Generazione di ricostruzioni organotipiche della pelle completa: una procedura per stabilire un modello di pelle 3D utilizzando campioni di pelle umana

La pelle è costituita principalmente da uno strato epidermico superiore e da uno strato dermico inferiore. Le cellule epidermiche sono stratificate in più strati che vanno dalle cellule meno differenziate presenti alla base alle cellule altamente differenziate alla periferia. Per far crescere un tessuto cutaneo che imita gli aspetti morfologici e biochimici della pelle normale, possiamo stabilire un modello di pelle organotipica.

Per iniziare, prendi una piastra a più pozzetti con un inserto membranoso. Aggiungere all'inserto fibroblasti dermici mescolati con collagene. Incubare per facilitare la solidificazione della matrice di collagene per incorporare i fibroblasti e imitare il compartimento dermico della pelle.

Quindi, aggiungi una sospensione di cellule di cheratinociti sullo strato dermico. Incubare la piastra per consentire ai cheratinociti di aderire al compartimento dermico. Integrare la coltura con un terreno di epidermlizzazione per avviare la proliferazione dei cheratinociti e la formazione di uno strato epidermico.

Infine, trasferire gli inserti su una piastra multipozzetto nuova. Aggiungere un mezzo di stratificazione tale da coprire solo la base del costrutto, creando così un'interfaccia aria-liquido. Dopo l'incubazione, l'interfaccia aria-liquido facilita la differenziazione dei cheratinociti in un'epidermide stratificata multistrato.

Nel seguente protocollo, genereremo ricostruzioni cutanee organotipiche 3D con controparti dermiche ed epidermiche da cellule cutanee umane isolate.

Per generare la controparte dermica della ricostruzione cutanea, posizionare inserti di membrana di 8 micrometri di dimensione dei pori in una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti. Per ogni inserto, risospendere 100.000 fibroblasti in soluzione di neutralizzazione su gel. Successivamente, mescolare rapidamente la sospensione di fibroblasti con collagene di tipo 1 in un rapporto di 1:3 in un volume finale di 500 microlitri senza formare bolle.

Quindi, utilizzare una pipetta per aggiungere la sospensione a ciascun inserto. All'interno di una cappa sterile, posizionare gli inserti a temperatura ambiente senza fluido per 30 minuti per consentire ai gel dermici di depositarsi. Successivamente, coprire i gel con DMEM e incubare per una notte a 37 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione notturna, rimuovere il DMEM dai gel dermici ed equilibrarli con EGM per 2 ore a 37 gradi Celsius per generare la controparte epidermica delle ricostruzioni cutanee. Quindi, utilizzare una pipetta per rimuovere l'EGM dai gel.

Quindi, sigillare accuratamente 100.000 cheratinociti risospesi in 100 microlitri di EGM sopra ogni gel. Incubare i ricostruzioni per 1,5 ore a 37 gradi Celsius per consentire ai cheratinociti di aderire al gel dermico. Utilizzando un puntale per pipetta, rimuovere con cautela il gel residuo dalla parete dell'inserto.

Successivamente, coprire ogni ricostruzione con 800 microlitri di EGM e coltivare per 7 giorni a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%.

Rimuovere con cautela il gel residuo dalla parete dell'inserto con una piccola punta bianca per pipetta.

Il giorno 8, posizionare gli inserti in pozzetti separati di una piastra a 6 pozzetti. Successivamente, aggiungere da 1,2 a 1,4 millilitri di terreno per melanoma metastatico a ciascun pozzetto per coprire solo la base della ricostruzione cutanea. Quindi, incubare per 10-17 giorni a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%.

• 3D Skin Models - Three-dimensional constructs mimicking natural skin structures
• Human Skin Samples - Biopsy samples of human skin used for scientific study.
• Epidermalization - The process of keratinocyte proliferation and formation of an epidermal layer.
• Organotypic Skin Culture - A method to grow skin tissues that mimic normal skin.
• Reconstructs - 3D skin models created from isolated human skin cells.

• Introduce 3D Skin Models: These are laboratory-grown structures that mimic the natural layers of skin (e.g., human skin samples).
• Key Concepts: They involve processes like epidermalization, that replicate skin cell behaviour (e.g., epidermalization).
• Underlying Mechanisms: The constructs are created by embedding cells in collagen and refining them in different stages.
• Connect to Experiment: The experiment involves creating an organotypic skin culture using a multi-well plate and cell substances.

• What are 3D Skin Models and how are they established (including organotypic skin culture)?
• What does the process of epidermalization entail?
• What are the mechanisms used in creating skin reconstructs?

• Describe Practical Applications: 3D skin models are vital in dermatological research and skincare product testing (e.g., 3D skin models).
• Industry Impact: They greatly influence sectors like healthcare and cosmetology (e.g., human skin samples).
• Societal Importance: Advancements in skin models can benefit personalized medicine and reduce animal testing (e.g., reconstructs).
• Link to Scientific Advancements: They enable understanding of skin diseases and testing of potential treatments.