP, uno con l'aggiunta di cellule doxiciclina, vengono quindi incubati durante la notte in incubatore cellulare.Quindi, decantare il terreno di coltura. Quindi lavare le cellule una volta con 10 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato per piastra. Quindi rimuovere completamente il PBS decantando.Posizionare le piastre scoperte su un vassoio con ghiaccio e irradiarle con luce UV a 365 nanometri in un reticolante UV straddle 2, 400 o equivalente dopo la radiazione UV, raschiare via le cellule con un poliziotto di gomma in un millilitro di PBS per piastra. Trasferire le cellule in provette da centrifugazione da 50 millilitri e centrifugare a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il nome del super e conservare il pellet della cella.A questo punto, i pellet cellulari possono essere congelati in azoto liquido e conservati a meno 80 per almeno 12 mesi. Per continuare con la procedura, sospendere il pellet in tre volumi di un tampone di lisi X NP 40 e incubare su ghiaccio per 10 minuti. Eliminare il lisato cellulare mediante centrifugazione a 13.000 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius.Dopo la centrifugazione, eliminare ulteriormente il lisato filtrandolo attraverso un filtro a siringa a membrana da cinque micron. Infine, aggiungere gli RNA T one a una concentrazione finale di un'unità per microlitro e incubare in un bagno d'acqua a 22 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, raffreddare la reazione sul ghiaccio per cinque minuti.A seguito di reticolazione UV in vivo. Preparare le microsfere magnetiche per l'immunoprecipitazione. Trasferire 10 microlitri di particelle magnetiche di proteina G di perline di dyna per un mil di lisato cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.Quindi posizionare il tubo contenente le perline su un supporto magnetico per uno o due minuti. Rimuovere il surnatante e aggiungere un millilitro di tampone citrato fosfato alla provetta mentre si trova sul separatore magnetico. Quindi, tappare il tubo e agitare il campione per risospendere le perline.Centrifugare brevemente per raccogliere le perle rimaste nel tappo della provetta. Ripetere questo lavaggio con un ulteriore millilitro di tampone citrato fosfato. Dopo la ripresa di lavaggio, sospendere le perle e il tampone fosfato di citrato a un volume pari a due volte il volume originale della sospensione di barbabietola.Quindi aggiungere 0,25 milligrammi di anticorpo monoclonale Anti-Flag M due per un millilitro di sospensione di battito. Incubare la sospensione su una ruota rotante per 40 minuti a temperatura ambiente dopo l'incubazione, lavare le perle due volte in un millilitro di tampone fosfato citrato come descritto in precedenza, questo lavaggio serve a rimuovere qualsiasi anticorpo non legato dopo il lavaggio Resus, sospendere le perle e il tampone fosfato citrato come prima quattro. Per iniziare l'immunoprecipitazione, aggiungere le microsfere magnetiche coniugate con anticorpi appena preparate agli RNA T uno lisato cellulare trattato.Trasferire il composto in provette da centrifugazione da 15 millilitri e ruotare per un'ora a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, raccogliere le microsfere magnetiche, scartare le perle di risospensione del surnatante in un millilitro di tampone di lavaggio IP e trasferirle in provette da centrifuga da 1,5 millilitri. Lavare le perle come descritto prima due volte in un millilitro di tampone di lavaggio IP.Dopo il lavaggio finale, sospendere nuovamente le perle nel volume originale del tampone di lavaggio IP. Quindi aggiungere RNAT uno a una concentrazione finale di 100 unità per microlitro. Incubare la sospensione di perle in un bagno d'acqua a 22 gradi Celsius per 15 minuti.Successivamente raffreddare la sospensione con ghiaccio per cinque minuti. Quindi, lavare le perle tre volte in un millilitro di tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale. Quindi risospendere le perle in un volume originale di perlina di tampone di defosforilazione.Aggiungere la fosfatasi alcalina intestinale di vitello a una concentrazione finale di 0,5 unità per microlitro e incubare la sospensione per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Lavare le perle due volte in un millilitro di tampone di lavaggio della fosfatasi e poi altre due volte in polinucleotide chinasi o tampone PNK senza DTT. Infine, risospendere le perle in un volume originale di tampone PNK.Per iniziare la marcatura radio dell'RNA reticolato. Aggiungere gamma 32 PATP e T four PNK a un volume di cordone originale della sospensione di perline appena preparata. Incubare la sospensione per 30 minuti a 37 gradi Celsius.Successivamente, aggiungere un TP non radioattivo alla sospensione e incubarla per altri cinque minuti a 37 gradi Celsius. Quindi lavare le perle magnetiche cinque volte con 800 microlitri di tampone PNK senza DTT. Infine, risospendere le perle in 70 microlitri di pagina SDS.Tampone di caricamento: incubare la sospensione del radiomarcatore per cinque minuti in un blocco termico a 95 gradi Celsius per denaturare e rilasciare le proteine leganti l'RNA immunoprecipitato con l'RNA reticolato. Quindi rimuovere le microsfere magnetiche sul separatore e trasferire il super natin in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 millilitri Caricare 40 microlitri di suade per pozzetto di un gel di poliacrilammide prefabbricato novox bis triss da quattro al 12% e far funzionare il gel per 55 minuti a 200 volt. Una volta che il gel è stato eseguito, smontare la camera del gel e smontare le piastre, lasciando il gel montato su una piastra per facilitare l'allineamento del gel alla stampa della carta phosphoimager.Impiantare tre minuscoli pezzi di gel radioattivo in modo asimmetrico agli angoli del gel. Avvolgere il gel in una pellicola di plastica come l'involucro Saran per evitare contaminazioni. Esporre il gel a uno schermo fosfoimager vuoto per un'ora e su un imager phospho.Quindi, allineare il gel sopra la stampa dell'imager fosfoscopico utilizzando i pezzi di gel impiantati per l'orientamento. Taglia le bande che corrispondono alla dimensione prevista della proteina legante l'RNA o RBP. Trasferire le bande in un tubo MIDI dializzatore dtu e aggiungere 800 microlitri di un elettro eluizione buffer XSDS.Il complesso R-N-A-R-B-P reticolato a 100 volt per due ore secondo le istruzioni del produttore. Successivamente all'elettroeluizione. Aggiungere il tampone proteinasi K e la proteinasi K incubare la soluzione per 30 minuti a 55 gradi Celsius.Recuperare l'RNA mediante estrazione acida di fenolo cloroformio isoamilico, seguita da un'estrazione di cloroformio. Quindi aggiungere un microlitro di glicogeno e precipitare l'RNA aggiungendo tre volumi di etanolo. Infine sciogliere il pellet risultante in 10,5 microlitri di acqua.Una volta recuperato l'RNA, trasportarlo attraverso un protocollo standard di preparazione della libreria CDNA ed eseguire un'attenta analisi bioinformatica delle letture della sequenza. Risultati rappresentativi per una clip par eseguita con HK 2, 93 cellule che esprimono IGF marcato con flag H ha, due BP, una sono mostrate con gli analoghi nucleosidici fotoreattivi, quattro SU e sei SG, l'efficienza di reticolazione del riboside fotoreattivo alternativo, sei SG è generalmente inferiore a quella di quattro su. La minore efficienza di reticolazione potrebbe comportare un maggiore background di sequenze derivate da frammenti di abbondanti RNA cellulari e quindi più cellule dovrebbero essere inizialmente utilizzate per l'esperimento.Diversi analoghi dell'uridina fotoreattiva par clip vengono confrontati con la tradizionale reticolazione UV 2 a 54 nanometri o clip come si vede qui. La reticolazione delle proteine dell'RNA UV 2 a 54 nanometri ha un'efficienza di reticolazione limitata. L'intensità della banda radioattiva di dimensioni adeguate indica se l'esperimento par clip ha funzionato e se è stata isolata una quantità sufficiente di RNA per eseguire un protocollo di sequenziamento dell'RNA piccolo.Le frequenze delle mutazioni caratteristiche nelle reads sequenziate a seguito dell'analisi bioinformatica sono indicative di sequenze cross-linked riuscite a riuscire a creare sequenze incrociate. Queste mutazioni sono transizioni T due C quando si utilizzano quattro transizioni SU e G due transizioni A quando si utilizza il successo. G. La caratteristica distintiva del park lip è la possibilità di derivare la posizione del legame incrociato mediante il punteggio per una mutazione caratteristica che risiede nelle librerie di CD NA preparate dagli RNA recuperati.Ciò consente la facile separazione del segnale derivato da RNA specificamente legati, dal rumore di sequenze derivate da frammenti co-isolati di abbondanti RNA cellulari. Oggi vi abbiamo mostrato come isolare i segmenti di RNA, specificamente riconosciuti dalle proteine leganti l'RNA. Quando si esegue questa procedura.È importante lavorare senza RNA. E così è stato. Grazie per aver guardato e buona fortuna con gli esperimenti.

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La disposizione spaziale di RNA-binding proteins in una trascrizione è un fattore determinante di regolazione post-trascrizionale. Pertanto, abbiamo sviluppato i singoli nucleotide reticolazione UV risoluzione e immunoprecipitazione (iClip) che permette preciso genoma mappatura dei siti di legame di una RNA-binding protein.

iClip - trascrittoma livello Mappatura delle interazioni proteina-RNA con risoluzione individuale Nucleotide

Le interazioni RNA-proteina sono al centro di molti processi cellulari. Qui, descriviamo un metodo in vivo per isolare RNA specifico e identificare nuove proteine ad esso associate. Questo potrebbe gettare nuova luce su come gli RNA sono regolati nella cellula.

Novel RNA-Proteine ​​leganti isolamento dalla rapida Metodologia

Descriviamo un protocollo per identificare le proteine RNA-leganti e mappare loro regioni di RNA-binding in cellule vive utilizzando photocrosslinking UV-mediati e spettrometria di massa.

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

Qui presentiamo un protocollo di cattura di interazione applicato ai protoplasti a foglia di Arabidopsis thaliana . Questo metodo si basa fondamentalmente sulla creazione di reticolazione UV in vivo e consente l'isolamento e l'identificazione delle proteine ​​legate alla mRNA da un ambiente fisiologico.

Cattura di Interactome mRNA da protoplasti vegetali

Un protocollo dettagliato per l'applicazione di cattura (CARIC) del RNA-Interactoma di chimica-assistita clicca strategia per identificare proteine leganti alla codificazione di entrambi e non codificanti RNA è presentato.

Cattura e identificazione delle proteine RNA-leganti utilizzando clic chimica-assistita RNA-Interactoma (Castaldi) strategia di acquisizione

La specificità della sequenza è fondamentale per la regolazione genica. Le proteine regolatorie che riconoscono sequenze specifiche sono importanti per la regolazione genica. La definizione di siti di legame funzionale per tali proteine è un problema biologico impegnativo. Un approccio iterativo per l'identificazione di un sito di legame per una proteina legante l'RNA è descritto qui ed è applicabile a tutte le proteine che legano l'RNA.

Esplorare lo spazio di sequenza per identificare i siti di legame per le proteine di legame dell'RNA regolamentare

Qui, presentiamo un protocollo eCLIP per determinare i principali obiettivi di RNA dei candidati RBP in testis.

Metodo di immunoprecipitazione crosslinking migliorato (eCLIP) per un'identificazione efficiente dell'RNA legato alle proteine nei testis del topo

Qui presentiamo un protocollo CLIP-seq modificato chiamato FbioCLIP-seq con purificazione tandem FLAG-biotina per determinare gli obiettivi di RNA delle proteine leganti l'RNA (RRP) nelle cellule dei mammiferi.

Profilazione a livello di trascrizione delle interazioni proteina-RNA attraverso il cross-linking e l'immunoprecipitazione mediata dalla purificazione tandem FLAG-Biotina

Il cross-linking cinetico e l'analisi del cDNA è un metodo che consente di studiare la dinamica delle interazioni proteina-RNA nelle cellule viventi ad alta risoluzione temporale. Qui il protocollo è descritto in dettaglio, compresa la crescita delle cellule di lievito, la reticolazione UV, la raccolta, la purificazione delle proteine e le fasi di preparazione della libreria di sequenziamento di prossima generazione.

Monitoraggio delle dinamiche di interazione proteina-RNA in vivo ad alta risoluzione temporale utilizzando χCRAC

Qui, presentiamo un metodo in vitro ottimizzato per scoprire, quantificare e convalidare gli interattori proteici di specifiche sequenze di RNA, utilizzando estratto proteico totale da cellule umane, perle di streptavidina rivestite con RNA biotinilato e analisi di spettrometria di massa.

Un'analisi pull-down quantitativa ottimizzata delle proteine leganti l'RNA utilizzando RNA biotinilato corto

Impara il metodo PAR-CLIP per identificare i siti di legame delle proteine RNA-binding a livello del trascrittoma utilizzando analoghi nucleosidici fotoreattivi e cross-linking UV. Questa tecnica consente di definire elementi di riconoscimento dell'RNA.

PAR-Clip - un metodo per identificare trascrittoma livello i siti di legame delle proteine ​​RNA binding

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